REVISIÓN

publicado: 04 Mayo el año 2016

doi: 10.3389 / fchem.2016.00018

Modi fi ed de nucleósidos trifosfato para In-vitro Técnicas

de selección
mineral de fi María A. Della 1, Javier M. Montserrat 1, 2 y Adolfo M. Iribarren 1, 3 *

1 Laboratorio de Química de Ácidos nucléicos, INGEBI (CONICET), Ciudad Autónoma de Buenos Aires, Argentina, 2 Instituto de Ciencias, Universidad Nacional de General

Sarmiento, Los Polvorines, Argentina, 3 Laboratorio de Biotransformaciones, Universidad Nacional de Quilmes, Bernal, Argentina

El desarrollo de SELEX ( Enhancement selectiva de Ligandos por Enriquecimiento Exponencial) proporciona una
herramienta potente para la búsqueda de oligonucleótidos funcionales con la capacidad de unirse a ligandos con alta
nidad af fi y selectividad (aptámeros) y para el descubrimiento de secuencias de ácidos nucleicos con diversas
actividades enzimáticas (ribozimas y ADNzimas). Esta técnica se ha aplicado ampliamente para la selección de
moléculas de ADN o ARN naturales, pero, con el fin de mejorar la diversidad estructural química y así como para
aplicaciones particulares en las que es necesario seguir estabilidad química o biológica, la extensión de esta
estrategia para modi oligonucleótidos ed fi es deseable . Teniendo en cuenta estas necesidades, esta revisión tiene
la intención de recopilar las investigaciones llevadas a cabo durante los últimos años, centrándose principalmente en
el uso de modi fi cados en los nucleótidos SELEX y el desarrollo de enzimas mutantes para la ampliación de
trifosfatos de nucleósido aceptación. Adicionalmente,

Editado por:

J. Carlos Penedo,

Universidad de St. Andrews, Reino Unido

Palabras clave: SELEX, modificado nucleótidos ed, oligonucleótidos funcionales, aptámeros, ADNzimas, ribozimas
Revisado por:

Wenshe R. Liu,

Texas A & M University, EE.UU.

Marcel Hollenstein, INTRODUCCIÓN

Instituto Pasteur, Francia

Hoy en día, los ácidos nucleicos no sólo están considerados como informationmessengers genéticos o repositorios. Nuevas
* Correspondencia:

Adolfo M. Iribarren
airibarren@unq.edu.ar
sección de la especialidad:
Este artículo fue sometido a
funciones y aplicaciones de estas moléculas, como la catálisis y el reconocimiento molecular han surgido en los últimos 25 años ( Klussmann
de 2006 ), Impactando campos di ff Erent como: la terapéutica ( Tei et al., 2015 ), El objetivo de la validación ( Rodríguez et al., 2015 ),
Biología Molecular ( Lee et al., 2015 ), diagnóstico ( Wandtke et al., 2015 ), Y la química analítica ( Li y Lu, 2009; Mascini, 2009;
Peinetti et al., 2015 ). El término “oligonucleótido funcional” fue acuñado en referencia a estas nuevas funciones.

Biología Química, una

sección de la revista Frontiers

Aunque algunos ejemplos de estas actividades de oligonucleótidos “no tradicionales” se pueden encontrar en la naturaleza,
en Química
como en el caso de ribozimas, microARN y riboswitches ( Li y Lu, 2009 ), Todo un conjunto de catalítica (ARN: ribozimas, ADN:
Recibido: 16 de de febrero de el año 2016
ADNzimas) y los oligonucleótidos de reconocimiento molecular (aptámeros) han sido preparados sintéticamente, ya que se
Aceptado: 05 de abril de el año 2016
pueden obtener usando in vitro técnicas de evolución molecular. Esta metodología combina un enfoque de química
Publicado: 04 de mayo de el año 2016
combinatoria con una propiedad particular de los ácidos nucleicos: catión amplificador con la ayuda de polimerasas. Este
Citación:
procedimiento se desarrolló simultáneamente en tres laboratorios independientes en 1990 ( Ellington y Szostak, 1990;
Della mineral fi MA, Montserrat JM y
Robertson y Joyce, 1990; Tuerk y Oro, 1990 ) Y fue denominado SELEX ( S ystematic mi volución de la L igands por Ex ponential
Iribarren AM (2016) Modi fi ed de
Enriquecimiento). Desde entonces, muchas variaciones di ff Erent de la técnica se han desarrollado con el fin de lograr una
nucleósidos trifosfato para In-vitro

Técnicas de selección.
mejor selectividad y constantes de unión, y las condiciones experimentales más simples ( Sol y Zu, 2015; Yüce et al., 2015 ).
Frente. Chem. 04:18.

