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TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
Lara Vázquez José Ángel, Elías Fernández Guillermo, Ordóñez Salanueva César

INTRODUCCIÓN

L
a necesidad de separar un compuesto de otro surgió muy temprano en la historia de la
humanidad como producto de un quehacer cotidiano. Al principio esta necesidad se
enfocaba básicamente en la obtención de alimentos. Pero con el paso del tiempo, y el
avance en todos los aspectos de la vida cultural, esta necesidad fue perfeccionándose al
grado de generar varias técnicas de procesamiento de productos naturales para satisfacer
prácticamente todas las necesidades y actividades humanas. Desde la elaboración de pan,
quesos y diferentes bebidas alcohólicas (destiladas o fermentadas), hasta la producción de armas
metálicas y la obtención de piedras y metales preciosos se emplean diversas técnicas de
separación. En la actualidad las técnicas de separación se utilizan en diversas áreas, a nivel
industrial se emplean grandes cantidades de materia prima y grandes instrumentos de separación
(refinerías); aquí el objetivo es la separación por volumen de los compuestos. Por otro lado, en los
laboratorios de análisis el objetivo es la separación de muestras reducidas para el estudio
cualitativo o cuantitativo de un analito. Particularmente en el trabajo de laboratorio que se realiza
en las áreas biológicas, bioquímicas y biomédicas frecuentemente es necesario el tratamiento de
un extracto o una muestra. El objetivo de este tratamiento puede ser la purificación de enzimas, la
identificación de drogas, la extracción de hormonas, la cuantificación de biomoléculas, etc. Por lo
tanto, el objetivo en las separaciones es dividir una mezcla homogénea o heterogénea en sus
componentes individuales. Hay muchos métodos y técnicas de separación los cuales están
basados en principios físicos y químicos fundamentales. Algunas técnicas de separación son muy
complejas mientras que otros son relativamente simples y requieren poco esfuerzo y recursos. Un
procedimiento de separación puede ser utilizado para purificar, identificar o cuantificar un analito;
dependiendo de la técnica de separación se pueden realizar una o varias de estas operaciones al
mismo tiempo.
La separación puede ser completa o parcial y preparativa o analítica, los principios básicos
de la separación se describen en la figura 9.1. El proceso de separación implica el transporte de
material y la redistribución espacial de los componentes. Hay muchos procedimientos de
separación, algunos de los cuales se han conocido y empleado desde hace mucho (precipitación y
destilación), mientras que otros han sido desarrollados recientemente (cromatografía de gases,
cromatografía de líquidos y electroforesis). En este capítulo se da una introducción general a las
técnicas de separación y sus fundamentos.
 Técnicas de separación

Figura 9.1. Principios de separación. En (a) una mezcla de cuatro componentes es separada por completo
de modo que cada componente ocupe una región espacial diferente. En (b) se ilustra una separación
parcial. Aquí A es aislada del resto de los componentes de la mezcla.

CLASIFICACIÓN DE LAS TÉCNICAS DE SEPARACIÓN

Se han realizado diferentes clasificaciones de las técnicas de separación. Éstas incluyen divisiones
de acuerdo al tipo de fuerza involucrada en el proceso, el tipo de equilibrio que se lleva a cabo y la
naturaleza del proceso (mecánica, física o química). Sin embargo debido a la amplia variedad de
propiedades en las cuales están basadas las técnicas de separación es difícil proponer un solo
esquema de clasificación. En el cuadro 9.1 se muestran la mayoría de las técnicas de separación
que existen y el principio básico de su funcionamiento.

TÉCNICA DE PRECIPITACIÓN

Las separaciones por precipitación requieren que existan grandes diferencias de solubilidad entre
el analito y los potenciales interferentes. El tamaño de las partículas de los sólidos formados por
precipitación es muy variable. En un extremo se encuentran las suspensiones coloidales (entre 10 -
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y 10 -4 cm de diámetro), estas partículas no muestran tendencia a sedimentar ni se filtran con
facilidad. En el otro extremo se encuentran las suspensiones cristalinas en donde las partículas
tienen dimensiones del orden de décimas de milímetros o mayores, estas partículas tienden a
sedimentar espontáneamente y se filtran con facilidad. Los precipitados se forman por una serie
de etapas sucesivas las cuales son: supersaturación, saturación, nucleación y crecimiento de
cristales. La supersaturación es un estado en desequilibrio que ocurre cuando una fase de la
disolución contiene más soluto disuelto que el descrito en el estado de equilibrio La saturación de
una disolución ocurre cuando esta disolución contiene la máxima cantidad de soluto que es capaz
de disolver. La supersaturación es la primera etapa del proceso de precipitación, sin embargo,
como este es un estado de no equilibrio es transitorio y el sistema tiende espontáneamente a la
saturación, el paso de la supersaturación a la saturación se denomina nucleación. La nucleación
es un proceso en el cual pequeñas partículas son capaces de crecer espontáneamente formando
pequeños núcleos en donde se adhieren otras partículas. El crecimiento de cristales ocurre una
vez que se ha formado un núcleo, este continua creciendo por la adhesión continua de partículas
precipitadas. Si predomina la nucleación se produce un gran número de partículas pequeñas
(coloides); en cambio, si predomina el crecimiento de partícula se obtiene menor número de
partículas pero de mayor tamaño (cristales).
 Técnicas de separación
Cuadro 9.1. Técnicas de Separación.
Técnica de separación Base del técnica
Precipitación Diferencia de solubilidad
Sublimación Diferencia en la presión de vapor
Cristalización Solubilización a bajas temperaturas
Zona de refinamiento Cristalización a elevadas temperaturas
Flotación Diferencias en la densidad entre liquido y sustancia
Filtración Diferencia en el tamaño de partículas
Diálisis Flujo de un sistema a través de una membrana
Intercambio iónico Intercambio de iones
Extracción Diferencia de solubilidad en dos líquidos inmiscibles
Destilación Diferencia de volatilidad

Técnicas cromatográficas
Cromatografía de absorción en
columna
Cromatografía de partición en
columna
Cromatografía de capa fina
(TLC)
Cromatografía en papel
Cromatografía de líquidos de
alta presión
Cromatografía de intercambio
iónico
Cromatografía de gases
Electroforesis
Cromatografía de fluidos super-
críticos
Electrodeposición
Distribución de un soluto entre una fase sólida y
una fase líquida en una columna
Distribución de un soluto entre dos líquidos en una
columna
Absorción o partición en una hoja de capa fina
Partición en una hoja de papel
Cromatografía liquida en columna bajo condiciones
de alta presión
Intercambio de iones
Distribución de un soluto gaseoso entre un gas y
una fase liquida o sólida
Diferencia en la velocidad de migración de especies
cargadas en un campo eléctrico
Diferencias en la temperatura critica
Electrolisis en electrodos inertes

Existen varios agentes precipitantes que permiten la separación de iones a partir de sus
diferencias de solubilidad. Estas separaciones requieren un estricto control de la concentración
activa del reactivo a un nivel predeterminado. Para ello regularmente se controla el pH de la
disolución con tampones adecuados. Esta técnica se aplica a reactivos aniónicos en los que el
anión es la base conjugada de un ácido débil. Entre los ejemplos se incluyen el ion sulfuro, el ion
hidróxido y los aniones de varios ácidos inorgánicos débiles. La viabilidad teórica de este tipo de
separación puede determinarse mediante cálculos de solubilidad.

