BIOQUÍMICA CLÍNICA – PROVA 1 – FOTOMETRIA

Espalhamento:
Implica uma variação mais ou menos desordenada na direção da propagação.

Calibração:
O método mais utilizado para calibrar um espectrofotômetro é através de filtros especiais de
absorção, que são devidamente calibrados com óxido dídimo e hólmio. Depois se faz as leituras
e as compara com a curva de transmitância espectral do filtro utilizado. Se os valores não
estiverem iguais, faz-se o acerto através da orientação contida no catálogo do fabricante do
aparelho.

Interpretação:
400 e 700 nm
1. As leituras em 400 e 700 nm correspondem aos pontos de menor transmitância, ou seja, de
maior absorção.
2. Detectam a presença de energia parasita.
3. Um aumento acima de 3%T exige correção.
4. Provável problema: sujeira na parte ótica, lâmpada envelhecida, falha no dispersador de
difração.
460 e 550 nm
(Na fina) = para calibração do comprimento de onda
1. As leituras de 460 e 550 nm correspondem as partes ascendentes e descendentes da curva de
transmitância e controlam a calibração do comprimento de onda.
2. A relação entre as absorbâncias nesses comprimentos de onda deverá estar próxima de 2/1,
ou seja, a absorbância em 460 nm é praticamente o dobro da absorbância em 550 nm. Fato que
demonstra a linearidade do aparelho.
3. A diminuição de uma leitura acima de 2%T acompanhada de um aumento equivalente da
outra exige correção.
4. Provável problema: má calibração do comprimento de onda, problemas com a lâmpada, com
a fotocélula, com as lentes ou com fenda de saída, falhas no fornecimento de energia elétrica,
no sistema fotossensível ou nos dispersados de difração.
510 nm
1. A leitura em 510 nm corresponde ao ponto de transmitância máximo, ou seja, de absorção
mínima.
2. Detecta mudança na banda de emissão, avaliando a taxa de emissão.
3. Diminuição de mais de 3%T indica aumento da banda e exige correção.
4. Provável problema: torção ou curvatura no filamento de lâmpada, avaria no dispersor de
difração.

Procedimento para Calibração e Controle das condições funcionais de um Espectrofotômetro:

Inicialmente deve-se calibrar o aparelho utilizando o filtro de óxido de didímio ou hólmio e
ajustar a transmitância em 100%T com o branco. Depois realiza-se a leitura de transmitância
(T%) da solução nos comprimentos de onda 400-460-510-550-700nm e deve-se repetir este
processo semanalmente, anotando os resultados, sendo que as leituras não podem ser
diferentes entre si, tendo como referência: 400nm = T% inferior a 4%T; 460nm = 25 a 31; 510 =
mínimo de 68; 550 = 52 a 56; 700nm = inferior a 2%T.
Procedimento para Calibração das Cubetas:
1) Preparar a solução aquosa de hemoglobina 50 mg/dl
2) Transferir a solução de hemoglobina 50 mg/dl para uma cubeta e acertar a leitura do
fotômetro em 50%T, empregando um filtro verde ou comprimento de onda de 540nm.
3) Fazer leitura fotométrica da solução aquosa de hemoglobina, utilizando as cubetas a serem
calibradas, girando-as em várias posições dentro do receptáculo.
4) Poderão ser aproveitadas todas as cubetas que coincidirem com a leitura de 50%T, permitindo
variação de 0,3%.

Utilização das Cubetas

1) Para leituras em comprimentos de onda 320 a 1000 nm, podem ser utilizadas cubetas de
vidro.
2) Para comprimentos de onda menores de 320 nm, utilizar cubetas de quartzo.
3) Nunca utilizar cubetas mal lavadas ou riscadas, pois pode contribuir para aumentar o erro
fotométrico.

Espectrofotômetro de mono-feixe
 Ajusta-se a transmitância em 0%, fechando o obturador entre a fonte de radiação e o
detector. Após ocorre o ajuste de transmitância em 100%. Coloca-se o solvente (branco)
no caminho ótico, abre-se o obturador e varia-se a intensidade da radiação até que o
sinal seja de 100% de transmitância. Então substitui- se o recipiente com solvente pelo
recipiente com a amostra e o percentual de transmitância da mesma é lido no indicador
de sinal.
Espectrofotômetro de duplo-feixe
 Dois feixes de radiação são formados no espaço. Um feixe passa pela solução de
referência (branco) até o transdutor e o segundo feixe, ao mesmo tempo, passa através
da amostra até o segundo transdutor. Nos espectrofotômetros deste tipo o ajuste do
0% é feito com a interrupção de radiação nos dois feixes e o 100% de transmitância é
ajustado com o solvente (branco) colocado no caminho ótico dos dois feixes.