doi: 10.3389 / fchem.2016.00018

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Durante los primeros años de desarrollo de aptámeros pronto se entiende que
esta oligonucleótidos funcionales podrían emular el rendimiento anticuerpos
monoclonales para el diagnóstico ( Jayasena, 1999 ) Y terapéutica ( Schmid-Kubista
et al., 2011 ) aplicaciones. Además, los aptámeros tienen algunas ventajas sobre
los anticuerpos: se pueden sintetizar químicamente sin la ayuda de los animales;
son térmicamente estables y se pueden plegar y desplegar fácilmente. Pero
también tienen una desventaja importante (como enzimas de ADN y ribozimas);
tienen vidas cortas en fluidos biológicos debido a la presencia ubicua de las
actividades de endo y exonucleasa. La estrategia para superar esta limitación era
el mismo que se empleó en el desarrollo de oligonucleótidos antisentido ( Iannitti et
al., 2014 ): La estructural modi química fi cación. oligonucleótidos funcionales fi
modi podrían ser obtenidos de acuerdo con dos estrategias ff Erent di:
post-selección modificación fi o por medio de modi fi ed-SELEX ( mo- SELEX)
(técnicas Figura 1).
El primer enfoque tiene la ventaja de tratar con la química de
oligonucleótidos natural, sino como consecuencia de la delicada relación
entre estructura y actividad, post-selección modi fi cación sin perder actividad
demostró ser una tarea difícil en ribozimas ( Pontiggia et al., 2010 ),
ADNzimas ( Robaldo et al., 2014 ), o aptámeros ( Bouchard et al., 2010;
Förster et al., 2012 ).
Teniendo en cuenta este inconveniente, los primeros e ff orts se realiza para
modificar el ciclo de SELEX con el fin de introducir nucleótidos fi modi ( Figura 1). El
primer informe mo- SELEX se llevó a cabo por el grupo Jayasena ( Lin et al., 1994 )
Que tuvo éxito en
FIGURA 1 | Representación esquemática de las rutas alternativas para obtener oligonucleótidos funcionales modi fi ed.
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
la realización de una in vitro selección de un aptámero de ARN frente a la elastasa de
neutrófilos humana (HNE) usando 2 '- nucleótidos aminopirimidina. El aptámero
resultante tenía un K re de (6 ± 3) nM y una vida media en el suero de (9,3 ± 1.8) h,
mejorando en gran medida la vida media de la secuencia de control ed fi no modificada
(4 min). modi fi caciones en el 2 '- posición del resto de ribosa y enlace internucleotídico
de fosfato se introduce usualmente en la estructura de oligonucleótido para mejorar la
estabilidad química y biológica ( Figura 1).
Además de la estabilidad, otra cuestión importante que impulsa el modi
química fi cación de oligonucleótidos funcional es el aumento de la diversidad
estructural. En este sentido, uno de los primeros ejemplos fue la obtención de un
aptámero de ADN anti-trombina usando desoxiuridina 5-pentinilo por grupo Toole ( Latham
et al., 1994 ). Aunque la ed aptámero modificado mostró una constante de unión
más débil contra la trombina en comparación con el aptámero natural obtenido por
el mismo grupo ( Bock et al., 1992 ), Demostraron que las estructuras químicas de
la modi fi ed y los aptámeros naturales eran Erent di ff.
Hay que notar que mo- SELEX y técnicas de post-selección de las estrategias
no son excluyentes como se puede aprender de aptámero anti-VEGF 165
comercial. grupo Janjic preparó un 2 '- F- pirimidina modi fi ed aptámero
anti-VEGF165 utilizando un enfoque mod-SELEX ( Ruckman et al., 1998 ) Y
después de la selección de la mejor secuencia, 2 '- OME nucleótidos ribopurine se
introdujeron en algunas posiciones sin perder capacidad de unión [K d = ( 49-130)
pM]. Esto en gran medida modi fi cada aptámero se convirtió últimamente el
primer ejemplo de un agente terapéutico
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aptámero aprobado por la FDA contra la enfermedad vascular ocular, pegaptanib ( Ng et
al., 2006 ). En una variante de la mo- estrategia de SELEX Mayer y colegas ( Toole et al.,
2015 ) Obtenido un aptámero modificado ed contra ciclo 3 GFP (Kd = 18.4 nM) utilizando
5-etinil-2 '- trifosfato de desoxiuridina que fue transformado adicionalmente después de la
polimerasa ampli fi cación usando química de clic. Una estrategia similar, denominado
SELMA (Selección con modificados con aptámeros), se utilizó para generar edad ff sca
ADN que contienen restos de desoxiuridina etinil que fueron glicosiladas empleando
azidas de glicano ( Horiya et al., 2014 ). Después de la selección de los clusterings más
antigénicas del glicano, las secuencias consolidados eran ampli ed fi y reglycosylated
para ser utilizado en la siguiente etapa de selección.
En las siguientes secciones del enfoque se ajustará en los nucleósidos
Erent modi fi cada trifosfato di ff utilizados en in vitro
técnicas de selección, pero también se debe notar que las fosforamiditas modi fi ED ( Figura
de oligonucleótidos en fase sólida, las razones que podrían explicar en parte la
1) también son esenciales a fin de preparar químicamente cantidades más grandes de
los oligonucleótidos funcionales modi fi ed.
Aunque las revisiones completas y recientes sobre los temas Erent di ff tratadas en
este trabajo están disponibles ( Diafa y Hollenstein, 2015; Lapa et al., 2016 ), El principal
propósito de este informe es conectar todos ellos teniendo en cuenta la aplicación de
los nucleótidos modificados con el fin in vitro técnicas de selección, centrándose en
ejemplos relacionados recientes.
Los nucleótidos modificados PARA SELEX
El diseño de útil modi fi nucleótidos ed apropiado para mo-
SELEX tiene algunas restricciones que se pueden resumir en cuatro condiciones ( Perrin et al., 2015 ) Desarrollado recientemente un aptámero fi ed totalmente modi contra Staphylococcus
et al., 1999 ):
1. no debe perturbar las interacciones de pares de bases (Watson-Crick y Hoogsteen);
2. Debe ser sustratos de las correspondientes polimerasas de ADN o ARN;
3. la introducción del nucleótido modificado ed debe ser e fi ciente en cualquier posición
de la secuencia;
4. la secuencia ed fi modi debe ser una plantilla para las polimerasas
correspondientes.
Además de las excelentes críticas disponibles en este campo ( Ke ff ey Cload, 2008;
Hollenstein, 2012a; Kong y Bym, 2013 ) Tenemos la intención de esta sección para resumir los
principales cationes modificadores de nucleótidos química que se han utilizado para in vitro la
selección molecular, prestando especial atención a los casos no previstos anteriormente.
En cuanto a los nucleótidos modi fi cados que se han utilizado en SELEX, la mayoría de
los ejemplos están relacionados con modificaciones estructurales de derivados de pirimidina
en las posiciones ff Erent tres di: la α-
fosfato, el 2 '- y C5-posiciones ( Figura 2). Como consecuencia de la extraordinaria
sensibilidad a la degradación de las bibliotecas de oligonucleótidos de ARN,
los primeros mo- ejemplos de SELEX
fueron motivadas por la mejora de la estabilidad de oligonucleótidos contra RNasas,
por sustitución de la de 2 '- hidroxilo de la ribosa por otras funcionalidades. Como se
mencionó anteriormente, los primeros ejemplo informó fue desarrollado por el grupo
Jayasena ( Lin et al., 1994 ) Que utiliza 2 '- aminouridina y 2 '- trifosfatos aminocytidine ( 3,nucleasa es la α- fosfato de trifosfatos de nucleósidos. Ellington y compañeros de
Figura 2) para obtener una modi fi ARN ed aptámero contra Human elastasa de
neutrófilos (HNE). Cuando se incubó en humanos
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
suero y orina humana, el HNE modi fi ed aptámero mostraron una estabilidad mejorada
en comparación con la secuencia de fi ed no modificada. Aunque la 2 '- aminopirimidina
modi fi cación también se utilizó para obtener un aptámero modificado ed contra el
factor de permeabilidad vascular (VPF), el factor de crecimiento endotelial vascular
(VEGF;
Green et al., 1995 ) Y el factor de crecimiento básico broblastos fi ( Jellinek et al., 1995 ),
Ya no se utilizó este Modificación, probablemente debido a las di di FFI en la
preparación trifosfato y la desestabilización e ff ect de los grupos 2-amino en dúplex de
ARN. Se observó que cuando el 2 '- amino modi fi cación se comparó con el 2 '- análogos
de fluoro ( 4, Figura 2) para el mismo objetivo, como en el caso del aptámero contra
factores de crecimiento de queratinocitos ( Pagratis et al., 1997 ), Ambas modificaciones
tienen resistencia nucleasa similar pero fluoro análogos mejor tener un FFI nidades (dos
órdenes). Como característica adicional, en comparación con grupos de amina, 2 '- fluor
modi fi cación no requiere medidas de protección-desprotección a lo largo de la síntesis
popularidad de esta modi fi cación ( Dupont et al., 2010; Svobodova et al., 2013 ). Modi fi
ed 2 '- O- (methylnucleotides 5, la Figura 2) También se han utilizado para obtener un
aptámero contra VEGF ( Burmeister et al., 2005 ). Keefe y compañeros de trabajo identi
condiciones de reacción fi ed que permitieron la incorporación de cantidades
significativas de 2 '- OME
trifosfato de desoxiguanosina en transcripciones en presencia de trifosfato de ribosil.
posiciones de guanosina deben ser fi nalmente comprobado para confirmar la presencia de
natural o modificados con el nucleótido. El obtenido 23 nucleótidos de longitud aptámero
(ARC245), mostró un K re de 2 nM y una estructura ed fi completamente modi que evita la
degradación durante al menos 96 h en plasma. En el mismo sentido, el grupo Li ( Friedman
aureus La proteína A (spa) usando 2 '-
F- desoxiguanosina, 2 '- OME adenosina, citidina, uridina y, una biblioteca de ARN y un
mutante (LAR) RNA polimerasa de T7 que eludan el anteriormente mencionado
inconveniente de la utilización de pequeñas cantidades de ribonucleótidos naturales.
Un campo prometedor es la obtención aptámero la utilización de nucleótidos con
grupos de azúcar fi ed totalmente caciones. Chaput y sus colegas ( Yu et al., 2012 )
Tenido éxito en la preparación de un aptámero treosa ácido nucleico (TNA) contra la
trombina humana (Kd = 0,2-0,9
μ M) con la ayuda de una variante modificada de 9 ◦ ADN N polimerasa.
Holliger y sus colegas ( Taylor y Holliger, 2015; Taylor et al., 2015 ) Informaron
de la preparación de cuatro XNAzymes (catalizador a partir de polímeros
sintéticos, genéticos XNA) sobre la base de cuatro di esqueletos de azúcar ff
Erent: arabino Nucleic Acids (ANA), 2 '- Fluoroarabino Nucleic Acids (FANA), de
hexitol Nucleic Acids (HNA) y ciclohexeno Nucleic Acids (Cena). polimerasas
mutantes D4K para ANA y FANA, 6G12 para Cena, y 6G12 I512L para HNA se
emplearon para la preparación de las bibliotecas de XNA. En estas condiciones
ARN endonucleasa (ANA, FANA, HNA, Cena), se obtuvieron RNA actividades
XNA ligasa (FANA) ligasa y.
Otra posición que ha sido modi fi con el objetivo de aumentar la resistencia a la
trabajo ( Jhaveri et al., 1998 ) Obtuvieron un factor de crecimiento fi broblastos contra
básico (bFGF) aptámero de ARN en la que todos los enlaces internucleotídicos eran
modi fi
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Della fi mineral et al. Nucleósido trifosfato de técnicas de selección