Producto de solubilidad: el producto de solubilidad puede ser empleado para predecir las
condiciones óptimas para la formación y disolución de precipitados. Estas incluyen variables como
temperatura, pH, concentración del agente precipitante, concentración de sales inertes y
composición del solvente. La constante del producto de solubilidad se define como:

Ksp = [cationes] [aniones] (1)

Donde los términos en corchetes representan las concentraciones de los iones. Por ejemplo, para
el AgCl el producto de solubilidad se define como:

Ag Cl = Ag+ + Cl-

Ksp = [Ag +] [ Cl- ] = 1.82 X 10 -10

 Técnicas de separación

En el apéndice A se muestran las constantes del producto de solubilidad a 25 °C para

diferentes compuestos.
Existen tres factores principales que afectan el producto de solubilidad, éstos son: la
temperatura, el solvente y el tamaño de partícula. Por lo regular el aumento en la temperatura
aumenta el producto de solubilidad. Sin embargo, existen algunas excepciones en las cuales,
algunas sales se disuelven con pérdida de energía y su solubilidad y el producto de solubilidad no
disminuye o cambia muy poco cuando aumenta la temperatura. Al utilizar un solvente de baja
constante dieléctrica, regularmente disminuye la solubilidad. Frecuentemente la solubilidad de una
sustancia moderadamente insoluble en el agua se reduce por la adición de alcohol o algún otro
solvente miscible en agua. Por otro lado, cuando el tamaño de la partícula disminuye parece que
la solubilidad aumenta. Éste es un efecto inicial y no representa una condición de equilibrio. Si la
solución es digerida, las partículas pequeñas gradualmente se disuelven y la saturación es
mantenida por la depositiación de una cantidad equivalente de cristales. Por lo tanto los cristales
más grandes crecen a expensas de los pequeños.
Desafortunadamente hay factores que pueden impedir el uso de esta técnica para lograr
una separación exitosa, estos factores son conocidos como fenómenos de coprecipitación.
Además, la velocidad de precipitación puede ser muy lenta. Finalmente, cuando los precipitados
se forman como suspensiones coloidales, la coagulación puede ser difícil y lenta, en particular
cuando se intenta aislar una cantidad pequeña de una fase sólida.

La coprecipitación: es un proceso en el cual los compuestos que normalmente son solubles son
arrastrados y separados de la disolución por un precipitado. Existen cuatro tipos de
coprecipitación:

Adsorción en la superficie: en este proceso, un compuesto normalmente soluble se separa de la

disolución al retenerse en la superficie de un coloide coagulado. Esta es la principal fuente de
contaminación en coloides coagulados, pero no en precipitados cristalinos.

Formación de cristales mixtos: en este proceso, uno de los iones de la red cristalina de un
sólido es remplazado por un ion de otro elemento. Para que ocurra el intercambio es necesario
que los dos iones tengan la misma carga y que su tamaño no difiera en más de un 5 %. Los
cristales mixtos pueden formarse tanto en los precipitados coloidales como en los precipitados
cristalinos.

Oclusión: ésta ocurre cuando los cristales de un precipitado crecen con rapidez de manera que
iones extraños, a la capa del cristal que se está formando, quedan atrapados u ocluidos dentro del
cristal en crecimiento.

Atrapamiento mecánico: este proceso es muy semejante al anterior, la diferencia principal radica
en que aquí es la cercanía de los cristales que se están formando, y no la velocidad de formación,
lo que ocasiona la captura de algunas porciones de disolución en pequeños huecos.
Se han desarrollado técnicas de precipitación para muchos aniones y cationes inorgánicos,
así como para especies neutras como el agua, dióxido de azufre, dióxido de carbono y yodo. La
principal aplicación de las técnicas de precipitación de iones y cationes inorgánicos se encuentra en
la industria metalúrgica, en joyería y farmacéutica. También es posible separar con facilidad
diversas sustancias orgánicas a través de esta técnica por ejemplo: proteínas y lactosa en la
industria alimenticia, salicilatos y fenolftaleina en farmacéutica, nicotina en plaguicidas y colesterol
en cereales. La precipitación de proteínas con soluciones salinas es una técnica ampliamente
empleada en todo tipo de laboratorios.

Intercambio iónico: en este proceso se intercambian los iones contenidos en un sólido insoluble
por los iones de una disolución que ha sido puesta en contacto con el sólido. Las propiedades de
intercambio iónico de arcillas y zeolitas han sido conocidas desde hace más de un siglo, aunque
actualmente se utilizan resinas sintéticas de intercambio iónico fabricadas con poliestireno
entrecruzado. Las resinas sintéticas de intercambio iónico son polímeros de alto peso molecular
que contienen un gran número de un grupo funcional iónico por molécula. Las resinas de
 Técnicas de separación
intercambio cationico contiene grupos ácidos, mientras que las resinas de intercambio aniónico
contienen grupos básicos. En general, el intercambio iónico se utiliza para eliminar iones tanto
orgánicos como inorgánicos. En muchos laboratorios se utiliza esta técnica para desionizar agua,
inclusive este mismo principio se aplica en los filtros ablandadores de agua domésticos.

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN

Uno de los campos en donde las técnicas de extracción son más utilizados es en análisis
fitoquímico. Cuando se quiere averiguar la efectividad de alguna planta para determinado
tratamiento, generalmente es preciso seguir cuatro etapas básicas: La primera etapa es obtener
una muestra representativa del material a evaluar; la segunda etapa consiste en separar o aislar
cada una de las sustancias que lo componen, de tal manera que estas puedan evaluarse
perfectamente; la tercera etapa consiste en la identificación y cuantificación, de cada uno de los
componentes. La cuarta etapa consiste en interpretar los resultados considerando los
procedimientos empleados y de las posibles fuentes de error.
La decisión acerca de qué procedimiento utilizar para obtener los extractos son diversos;
cuál utilizar depende de que compuesto se sospecha sea el principio activo y de las
características físicas y químicas del mismo, sobre todo si tiene alguna afinidad por determinados
solventes.

Cuadro 9.2. Polaridad de algunos solventes orgánicos

POLARIDAD Éter de petróleo
Hexano
n-heptano
Polaridad baja
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tricloro etilo
Benceno
Diclorometano
Cloroformo
Dietil éter Polaridad media
Acetato de etilo
Piridina
Acetona
n/propanol Polaridad alta
Etanol
Metanol
Agua
POLARIDAD
 Técnicas de separación

Cuadro 9.3. Técnicas de extracción más comunes.

percolación
- Técnicas en frío
maceración

Reflujo
decocción
- Técnicas en caliente
infusión
arrastre de vapor

- Extracción ácido-base

Destilación simple
- Destilación Destilación al vacío
Destilación fraccionada.
Destilación a presión reducida (ó vació)

Extracción: es el proceso de separación de los principios solubles de las materias primas de

origen natural, mediante la acción de un disolvente.

La extracción con disolventes es una técnica de separación que se puede aplicar a todo tipo de
mezclas, ya sean éstas sólidas, líquidas o gaseosas. La extracción se basa en la diferencia de
solubilidad de los componentes de una mezcla en un disolvente adecuado. La forma más simple
de realizar una extracción consiste en tratar la mezcla de compuestos con un disolvente de
manera que uno de los componentes se disuelva y los demás no. Sin embargo, la técnica de
extracción más empleada consiste en la disolución de la mezcla a separar en un disolvente que
disuelva a todos los componentes. A continuación, se procede a la adición de un segundo
disolvente, no miscible con el primero, de manera que los componentes de la mezcla se
distribuyan entre los dos disolventes según su coeficiente de reparto, que está directamente
relacionado con la solubilidad de cada compuesto. Si algún componente de la mezcla es muy
soluble en uno de los disolventes y muy poco en el otro quedará prácticamente todo en el que es
soluble, mientras que los otros componentes de la mezcla quedarán en el otro disolvente. La
separación de los dos disolventes y su evaporación suministrará residuos enriquecidos en los
componentes más solubles.
Por otra parte la extracción selectiva se emplea para separar mezclas de compuestos
orgánicos, en función de la acidez, de la basicidad o de la neutralidad de éstos, como por ejemplo,
muchos compuestos orgánicos que poseen carácter ácido no son solubles en agua y sí en
disolventes orgánicos; en cambio, en sus sales metálicas, el comportamiento es inverso, son
solubles en agua e insolubles en disolventes orgánicos. Si se convierte un ácido en su sal sódica,
se puede hacerlo soluble en agua y extraerlo así del disolvente orgánico en el que se encuentra.

Las técnicas para realizar extracciones son:

Percolación Extracción en frío continua: la percolación es el flujo de un líquido a través de un

medio poroso no saturado, por ejemplo de agua en el suelo, bajo la acción de la gravedad.
El material adecuadamente dividido y empacado propiamente en capas en un recipiente
denominado percolador, es sometido a la acción de porciones frescas y sucesivas de un
disolvente, de tal modo que dicho líquido atraviesa las capas de material, y separa los principios
solubles

Criterios para seleccionar la técnica de extracción:

- Parte de la planta que se emplea.
- Forma de uso de la planta medicinal (té, infusión, tintura, etcétera).
- Antecedentes fotoquímicos de la planta.
 Técnicas de separación
- Posibles metabólitos presentes y su solubilidad.
- Presencia de metabolitos termolábiles.
- Seca o fresca.

