Escuela Superior Politécnica del Litoral

FACULTAD CIENCIAS DE LA VIDA

BIOQUIMICA (BIOG1006)
Informe de Laboratorio # 5

Práctica Nº 5: Determinación de proteínas

Unidad Nº 2: Proteínas y enzimas
Objetivo de Aprendizaje: Estudiar uno de los métodos de cuantificación de proteínas
para identificar su mecanismo de acción.

1. INTRODUCCIÓN

Las proteínas son conjuntos de aminoácidos dispuestos en cadenas y unidos por

enlaces peptídicos, estas macromoléculas son importantes en la formación de
estructuras y para el correcto funcionamiento dentro de todos los organismos,
es por eso que su cuantificación es esencial en investigaciones con fines
biológicos y alimenticios. (Johnson, 2012)
Dada la necesidad de determinarlas se han ideado varios métodos para poder
realizarlo, uno de ellos es el método de Bradford, descrito por primera vez por el
Dr. Marion Bradford, el cual se basa en la formación de un complejo entre el
colorante azul brillante de Coomassie G-250 y las proteínas en solución,
principalmente a residuos de arginina, triptófano, tirosina, histidina y
fenilalanina. (Mejía, 2018)
Tiene un rango de detección de entre 20-2000 ug/ml de solución y para
determinar estos valores se deber prepara una curva estándar con la cual, según
las diluciones realizadas se podrá comparar la cantidad de proteínas presentes.
La mayoría de investigadores prepara esta curva con SBA, sin embargo, no es
siempre recomendable debido a que tiene una gran respuesta al colorante y
puede subestimar el contenido de ciertas proteínas. Esta curva de calibración se
presenta como una escala de colores con tonos que van desde el color café
cuando se encuentra pura hasta un tono azul muy intenso luego de haberse
unido a una solución con una concentración de proteínas muy alta.
Este método de detección, a pesar de ser rápido, sencillo y compatible con
agentes reductores, presenta desventajas como su incompatibilidad con agentes
detergentes y no detecta proteínas de <3kDa. (Abyntek, 2018)

2. OBJETIVO:

Objetivo general
Realizar una curva de patrón para la determinación de proteínas y
determinar la presencia de proteínas en una muestra problema.

Objetivos específicos:

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1. Comparar las tonalidades de las muestras problemas con las tonalidades de la

curva de calibración para seleccionar las más semejantes.
2. Calcular teóricamente la cantidad de proteínas presentes en las muestras
problemas para determinar la eficacia del uso de reactivo de Bradford en la
determinación de proteínas.

3. MATERIALES:
‘
MATERIALES
 9 tubos de ensayo
 3 vasos de precipitación
 Micropipetas
 Puntas para micropipeta

REACTIVOS:
 Reactivo de Bradford: Colorante Brillant Blue G-250
 Muestra BSA (Bovine Serum Albumine)
 Leche comercial
 Agua destilada

4. PROCEDIMIENTO:

Curva de calibración:
1. Disolver 100mg de SBA en 10 mL de agua destilada para obtener una solución
madre de 10 mg/mL.
2. Mediante la ecuación C1 x V1 = C2 x V2 , calcular el volumen necesario de la
solución madre para obtener 6 ml de una solución con concentración de
1mg/mL .
3. Preparar la curva patrón de albúmina bovina colocando la solución madre en
distintos tubos de ensayo, en un rango de 0 hasta 1,0mL con intervalos de
0,1mL y completar con agua destilada hasta obtener disoluciones de 1 mL.

MUESTRA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
BSA (mL ) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 10
H2O (mL ) 10 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0

4. Añadir 20 uL de cada una de las disoluciones en los pocillos de una placa de

microtitulación, en orden ascendente según la concentración, es decir, desde la
muestra 1 hasta la 11.
5. Agregar 150 uL de reactivo de Bradford en cada uno de los pocillos utilizados.