FIGURA 2 | Modi fi ed trifosfatos de nucleósidos utilizados en los experimentos de SELEX. referencias: 1: ( Jhaveri et al., 1998; Somasunderam et al., 2010; Higashimoto et al., 2013 ); 2: ( Lato et al., 2002 ); 3: ( Lin et al., 1994; Green
et al., 1995; Jellinek et al., 1995 ); 4: ( Svobodova et al, 2013.; Dupont et al., 2010 ); 5: ( Burmeister et al., 2005 ); 6: ( Pagratis et al., 1997 ); 7: ( Friedman et al., 2015 ); 8: ( Latham et al., 1994 ); 9: ( Li et al., 2008 ); 10: ( Vaught et al., 2010;
Ochsner et al., 2013, 2014 ); 11:
( Tarasow et al., 1997 ); 12: ( Battersby et al., 1999 ); 13: ( Vaish et al., 2003 ); 14: ( Masud et al., 2004; Shoji et al., 2007 ); 15: ( Santoro et al., 2000; Sidorov et al., 2004 );
dieciséis: ( Wiegand et al., 1997 ); 17: ( Hollenstein et al., 2009 ); 18: ( Imaizumi et al., 2013 ); 19: ver 9; 20: ( Hollenstein et al., 2009 ); 21: ( Sidorov et al., 2004 ); 22: ( Hollenstein et al., 2009 ); 23: ( Liu et al., 2010 ); 24: ( Kasahara et al., 2013 );
25: ( Minikawa et al., 2008 ).

con fosforotioatos ( 1, Figura 2). Aunque el rendimiento de ARN fosfotiolados
siguiente in vitro la transcripción y la purificación fue baja, era suficiente para los
experimentos de selección y se seleccionó una secuencia de consenso de 13
nucleótidos con una Kd de 1,8 nM para bFGF. Utilizando la misma modificación fi
Gorenstein y compañeros de trabajo ( Somasunderam et al., 2010 ) Obtuvieron una fi
ed aptámero de ADN tiofosfato modi contra el dominio de unión de ácido hialurónico
(HABD). En este caso, todos los residuos de desoxiadenosina (con la excepción de
los cebadores) fueron sustituidos por tiofosfatos desoxiadenosina en el S p con fi
guración. Más recientemente, Yamagishi y compañeros de trabajo ( Higashimoto et
al., 2013 ) Aptámeros fi ed fosforotioato-modi seleccionados dirigidos contra
productos finales de glicación avanzada (AGEs-thioaptamers) utilizando una mezcla
de 2 '- desoxiadenosina-5 '- O- ( 1-tiotrifosfato) (dATP ( α S)),
2 '- desoxitimidina-5 '- O- ( 1-tiotrifosfato)
[DTTP ( α S)] y una mezcla de desoxicitidina y desoxiguanosina trifosfato. Los
aptámeros obtenidos tenían K re en el intervalo nanomolar bajo. Otra posible
modificación fi en el α-
resto fosfato de los nucleótidos es la sustitución de oxígeno por un grupo
borohidruro (boranofosfato, 2, Figura 2).
Burke y colaboradores ( Lato et al., 2002 ) Explorado el uso de uridina (Bu) o
guanosina (BG) 5 '- ( α- P-borano) en un proceso SELEX contra ATP. Incluso si bU y BG
son compatibles con el proceso de selección, cuando se introdujeron en las
estructuras de aptámeros naturales generalmente disminuido o eliminado
reconocimiento de la diana.
Aunque la 2 '- posición y la α- fosfato cationes modificadores de nucleótidos
persiguen principalmente el aumento de la estabilidad de los oligonucleótidos, otro
aspecto importante de SELEX es la expansión de la diversidad química de la fracción
de nucleótidos. Se razonó que un conjunto de grupos funcionales complementarios,
que originalmente no disponibles en las estructuras de nucleótidos, mejorará las
posibilidades de reconocimiento molecular o fenómeno catalítico. En este sentido, la
posición 5 de pirimidina, particularmente uridina y desoxiuridina, era la opción más
frecuente modificación fi. Los grupos funcionales presentes en la posición 5-pirimidina
podrían clasificarse en tres grupos principales: hidrófobo, ácido / base y otros
(borónicos). En el primer subconjunto fi podemos fi ejemplos nd tales como compuestos 8,
9, y 10 en Figura 2. Toole y compañeros de trabajo ( Latham et al., 1994 ) Preparado
aptámeros de ADN contra la trombina utilizando 5- (1-pentinilo) -2 '- deoxyurindine ( 8,
Figura 2) con K re en el intervalo de 400-1000 nM. Wang y colaboradores ( Li et al., 2008 )
Introducido estructuras hidrofóbicas ( 9, la Figura 2) en aptámeros contra el fibrinógeno.
De manera sistemática, Eaton y compañeros de trabajo ( Vaught et al., 2010 ) Primera y
Janjic y compañeros de trabajo posteriores ( Ochsner et al., 2014 ), Explorado el uso de
un conjunto de restos hidrófobos conectados a la posición 5 de desoxiuridina por un
grupo amida ( De 10, Figura 2). En la obra de Eaton se realizó una exploración de los
mejores polimerasas que aceptan los nucleótidos modificados con como sustratos,
hallazgo de que la OD XL y D.Vent (exo-) fueron capaces de incorporar los derivados
trifosfato modificado ed desoxiuridina