Maceración: la maceración es un proceso de extracción sólido-líquido. El producto sólido (materia

prima) posee una serie de compuestos solubles en el líquido extractante que son los que se
pretende extraer.
En general en la industria química se suele hablar de extracciones, mientras que cuando se
trata de alimentos, hierbas y otros productos para consumo humano se emplea el término
maceración. En este caso el agente extractante (la fase líquida) suele ser agua, pero también se
emplean otros líquidos como vinagre, jugos, alcoholes o aceites aderezados con diversos ingredientes
que modificarán las propiedades de extracción del medio líquido.
A veces el producto empleado es el extracto propiamente dicho y otras el sólido sin los
citados compuestos o incluso ambas partes, por ejemplo si extraemos cafeína del café, podemos
emplear el café descafeinado para hacer una infusión tradicional y la cafeína para la confección de
refrescos u otros usos.
La naturaleza de los compuestos extraídos depende de la materia prima empleada así como
del líquido de maceración. En los casos en que se utilice el producto extraído se suele emplear una
etapa de secado bien al sol, con calor o incluso una liofilización. En herbolaria se utiliza mucho esta
técnica. Existen, básicamente, dos tipos de maceración:

a) Maceración en frío
Consiste en sumergir el producto a macerar en un recipiente con la menor cantidad de agua posible,
sólo lo suficiente como para cubrir totalmente lo que se desea macerar. Esto se hace por un lapso
más o menos largo, dependiendo de lo que se vaya a macerar.
La ventaja de la maceración en frío consiste en que al realizarse sólo con agua se logran
extraer todas las propiedades de lo que se macera, es decir, toda su esencia sin alterarla.

b) Maceración con calor

El proceso a ejecutar en este tipo de maceración es el mismo que en la maceración en frío, sólo
que en este caso puede variar el medio por el cual se logra la maceración. El tiempo que se desea
macerar varía mucho de la maceración en frío ya que al utilizar calor se acelera el proceso
tomando como referencia que 3 meses de maceración en frío, es igual a 2 semanas en
maceración con calor, esto es en el caso de las plantas y hierbas medicinales.
La desventaja de la maceración en calor es que no logra extraer totalmente puro la esencia
del producto a macerar ya que siempre quema o destruye alguna pequeña parte de estas, es
decir, muchas veces se trata de compuestos termolábiles.
Muchas veces, para acortar más los tiempos de extracción y que las substancias pasen el
menor tiempo posible a elevadas temperaturas, se hacen extracciones con corriente de vapor.

Reflujo: extracción sólido-líquido. La misma cantidad de un determinado disolvente actúa

continuamente sobre el material vegetal objeto de la extracción, gracias a un proceso de
evaporización-condensación repetitivo
La extracción con Soxhlet consiste básicamente en el lavado sucesivo de una mezcla
sólida con un determinado solvente, que va “lavando o extrayendo” de la mezcla, los componentes
más solubles en él. Mediante el lavado sucesivo de una mezcla, se pueden extraer de ella
componentes cuya solubilidad en el solvente extractante es muy baja, debido al efecto acumulado
de las múltiples extracciones. Un equipo especialmente diseñado para realizar extracciones a
partir de mezclas sólidas diversas, es el Soxhlet, instrumento ingenioso de amplia utilidad en
fotoquímica.
Un montaje para reflujo permite realizar procesos a temperaturas superiores a la ambiente
(reacciones, recristalizaciones, etc), evitando la pérdida de disolvente y que éste salga a la
atmósfera. Básicamente consta de un matraz donde se coloca la disolución y de un refrigerante,
acoplado en vertical, al que según la finalidad del experimento se acoplan otros elementos en
función de que sea necesario llevar a cabo adiciones, mediciones de temperatura interna, etc.
El refrigerante se conecta mediante tubos de goma, al grifo de agua por su parte inferior y
al desagüe por la parte superior (en contracorriente).
 Técnicas de separación
El matraz se sumerge parcialmente en el baño calefactor y todo el montaje en posición
vertical debe ser adecuadamente asegurado mediante un pie, pinzas y clips o muelles de
sujeción.
Para evitar ebulliciones violentas es conveniente introducir en el matraz con la disolución
un agitador magnético o porcelana porosa.
El sistema tipo Soxhlet permite poner en contacto el disolvente y el sólido. Este posee un
recinto en el cual se coloca el sólido dentro de una bolsa cilíndrica de material permeable al líquido
(pero no al sólido), que bien puede ser un paquete elaborado con papel de filtro, de forma que el
líquido que procede del condensador de reflujo vaya llenando el recinto hasta que descargue
mediante un sifón pasando al destilador. El disolvente que se ha evaporado pasa al condensador
donde se convierte en líquido para pasar de nuevo al recinto extractor.

Primero se introduce la muestra molida en el extractor, en la zona habilitada para ello.

 A continuación el reactor (donde está el disolvente) es calentado por la manta calefactora
(calefacción) a suficiente temperatura como para que éste se evapore y pase al
condensador, y de aquí al Soxhlet, extrayendo el aceite de la almendra con el disolvente
líquido.
 En el interior del extractor al final nos encontraremos con el refinado que estará compuesto
por el sólido de la almendra y por disolvente no evaporado.
 En cada etapa se toman muestras del contenido del matraz que nos sirve de reactor. El
contenido del matraz constituye el refinado, que está formado tanto por el disolvente, como
por el aceite que se ha ido extrayendo en la operación.

Decocción o cocimiento: se pone en contacto el material del cual se quiere extraer un soluto con
el disolvente (agua), se lleva hasta la temperatura de ebullición manteniéndola durante 15 a 30
minutos. Una vez enfriado, se filtra y se exprime el residuo. Hay que tomar en cuenta las
características del material a estudiar, pues el tiempo de decocción depende de ello, siendo menor
para hojas, flores etc. Y mayor para materiales más duros como cortezas, semillas etc. Además
depende de los principios activos que se deseen extraer.
La decocción se aplica sobre todo a material vegetal duro en la que resulta difícil el
contacto entre los principios activos y el disolvente debido a sus características histológicas y a
vegetales con principios activos difíciles de disolver que precisan de una temperatura elevada y un
tiempo elevado para su disolución.
Habrá que tomar en cuenta la poca estabilidad en el tiempo de los extractos acuosos
obtenidos, por lo que se recomienda preparar la decocción en el momento que se va a utilizar.

Infusión: el disolvente empleado es el agua a temperatura próxima a la ebullición, se introduce el

material del cual se quiere extraer el soluto y posteriormente se deja enfriar el conjunto hasta la
temperatura ambiente. Igual que en el caso anterior prepararse al momento de usarse.