Equipamentos usados para medidas fotométricas:

- Espectrofotômetros (colorimetria e turbidimetria) → trabalha com prisma pra
selecionar o comprimento de onda
- Nefelômetros → mede luz dispersa (quando ela muda de direção)/espalhamento
- Fluorímetros → medida fotométrica → quantifica determinados metabólitos
- Fotômetros de chama: medida de concentração de um produto alcalino, alcalino
terroso ou químico → para dosagem de Na,K,Li,Ca
- Densitômetros: amostras opacas (proteínas, lipídios, hb) → mede densidade óptica de
amostras opacas

Equipamentos
1. Fonte de Energia Elétrica: fornece energia c/ voltagem constante, regulada e apropriada para
a operação do aparelho. ERRO: oscilações na corrente e/ou voltagem
2. Fonte de Luz (energia radiante): fornece energia radiante com os comprimentos de onda
desejados. ERRO: utilizar lâmpada especifica de uma região em outra faixa
3. Fenda de Entrada: usada para que o raio de luz chegue ao seletor de comprimento de onda
sem haver perdas. ERRO: a luz pode ser dispersa por imperfeições na fenda
4. Monocromador: Isola a energia radiante de um determinado comprimento de onda,
excluindo a dos outros comprimentos de onda. Prisma- seleciona o comprimento de onda pela
refração da energia radiante fornecendo estreita faixa espectral (que é isolada pela faixa ou
saída) ERRO: imperfeições podem permitir o aparecimento de energia parasitária.
Filtros: Fotocolorímetro; Prismas ou grades de difração: Espectrofotômetro
5. Fenda de saída: usados para controlar a dimensão do feixe luminoso que vai incidir sobre a
solução. ERRO: imperfeições que podem permitir que o feixe de luz selecionado incida sobre a
amostra
6. Cubeta: conter a solução para medição. (Vidro 320 q 100) (quartzo: menor que 320) ERRO:
arranhões, sujeira, impropria para o aparelho e λ selecionado.
7. Detector (aceptor de fótons): transformar a energia radiante transmitida pela amostra em
energia elétrica. ERRO: pode perder a linearidade
8. Circuito medidor: converter a energia elétrica em forma útil de medida (A, T%) ERRO:
ponteiro

Linearidade:
É uma característica de espectrofotometria e indica a faixa que a variação na absorbância é
proporcional a variação da concentração, seguindo a lei de Lambert-Beer. Ou seja, um aumento
na absorbância leva a um aumento na concentração. Dessa forma, cada reação tem uma
linearidade e para descobrir a linearidade da reação, deve-se fazer várias diluições em
concentrações diferentes abaixo e acima do valor de referência. Quando as concentrações
forem superiores ao limite de Linearidade observa-se um desvio na Lei de Lambert-Beer, deixa
de existir a proporcionalidade linear entre concentração e absorbância. Depois de terminar a
dosagem, pega-se o resultado e multiplica pelo fator de diluição para se obter o resultado real
da amostra.

Procedimento:
1. Ajustar o comprimento de onda a 550 nm, cobrir o compartimento de cubeta vazio e ajustar
a absorbância para zero.
2. Ler a absorbância do filtro de dídimo e registrar o seu valor.
3. Remover o filtro e ajustar a absorbância para 0,25
4. Ler o filtro de dídimo e registrar o seu valor.
5. Ajustar a absorbância para 0,50; 0,75; 1,00; 1,25 etc. com o compartimento vazio, e ler a
absorbância como indicado anteriormente.
6. Calcular a variação de A para cada aumento nos ajustes

Grade de Difração
As grades de difração são produzidas pela evaporação de uma película de um “alloy” (alumínio-
cobre) na superfície oticamente lisa de um vidro, com isso, são feitos sulcos na superfície do
“alloy” com um número que pode variar e quanto maior o número de sulcos, maior é a
capacidade de difração da grade e menor é a faixa de emissão. Grades com boa capacidade de
difração podem ter de 1000 a 2000 sulcos/mm.
A grade de difração utiliza o princípio de que os raios de energia radiante sofrem refração ao
encontrar um ângulo agudo e o comprimento de onda fornecido varia com o grau de difração.
Os sulcos da grade funcionam como pequenos prismas e a energia é refletida ou transmitida de
maneira a fracionar a energia radiante composta em seus vários comprimentos de onda.