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Della fi mineral et al.
con rendimientos similares o mejores que con trifosfato de timidina. En este caso los
objetivos seleccionados fueron el transductor asociado a un tumor señal de calcio 2
(TACSTD2) y el receptor del factor de miembro súper familia de necrosis tumoral 9
(TNFRSF9). En el primer caso se utilizaron bencilo e isopropilo restos dando
aptámeros con K re s en el rango nM. En el segundo caso, donde fallaron selecciones de
ADN anteriores, el resto bencilo de un ff orded un aptámero con una K re de 100 nM.
Como se ha comentado previamente, Janjic y compañeros de trabajo también
explorado el uso de modificaciones hidrófobas. En este caso, el objetivo fue desarrollar
métodos para el aislamiento sistemática de los aptámeros que se unen a epítopos di ff
Erent de las proteínas, lo que permite la detección e fi ciente del par de valores múltiples
ligandos ( Ochsner et al, 2014.; Rohlo ff et al., 2014 ). Estos aptámeros, llamado lento o tasa
de FF- aptámeros modificados con (SOMAmer) se prepararon usando un resto bencilo
ligado a la uracilo por un grupo amida y estaban dirigidos contra proteínas humanas como:
ANGPT2, TSP2, CRDL1, MATN2, GPVI, C7, y PLG, algunos de ellos indicadores de
riesgo cardiovascular. Las constantes de disociación de equilibrio fueron de entre 0,02 2,7
nM.
Teniendo en cuenta modificaciones de nucleótidos fi ahora 5-pirimidina con
actividad ácido / base, un grupo funcional por lo general presente en esta posición
es amina (o amonio). Eaton y compañeros de trabajo ( Tarasow et al., 1997 )
Sintetizado una uridina 5-pyridylmethylcarboxamide ( 11, Figura 2) para la obtención
de una ribozima con actividad dielsalderase moderada (formación de enlaces
carbono-carbono Diels Alder). Benner y compañeros de trabajo ( Battersby et al.,
1999 ) Sintetizado 5- (3 '' - aminopropynyl) -2 '- trifosfato de desoxiuridina ( 12, Figura 2) que
selección de edDNAzymes modi fi con actividad hidrolítica amida que era hasta
se utilizó para sustituir nucleótidos de timidina en un proceso SELEX, con la ayuda
de la ADN polimerasa Vent, contra la molécula de ATP como objetivo. Se
examinaron las secuencias de consenso para determinar si coinciden o no la
secuencia original Szostak ( Huizenga y Szostak, 1995 ), Hallazgo signi fi cativo
semejanza con el “motivo LinPatel-Huizenga-Szostak” ( Battersby et al., 1999 ). En
cuanto a la existencia de restos de modi fi cados se encuentran en el ARN de
fuentes biológicas, post-transcripcional modificaciones están implicados en eventos
de reconocimiento catalíticos o moleculares ( Limbach et al., 1994; Timón y Alfonzo,
2014 ). Aunque restos con carga positiva son naturalmente raras, se conocen
algunos ejemplos, como en el caso de archaeosine ( Gregson et al., 1993 ), Un ed
purina modificado que tiene una carga positiva a pH fisiológico. Este hecho inspiró
McLaughlin y colaboradores ( Vaish et al., 2003 ) Que se utiliza 5- () uridina 3
aminopropil ( 13, Figura 2) para obtener un aptámero de ARN contra ATP. La
secuencia resultante tenía un K re de 1.08mM con varios de los uridines modi fi
cados críticos para el reconocimiento de la diana. Siguiendo el mismo concepto,
Sawai y compañeros de trabajo ( Masud et al., 2004 ) Utilizado el 5 '- trifosfato de 5- NORTE-
en la conocida capacidad de boro para coordinar grupos de glicol. Los aptámeros modi
(6-aminohexil) carbamoilmetil-2 '- desoxiuridina ( 14, Figura 2)
para la selección de un aptámero de ADN (K d = 4.9 μ M) contra sialillactosa, un
oligosacárido con un grupo carboxi que parece ser un componente del receptor
esencial de muchos virus animales de familias de Erent di ff, tales como la influenza
A y virus C. Lo mismo modi fi cada pirimidina fue utilizado recientemente por este
grupo de investigación para desarrollar un aptámero contra el ( R) - isómero de la
talidomida ( Shoji et al., 2007 ) Con una K re de 1 μ Se evaluaron M. Otros
sustituyentes que contienen nitrógeno. Barbas y colaboradores ( Santoro et al., 2000 )
obtenido por in vitro
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
evolución una ADNzima con actividad de RNasa que lleva un resto imidazolilo
en la posición 5 de desoxiuridina ( 15, Figura 2). La ADNzima tiene un núcleo
mínimo de doce nucleótidos incluyendo tres nucleótidos imidazol-funcionalizado
y requiere μ concentración M de Zn 2+ y mM de Mg 2+ y Na + por ser activo.
Últimamente, Williams y colaboradores ( Sidorov et al., 2004 ) Utilizado una
combinación de la trifosfato fi ed desoxi uridina 5-imidazolilo-modi ( 15, Figura 2) además
de una modi fi ed 7-deaza-desoxiadenosina trifosfato análogo 7-aminopropynyl ( 12,
Figura 2),
para la selección de una ADNzima con actividad de escisión de ARN independiente
de los requisitos de metales divalentes. Siguiendo con el desarrollo de
oligonucleótidos funcionales modi fi ed con actividad catalítica, Eaton y compañeros
de trabajo ( Wiegand et al., 1997 ) Utilizado 5-imidazolilo análogo trifosfato de uridina ( 16,
Figura 2)
para la preparación de una ribozima con la actividad de formación del enlace amida,
empujando la hipótesis de la expansión de la actividad catalítica de ácido nucleico.
Con el mismo objetivo, Perrin y compañeros de trabajo ( Hollenstein et al., 2009 )
Utilizado una combinación simultánea de 8-histaminyl-desoxiadenosina ( 21, Figura
2), 5-guanidinoallyldeoxyuridine ( 17, Figura 2) y 5-aminoallyl-desoxicitidina ( 20,
Figura 2) trifosfatos en una in vitro la selección de un metal fi ed fuertemente modi 2+ Enzima
de ADN libre con la actividad RNasa. Perseguir un objetivo similar, Williams y
colaboradores ( Sidorov et al., 2004 ) Preparado y utilizado un trifosfato 3-
(aminopropynyl) -7-deazadeoxyadenosine ( 21, Figura 2). En un ejemplo reciente,
Silverman y colegas ( Zhou et al., 2016 ) Mostraron que la introducción de residuos de
proteínas-como (alcohol primario 5-timidina, amina o grupo carboxilo) permitió la
entonces una empresa difícil de alcanzar.
Sugimoto y colaboradores ( Imaizumi et al., 2013 ) preparado
una ( MI)- 5- (2- (N 6- adeninil) etil)) carbamylvinyl) trifosfato de desoxiuridina ( 23,
Figura 2) que se utilizó para obtener una modi fi aptámero de ADN ed contra
camptotecina, un alcaloide de quinolina que inhibe la topoisomerasa I. En este caso,
la ed aptámero modificado mostró una mayor una constante de la no modificada fi ed
captothecin aptámero nidad FFI, que ilustra la hipótesis de que la funcionalización
aptámero adicional puede mejorar el rendimiento de unión.
Volviendo a modi ejemplos de aptámero fi ed, Wang y colaboradores ( Li et al., 2008 )
Preparado un ácido borónico 5-modi trifosfato fi ed timidina ( 19, Figura 2) con el objetivo
de mejorar la unión a las glicoproteínas aptámero (fibrinógeno como modelo), basado
fi cados de ácido borónico seleccionados contra fibrinógeno tenían una K re en el rango
bajo nM, mientras que los aptámeros prepararse con nucleótidos naturales tenido K re s
ca. 5 μ M, confirmando la hipótesis propuesta.
Ito y colaboradores ( Liu et al., 2010 ) Preparado una
fotosensible norte 6- azobencene-adenosina trifosfato
( 23, Figura 2) para la selección de una modi fi ARN ed aptámero contra
hemina con actividad catalítica como la peroxidasa. El objetivo de este
Modificación era el fotocontrol del evento de reconocimiento y, en
consecuencia de la actividad catalítica. La irradiación visible y UV de la modi
obtenido aptámero fi ed controló la cis-trans isomerización azobencene, que
modi fi ed la capacidad catalítica hemina-aptámero como peroxidasa.
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Por último, algunas modificaciones en los restos de ribosa / desoxirribosa
también han sido exploradas. Kuwahara y compañeros de trabajo ( Kasahara et al.,
2013 ) Explorado el uso de 2 '- O, 4 '- DO- ribonucleótidos bicíclicos methylenebridged ( 24,fi cados contra humano VEGF-165 (Kd = 0,62 nM) y el interferón γ ( kd = 0.038 nM)
Figura 2) para la selección de DNA aptámeros contra la trombina humana. Los
aptámeros han sido seleccionados por electroforesis capilar-SELEX (CE-SELEX) y
tenía K re en el intervalo lownM. Matsuda y colaboradores ( Minikawa et al., 2008 )
Usado 4 '- (thioribonucleotides 25, Figura 2) para la selección de un aptámero de ARN
contra humana α- trombina. La optimización de las condiciones de SELEX para el
uso de los cuatro nucleótidos fi modi ( 25, Figura 2) incluido el uso de cantidades
adicionales de ATP y GTP y la asistencia de polimerasas mutantes. La fi altamente
modi 4 '- thioRNA aptámero también era posterior a la selección totalmente modi fi,
que tiene una K re de 29,6 nM.
Todos los ejemplos de nucleótidos modi fi cados descritos hasta ahora se han
utilizado con éxito en SELEX procesa finalmente la obtención de oligonucleótidos
funcionales. Sin embargo, algunos ejemplos de nucleótidos modi fi cados,
aceptadas por las polimerasas mutantes y no se aplica todavía a SELEX, también
se han descrito. Solo por mencionar dos ejemplos, Hollenstein (2012b) ha descrito
un conjunto de 5-modi desoxiuridina fi ed, con restos diseñados para
organocatálisis ( 26, Figura 3). Estos nucleótidos modi fi cados eran sustratos de Ven
(exo-), el ADN Pwo y polimerasas de fragmentos de E. coli Klenow. Más
recientemente, Perrin y compañeros de trabajo ( Liu et al., 2015 ) Informaron de la
preparación de derivados de desoxiuridina trifosfato 5-aminometil ( 27, Figura 3) modi
fi ed principalmente con restos aromáticos. Los autores utilizaron con éxito todos los
trifosfatos fi modi como sustratos de la Vent (exo-) polimerasa.
También se incluirá Amention a L- aptámeros (Spiegelmers). Aunque no se