Arrastre de vapor: esta técnica es quizá la principal técnica de obtención de los “aceites
esenciales”; fragancias naturales muy apreciadas que se encuentran en las plantas, tales como el
mentol, el eucaliptol, etc.
La destilación por arrastre de vapor es una técnica aplicada en la separación de sustancias
poco solubles en agua. Se emplea para separar una sustancia de una mezcla que posee un punto
de ebullición muy alto y que se descomponen al destilar. También se emplea para purificar
sustancias contaminadas por grandes cantidades de impurezas resinosas y para separar
disolventes de alto punto de ebullición de sólidos que no se arrastran.
En esta técnica se lleva a cabo la vaporización selectiva del componente volátil de una
mezcla formada por éste y otros "no volátiles". Lo anterior se logra por medio de la inyección de
vapor de agua directamente en el seno de la mezcla, denominándose este "vapor de arrastre",
pero en realidad su función no es la de "arrastrar" el componente volátil, sino condensarse en el
matraz formando otra fase inmiscible que cederá su calor latente a la mezcla a destilar para lograr
su evaporación. En este caso se tendrán la presencia de dos fases insolubles a lo largo de la
destilación (orgánica y acuosa), por lo tanto, cada líquido se comportará como si el otro no
 Técnicas de separación
estuviera presente. Es decir, cada uno de ellos ejercerá su propia presión de vapor y
corresponderá a la de un líquido puro a una temperatura de referencia.
En la destilación por arrastre es posible utilizar gas inerte para el arrastre. Sin embargo, el
empleo de vapores o gases diferentes al agua implica problemas adicionales en la condensación y
recuperación del destilado o gas.
El comportamiento que tendrá la temperatura a lo largo de la destilación será constante, ya
que no existen cambios en la presión de vapor o en la composición de los vapores de la mezcla,
es decir que el punto de ebullición permanecerá constante mientras ambos líquidos estén
presentes en la fase líquida. En el momento que uno de los líquidos se elimine por la propia
ebullición de la mezcla, la temperatura ascenderá bruscamente.
La destilación con arrastre de vapor permite separar sustancias que son insolubles en
agua y ligeramente volátiles de otras que no lo son.
Existe una gran diferencia entre una destilación por arrastre y una simple, ya que en la
primera no se presenta un equilibrio de fases líquido-vapor entre los dos componentes a destilar
como se da en la destilación simple, por lo tanto no es posible realizar diagramas de equilibrio ya
que en el vapor nunca estará presente el componente "no volátil" mientras este destilando el
volátil. Además de que en la destilación por arrastre de vapor el destilado obtenido será puro en
relación al componente no volátil (aunque requiera de un decantación para ser separado del
agua), algo que no sucede en la destilación simple donde el destilado sigue presentando ambos
componentes aunque más enriquecido en alguno de ellos.
Además si este tipo de mezclas con aceites de alto peso molecular fueran destiladas sin la
adición del vapor se requeriría de gran cantidad de energía para calentarla y emplearía mayor
tiempo, pudiéndose descomponer si se trata de un aceite esencial.

Extracción ácido-base Alcaloides:

 La mayor parte de los alcaloides se encuentran como sales de ácidos.
 Desengrasar el material vegetal.
 Alcalinizar (Hidróxido de calcio, amonio, etcétera).
 Extraer con solventes orgánicos.
 Extracción de los alcaloides con agua acidulada.
 Precipitación de los alcaloides con un álcali.
 Extracción con una fase orgánica.

Destilación: la destilación es el proceso de separación de uno o más líquidos, en función de sus

diferencias de puntos de ebullición. En la destilación se calienta lentamente una mezcla líquida,
hasta cuando el líquido más volátil comienza a separarse en forma de vapor. La masa evaporada
se recibe entonces sobre una superficie fría en donde se condensa nuevamente a su forma líquida
y se recoge, libre ya, de los demás componentes de la mezcla. Con este procedimiento se pueden
separar mezclas de diversos líquidos, siempre y cuando las diferencias en puntos de ebullición
sean apreciables, aproximadamente 5 ºC.
Las dos fases en una destilación son: la vaporización o transformación del líquido en vapor
y la condensación o transformación del vapor en líquido.

Los distintos tipos de destilación que se pueden realizar son:

Destilación simple: es una técnica utilizada en la purificación de líquidos cuyo punto de ebullición
es menor de 150 ºC a la presión atmosférica y sirve para eliminar impurezas no volátiles. Esta
técnica también se emplea para separar dos líquidos cuyos puntos de ebullición difieran al menos
en 25 ºC.
La destilación simple se usa cuando la diferencia entre los puntos de ebullición de los
componentes es grande, mayor de 80 ºC, o cuando las impurezas son sólidos disueltos en el
líquido a purificar. En este tipo de destilación el líquido se calienta, a presión atmosférica, en un
recipiente cerrado que contiene una salida hacia un tubo refrigerado donde se condensan los
vapores. Con esta sencilla operación podemos purificar un disolvente, pero no podemos separar
completamente dos o más líquidos volátiles.
 Técnicas de separación
En este tipo de destilación, el material vegetal disgregado, y que le realizaremos una
destilación simple, se coloca en un matraz con muy poca agua. Se calienta, entonces la diferencia
de presión entre el vapor de agua y los componentes a extraer, hace que estos últimos se
separen, posteriormente, los vapores recibidos, se condensan y se recoge en un matraz.
El procedimiento para destilar es el siguiente (Figura 9.2):

Figura 9.2. Esquema de destilación simple.

Se coloca un matraz de destilación de boca esmerilada, donde se sitúa la mezcla a

destilar. Este matraz va sujeto a un soporte mediante unas pinzas. También se coloca una cabeza
de destilación o T de destilación unida por un lado al matraz y por otro al refrigerante, y en la que
se coloca un termómetro en la parte superior utilizando un macho guía. El termómetro debe
quedar situado de manera que el bulbo quedará bañado completamente con el vapor y la lectura
será correcta.
Se coloca un refrigerante que va unido a la cabeza de destilación. A lo largo del mismo
existen dos zonas, una interna por donde pasa y se condensa el vapor que proviene del matraz de
destilación y otra externa por donde circula el agua de refrigeración.
También lleva un adaptador que une el refrigerante y el colector, que es el matraz colector
donde se recoge el destilado.
Es recomendable que todas las uniones entre piezas de vidrio se hagan con muelles o
clips.

Destilación al vacío: esta técnica se emplea en la separación de líquidos con un punto de

ebullición superior a 150 ºC. Como un líquido hierve cuando su presión de vapor iguala a la presión
externa, se puede reducir el punto de ebullición disminuyendo la presión a la que se destila. Esta
técnica se conoce como destilación a presión reducida o destilación al vacío. La destilación al vacío
se utiliza cuando el líquido tiene un punto de ebullición excesivamente alto o se descompone a alta
temperatura.

Destilación fraccionada: es una técnica que se emplea en la separación de sustancias cuyos

puntos de ebullición difieran entre sí menos de 25 ºC. La diferencia respecto a la destilación simple
es la presencia de una columna de fraccionamiento entre el matraz y la cabeza de destilación.
Si la diferencia que hay entre los puntos de ebullición es demasiado pequeña para que una
destilación simple resulte eficiente, es necesario recurrir a destilaciones repetidas. En la práctica
se emplea una columna fraccionada, a través de la cual la fase de vapor y la fase condensada
fluyen en direcciones opuestas. De tal manera que el vapor a medida que asciende por la columna
es cada vez más rico en el componente más volátil.

Algunas recomendaciones al emplear esta técnica:

 Al fijar las piezas de vidrio con pinzas o nueces metálicas, se apretará suavemente; si se
fijan piezas metálicas se apretará fuertemente.
 Técnicas de separación
 La parte inferior del termómetro ha de quedar a la altura de arranque del vástago lateral de
forma que todo el bulbo de mercurio quede bañado por el vapor ascendente.
 Las uniones entre las distintas piezas del montaje han de ser perfectas para evitar las
fugas.
 La entrada y salida de agua en el refrigerante se hará de forma que el agua circule en
contracorriente con el vapor que circula por dicho refrigerante.
 Se introduce la mezcla a destilar con ayuda de un embudo cónico en el matraz de fondo
redondo, así como un trocito de porcelana porosa para homogeneizar la ebullición.
 No se inicia el calentamiento hasta que no circule agua por el circuito de refrigeración.
 Comenzado el calentamiento se anota la temperatura que marque el termómetro cada
minuto. La temperatura irá aumentando hasta que comience la destilación del componente
más volátil, permaneciendo prácticamente constante la temperatura mientras destila este
primer componente. Cuando la temperatura comience a descender se da por concluida la
destilación.
 La destilación debe realizarse lentamente pero sin interrupciones, procurando que siempre
haya una gota de condensado en la base del termómetro.

Destilación a presión reducida (o al vacío): este tipo de destilación es especialmente utilizada

en la purificación de productos con muy altos puntos de ebullición y/o que se descomponen en el
proceso de calentamiento.
Si la presión total sobre la disolución a destilar es menor que la presión atmosférica, las
contribuciones de las presiones de vapor a una temperatura menor serán lo suficientemente grandes
como para permitir la destilación a temperatura inferior al punto de ebullición.
Según sea el interés por el líquido destilado o no, los equipos utilizados tienen
características diferentes. En el proceso rutinario de eliminación de disolventes, en el trabajo de
laboratorio se utiliza el equipo denominado como rotavapor.