Prisma:
Os prismas produzem refração da energia radiante separando os vários componentes da energia
composta. As fendas devem ser infinitamente estreitas e suficientemente largas para
permitirem a passagem de energia radiante suficiente para medições exatas e este é um dos
fatores de limitação porque quanto mais larga a fenda maior é a faixa de emissão. A largura da
fenda será tanto menor quanto maior for o comprimento de onda desejado. Os instrumentos
equipados com prismas têm fendas de entrada e saída que podem ser ajustadas em uma
operação concomitante com o ajuste do comprimento de onda.
 Os prismas de quartzo são indicados para trabalhar na região ultravioleta, embora
tenham mais dispersão que o vidro.
  Na região do visível são empregados primas de vidro.
 Os prismas de quartzo apresentam desvantagem por serem altamente refringentes e
oticamente ativos.

Filtros de Vidro: 2 tipos de filtro de acordo com seu desempenho. Filtro de corte: produz um
nítido corte no espectro com transmitância quase nula de um lado e grande transmitância do
outro. É usado para eliminar energia estranha, espectros de segunda ordem etc. Filtro
composto: é construído pela associação de dois ou mais filtros de corte e transmite uma faixa
definida do espectro. É o tipo mais comumente empregado nos fotocolorímetros. O filtro
composto não é um monocromador porque transmite uma faixa muito ampla de λ. A capacidade
de monocromatização de um filtro composto é dependente de sua faixa de emissão.

Área espectral:
Quando se realiza uma medida fotométrica deve-se utilizar uma faixa do espectro na qual a
energia radiante seja absorvida ao máximo ou próximo do máximo a fim de se obter o mais alto
grau de sensibilidade.

Escolha da área espectral:

Figura do Livro: 420 nm (absorbância alta da amostra, mas alta também do Branco); 625 nm
(segunda maior absorbância da amostra e mínimo do Branco).
Normalmente, não é usado o maior pico de absorção, o que promove diminuição da
sensibilidade, mas é um artificio para se obter a linearização, aumento da faixa de trabalho ou
eliminação de interferência como, por exemplo, bilirrubina.
Normas para escolha da Região Espectral: a) Realiza-se a curva de absorção espectral nos
fotômetros equipados com filtros contendo diferentes emissões para avaliar a melhor região
espectral de acordo com as emissões correspondentes a cor complementar da solução a ser
medida. O zero pode ser acertado com água destilada ou com o branco dos reagentes.
b) Escolher o comprimento de onda que se obtém a maior absorbância, evitando as
interferências de, por exemplo, bilirrubina.
c) Se as porções ascendentes e descendentes da curva não são linhas retas, provavelmente o
sistema colorimétrico não seguiu a Lei de Beer.
d) Deve-se usar os picos para a leitura colorimétrica, porque pequenas variações no
comprimento de onda produzem também pequenas variações na absorbância, enquanto que
nas porções ascendentes e descendentes da curva as pequenas variações do comprimento de
onda correspondem grandes variações na absorbância.

Faixa Útil de trabalho:

Para obter exatidão máxima nas leituras fotométricas é necessário conhecer faixa útil do
calorímetro ou espectrofotômetro para determinado sistema calorímetro. Os catálogos dos
aparelhos orientam quanto a faixa útil do seu instrumento. Normalmente é compreendido entre
80 e 10% de transmitância ou entre 60 e 20% de transmitância.
Procedimento:
1) conhecer a linearidade da reação química, isto é, aumento de cor proporcional a
concentração.
2) escolher os padrões com várias concentrações a serem dosadas. Incluir valores muito baixos
e muito altos.
3) proceder a dosagem pelo método proposto. Determinar as transmitâncias dos padrões
4) plotar transmitâncias (ordenada) contra o logaritmo da concentração (abcissa). T%(y) Xilog.
Da concentração (X)
5) A faixa útil de trabalho será aquela colocada entre as curvaturas das duas extremidades. Caso
não se observe acentuadas curvaturas nas extremidades, repetir o procedimento usando
padrões mais diluídos e mais concentrados.

O que é Energia Parasita e o que ela causa nas leituras fotométricas?

A energia parasita é um tipo de energia indesejável, que chega à cubeta com  diferente do
indicado no monocromador e promove a obtenção de resultados incorretos, promovendo
desvios da linearidade.
Pode ser causada por:
- Imperfeições na grade de difração ou prisma
- defeitos no sistema ótico
- deposições no vidro da lâmpada
- orifícios permitiondo a entrada de luz adversa, etc.