obtuvieron estrictamente usando modi fi ed trifosfatos de nucleósidos ( Eulberg et
al., 2006 ), El resultado final de esta variante del método SELEX es un Laptamer
fi ed totalmente modi. Esta técnica se ha aplicado cuando fue sintéticamente
disponible el enantiómero del objetivo, como en el caso de péptidos ( Yatime et
al., 2015 ) O estructuras de ARN ( Sczepanski y Joyce, 2013 ).
FIGURA 3 | Modi fi ed trifosfatos de nucleósidos aceptados por polimerasas modi fi cados pero aún no utilizados en los protocolos de SELEX.
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
Otro enfoque interesante es el uso de la expansión alfabeto genético. Hirao y
sus colegas ( Kimoto y col., 2013 ) Han descrito el primer ejemplo de aptámeros modi
usando las cuatro bases de ADN naturales además de un par de bases sintética
adicional en una estrategia alfabeto expandido, nombrando la técnica como
Ampliado-SELEX (ExSELEX; Kimoto y col., 2016 ).
MODIFICADO NUCLEÓSIDOS TRIFOSFATO SÍNTESIS
Cuándo trifosfatos de nucleósidos modificados con (PNT) para in vitro
técnicas de selección son necesarios tienen que ser sintetizados, ya que sólo unos pocos
de ellos están disponibles comercialmente. Por lo tanto, para la caja fuerte de finalización,
un breve resumen de los principales métodos desarrollados para este fin están aquí
incluidos.
El regioselectiva modi fi cación de nucleósidos es un
meta engorroso debido a su estructura polifuncional y en particular un
reflexivo e ff y la metodología general para la síntesis de los PNT es todavía
un reto sin una solución correcta. Además, NTP son moléculas polycharged
e inestables, las características que hacen di FFI culto el trabajo hasta los
procesos asociados con su purificación.
Los protocolos disponibles para la síntesis de los PNT fueron revisados
​extensamente ( Burgess y Cook, 2000; Hollenstein, 2012a; Kore y Srinivasan,
2013 ), Y aquí sólo habrá brevemente mencionado. Uno de los métodos pionero
fue la llevada a cabo por Ludwig ( Ludwig, 1981 ) Basado en el regioselectiva 5 '-
fosforilación diseñado por Yoshikawa ( Yoshikawa et al., 1967 ). Consiste en la
reacción en un solo recipiente de un nucleósido no protegido y oxicloruro de
fósforo usando fosfato de trimetilo como disolvente. El reactivo 5 '- phosphorodichlorate
intermedio se trata adicionalmente con pirofosfato de bis-tributilamonio para
generar un trifosfato cíclico que es fi nalmente hidrolizada a la NTP
correspondiente. Este proceso no es adecuado para los nucleósidos modi fi
cados y además implica di FFI culto purificación
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procesos debido a la presencia de productos secundarios. Una reciente
contribución a esta estrategia ( Korhonen et al., 2015 ) Proponen el uso de tris
{bis (trifenilfosforaniliden) amonio} (PPN) pirofosfato como una alternativa a
las sales de alquilamonio higroscópicos.
Un método alternativo desarrollado por Ludwig y Eckstein ( Ludwig y
Eckstein, 1989 ) Está todavía hoy en día ampliamente aplicado para la
preparación de NTP. También es una ruta olla de uno, sino el nucleósido debe
estar debidamente protegida debido a la falta de regioselectividad del proceso.
Esta ruta consiste en el ataque de phosphorochlorite salicyl a un ord ff la
correspondiente 5 '- derivado de fosfito. La posterior adición de pirofosfato
bistributylammonium produce el fosfito cíclico intermedio clave, que se oxida a
continuación, en el lugar para dar el resultante NTP. Aunque las funciones
nucleosídicos interferentes necesitan ser protegidos, los protocolos de
purificación son más simples ya que la presencia de otras especies polycharged
se minimiza.
Otra estrategia, diseñado por Caton-Williams et al. ( CatonWilliams et al.,
2011a, b, 2013 ), También hace uso del reactivo fosforocloridita salicyl, sino a
través de y ruta alterada. En este esquema de síntesis del agente de
fosfitilación se primera trató con pirofosfato en DMF para generar el reactivo
de fosfitilación real que regioselectiva reacciona con el 5 '-
hidroxilo de un nucleósido no protegido para producir un intermedio cíclico similar a
la formada en la estrategia de Ludwig-Eckstein. Por último, la NTP correspondiente
se obtiene por oxidación con yodo tradicional e hidrólisis. Después de realizar una
simple precipitación con etanol, el producto crudo se puede utilizar directamente
como sustrato polimerasas.
Muchos otros enfoques di ff Erent han sido explorados en la búsqueda de
una ruta ciente y e fi universales para la preparación de los PNT, algunos de
ellos emplean fosfitos, fosforamiditas de nucleósido difosfato, o
desplazamiento de 5 '- O-
Los grupos salientes por trifosfato. Una revisión completa de estos métodos
ya ha sido revisado ( Burgess y Cook, 2000; Kore y Srinivasan, 2013 ).
Los enfoques favorables al medio ambiente o FF Ered por biocatálisis y
biotransformaciones dan una alternativa intestering a la preparación química de los
PNT ya que proporcionan reacciones regioselectivas utilizando condiciones suaves ( Sta
ff una de 2005 ). Este proceso implica tres pasos siendo la primera una catalizada por
especí fi quinasas c nucleósidos. Por lo tanto, los procedimientos enzimáticos
alternativos para la preparación de monofosfatos de nucleósidos son relevantes y se
han revisado recientemente ( Iglesias et al., 2015 ). En cuanto a enfoques químicos, las
síntesis biocatalizada no proporcionan un método ciente FFI general y e para la
preparación de NTP y la ruta apropiada para cada caso ha de ser explorado
específicamente.
POLIMERASAS PARA nucleótidos
modificados
El número creciente de análogos de nucleótidos usados ​para el desarrollo de
oligonucleótidos funcionales exige el acceso a polimerasas con un repertorio
sustrato expandido. Con los años polimerasas naturales han sido probados por
su capacidad de aceptar los nucleótidos no naturales y muchas evolución
dirigida
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
los experimentos se han llevado a cabo para lograr siendo estas obras adecuadamente
revisados ​en varios documentos de este objetivo ( Henry y Romesberg, 2005;
Lauridsen et al, 2012.; Walsh y Beuning, 2012; Chen y Romesberg, 2014; Laos et al.,
2014 ). Un resumen de las polimerasas evolucionó a aceptar nucleótidos modi fi cados
pueden verse en Tabla 1.
POLIMERASAS para los nucleótidos TENIENDO
SUGAR MODIFICACIONES
En la década de 1990 Aurup et al. demostró que el tipo salvaje de ARN polimerasa de
T7 puede aceptar 2 '- fluoro-CTP, 2 '- fluoro-ATP, 2 '- fl uoroUTP, y 2 '- amino-UTP como
sustratos en reacciones de transcripción. Los resultados mostraron que las plantillas
cortos podrían ser transcritos a productos de ARN de longitud completa en presencia de
estos nucleótidos modificados con el, aunque se observó mayor un nidad FFI para los
análogos 2'amino ( Aurup et al., 1992 ). También se encontró que esta enzima para ser
capaz de sintetizar ácidos nucleicos quimeric compuestas de ribo y
desoxirribonucleótidos y de la incorporación de 2 '- O-
methylnucleotides en varias posiciones ( Conrad et al., 1995 ). Desde entonces,
muchos experimentos de evolución dirigida se han realizado para mejorar RNA T7
repertorio sustrato polimerasa y procesividad. Diseño racional condujo a una ARN
polimerasa de T7 que lleva la mutación Y639F, que era capaz de sintetizar
transcritos con 2 '- fluoro, 2 '- amino, 2 '- O- methylpyrimidines y 2 '- desoxi-2 '- tio-CTP
más e fi cientemente que el tipo salvaje ( Raines y Gottlieb, 1998; Padilla y Sousa,
1999 ). Un mutante doble (Y639F: H784A) se informó más tarde que mostró una
mejor utilización de 2 '- O- metilo y 2 '- pirimidinas azido como sustratos ( Padilla y
Sousa, 2002 ). Utilizando el método de selección autogene se reportaron muchas
otras variantes con una mejor utilización de los 2 '- PNT sustituidas ( Chelliserrykattil
y Ellington, 2004 ). Curiosamente, las mutaciones previamente demostrado para
aumentar la tolerancia térmica de ARN polimerasa de T7 también puede aumentar
la actividad de mutantes con rango sustrato expandido ( Meyer et al., 2015 ). RNA
polimerasa de T7 también se ensayó por su capacidad para aceptar 2 '- DO- PNT
ramificada. enzima de tipo salvaje fue capaz de realizar la reacción con 2 '- α- hidroximetil-UTP
mientras que el mutante Y639F no pudo utilizar cualquiera de los sustratos ( Pavey
et al., 2004 ). En otro trabajo, la enzima de tipo salvaje fue capaz de sintetizar 4 '- thioRNA
usando 4 '- thioUTP y 4 '- thioCTP ( Kato et al., 2005 ). En cuanto a las enzimas
accesibles,
vale la pena mencionarlo
que muchas polimerasas de ADN disponibles comercialmente, tales como
SequiTherm, Tht, AmpliTaq FS (exo-), Pfu (exo-), de Vent (exo-) y Deep Vent (exo-),
así como las polimerasas de ADN humano
α y γ, eran cualificada para aceptar 2 '- FL PNT fi ed fluoro-caciones ( Ono et al., 1997;
Richardson et al., 2000 ). Orts ff evolución dirigida E también se han centrado en la
ADN polimerasa Taq ampliamente utilizado para mejorar 2 '- modi nucleótidos fi ed
reconocimiento. Varias variantes de esta enzima se han identificado fi para
incorporar ribonucleótidos más e fi cientemente que el tipo salvaje ( Suzuki et al.,
1996; Patel y Loeb, 2000; Ogawa et al., 2001; Patel et al., 2001 ), Mientras que Taq
DNAP AA40 fue capaz de incorporar ribonucleótidos así como 2 '- azido y 2 '- PNT
(fluor Ong et al., 2006 ). Sto ff el fragmento (Sf) de ADN polimerasa, un fragmento
proteolítico de la ADN polimerasa Taq, se sometió también
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Della fi mineral et al. Nucleósido trifosfato de técnicas de selección