Algunas recomendaciones al emplear esta técnica:

 Elegir un matraz de destilación adecuado al volumen a destilar. El matraz no debe llenarse más
de las 2/3 partes de capacidad ni tampoco debe ser excesivamente grande.
 Poner un poco de grasa en las juntas esmeriladas.
 Unir todas las piezas de vidrio con muelles o clips.
 Conectar el refrigerante, teniendo en cuenta que la goma unida a su parte superior va al
desagüe y la de la parte inferior al grifo del agua (intercambio de calor en contracorriente).
 No abrir demasiado la llave del agua, un flujo continuo es suficiente y evitará que salten las
mangueras.
 Se recomienda utilizar una manta de calefacción (según la temperatura a alcanzar) para
que la calefacción sea más uniforme.
 Ajustar la temperatura de la fuente de calor. No introducir nunca el matraz de destilación
en un baño que esté a temperatura próxima o superior a la de destilación, se evitarán así
sobrecalentamientos y que todo destile de golpe o salte.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS EXTRACTIVAS

Ventajas
 Buena conservación, sobre todo en las que el disolvente es antiséptico (alcohol, glicerina,
propilenglicol).
 Fácil empleo y prescripción.
 Posibilidad de estandarizar los productos obtenidos, esto es, posibilidad de ajustar la
concentración del principio activo.
 Técnicas de separación
 Posibilidad de eliminar componentes indeseables.

Desventajas
 Baja estabilidad de las soluciones extractivas acuosas.
 Dilución de los principios activos, pudiendo ocasionar una disminución en su eficacia.
 Variación del “contexto natural” de los compuestos activos, pues hay asociación de
componentes que pueden alterarse al realizar una extracción.

TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS

La cromatografía es una técnica muy utilizada que permite la separación, identificación o

cuantificación de componentes químicos que están muy relacionados entre sí. Ninguna otra técnica
de separación es tan potente y de aplicación tan amplia como la cromatografía.
La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla se separan a
partir de las diferencias de velocidad a la que son transportados a través de una fase estacionaria
por una fase móvil, gaseosa o líquida. La fase estacionaria está fija en un lugar, ya sea una
columna o una superficie plana. La fase móvil se mueve sobre la fase estacionaria o a través de
ella, arrastrando consigo la mezcla de analitos. Esta fase puede estar constituida por un líquido,
un gas o un fluido supercrítico.
La elusión es el proceso por el cual los solutos son arrastrados a través de una fase
estacionaria por el movimiento de una fase móvil. La fase móvil que sale de la columna se conoce
como el eluato. La porción de la muestra contenida en la fase móvil se conoce como eluyente,
cuando éste empieza a descender por la columna se va transfiriendo continuamente entre ambas
fases. Dado que el movimiento del soluto solo puede ocurrir en la fase móvil, la velocidad media a
la que un soluto se mueve depende de la fracción de tiempo que pase en la fase móvil. Esta
fracción es pequeña para los solutos que son fuertemente retenidos por la fase estacionaria
(componente B en Figura 9.3) y grande cuando la retención en la fase móvil es más probable
(componente A). Las diferencias resultantes en la velocidad hacen que los componentes de una
muestra se separen en bandas o zonas a lo largo de la columna. El aislamiento de la molécula
separada se consigue haciendo pasar a través de la columna una cantidad suficiente de fase móvil
para que las bandas individuales lleguen al extremo final, donde pueden ser recogidas o detectadas
(Figura 9.3).
Si un detector que responde a la concentración de soluto se coloca en el extremo final de
la columna durante la elusión y se representa gráficamente su señal en función del tiempo se
obtiene una grafica, conocida como cromatograma. El cromatograma es útil para el análisis
cualitativo y cuantitativo. La posición de los picos en el eje del tiem po puede usarse para
identificar los componentes de la muestra; las áreas bajo los picos proporcionan una medida
cuantitativa de la cantidad de cada componente (Figura 9.3). Los detectores comúnmente
utilizados para el análisis de los componentes separados por cromatografía son herramientas
espectroscópicas de radiaciones UV-Visible, infrarrojo, fluorescencia, ionización de llama,
conductividad térmica, captura electrónica, espectroscopia de masas, conductividad eléctrica y
fotoionización.
 Técnicas de separación

Figura 9.3 (a). Diagrama que muestra la separación de una mezcla de componentes A y B por
cromatografía de elusión en columna. (b) La señal del detector en las distintas etapas de elusión.

Constantes de distribución: todas las separaciones cromatográficas se basan en las diferencias

en el grado en que los solutos se distribuyen entre la fase móvil y la estacionaria. Para la especie
de soluto A, el equilibrio implicado se describe con la ecuación:

A (móvil) = A (estacionaria)

La constante de equilibrio Kc de esta reacción se conoce como constante de distribución, la cual

se defina como:
Kc = (aA )S
(aA )M (2)

Donde (a A)S es la actividad del soluto A en la fase estacionaria y (a A)M es la actividad del soluto en
la fase móvil. A menudo se sustituye la actividad del soluto A por su concentración molar en
ambas fases, por lo tanto la ecuación 4 se escribe como:

Kc = c S_
cM (3)

La constante de distribución, en el caso ideal, es la misma en un amplio intervalo de

concentraciones del soluto, es decir, c S es directamente proporcional a cM.

Clasificación de las técnicas cromatográficas: las técnicas cromatográficos pueden ser

divididas en cuatro grandes categorías: cromatografía de adsorción, cromatografía de partición,
cromatografía de exclusión y cromatografía de intercambio iónico.

Cromatografía de partición: aquí las moléculas del soluto están en equilibrio a través de una
capa interfacial que se produce entre la fase móvil y la fase estacionaria. El soluto se distribuye a
 Técnicas de separación
través de la fase estacionaria dentro de ésta, y no solo en la superficie como en la adsorción. En
este caso la fase estacionaria siempre es liquida por lo tanto, la solubilidad entre ambas fases es
una parte importante de este proceso. Algunas propiedades generales y específicas las cuales
tienen influencia en la solubilidad son parámetros importantes en la cromatografía de partición.
Las principales fuerzas que interfieren en la solubilidad entre ambas fases son los enlaces
hidrógeno, interacciones dipolo-dipolo y procesos de transferencia de carga entre el solvente y las
moléculas del soluto. En este tipo de cromatografía al coeficiente de distribución se le llama
coeficiente de partición y se define por la ecuación:

Kp = CS_
CM (4)

Donde CS es la concentración de soluto en la fase estacionaria y CM es la cantidad de soluto en la

fase móvil. Por lo tanto, mientras mayor sea el valor de K P mayor es la retención del soluto en la
fase estacionaria

Cromatografía de adsorción: en este tipo de cromatografía ocurren interacciones como

resultado de fuerzas intermoleculares entre los átomos de la superficie del sólido y las moléculas
del soluto. Los tipos de fuerza involucrados pueden ser uno o más de las siguientes: fuerzas
“Londón” entre toda la superficie y las moléculas absorbidas, fuerzas electrostáticas entre
superficies polares y cualquier molécula absorbida o entre superficies no polares y moléculas
polares adsorbidas, fuerzas de transferencia de carga entre electrones donadores y aceptores y
formación de enlaces hidrógeno. El coeficiente de partición es el mismo que el de absorción
excepto que C S es la cantidad de soluto adsorbido por la fase estacionaria y CM es la cantidad de
soluto en la fase movió. Por lo tanto, un coeficiente de absorción alto indica una mayor retención
por el soluto.
Cromatografía de exclusión: incluye aquellos procesos cromatográficos en los cuales la separación
de los componentes de la muestra tiene lugar de acuerdo a su tamaño molecular. Esta técnica puede
ser separada en dos tipos: separación por tamizado y difusión de gel.

Cromatografía de intercambio iónico: un intercambio reversible de iones es posible entre

iones de la fase móvil y sitios iónicos de la fase estacionaria. En general la fase estacionaria
puede ser una matriz polimérica, un entramado cristalino o una sustancia modificada
conteniendo grupos iónicos fijos y contraiónes móviles con carga opuesta. Estas fases sólidas son
insolubles, permeables y tienden a mostrar una selectividad bien definida por un ión. Aquí el
coeficiente de distribución es modificado por el volúmen de la solución y el peso de la resina y se
expresa como coeficiente de distribución de conjunto.