Valores maiores que 600mg/dl não obedecem a Lei de Beer. Os valores não são confiáveis (a
concentração não é proporcional a absorbância)
1. Raios ultravioleta: 200-400 nm menor intensidade de energia
2. Raios visível: 400 a 700 nm intensidade intermediaria
3. Raios infravermelho: 700 a 2000 nm maior intensidade

Regras gerais e precauções:

Branco:
1. A Prova em Branco é preparada de maneira idêntica as amostras analisadas e deve conter os
mesmos reagentes, nas mesmas proporções.
2. Em algumas circunstancias, o Branco poderá ser substituído por agua destilada ou deionizada.
3. A Função do Branco é anular as interferências nas leituras fotométricas produzidas por: a)
absorbância dos reagentes; b) absorbância das cubetas; c) perdas de energia radiante por
reflexão ou refração d) efeitos de lentes das cubetas redondas.
4. Quando usamos o Branco em fotometria para estabelecer absorbância Zero ou 100% de T
(elimina necessidade de cálculos) estamos realmente usando um simples
Sistema de computação para eliminar interferências que já foram ditas.
Faixa Útil:
Deve-se sempre trabalhar dentro da Faixa Útil do aparelho, que corresponde a faixa de maior
sensibilidade nas leituras fotométricas. Ela é delineada pelo fabricante ou pode ser determinada
no próprio laboratório. De maneira geral, ela corresponde a uma faixa de 16% a 90%T.
Comprimento de onda:
Ao fazer a leitura, ajustar o aparelho no Comprimento de Onda Ideal recomendado para aquela
determinação. Na dúvida, traçar a Curva de Absorção Espectral e determinar o comprimento de
onda ideal.
Tempo de estabilidade do produto:
Observar sempre o tempo de estabilidade dos produtos (corados ou não) resultantes nas
reações de dosagem, que é característica para cada sistema utilizado.
Aquecimento do aparelho:
Todo aparelho deve ser ligado alguns minutos (5 a 10) antes de se efetuar as leituras
fotométricas.
Cubetas limpas e secas
Volume mínimo de leitura:
Ficar atento ao volume mínimo de leitura do aparelho. Cada aparelho tem as suas próprias
cubetas, que são calibradas para trabalhar com um determinado volume mínimo de leitura.
Então, para cada dimensão da cubeta há um determinado volume mínimo que é suficiente para
cobrir completamente a abertura no receptáculo da cubeta pelo qual passa o feixe luminoso. Se
usar um volume menor, o feixe luminoso será refletido pelo menisco e pela área vazia acima
dele, causando sérios erros na leitura fotométrica.

Colocação da cubeta:
A cubeta deve ser colocada sempre com a mesma face voltada para a fonte luminosa.
Geralmente, as cubetas vem de fábrica com uma marca ou sinal para orientar a sua colocação
no porta-cubetas.
Tampar a porta cubetas:
Sempre tampar o porta-cubetas no momento das leituras fotométricas. A luz externa
proveniente q sua colocação no porta-cubetas.
Leitura fotométrica:
1. Dentro de cada cubeta, a solução deve estar límpida, livre de bolhas de ar, no volume mínimo
indicado ou superior, cubeta na posição correta.
2. Previamente, zerar o aparelho, ajustando-o em 0%T.
3. Em seguida, acertar o 100%T com a Prova do Branco.

Fator Importante para avaliar diluição

O fator mais importante para avaliar a diluição de uma amostra que ultrapassa a linearidade é
fazer com que quando diluirmos a amostra, os valores lidos pelo aparelho estejam dentro ou
bem próximos dos valores de referência da análise normal. Lembrando-se, também, que se deve
atentar com a capacidade de instrumentos do laboratório necessários para realizar essa diluição
de forma correta.

Fluorescência
Baseia-se na medida da energia radiante transmitida por uma solução de substância
fluorescente.
Este fenômeno é apresentado por substâncias que tem a capacidade de absorverem radiação
de baixo λ, ou seja, de alta energia na faixa do U.V., e de transmitirem radiações de λ maiores,
que possuem baixa energia, na faixa do visível. Ex: dosagens hormonais.

Quimioluminescência
A quimioluminescência é um evento em que há uma excitação que é causada por uma reação
química ou eletroquímica e não por fotoiluminação. Envolve a oxidação de um composto
orgânico como, por exemplo, o luminol, por um oxidante ( H2O2, hipoclorito ou oxigênio): a luz
é emitida do produto excitado formado na reação de oxidação. Estas reações ocorrem na
presença de catalisadores (exemplo: fosfatase alcalina). Aparelhos de medida: fluorímetros ou
espectrofluorímetros.

Qual é o impedimento para a obtenção dos resultado sem diluição da amostra?

a) Considerando que a concentração mais alta da curva de calibração tenha sido 400mg/dl, o
que se pode dizer que se não fosse feita a diluição prévia, não se conheceria o real
comportamento do aparelho perante uma leitura de concentração superior, sendo
completamente descartado esta hipótese.
b) Como a linearidade da reação chega apenas a 500mg/dl, considera-se que o resultado de 516
mg/dl está fora da linearidade e, portanto, é necessário que se faça uma diluição prévia da
amostra para que se obtenha o valor real do analito na amostra analisada.
c) Considerando a faixa útil de trabalho de 0,008A até 0,696A, pode-se dizer que a leitura com a
diluição é que caiu dentro da faixa útil de trabalho (A=0,061). Sendo assim, é bem provável dizer
que sem a diluição o resultado encontrado estaria fora da faixa útil de trabalho (acima do valor
limite).