TABLA 1 | Las polimerasas evolucionaron para aceptar nucleótidos fi modi.

polimerasa Las mutaciones Actividad referencias

T7 RNAP (RGFH) (Y639F) Incorpora con 2 '- F, 2 '- amino, 2 '- pirimidinas OMe, 2 '- desoxi-2 '- CTP tio 1; 2

T7 RNAP (RGFA) (Y639F: H784A) Sintetiza transcripciones que contienen 2 '- pirimidinas OMe, 2 '- azidoU o 2 '- azidoC 3; 4; 5

T7 RNAP (VRS) (G542V: H784S: H772R) incorpora 2 '- F-pirimidinas 5

T7 RNAP (RGVG, E593G, V685A) (Y639V: H784G: E593G: V685A) incorpora 2 '- pirimidinas OMe 5

T7 RNAP (RGLH, A255T) (Y639L: A255T) incorpora 2 '- pirimidinas F, 2 '- pirimidinas OMe 5

Taq DNAP (I614K) Incorpora rNTPs más e fi ciente que el tipo salvaje 6; 7

Taq DNAP (I614N: L616I) Incorpora rNTPs más e fi ciente que el tipo salvaje 6; 7

Taq DNAP (A661E) Incorpora rGTPs más e fi ciente que el tipo salvaje 8; 9

Taq DNAP AA40 (E602V: A608V: I614M: E615G) RNAP y la actividad RT. Incorpora rNTP, 2 '- azido-2 y NTP '- F-NTP 10

Sf DNAP R1 (K531E: A597T: A600T: W604G: A608S: L609V: Incorpora rNTPs más e fi ciente que el tipo salvaje 11
I614T: E615G)

Sf DNAP R2 (A597T: E615G) Incorpora sustratos rNTP más e fi ciente que el tipo salvaje 11

Sf DNAP R3 (A597T: W604R: L605Q: I614T: E615G) Incorpora sustratos rNTP más e fi ciente que el tipo salvaje 11

Sf DNAP M19 (I614E: E615G) incorpora 2 '- O-methylNTP, rNTP, 2 '- amino-NTP, 2 '- azido-NTP, 2 '- F-NTP 12; 13

KF DNAP (I709F) Incorpora rNTPs más e fi ciente que el tipo salvaje 14

TgoT DNAP C7 (TgoT: E654Q: E658Q: K659Q: V661A: E664Q: La replicación de ADN de CeNA y LNA 15
Q665P: D669A: K671Q: T676K: R709K)

TgoT DNAP D4K (TgoT: L403P: P657T: E658Q: K659H: Y663H: La replicación de ADN utilizando ANA, o FANA 15
E664K: D669A: K671N: T676I)

TgoT DNAP 6G12 (TgoT: V589A: E609K: I610M: K659Q: E664Q: La replicación de ADN utilizando HNA 15
Q665P: R668K: D669Q: K671H: K674R: T676R:
A681S: L704P: E730G)

TgoT DNAP RT521 (TgoT: E429G: I521L: K726R) actividad de RT para los oligonucleótidos que contienen HNA, ANA, y FANA 15

TgoT DNAP RT521K (RT521: A385V: F445L: E664K) actividad de RT para los oligonucleótidos que contienen el CeNA y LNA 15

Taq DNAP M1 (G84A: D144G: K314R: E520G: F598L: A608V: Replica plantillas que contienen sitios abásicos, cis-syn ciclobutano dímero de pirimidina, o dieciséis

E742G) 5-nitroindol. Incorpora 7-deaza-dGTP, Rodamina-5-dUTP, biotina-16-dUTP,

fluoresceína-12-dATP.