KD = cantidad del ión en la resina por gramo de resina__

cantidad del ión en la solución por mililitro de solución (5)

En las técnicas cromatográficas planas la retención de los solutos, por partición o adsorción, se
describe por su migración relativa en relación a la fase móvil. Esta proporción se simboliza como:
Rf y RR, en donde Rf es para el flujo lineal en una dirección y RR es para el flujo lineal en una
dirección radial. Ambos son definidos como:

Rf ( o RR) = distancia recorrida por el soluto

distancia recorrida por la fase móvil (6)

Cuando la Rf aumenta la retención del soluto disminuye

Cromatografía en columna: la cromatografía en columna utiliza fase móvil liquida o fase móvil
gaseosa por adsorción o partición. El intercambio iónico y la exclusión también son posibles en
cromatografía de columna. Las columnas son hechas de vidrio o algunos materiales químicos
inertes y se encuentran en diferentes formas tamaños y diseños. Su principal objetivo es contener la
fase estacionaria y permitir el control del flujo del solvente.
 Técnicas de separación
Adsorción o partición: ambas técnicas tienen ventajas y limitaciones en su aplicación. En
general, la cromatografía de adsorción en columna es menos difícil de realizar que la de partición.
Sin embargo, se debe de considerar otros factores antes de elegir entre uno u otro, básicamente
se refieren al tipo de compuestos que se quieren separar y al objetivo de la separación.

Aunque los mecanismos de absorción y partición involucran complicados procesos, un factor

simple es determinante, la polaridad. Podría parecer que la adsorción es una técnica más versátil,
sin embargo, como se dijo anteriormente la adsorción y partición están basados en diferencias de
polaridad. Debido a esto la adsorción aumenta cuando es mayor la polaridad, esto origina que sean
más difíciles de eluir moléculas muy polares. Por esta razón la absorción es usada para moléculas
no polares o poco polares, mientras que la partición es utilizada para moléculas polares. La figura
9.4 muestra una guía general de la polaridad de grupos funcionales en relación a la adsorción y
partición. Como se observa la polaridad aumenta cuando aumenta el número de grupos funcionales
en la molécula, y disminuye cuando aumenta el contenido de carbones y el peso molecular.

Figura 9.4. Guía para la elección de solventes en la cromatografía de partición y adsorción.

Cromatografía de adsorción en columna. Se han utilizado una gran variedad de adsorventes

naturales y sintéticos. En general, las características más importantes de un buen adsorvente:
Una gran área de superficie, disponibilidad de sitios polares y reproductibilidad en el grado de
activación. Las más comúnmente utilizadas son sílica gel y oxido de aluminio (Cuadro 9.4).

Cuadro 9.4. Enlista diferentes tipos de adsorventes para cromatografía en columna de menor a
mayor poder de adsorción.
Adsorventes para Cromatografía en Columna
Sacarosa
Celulosa
Almidón
Carbonato de calcio
Sulfato de calcio
Fosfato de calcio
Carbonato de magnesio
Oxido de calcio
Acido silisico (sílica gel)
Charcoal
Oxido de magnesio
Oxido de aluminio
 Técnicas de separación
La alúmina (Al 2O3) está disponible en muchas formas. Dependiendo del grado de secado y la
preparación ésta puede tener los siguientes sitios activos, Ald+, Al-OH, AlO-H y Al-O-, los cuales
son responsables de la adsorción. La alúmina es activada calentándola en un horno a 200 oC o a
400 oC durante 3 hrs. Estos procedimientos de secado proveen dos diferentes formas de
activación de alúmina. Ninguno de estos dos tipos es completamente anidro, de hecho la alúmina
anidra es poco adsorvente. La alúmina también puede ser graduada como ácida, básica o neutral
de acuerdo al tipo de lavado.

La sílica gel (SiO2) es activada calentando las placas a 160 °C durante 3 horas. Por medio de
éste proceso no se remueve toda el agua y los sitios activos son semejantes a los de la alúmina,
además en estas placas también existe silicón. Al igual que con la alúmina la sílica gel es
compatible con el agua y la mayoría de solventes orgánicos. Sin embargo, ésta tiende a
expandirse, el grado de expansión depende del tipo de solvente.

Existe un factor de polaridad que puede ser empleado para relacionar solventes como fases de
elusión en la cromatografía de adsorción. El grado de adsorción de un solvente puede ser
cualitativamente predecible dependiendo de los grupos funcionales presentes (Cuadro 9.5).

Cuadro 9.5. Serie eluotrópica de solventes comunes el poder de elusión aumenta de arriba
hacia abajo.
Éter de petróleo
Ciclohexano
Tetracloruro de carbono
Tolueno
Benceno
Cloroforma
Éter etílico
Acetato de etilo
Acetona
n-propanol
Etanol
Metanol
Agua
Piridina
Ácidos orgánicos
Ácidos y bases inorgánicos

Cromatografía de partición en columna: un soporte adecuado en la partición en columna debe

tener una gran capacidad para sostener la fase líquida estacionaria y debe ser inerte a la fase móvil y
los componentes de la muestra. El soporte puede contener solventes polares o no polares como fase
estacionaria; un segundo soporte es utilizado en la técnica conocida como fase reversa. El cuadro 9.6
muestra varios tipos de soportes que pueden ser utilizados en ambas técnicas de partición en
columna. Aquellos que son útiles para partición convencional tienen propiedades polares, mientras
que aquellos que son útiles para fase reversa son no polares. La sílica gel, Kieselguhr y la celulosa
son los más empleados.

Cuadro 9.6. Algunos soportes comunes para cromatografía de partición en columna.

Kieselguhr
Sílica gel
Celulosa
Almidón
Azúcar
Goma
Celulosa acetilada
Varios polímeros orgánicos
 Técnicas de separación

El mismo tipo de sílica gel que se utiliza para adsorción es utilizado para partición, sin embargo,
esta debe ser desactivada impregnándola con agua o algún otro solvente polar.

Kieselguhr: es suelo derivado de diatomitas y se encuentra disponible en diferentes grados. Tiene la

ventaja de no participar en la actividad adsorvente. Puede utilizarse en fase reversa.

La celulosa se utiliza en forma activada y frecuentemente se utiliza para separar grandes

cantidades de muestra.

Fase móvil en cromatografía de partición: en general las moléculas que son más solubles en la
fase móvil se mueven más rápido que aquellas menos solubles. Además, mientras más soluble
sea la molécula en la fase estacionaria más lenta será su elución. Por tanto, en la partición se
deben elegir dos líquidos, uno que actúe como fase estacionaria y otro que actué como fase móvil.
Es difícil predecir la combinación óptima entre estas fases porque el sistema de partición puede
involucrar mezclas de solventes, soluciones salinas, buffers o agentes complejos. Otra
complicación radica en que las dos fases deben estar en equilibrio durante la cromatografía y si un
tercer componente es introducido se pierde la condición de equilibrio. El cuadro 9.7 enlista
diversos sistemas de partición para cromatografía en columna convencional y en fase reversa.

Cuadro 9.7. Sistemas de solventes sugeridos para cromatografía de partición en columna.