O essencial para trabalhar com medidas fotométricas deve ser (Regras gerais e Precauções):
1. Desenvolvimento da reação e operação do fotômetro;
2. Usar uma prova em Branco para cada determinação;
3. Trabalhar na faixa útil do aparelho;
4. Trabalhar no comprimento de onda ideal;
5. Tempo de estabilidade do produto da reação;
6. Aquecimento do aparelho;
7. Cubetas limpas e secas;
8. Volume mínimo de leitura fotométrica;
9. Colocação da cubeta no fotômetro;
10. Tampar o porta-cubetas;
11. Leitura fotométrica, ajustando com 0%T e 100%T com a Prova em Branco.
OBS: 4 parâmetros mais importantes: Faixa Útil de Trabalho, Linearidade da Reação, Área
Espectral e Estabilidade do produto

Como podem ser classificadas as reações laboratoriais de acordo com o produto formado?
- Reação de aglutinação: são utilizadas partículas ligadas a antígenos ou anticorpos para
reagirem com o analito na amostra biológica, sendo que, se há aglutinação formada esta é
visualizada a olho nu ou no microscópio. Ex.: Proteína C Reativa (PCR).
- Reação de precipitação: o analito presente na amostra biológica é precipitado por ação de um
reagente, que pode ser químico ou anticorpo, sendo que, se há turvações estas serão percebidas
visualmente ou medidas por turbidimetria ou fotometria. Ex.: Pesquisa ou dosagem de proteína
na urina.
- Reações colorimétricas: são reações em que os produtos formados são corados. Mede-se a
energia radiante transmitida e/ou absorvida na faixa do visível do espectro eletromagnético
radiante (400 a 680nm). Ex.: Dosagem de colesterol.
- Reações no ultravioleta: são reações em que os produtos formados não são corados, mas que
são capazes de absorverem energia radiante na faixa ultravioleta do eletromagnético radiante
(340 a 365nm). Ex.: Dosagem de Lactato Desidrogenase (LDH).

Reações segundo o procedimento:

- Reação de ponto final: aquelas reações que formam produtos cuja concentração chega a um
ponto máximo permanecendo estável por um certo tempo. Ex.: dosagem de glicose.
- Reação cinéticas: são reações em que a velocidade de formação do produto é medida durante
um intervalo de tempo, que pode ser em horas, minutos ou segundos. Podem ser classificadas
em:
. Reação cinética de tempo fixo: a velocidade de formação do produto é medida após um
tempo fixo para sua leitura. Ex.: dosagem de transaminase.
. Reação cinética contínua: reações que utilizam medidas contínuas da formação de
produtos. A medida de formação de produto é feita em pelo menos 3 intervalos de tempo. Ex.:
dosagem de fosfatase alcalina
. Reação cinética de dois tempos: é uma variante da Reação Cinética Contínua em que se
faz uma leitura no tempo 1 e a outra leitura no tempo 2. Utiliza-se a variação de ∆A de 1 hora
ou minuto para calcular a concentração do analito.
Diferença entre fotômetro e espectrofotômetro: o fotômetro é um aparelho de construção
simples que utiliza filtros compostos para selecionar porções do espectro a serem utilizadas.
Geralmente são aparelhos de pequena sensibilidade, utilizando somente a porção visível do
espectro. Já o espectrofotômetro é um aparelho mais avançado que utiliza grades de difração
ou prismas na seleção da porção desejada do espectro. Muitos fazem medições nas 3 porções
do espectro, ou seja ultravioleta, visível e infravermelho.

Diferença entre fotocolorímetro e espectrofotômetro: O fotocolorímetro é um instrumento

que mede a concentração de substâncias coloridas misturadas em soluções por meio da
absorção de luz; são reações de quimioluminescência. Já o espectrofotômetro é um instrumento
capaz de registrar dados de absorbância ou transmitância em função do comprimento de onda,
sendo possível a identificação de uma espécie química através de seu espectro de absorção.