Taq DNAP (M444V: P527A: D551E: E832V) Acepta nucleótidos con patrones de enlaces de hidrógeno no estándar 17

Taq DNAP (N580S: L628V: E832V) Acepta nucleótidos con patrones de enlaces de hidrógeno no estándar 17

Tth y Taq DNAP quimera 5D4 (V62I: Y78H: T88S: P114Q: P264S: E303V: G389V: Formas y se extiende d5NI y d5NIC auto-pares y heteropairs con las cuatro bases. 18
E424G: E432G: E602G: A608V: I614M: M761T: Extiende pares de HBA como Pyrene: sitio abásico, d5NI: sitio abásico, y ICS: 7AI
M775T)

Sf DNAP P2 (F598I: I614F: Q489H) Formas y se extiende de emparejamiento de ADN cojinete ICS base. 19

Pfu DNAP E10 (Pfu (exo -): V93Q: V337I: E399D: N400D: Acepta Cy3-dCTP y Cy5-dCTP como sustratos. 20
R407I: Y546H)

Taq DNAP M1 (G84A: D144G: K314R: E520G: F598L: A608V: Acepta fosforotioatos. Alllows una sustitución plena de dNTPs con α S dNTPs. dieciséis

E742G)

pfu DNAP Q484R + dividida incorpora γ- derivados DABCYL fosfato-O-enlazador. 21

DNAP, DNA polimerasa; RNAP, la ARN polimerasa; NTP, trifosfato de nucleósido; Cena, ciclohexenilo de ácido nucleico; LNA, ácido nucleico bloqueado; ANA, arabino ácido nucleico; FANA, 2 '- Farabino de ácido nucleico; HNA, ácido
nucleico de 1,5-anhidrohexitol; d5NI, 5-nitroindol; d5NIC, 5-nitroindol-3-carboxamida; ICS, isocarbostyril; 7AI, 7-azaindol. Refrences: 1 ( Padilla y Sousa, 1999 ); 2 ( Raines y Gottlieb, 1998 ); 3 ( Padilla y Sousa, 2002 ); 4 ( Burmeister et al.,
2006 ); 5 ( Chelliserrykattil y Ellington, 2004 ); 6 ( Patel y Loeb, 2000 ); 7 ( Patel et al., 2001 ); 8 ( Suzuki et al., 1996 ); 9 ( Ogawa et al., 2001 ); 10 ( Ong et al., 2006 ); 11 ( Xia et al., 2002 ); 12 ( Fa et al., 2004 ); 13 ( Schultz et al., 2015 ); 14 ( Shinkai et
al., 2001 ); 15 ( Pinheiro et al., 2012 ); dieciséis ( Ghadessy et al., 2004 ); 17 ( Laos et al., 2013 ); 18 ( Loakes et al., 2009 ); 19 ( Leconte et al., 2005 ); 20 ( Ramsay et al., 2010 ); 21 ( Hansen et al., 2011 ).

a evolución dirigida la obtención de las variantes Sf R1, R2 y Sf Sf R3 con un y también identi fi có Sf M19 como el mejor candidato para más de ingeniería
mayor eficiencia e FFI para incorporar ribonucleótidos ( Xia et al., 2002 ), Y Sf M19, ( Schultz et al., 2015 ). El fragmento Klenow (Kf), un fragmento proteolítico de E.
que también podría aceptar 2 '- O- metil NTP, 2 '- amino-NTP, 2 '- azido-2 y NTP '- F- NTPcoli ADN polimerasa I, que lleva una mutación (I709F), presentado mejor
como sustratos ( Fa et al., 2004 ). Un estudio reciente ha mejorado la comprensión incorporación de ribonucleótidos al producto que el tipo salvaje ( Shinkai et
de los orígenes de mutación de 2 '- reconocimiento de sustrato fi ed Modi, al., 2001 ).