Fase estacionaria Fase móvil
Partición fase normal
Agua Alcoholes (n-Butanol, Isobutanol)
Agua + Ácido Hidrocarburos (Benceno, tolueno,
ciclohexano, hexano)
Agua + Álcalis Hidrocarburos (Benceno, tolueno,
ciclohexano, hexano)
Agua + Buffers Cloroformo
Alcohol + Agua (MeOH, EtOH) Acetato de etilo
Alcoholes (MeOH, EtOH) Etilenglicol monometil éter
Formamida Metil etil cetona
Glicoles (Etilen, propilen, gilicerol) Piridina
Partición fase reversa
n-Butanol Agua
Octanol Agua + Acido
Cloroformo Agua + Álcalis
Cloro silanos y silicones Agua + Buffers
Aceite mineral Alcohol + Agua (MeOH, EtOH)
Parafina Alcoholes (MeOH, EtOH)
Formamida
Glicoles (Etilen, propilen, gilicerol)

En la cromatografía de gases los componentes de una muestra vaporizada se separan como

consecuencia del reparto entre una fase móvil gaseosa y otra fase estacionaria líquida o sólida
mantenida en una columna. Al realizar una separación cromatográfica de gases, la muestra se
vaporiza a más de 400 °C y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elusión se
logra mediante el flujo de una fase móvil de gas inerte. A diferencia de muchos otros tipos de
cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas de analito, sino que su única
función es transportar el analito a lo largo de la columna. Son dos los tipos de cromatografía de
gases, la cromatografía de gas-líquido (CGL) y la cromatografía de gas-sólido (CGS). La primera
es de amplio uso en todos los campos de la ciencia y su nombre suele abreviarse a cromatografía
de gases (CG). La de gas-sólido se basa en una fase estacionaria sólida, donde la retención de lo
analitos ocurre como resultado de una adsorción física. Esta variante ha tenido aplicación limitada
debido a la retención semipermeante de moléculas activas o polares y a que los picos de elusión
 Técnicas de separación
suelen presentar grandes colas (consecuencia de la naturaleza no lineal del proceso de
absorción). Así pues, esta técnica no ha tenido una aplicación generalizada, salvo en la
separación de ciertas especies gaseosas de bajo peso molecular.

La cromatografía liquida de alta resolución (HPLC) es el tipo de cromatografía de elusión más

versátil y ampliamente utilizado. Los químicos la emplean para separar y determinar en diversos
materiales orgánicos, inorgánicos y biológicos. En cromatografía líquida, la fase móvil es un
disolvente líquido que contiene la muestra como mezcla de solutos. Los tipos de cromatografía
líquida de alta resolución suelen clasificase según el mecanismo de separación o el tipo de fase
estacionaria. Éstos comprenden: (1) cromatografía de reparto o de líquido-liquido; (2)
cromatografía de adsorción o de líquido sólido; (3) cromatografía de intercambio de iones o iónica;
(4) cromatografía de exclusión molecular; (5) cromatografía de afinidad, y (6) cromatografía quiral.

La cromatografía de fluidos supercríticos (SPC) en la que la fase móvil es un fluido

supercrítico, es un hibrido de la cromatografía de líquidos y de gases que combina alguna de la
mejores características de cada una. Para ciertas aplicaciones parece ser claramente superior
tanto a la cromatografía de gas-líquido como a la cromatografía de alta resolución. Un fluido
supercrítico es el estado físico de una sustancia que se mantiene por encima de su temperatura
crítica. La temperatura crítica es aquella por encima de la cual una sustancia no puede ser licuada
Un fluido supercrítico se forma siempre que una sustancia se calienta por encima de su
temperatura crítica. Por encima de la temperatura crítica, una sustancia ya no puede ser
condensada en forma líquida por la simple aplicación de presión. Por ejemplo el dióxido de
carbono es un fluido supercrítico a temperatura por encima de 31 °C. En este estado, las
moléculas del dióxido de carbono actúan independientemente una de otras, tal como ocurre en un
gas. Las propiedades físicas de un fluido supercrítico pueden ser notablemente diferentes de sus
propiedades en estado líquido o gaseoso. Por ejemplo, la densidad de un fluido supercrítico es
normalmente entre 200 y 400 veces mayor que la del gas correspondiente y se aproxima a la de la
sustancia en su estado líquido.
Una propiedad de los fluidos supercríticos que es importante y se relaciona con sus altas
densidades (0.2 a 0.5 g/cm 3) es su capacidad para disolver moléculas no volátiles. Por ejemplo, el
dióxido de carbono supercrítico disuelve fácilmente n-alquilftaltos en los que los grupos alquilo
contienen de 4 a 16 átomos de carbono, y varios hidrocarburos aromáticos policíclicos formados
por varios anillos. Las temperaturas críticas para los fluidos que se usan n cromatografía varían
mucho, de unos 30 °C a más de 200 °C. En cromatografía son convenientes las temperaturas
críticas más bajas desde varios puntos de vista. Por esta razón, gran parte del trabajo realizado
hasta hoy se ha concentrado en los fluidos supercríticos.
La cromatografía de fluidos supercríticos parece tener un lugar potencial en el espectro de
los técnicas cromatográficos de columna, porque es aplicable a un tipo de compuestos que no son
fácilmente manejables con la cromatografía de líquidos o la cromatografía de gas-líquido. Estos
compuestos incluyen especies no volátiles o térmicamente inestables y que, además, no
contienen grupos cromóforos que puedan usarse para la detección fotométrica. La separación de
estos compuestos es posible por la cromatografía de fluidos supercríticos a temperaturas por
debajo de 100° C; además, la detección se realiza con facilidad por medio del muy sensible
detector de ionización de llama. También vale la pena comentar que las columnas supercríticas
tienen la ventaja adicional de que son mucho más fáciles de acoplar a los espectrómetros de
masas que las columnas cromatográficas de líquidos.

Cromatografía plana: entre las técnicas de cromatografía plana figuran la cromatografía de capa
fina (TLC), la cromatografía en papel (PC) y la electrocromatografía. Cada uno de ellos utiliza una
capa plana y relativamente fina de material que se sostiene por sí misma o se aplica como
recubrimiento sobre una superficie de vidrio, plástico o metal. La fase móvil avanza a través de la
fase estacionaria por capilaridad, ayudada en ocasiones por la acción de la gravedad o de un
potencial eléctrico.

Cromatografía en papel: de manera muy simple la cromatografía en papel puede describirse como
el paso de una fase móvil líquida a través de la estructura porosa de un papel que contiene una fase
estacionaria líquida. El desarrollo (elusión de la cromatografía) es detenido antes de que la fase
 Técnicas de separación
móvil alcance el borde del papel, de esta manera, las zonas se distribuyen a lo largo de éste.
Probablemente las principales limitaciones de la cromatografía en papel en comparación con la
cromatografía de capa fina son: tiempos de desarrollo más prolongados, la exactitud en el análisis
cuantitativos bajo, las zonas no siempre están bien definidas y algunas veces las condiciones de
desarrollo son difíciles de reproducir.
En general el papel está compuesto por fibras de celulosa; ésta es una red polimérica de
carbohidratos que posee características hidrofílicas y está entrecruzada por un sistema de
puentes de H estable. El agua u otros solventes muy polares son fuertemente compatibles con el
sistema hidrofílico de la celulosa. Si el papel está acetilado (grupos hidróxido son convertidos a
grupos acetilo) entonces toma propiedades hidrofóbicas; por lo tanto, tiende a retener solventes
hidrofóbicos en vez de solventes hidrofílicos como fase estacionaria. A este tipo de aplicación se
le refiere como fase reversa en la cromatografía en papel. El papel también se puede hacer
hidrofóbico por tratamientos con silicón o impregnándolo con polímetros orgánicos no polares e
inertes.
La cromatografía en papel se da esencialmente por partición y existe una amplia variedad
de combinaciones entre fase estacionaria y fase móvil. No es necesario que los dos sistemas
sean inmiscibles. Los tipos de fase estacionaria que se utilizan se pueden clasificar como
sistemas: acuosos, hidrofílicos e hidrofóbicos.

Fase estacionaria acuosa: el agua es fácilmente sostenida por el papel. Por lo tanto, se puede
conseguir equilibrar la humedad del papel suspendiéndolo en una cámara cerrada cuya atmósfera
está saturada con agua. Si se desea impregnar el papel con una solución salina o buffers, se rocía
el papel con la respectiva solución y después se expone a la cámara con atmósfera saturada de
agua. Este tipo de sistema es particularmente útil para la separación de mezclas moderadamente
polares de mezclas muy polares.