Explique como é realizada uma reação cinética de tempo fixo e uma reação cinética de 2
tempos. Dê exemplo de dosagens usando as duas metodologias.
- Reação cinética de tempo fixo: esta reação é realizada marcando-se o tempo no momento em
que a amostra entra em contato com o substrato, para medir a sua velocidade de formação. A
amostra já deve estar na sua temperatura de incubação (37°C). Quando houver várias amostras
a serem dosadas, deve-se pipetá-las com intervalos de tempo (10 a 15 segundos). Quando o
tempo cronometrado se completar, interrompe-se a reação com os mesmos intervalos de
tempo determinados. Ex.: dosagem de fosfatase alcalina.
- Reação cinética de 2 tempos: nesta reação deve-se realizar 2 leituras da amostra, uma no
intervalo de tempo de 30 segundos e a outra em 90 segundos. A concentração do analito será
obtida através da variação de A entre as leituras fotométricas. Ex.: dosagem de creatinina.

Um Farmacêutico Analista Clínico quer conhecer a área de maior exatidão de leitura de seu
aparelho espectrofotométrico. Se este profissional solicitar que você delimite esta área para
ele, qual seria o seu trabalho para atendê-lo? Descreva todo o procedimento.
Para se obter a exatidão máxima nas leituras, é necessário determinar a faixa útil de trabalho do
espectrofotômetro, que é a faixa que tem maior exatidão de leitura do aparelho e para isso
deve-se conhecer a linearidade da reação, ou seja, quando há proporcionalidade do aumento
da concentração e do aumento da absorbância. Logo, deve-se preparar soluções de
concentrações conhecidas que variam desde muito baixas à muito altas e as de concentrações
que são mais altas não devem ultrapassar a linearidade da reação. Após o preparo das soluções,
faz-se a leitura (dosagem) das amostras pelo método proposto, anotando os seus valores de
transmitância.
Plota-se em um gráfico de Transmitância (%) X Log da concentração e a faixa útil será a reta
entre as duas curvas de extremidade do gráfico. Caso as curvaturas não sejam bem acentuadas,
deve-se realizar nova leitura com padrões mais diluídos e mais concentrados.

O que você considera ao decidir qual diluição fará de uma amostra que ultrapassou a
linearidade da reação?
Quando uma amostra diluída ultrapassa a linearidade da reação, essa amostra não pode ser lida,
pois não está seguindo a Lei de Beer, logo, esta não tem proporcionalidade entre a concentração
e a absorbância e, para concertar isto, é necessário ajustar os valores lidos pelo aparelho para
valores bem próximos ou dentro dos de referência da análise normal. Além disso, deve-se
atentar com a capacidade de instrumentos do laboratório necessários para realizar essa diluição
de forma correta.
Citar e explicar como calcular os resultados de dosagens dos seguintes casos:
a) Determinação colorimétrica em que o padrão é uma substância instável
Quando o padrão é uma substância instável (Ex.: Bilirrubina), deve-se calcular o Fator de
Calibração. Para isso, deve-se preparar uma solução padrão com concentração conhecida e fazer
a leitura de absorbância em um determinado λ. Depois de se obter os resultados da leitura
utiliza-se a fórmula FC=CP/AP para descobrir o Fator de Calibração.

b) Determinação colorimétrica em que o produto corado segue a lei de Beer e o padrão é

estável.
Se o produto segue a Lei de Beer, quer dizer que a relação de absorbância e concentração é
diretamente proporcional, então usa-se um padrão de concentração conhecida (de soluções
diluídas e concentradas), faz-se a leitura das absorbâncias e depois esses dados são utilizados
para conhecer a concentração do analito no material biológico analisado.

Como você determina a linearidade de uma reação colorimétrica que segue a lei de Beer.
Descreva todo o processo.
Para se determinar a linearidade de uma reação que segue a lei de Beer, deve-se fazer uma
curva utilizando várias soluções de concentrações conhecidas, desde as mais diluídas até as mais
concentradas. Depois da leitura dessas amostras, constrói-se um gráfico de Absorbância (no eixo
Y) X Concentração das soluções (eixo X) e o que vai determinar a linearidade da reação será o
ponto máximo em que a relação Absorbância X Concentração sejam proporcionais (o aumento
de uma também seja o aumento da outra e vice-versa).

Qual das seguintes radiações é mais nociva a saúde: 320nm, 430nm, 680nm? Justifique.
320 nm, pois quanto menor o comprimento de onda, maior é sua intensidade energética e maior
o efeito danoso.

Porque um filtro composto não é considerado um monocromador?

O filtro composto possui no mínimo dois filtros de corte com características de transmitância
opostas, de modo a selecionar a área espectral. Porém a área selecionada abrange uma região
ampla do espectro, não funcionando com monocromador que seleciona o comprimento de onda
específico.

Citar 4 possíveis interferentes que podem fazer com que uma determinação colorimétrica seja
feita em comprimento de onda diferente daquele em que há um máximo de absorção.
Lipemia, hemoglobina, bilirrubina e hemólise.

O que você entente por reação colorimétrica de ponto final? Dê exemplo.