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Della fi mineral et al.
Otro interesante hallazgo en relación 2 '- modificadores de nucleótidos fi Ed era la
capacidad de agregar 2 '- análogos de C-metilo en RNAby una hepatitis C RNA
polimerasa del virus. proteína no estructural del virus de la hepatitis C 5B (NS5B del
VHC) aceptó 2 '- , C-metil-ATP y 2 '- C-methylCTP como sustratos mientras NS5B mutante 1 557-amino-2,5-dioxaheptil dCTP, dUTP propinilo, y metil dCTP ( Kuwahara et al.,
incorporados los nucleótidos modificados con más e fi cientemente ( Carroll et al., 2003;
Dutartre et al., 2006 ).
de polimerización utilizando nucleótidos de LNA enzimática se reportaron el uso
de muchas polimerasas Erent di ff. En primer lugar, el grupo de Wengel ( Veedu et al.,
2007 ) Informó que Phusion de alta fidelidad de ADN polimerasa tenía la capacidad de
añadir hasta tres LNATTPs y hasta ocho consecutivo LNA-ATP. Más tarde, los
resultados mostraron que 9 ◦ ADN polimerasa NMTM presentó esta actividad, así, y fue
capaz de leer a través de residuos de LNA en la plantilla. Además, la ARN polimerasa
T7 era capaz de transcripción incorporando LNA-ATP como sustratos y también
transcripciones de ARN de longitud completa se obtuvieron cuando se trataba de
plantillas de LNA y ADN ( Veedu et al., 2008 ). En otro trabajo, se observó que el uso
de concentraciones más altas de KOD Dash, KOD (exo-) y Vent (exo-) ADN
polimerasas condujeron a rendimientos más altos de productos de longitud completa
que llevan cationes LNA modi fi ( Kuwahara et al., 2008 ). Varias ADN polimerasas se
ensayaron para su capacidad de sintetizar 2 '- desoxi-2 '- fl uoro- β- ácidos nucleicos
D-arabino (FANA). Los experimentos revelaron que las polimerasas de la familia B
como Deep Vent (exo-), 9 ◦ Nm, Therminator y Phusion HighFidelity fueron capaces de
incorporar los cuatro análogos de FANA para producir productos de longitud completa
( Peng y Damha de 2007 ). Una investigación posterior, propuso el desarrollo de
polimerasas que podrían sintetizar ácidos nucleicos Xeno (XNA, los ácidos nucleicos
que llevan tipos Erent di ff de azúcares sintéticos) a partir de una plantilla de ADN y
polimerasas que podría revertir transcribir XNA de nuevo en ADN. Usando selección
compartimentada auto-etiquetado (CST) de una biblioteca de ADN TgoT polimerasa,
obtuvieron mutantes TgoT que fueron capaces de replicar el ADN usando ácidos
ciclohexenilo nucleicos (Cena), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), arabino ácidos
nucleicos (ANA), 2 '- ácidos uoroarabinonucleic FL (FANA) y 1,5anhydrohexitol ácidos
nucleicos (HNA) como sustratos. Por mutagénesis de saturación sobre la base de
análisis estadístico de correlación (SCA) y el cribado ELISA-como evolucionaron TgoT
en variantes capaces de transcripción inversa de plantillas que contienen HNA, ANA,
FANA Cena, y LNA ( Pinheiro et al., 2012 ). Recientemente, Holliger y compañeros de
trabajo ( Cozens et al., 2015 )
ingeniería la polimerasa TGLLK (TgoT: Y409G, I521L, F545L, E664K), que resultó
ser e ff reflexivo a sustituir completamente la dNTPs purina y PNT con su
respectiva 3 '- desoxi o 3 '- O- análogos de metilo con de fi ne 2 '- 5 ' vínculos que
permiten la síntesis dirigida por molde y la transcripción inversa de oligonucleótidos
con mezclado 2 '- 5 '/ 3 '- 5 ' enlaces del esqueleto, expandiendo el repertorio para futuro innucleósidos
vitro experimentos de evolución.
POLIMERASAS para los nucleótidos TENIENDO base
nitrogenada MODIFICACIONES
Di ff Erent ADN polimerasas termoestables se ensayaron usando pirimidinas
C5-sustituido como sustratos. Familia A las ADN polimerasas, tales como Taq,
Tht y termosequenasa, fueron capaces
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
para aceptar dUTP propinilo, dUTP, dCTP y metilo mientras que las ADN
polimerasas B de la familia, tales como Pwo, Pfu, Vent (exo-), Deep Vent (exo-),
fueron capaces de incorporar dUTP 7-amino-2,5-dioxaheptilo,
2003 ). Vent (exo-), Pwo y KF ADN polimerasas también fueron capaces de utilizar
los PNT que llevan urea, prolina, y grupos sulfonamida en la posición C5 ( Hollenstein,
2012b ). moléculas de ADN que contienen 5-vinil-dUTP, 5-vinyldCTP, o
7-deaza-7-vinil-dATP se prepararon mediante la incorporación de la polimerasa
usando Pwo, de Vent (exo-), y ADN polimerasas KOD XL ( Mamá
cková et al., 2014 ).
KOD ADN polimerasa Dash se utilizó para realizar SELEX de aptámeros de unión
a ADN sialillactosa compuestas de varias TTPs modi fi cados que llevan un grupo
amino cargado positivamente en la posición C5 ( Masud et al., 2004 ). Más tarde,
también se demostró la capacidad de aceptar con éxito dUTP aminoácidos que tienen
di ff Erent en la posición C5 ( Kuwahara et al., 2006 ). dCTP Útil análogos para el
descubrimiento de aptámero mediante SELEX que lleva una 5-
(N-substitutedcarboxamide) se encontraron grupo funcional para ser sustratos
adecuados de ADN polimerasa KOD ( Rohlo ff et al., 2015 ). evolución dirigida de ADN
Taq polimerasa condujo a más e enzimas fi ciente que podrían anuladas bloquea las
lesiones, tales como un sitio abásico, un dímero de timidina o el análogo de base de
5-nitroindol ( Ghadessy et al., 2004; Loakes et al., 2009 ), Y variantes que podían
aceptar nucleótidos con patrones de enlaces de hidrógeno no estándar, por lo tanto
permitiendo la expansión del alfabeto genético ( Laos et al., 2013 ).
Usando dirigido a corto parche selfreplication compartimentada (spCSR) y la
etiqueta de colorante fluorescente usado ampliamente Cy3-dCTP y Cy5 dCTP
como sustratos, una variante de ADN Pfu polimerasa que era capaz de amplificar
se obtuvieron fragmentos de ADN de doble cadena que incorporan estos análogos ( Ramsay
et al., 2010 ). Estudios recientes ( Wyss et al., 2015 ) Que implica la capacidad de
amplificar aductos de ADN mostraron que un mutante de ADN KlenTaq polimerasa
(KTqM747K), fue capaz de incorporar un nucleótido fi artificial, BenziTP, frente a un
aducto de alquilación de DNA con alta selectividad. De esta manera, los arti fi funciones
de nucleótidos ciales como un marcador para el aducto en la plantilla original de ser útil
para investigar los niveles de daño del ADN.
POLIMERASAS para los nucleótidos TENIENDO
TRIFOSFATO MODIFICACIONES
llevando 5 '- O- ( 1-tiotrifosfato) restos
(NTP ( α S)) son las trifosfato caciones sustratos fi ed más empleadas para las
enzimas naturales y evolucionado utilizados para la selección de aptámeros. Taq
ADN polimerasa se ha utilizado para seleccionar una de una sola hebra aptámero
de ADN dirigido a la factor de crecimiento transformante B1 (TGF-b1) donde
todos los dATPs y dCTPs fueron sustituidos por fosforotioatos ( Kang et al., 2008 ).
En otro estudio, la variante M1 de Taq ADN polimerasa permitió la sustitución
completa de los dNTPs con fosforotioatos ( Ghadessy et al., 2004 ). En cuanto
menos frecuentes, cationes modificadores, se utilizó ARN polimerasa de T7 para
seleccionar
9 Mayo 2016 | Volumen 4 | artículo 18
Della fi mineral et al.
un aptámero de unión a ATP que contiene 5 '- ( α- P-borano) GTP y 5 '- ( α- P-borano)
-UTP ( Lato et al., 2002 ) Y una ADN polimerasa Pfu mutado fue capaz de incorporar
los nucleótidos que llevan un voluminoso
γ- sustituyente fosfato-O-enlazador-DABCYL ( Hansen et al., 2011 ).
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS
La gran número y los tipos de aplicaciones que Modi oligonucleótidos funcionales fi
cados o ff er a di ff Erent campos tales como el diagnóstico, la terapia, la química
analítica, la validación de dianas y la biología molecular, hace de la utilización de modi fi
ed trifosfatos de nucleósidos para in vitro técnicas de selección de un área de
investigación desafiante. Esta estrategia produce una segunda generación de
oligonucleótidos funcionales con mayor resistencia a las nucleasas y una mayor
diversidad estructural y química que permiten la selección de moléculas con propiedades
diferenciales di ff respecto al ADN o ARN oligómeros naturales, tales como la mejora de
las actividades de unión o catalíticas. Además, otros beneficios tales como una mejor
absorción de en vivo Se espera que las aplicaciones.
Todavía se necesitan muchas contribuciones y nuevos desarrollos
principalmente de dos disciplinas: biología molecular y la química orgánica. El
primero uno debe generar un repertorio más amplio de polimerasas evolucionados
capaces de reconocer fielmente un espectro más amplio de modi fi ed trifosfatos de
nucleósidos. Por otro lado, aunque la química ya a disposición una gran cantidad
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Nucleósido trifosfato de técnicas de selección
caciones nucleósidos fi cados, que todavía tiene que proporcionar una ruta general y
E sintética fi ciente tomodi fi ed trifosfatos de nucleósidos y proponer mejoras de los
protocolos de purificación complejos actuales.
La investigación llevada a cabo en estas áreas, y que se resumen en esta revisión,
indica que en un futuro próximo estas cuestiones se pueden abordar con éxito la
ampliación del alcance de los oligonucleótidos funcionales herramientas de medida
como útiles para en vivo y in vitro aplicaciones.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
JM contribuyó principalmente para escribir los nucleótidos modi fi cados para las
secciones de SELEX y la introducción. MD contribuido principalmente para revisar las
polimerasas para la sección modi fi nucleótidos ed. AI contribuyó principalmente para
escribir themodi fi síntesis de trifosfato de nucleósido ed y Conclusiones y perspectivas
secciones y revisado todo el papel.
FONDOS
JM y AI son miembros investigadores de CONICET y MD tiene una beca de doctorado
fromCONICET. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por el PICT 2011-2007.
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El conflicto de intereses declaración: Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia
de cualquier relación comerciales o financieras que puedan interpretarse como un potencial conflicto de
intereses.
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13 Mayo 2016 | Volumen 4 | artículo 18