Fase estacionaria hidrofílica: se puede utilizar un solvente orgánico para la fase estacionaria
hidrofílica. Si el solvente es suficientemente volátil, se puede equilibrar el papel en una cámara
que esté saturada con el solvente deseado. Alternativamente, el solvente de la fase estacionaria
se diluye en otro solvente muy volátil y el papel es sumergido en la solución, posteriormente el
papel es secado con aire y el solvente volátil se evapora dejando la fase estacionaria liquida
uniformemente distribuida a través del papel. Algunos de los solventes hidrofílicos más
comúnmente empleados son: metanol, formamida, glicoles y glicerol.
Fase estacionaria hidrofóbica: como se describió previamente, el papel debe ser modificado
antes de que empiece a mostrar una tendencia para retener una fase móvil hidrofóbica. Para
equilibrar el papel, se tiene que exponer a los vapores del solvente elegido o sumergirse en una
solución con un solvente más volátil. Los solventes más empleados son: dimetil-formamida,
queroseno, hidrocarburos aromáticos y alifáticos, así como algunos solventes oxigenados.

Fase móvil: hay una gran combinación de fases móviles posibles. Mezclas de dos, tres o más
solventes son frecuentemente empleadas en la cromatografía en papel. También pueden utilizarse
soluciones salinas o soluciones buffers. Se pueden utilizar ciertos parámetros para predecir las
condiciones de elución, por ejemplo, las características de los componentes en la mezcla y el tipo
de fase estacionaria. El cuadro 9.8 enlista diez fases móviles básicas para la cromatografía en
papel. Las mezclas de A a C se utilizan para la separación de substancias hidrofílicas, las mezclas
de A a G son para substancias medianamente hidrofílicas y las mezclas H a J, son para
sustancias hidrofóbicas. Es posible utilizar diferentes proporciones de estas mezclas para
conseguir un mayor poder de partición en la cromatografía.

Cuadro 9.8. Diez fases móviles básicas para cromatografía en papel. Las proporciones de cada
solvente se indican en paréntesis, cuando no se indican la proporción es de uno por cada
componente.
a. Isopropanol-amonio-agua (9:1:2)
b. n- Butanol-ácido acetico-agua (4:1:5)
c. Agua-fenol
d. Formamida-cloroformo
 Técnicas de separación
e. Formamida-cloroformo-benceno
f. Formamida-benceno
g. Formamida-benceno-coclohexano
h. Dimetilformamida-ciclohexano
i. Keroseno-isopropanol 70 %
j. Parafina-dimetilformamida-metanol-agua

Cromatografía en capa fina: en general, la cromatografía de capa fina se corre

experimentalmente como una técnica de cromatografía plana, pero la capa fina exhibe las
propiedades de la técnica en columna. Por consiguiente, cualquiera de las fases estacionarias
utilizadas en la cromatografía en columna, pueden ser utilizadas en la cromatografía en capa fina.
El material de la capa consiste en un recubrimiento y material de soporte activo. Esta mezcla se
hace en una solución acuosa y se esparce en una placa de vidrio, metal o plástico;
posteriormente, el agua se evapora, lo que produce una fina capa del material de soporte unida en
una placa continua por el recubrimiento. Las placas deben de ser comprimidas y limpiadas para
que esto no afecte su uniformidad y adhesión. La cromatografía de capa fina ha llegado a ser el
caballo de batalla de la industria farmacéutica para la siempre importante determinación de la
pureza de sus productos. También ha encontrado múltiples aplicaciones en los laboratorios
clínicos y es la columna vertebral de muchos estudios bioquímicos y biológicos. Por último,
alcanza un uso extensivo en los laboratorios industriales. Como consecuencia de tal abundancia
de áreas de aplicación, la TLC sigue siendo una técnica muy importante. La separación en capa
fina típicas se realizan en una placa de vidrio recubierta con una capa adhesiva delgada de
partículas finamente divididas; esta capa constituye la fase estacionaria. Las partículas son
similares a las descritas en la exposición sobre cromatografía de adsorción, de reparto en fase
normal y reversa, de intercambio iónico y de columna de exclusión molecular. Las fases móviles se
asemejan también a las que se emplean en cromatografía de líquidos de alta resolución.
Una placa de capa fina se prepara esparciendo una suspensión acuosa del sólido
(finamente molido) sobre la superficie limpia de una placa de vidrio o plástico, o de un portaobjeto
de microscopio. Con frecuencia, se incorpora un aglomerante a la suspensión acuosa para
reforzar la adhesión de las partículas sólidas al vidrio, y de unas con otras. Se deja entonces que
la placa repose hasta que la se asiente y se adhiera firmemente a la superficie; para ciertos
propósitos se puede calentar en un horno durante varias horas. Algunas tiendas de materiales
químicos las ofrecen pre-recubiertas de diversos tipos.
El desarrollo de la placa equivale al proceso en el cual la muestra es transportada a través
de la fase estacionaria mediante una fase móvil. Es análogo a la elusión en la cromatografía de
líquidos. El modo más común de desarrollar una placa consiste en verter una gota de la muestra
cerca de uno de los bordes de la placa (las dimensiones de la mayoría de las placas son 5 x 20 o 20
x 20 cm) y marcar su posición con un lápiz. Una vez que el disolvente de la muestra se ha
evaporado, la placa se coloca en un recipiente cerrado, saturado con los vapores del disolvente de
desarrollo, el eluyente. Un extremo de la placa se sumerge en el eluyente, teniendo cuidado de
evitar el contacto directo entre la muestra y el disolvente. Cuando el eluyente ya ha recorrido la
mitad o dos tercios de la longitud de la placa, se retira ésta del recipiente y se la deja secar.
Entonces se determinan las posiciones de los componentes por distintas formas.
Se emplean varios para localizar los componentes de la muestra después de la
separación. Dos técnicas comunes que pueden aplicarse a la mayor parte de las mezclas
orgánicas consisten en rociar la muestra con una disolución de yodo o ácido sulfúrico, pues estas
sustancias reaccionan con los compuestos orgánicos y dan lugar a productos oscuros. Hay varios
reactivos específicos (como la ninhidrina) que son útiles también para localizar especies
separadas. Otra técnica de detección se basa en incorporar un material fluorescente a la fase
estacionaria. Después del desarrollo, la placa es examinada bajo luz ultravioleta. Los
componentes de la muestra inhiben la florescencia del material, de modo que toda la placa brilla,
excepto en los lugares en donde se localizan los componentes de la muestra, no fluorescente.

Electroforesis: técnica de separación basada en las diferencias en la velocidad de migración de

especies cargadas en un campo eléctrico aplicado. La electroforesis a escala macro se ha
 Técnicas de separación
aplicado a diversos problemas de separación analítica difíciles: aniones y cationes inorgánicos,
aminoácidos, catecolaminas, fármacos, vitaminas, carbohidratos, péptidos, proteínas, ácidos
nucleicos, nucleótidos, polinucleótidos, entre otras especies. Una ventaja particular de la
electroforesis es su capacidad única para separar macromoléculas cargadas que son de interés
para bioquímicos, biólogos y químicos clínicos. Durante muchos años, la electroforesis ha sido la
técnica más poderoso para la separación de proteínas (enzimas, hormonas, anticuerpos) Y ácidos
nucleicos (ADN, ARN), para lo cual ofrece una resolución sin igual.

BIBLIOGRAFÍA

Därr, A. 1979. Tecnología Farmacéutica. Ed. Acribia. España. 366 pp.

Evans, W. C. 1989. Farmacognosia. 13ª Edición. Ed. Interamericana. México. 134-150 p.
Kuklinski, C. 2000. Farmacognosia. Estudio de las drogas y sustancias medicamentosas de origen natural .
Ed. Omega. Barcelona España. 32-42 p.
Pietrzyk, J. y Frank, C.W. 1979. Analytical chemistry. 2ª Edición. Academic Press. New York. pp 699
Rouessac, F y Rouessac, A. 2002. Chemical analysis. Modern Instrumentation Methods and Techniques. 4ª
Edición. J. Wiley. London. pp 445
San Martín, C. 1977.Tratado de Farmacognosia. Editorial Científico Médica. Barcelona, España. pp 1114
Sherma, J. y Fried, B. 1991. Handbook of Thin-Layer Cromatografy. M. Dekker. pp 1021
Skoog, D.A., West, D.M., Holler, F.J. y Crouch, S.R. 2005. Fundamentos de Química Analítica. 8ª Edición.
Thomson Editores. España. pp 1065
Tyler, V. E.; Brady, L. R. & Robbers, J. E. 1979. Farmacognosia 2ª Edición. Editorial El Ateneo. pp. 450
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APÉNDICE A
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