São reações que formam produtos cuja concentração chega a um ponto máximo permanecendo
estável por um certo tempo e depois deste tempo a estabilidade começa a cair, então a leitura
tem que ser feita sempre dentro deste tempo de estabilidade. Exemplos: dosagem química ou
enzimática de colesterol, uréia, glicose etc.
Um composto A junto com um composto B forma um composto C que emite luz. Falar sobre
o processo de padronização para preparo da amostra.
Encontrar o comprimento de onda no qual a substância absorverá melhor a luz emitida com o
mínimo de interferência, em seguida definir a linearidade da reação e a faixa útil de trabalho.
Assim será possível definir até que ponto o aparelho será capaz de mensurar a amostra. Para se
descobrir esse λ, deve-se fazer a seleção da área espectral, que baseia na leitura do branco e do
padrão em diversos λ, gerando um gráfico de A x λ. Sendo assim, será utilizado o λ onde se teve
o máximo de absorbância livre de interferência, obtendo assim um alto grau de sensibilidade.

O que é o Branco e pra que ele serve?

O branco é uma solução que contém os mesmos reagentes da reação, mas sem a substância que
será analisada ou água destilada e este serve para eliminar interferências dos reagentes, perdas
por reflexão e refração e compensar o efeito de lente produzido pelas cubetas redondas.

Fenômenos que podem explicar a atenuação da intensidade de energia radiante quando

atravessa uma solução:
- Reflexão: entre o ar, solução e a parede da cubeta
- Absorção: absorção da energia pela solução
- Refração/Dispersão: causada por partículas presentes na solução

Critérios a serem considerados ao selecionar uma metodologia para dosar um certo analito:
Os critérios a serem considerados são: sensibilidade, especificidade e segurança. Além da
necessidade de bons equipamentos e reagentes.

Qual a faixa de λ da região espectral da luz do visível?

A faixa de λ da região espectral da luz do visível, na bioquímica, é de 400 a 700 nm.

Quais os cuidados que deve ter em relação a leitura feita em λ < 340 nm?
São necessários componentes opticos de quartzo e direcionar altamente sensores capazes de
detectar radiação nessa faixa espectral.
- Não dever usar lâmpada de tungstênio, já que o inóculo de raro absorve toda radiação abaixo
de 320 nm, limitando o uso de lâmpada para o visível e UV. Pode-se usar lâmpada de descarga
de hidrogênio ou de íons, lâmpada de quartzo – iodo.
- Deve usar prisma de quartzo ao invés dos de vidro
- Para o uso em λ abaixo de 340 nm são usadas cubetas de quartzo

Qual o fundamento da dosagem de LDH pelo método UV. Que tipo de reação é essa em relação
ao procedimento?
Nas condições do teste, a LDH catalisa a conversão do piruvato para lactato enquanto o NADH
é oxidado a NAO+. A adversidade catalítica é determinada a partir da velocidade de
desaparecimento do NAOH, em 340 nm. Determina-se o decréscimo da absorbância em 340 nm,
que é proporcional a atividade de LDH na amostra analisada.
Piruvato + NADH + H+ ___LDH___> Lactato + NAD+ é uma reação do tipo produto formado.
Quais fenômenos podem explicar a atenuação da intensidade de energia radiante quando esta
atravessa uma solução?

Quando um raio de energia radiante atravessa uma solução, a energia incidente (Io) será sempre
mais intensa que a energia emergente (I).

Esta atenuação (dissipação da energia) da intensidade de energia pode ser atribuída a:

(1) Reflexões nas interfaces entre o ar e a parede da cubeta e entre a solução e a parede da
cubeta,

(2) dispersão por partículas presentes na solução

(3) absorção da energia pela solução

Nas aplicações da fotometria, a absorção da energia é o fator primário na redução da energia

incidente.

Quando se usa energia monocromática (comprimento de onda simples), a fração da radiação

absorvida pela solução, ignorando perdas por reflexão e dispersão, será função da concentração
da solução e da espessura da solução.

Matematicamente esta função pode ser definida como:

 T = I / Io = e –abc ou 10 –abc (matemática)

 I= Intensidade de energia emergente

 Io= Intensidade de energia incidente

 e= base dos logaritmos neperianos: 2,303

 a= absortividade constante que depende do 

 b= espessura da solução atravessada pela radiação

c= concentração da solução.

 T = I / Io = e –abc ou 10 –abc

Esta fórmula estabelece que quando a energia radiante monocromática atravessa uma solução,
a quantidade de energia transmitida diminui exponencialmente com:

 (1) aumento da espessura da solução e (Lei de Lambert )

 (2) aumento da concentração ou intensidade de cor da solução (Lei de Beer)

Como você calcula o fator de calibração de uma reação colorimétrica?