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Cuantificación de proteínas en muestra:

1. Prepara las siguientes disoluciones de leche comercial:

MUESTRA 1/20 1/100

Leche 1 mL 1 mL
Agua destilada 20 mL 100 mL

2. Preparar las siguientes disoluciones de distintas proteínas:

MUESTRA Proteína 1 Proteína 2

Proteína 500 mg 500 mg
Agua destilada 5 mL 5 mL

3. Añadir 20 uL de cada una de las disoluciones en distintos pocillos de una placa

de microtitulación.
4. Agregar 150 uL de reactivo de Bradford en cada uno de los pocillos utilizados.

5. RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIÓN:

RESULTADOS

Cálculo para obtener 6mL de solución con concentración 1mg/mL a partir de una
solución madre de BSA con concentración de 10mg/mL.

𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2

𝑚𝑔 1𝑚𝑔
10 × 𝑉1 = × 6𝑚𝐿
𝑚𝐿 𝑚𝐿

𝑉1 = 6 𝑚𝑔 ÷ 10 𝑚𝑔⁄𝑚𝑙 = 0,6 𝑚𝐿 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒

6 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙. 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙 − 0,6 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑠𝑜𝑙. 𝑚𝑎𝑑𝑟𝑒 = 5,4 𝑚𝑙 𝑑𝑒 𝑎𝑔𝑢𝑎 𝑑𝑒𝑠𝑡𝑖𝑙𝑎𝑑𝑎

Curva de calibración obtenida a partir de las diluciones realizadas

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Muestra 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Mg/mL 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Ilustración 1: Curva patrón para cuantificación de proteínas, en tabla se presentan las concentraciones de cada
muestra

Comparación de muestras problemas de proteínas con curva de calibración

Ilustración 2: Muestras problemas con contenido proteico

Las muestras problemas se encuentran en el siguiente orden secuencial:

(1) Dilución leche en agua (1/20)
(2) Dilución leche en agua (1/100)
(3) Dilución de proteína 1 en agua ( 500mg/5ml)
(4) Dilución de proteína 2 en agua ( 500mg/5ml)

Observaciones
Muestras problema (1) (2) (3) (4)
Muestra del patrón de 4 3 NINGUNA NINGUNA
calibración con similitud
Concentración de proteína 0,3 mg/mL 0,2 mg/mL --- ---

Cálculo de concentración de proteínas en muestras analizadas.

(1) Dilución leche en agua (1/20)

Muestra original: Leche comercial
Proteína: 8g/240 ml leche

Proteína Porción de leche

8g → 240 mL
Xx → 1 mL 8𝑔 × 1𝑚𝐿 ÷ 240𝑔 = 0,033𝑔 = 𝑋𝑥

Concentración de proteína en solución con 20 ml de agua

𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2

𝑔
0,033 × 1𝑚𝐿 = 𝐶2 × 20𝑚𝐿
𝑚𝐿

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𝑔
𝐶2 = 0,033𝑔 ÷ 20 𝑚𝐿 = 0,00165
𝑚𝐿

0,00165𝑔 1000𝑚𝑔 𝑚𝑔
× = 1,65
𝑚𝐿 1𝑔 𝑚𝐿

Proteína Solución
1,65 mg → 1 mL
1,65𝑚𝑔 × 20𝑢𝑙 ÷ 1000𝑢𝑙 = 0,03 𝑚𝑔 = 𝑍𝑍
ZZ → 20 uL

Hay 0,03mg de proteína por cada 20 uL de agua en la disolución preparada

(2) Dilución leche en agua (1/100)

Muestra original: Leche comercial
Proteína: 8g/240 ml leche

Proteína Porción de leche

8g → 240 mL 8𝑔 × 1𝑚𝐿 ÷ 240𝑔 = 0,033𝑔 = 𝑋𝑥
Xx → 1 mL

Concentración de proteína en solución con 100 ml de agua

𝐶1 × 𝑉1 = 𝐶2 × 𝑉2
𝑔
0,033 × 1𝑚𝐿 = 𝐶2 × 100𝑚
𝑚𝐿
𝑔
𝐶2 = 0,033𝑔 ÷ 100 𝑚𝐿 = 0,00033
𝑚𝐿

0,00033𝑔 1000𝑚𝑔 𝑚𝑔
× = 0,33
𝑚𝐿 1𝑔 𝑚𝐿

Proteína Agua destilada

0,33 mg → 1 mL
0,33𝑔 × 20𝑢𝑙 ÷ 1000𝑢𝑙 = 0,0067 𝑚𝑔 = 𝑍𝑍
ZZ → 20 uL

Hay 0,0067mg de proteína por cada 20 uL de agua en la disolución preparada

(3) Dilución de proteína 1 en agua ( 500mg/5ml)

Muestra original: Suplemento Proteico “PROAMINO”

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Proteína: 8g/10g por porción

Proteína Porción
8g → 10 g 8𝑔 × 0,5 𝑔 ÷ 10𝑔 = 0,4𝑔 = 𝑋𝑥
Xx → 0,5 g

Proteína Agua destilada

0,4g → 5 mL
0,4𝑔 × 1𝑚𝑙 ÷ 5𝑚𝑙 = 0,08𝑔 = 𝑌𝑌
YY → 1 mL

0,08𝑔 1000𝑚𝑔 𝑚𝑔
× = 80
𝑚𝐿 1𝑔 𝑚𝐿

Proteína solución
80 mg → 1 mL
80𝑚𝑔 × 20𝑢𝑙 ÷ 1000𝑢𝑙 = 1,6 𝑚𝑔 = 𝑍𝑍
ZZ → 20 uL

Hay 1,6mg de proteína por cada 20 uL de agua en la disolución preparada

(4) Dilución de proteína 2 en agua ( 500mg/5ml)

Muestra original: Suplemento Proteico “ULTRA WHEY”
Proteína: 22g/30g por porción

Proteína Porción
22g → 30 g 22𝑔 × 0,5 𝑔 ÷ 30𝑔 = 0,37𝑔 = 𝑋𝑥
Xx → 0,5 g

Proteína Agua destilada

0,37g → 5 mL
0,37𝑔 × 1𝑚𝑙 ÷ 5𝑚𝑙 = 0,073𝑔 = 𝑌𝑌
YY → 1 mL

0,07𝑔 1000𝑚𝑔 𝑚𝑔
× = 73
𝑚𝐿 1𝑔 𝑚𝐿

Proteína solución
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73 mg → 1 mL
73𝑔 × 20𝑢𝑙 ÷ 1000𝑢𝑙 = 1,46 𝑚𝑔 = 𝑍𝑍
ZZ → 20 uL

Hay 1,46mg de proteína por cada 20 uL de agua en la solución preparada

DISCUSIÓN
En las muestras que contenían suplementos proteicos, la curva de calibración
no nos permitió definir la concentración de proteínas en la disolución, esto
pudo darse debido a que el rango que establecimos para nuestra curva no
abarcaba el valor de la concentración de las proteínas en estas muestras. Otro
motivo pudo ser la coloración que estos suplementos proporcionaban al agua
destilada, por lo tanto, al añadirse el reactivo de Bradford, la combinación de
estos colores nos generó unos que estaban fuera de nuestra curva patrón.

CONCLUSIÓN
El reactivo de Bradford nos permite obtener una curva de calibración bastante
precisa con la cual podemos comparar la presencia de proteínas en otras
muestras, sin embargo, debido a que es un proceso que involucra observar
tonalidades, el resultado podría variar entre cada observador. Para evitar que
la variación entre las concentraciones observadas sea muy distante es
recomendable realizar una mayor cantidad de disoluciones de BSA en agua,
en un rango mayor e intervalos más pequeños para así cuantificar de manera
más exactas las concentraciones de proteínas.

6. BIBLIOGRAFÍA:

Bibliografía
Abyntek. (2018). Abyntek. Obtenido de 5 MÉTODOS PARA CUANTIFICAR PROTEÍNAS:
http://www.abyntek.com/5-metodos-para-cuantificar-proteinas/
Johnson, M. (2012). Labome. es. Obtenido de Cuantificación de proteínas.:
http://www.labome.es/method/Protein-Quantitation.html
Mejía, L. (2018). ISSUU. Obtenido de Cuantificación de proteínas:
https://issuu.com/lmejia75/docs/cuantificacion_de_proteinas

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