Primeiramente deve-se preparar uma solução padrão com concentração conhecida e fazer a
leitura de absorbância em um determinado λ. Depois utiliza-se a fórmula FC=CP/AP para
descobrir o fator de calibração.
Obs: se utiliza o FC em situações que o padrão é instável (Ex.: Bilirrubina)
Quais os objetivos de fazer uma determinação colorimétrica em λ diferente daquele em que
há o máximo de absorção?

Os objetivos de se fazer isso é para se obter linearização, aumento da faixa útil de trabalho ou
para eliminar interferências, como, por exemplo, bilirrubina.

Que tipos de fotometria podem ser usados em dosagens laboratoriais? Explique o que
caracteriza cada uma delas e dê exemplo de um analito que pode ser medido em cada uma
dessas metodologias.

A) Fotometria de absorção pode ser dividida em dois modos:

- Colorimétrica: Avalia a absorção de luz na faixa do visível pelo analito analisado. Ex.:
Glicose
- Não colorimétrica: Avalia a diferença de absorção de energia radiante de um analito na
faixa do UV. Ex.: Lactato Desidrogenase (LDH)
B) Turbidimetria: Absorção de energia radiante por uma solução de partículas em suspensão
(soluções turvas). Ex.: Hemoglobina glicada
C) Nefelometria: Mede a quantidade de luz dispersa ou espalhada pelas partículas em
suspensão. Ex.: Imunoglobulinas quantitativas

D) Fotometria de chama ou de emissão: Mede a concentração de determinado produto,

quando é introduzido em uma chama. Ex.: dosagem de sódio

E) Fotometria luminescente: Mede a energia transmitida por uma solução de substância

fluorescente. Ex.: dosagens hormonais

O que você entende por uma reação colorimétrica de ponto final? Dê exemplo.

Uma reação de ponto final é aquela que forma produtos cuja concentração chega a um ponto
máximo e esta permanece estável por um certo tempo. Podem ser ultravioleta ou
colorimétricas. Ex.: dosagem de glicose.

Como é feito o controle de qualidade de um espectrofotômetro usando solução de sulfato de

níquel a 40%. O que é avaliado e como é feita a interpretação dos resultados?

O controle de qualidade serve para detectar se há alterações no desempenho do aparelho. Esse

controle deve ser feito quando o aparelho é novo. Para realizar o controle de qualidade com
solução de sulfato de níquel deve-se preparar um padrão (contendo 40g de NiSO4 + 75 mL de
água destilada + 1 mL de ácido clorídrico) e o branco (ácido clorídrico 1%). Depois disso, deve-
se realizar a leitura com o padrão nos λ = 400, 460, 510, 550e 700 nm, respectivamente, não
esquecendo de zerar com o branco (100% T).
Neste controle de qualidade são avaliados:
- A Energia parasita: que é avaliada com base nos λ de 400 e 700 nm (extremos). Interpretação
dos resultados: Quando há diminuição de 3% ou mais na absorbância é porque há algum
problema (monocromador/sistema óptico/energia externa).
- A Faixa de emissão: que é avaliada com base na absorbância no λ = 510 nm (menor
absorbância). Interpretação dos resultados: Quando há um aumento de 3% ou mais na
absorbância, há um aumento da faixa de emissão (problema na fenda de saída).
- A Calibração do comprimento de onda: que é avaliada com base na absorbância relacionada
com o λ = 460 e 550 nm. Interpretação dos resultados: Quando há uma diminuição de 2% ou
aumento da outra é porque há necessidade de correção (calibrar com filtro de hólmio e dídimo).
 CÁLCULO:

 50 mL de uma solução estoque tem 75 mg de substância “S”. Um padrão de uso de X

mg/dl foi preparado juntando 1,0 mL da solução estoque a 9,0 mL da água destilada.
Este padrão de uso foi usado na colorimetria e após a reação colorimétrica forneceu
leitura de absorbância em 505 nm: A= 0,244 e o material biológico diluído a 1/20
forneceu leitura A= 0,061. Pede-se:

a) A concentração de “S” no padrão de uso (X mg/dl)?

75 mg ____ 50 mL

X ____ 100 mL

X= 150 mg/dl x 1/10 (diluição) = 15 mg/dl

b) A concentração de “S” no material biológico ?

Cp ___ Ap 15 ___ 0,244

Ct ___ At Ct x 1/20___ 0,061

Ct = Cp/Ap x At

Ct = 15/0,244 x 0, 061 x 20 (diluição) → Ct = 75 mg/dl

c) Se o material fosse urina, qual a excreção urinária de “S” em 24h, sabendo-se que o
volume de 24h é de 1.350 mL?

75 mg ___ 100 mL

X ___ 1.350 mL

X= 1.012 mg/24h