LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR

GUÍA No. 4 CARIOTIPO

1. OBJETIVOS

 Relacionar las malformaciones cromosómicas con la transmisión y expresión del

material genético de una generación a otra.

 Interpretar las variaciones génicas y cromosómicas.

 Proporcionar al estudiante elementos teórico-prácticos para caracterizar

cromosómicamente a un organismo, tejido o célula, usando técnicas citogenéticas
modernas.

2. REFERENTES TEÓRICOS

Los seres humanos poseen 23 pares de cromosomas, 22 pares iguales denominados

autosomas y un par diferente ligado al sexo del individuo (heterocromosoma). Los grupos
de cromosomas que comprenden el cariotipo humano son los siguientes:

- Cromosomas grandes
Grupo A, (cromosomas 1, 2 y 3), meta y submetacéntricos.
Grupo B, (cromosomas 4 y 5), submetacéntricos.

- Cromosomas medianos
Grupo C, (cromosomas 7, 8, 9, 10, 11, 12 y además los cromosomas X) submetacéntricos.
Grupo D, (cromosomas 13, 14 y 15) acrocéntricos.

- Cromosomas pequeños
Grupo E, (cromosomas 16, 17 y 18) submetacéntricos.
Grupo F, (cromosomas 19 y 20) metacéntricos.
Grupo G, (cromosomas 21 y 22) acrocéntricos.

Por acuerdo los cromosomas sexuales Y y X se separan de sus grupos correspondientes y

se ubican al final del cariotipo, como se ven representados en la figura 1.
 Figura 1. Representación gráfica de los cromosomas humanos.

Con el estudio del cariotipo se pueden identificar y/o confirmar síndromes congénitos,
anomalías congénitas, problemas de esterilidad. Para determinar el cariotipo de un
individuo, es necesario llevar a cabo un cultivo de células y, cuando estas comienzan a
dividirse, realizar una tinción y hacer una preparación microscópica para fotografiar los
cromosomas.

Para ampliar el marco teórico pueden relacionar información sobre:

 ¿Qué es un cromosoma y cuáles son sus partes?

 ¿Cuál es la clasificación de las anomalías o alteraciones cromosómicas? Explíquelas.

 Mencionar dos características de cada grupo de cromosomas que se ven en un

cariotipo humano.

 ¿Cuál ha sido el desarrollo histórico de identificación del cariotipo? Realice una línea de
tiempo.

 ¿En qué consiste puntualmente el proceso de identificación del cariotipo? ¿Cuál es la

importancia o relación de este procedimiento con el diagnóstico de enfermedades y
síndromes?
  Dé una explicación sucinta del ciclo celular, haciendo énfasis en la etapa empleada
para la identificación de los cromosomas.

 ¿Qué función cumple cada uno de los reactivos empleados?

3. MATERIALES Y REACTIVOS

 Muestra biológica conservada bajo estrictas condiciones de esterilidad (sangre

periférica con heparina como anticoagulante).
 Campana de flujo laminar.
 Envase de vidrio de 10 ml con corcho de caucho.
 Etanol absoluto en spray.
 Papel parafilm.
 RPMI 160 (16g/L).
 Suero fetal de bovino (SFB) (5%v/v).
 Fitohemaglutinina (PHA).
 Solución penicilina – estreptomicina.
 Solución Colcemid o colchicina 10µg/L.
 Solución hipotónica de Cloruro de potasio KCl 0.075M a 36.5°C.
 Solución fijadora o carnoy fría(3:1 metanol absoluto - ácido acético glacial).
 Solución de tinción Giemsa (3 ml de buffer 6.8 + 6 gotas de colorante Geimsa) preparar
al momento de usar.
 Incubadora.
 Centrífuga.
 Tubos Falcon.
 Pipetas Pasteur.
 Láminas.
 Laminillas.
 Gasa para limpiar las láminas.

Por grupo de cuatro (4) estudiantes deben traer los siguientes materiales:

 Una botella de alcohol industrial.

 Un par de tijeras por cada estudiante.
 Pegante.
 Una copia impresa de las imágenes (preferiblemente en papel grueso fotográfico o
cartulina) y cuatro copias del formato que encuentran al final de ésta guía.
4. PROCEDIMIENTO

El procedimiento de esta práctica se debe realizar bajo estrictas normas de esterilidad. Las
láminas empleadas para el montaje de las muestras, se deben conservar en solución
fijadora durante 3 días para garantizar su esterilización.

4.1 CULTIVO CITOGENÉTICO

Los procedimientos 4.1.1 a 4.1.3 se realizarán el sábado anterior al día en que se

desarrollará la práctica.

4.1.1 Toma de muestra

Se realiza la toma de muestra de sangre periférica aproximadamente 4 cc en tubo
de muestreo con heparina como anticoagulante, homogenizar y guardar.

4.1.2 Esterilización de materiales y equipos

Esterilizar rociando con etanol absoluto las micropipetas, los recipientes de las
soluciones RPMI, SFB, PHA, la penicilina-estreptomicina.

4.1.3 Cultivo
Utilizando guantes, tapabocas, gorro y manteniendo las condiciones estériles, en
los envases para cultivo previamente esterilizados por calor, agregar:

Cultivo viernes Cultivo sábado

SOLUCIÓN
VOLUMEN EN µL
RPMI 6000 4500
SFB 900 750
PHA 267 200
Penicilina - estreptomicina 133 100
Sangre 500 500

Tapar con el corcho (previamente flameado). Los cultivos se mantienen en la

incubadora a 36,5 - 37°C, concentración de CO2 5% y humedad del 95% durante 72
horas.

4.2 LIMPIEZA DE LÁMINAS

4.2.1 Usar doble par de guantes de nitrilo.

4.2.2 El día del cultivo dejar en un beacker grande las láminas que se van a emplear
sumergidas en solución de Carnoy.
4.2.3 El día de la cosecha retirar las láminas de la solución de Carnoy y limpiarlas con
gasa para eliminar cualquier rastro de grasa, no utilizar láminas que se encuentren
rayadas. Una vez limpias y secas, marcarlas con lápiz punta de diamante con el
código de la muestra y la fecha. (Éste proceso se puede realizar mientras se
centrifugan las muestras).

4.3 COSECHA

4.3.1 Durante el desarrollo de la práctica debe permanecer un mechero encendido por

mesón, de esta manera se mantiene el ambiente a una temperatura estable.

4.3.2 En ambiente estéril, con guantes de nitrilo, tapabocas y gorro sacar los tubos de la
incubadora, la coloración debe ser rojo sangre, si es de otra tonalidad descartar
por presentar hemolisis. Para verificar la viabilidad del cultivo, tomar una pequeña
alícuota con una micropipeta (20 a 100 µL), depositarla sobre una lámina, colocar
laminilla y observar al microscopio, identificar la presencia de linfocitos vivos.

4.3.3 Si la muestra es viable, al recipiente con el cultivo, agregar 200 µL de colchicina

[10μg/ml] o solución colcemyd y dejar incubar a 36,5 - 37°C durante 45 minutos,
pasado este tiempo, trasvasar la muestra a un tubo falcon de 15 ml, tapar y
centrifugar a 2000 RPM durante 20 minutos. Revisar el pellet, si la parte blanca del
mismo se encuentra en la parte superior, centrifugar nuevamente durante 10
minutos a 2000 RPM.

4.3.4 Retirar el sobrenadante con pipeta pasteur o con un solo movimiento, tratando de
no romper el pellet. Inclinando suavemente y por las paredes del recipiente
adicionar 1 ml de solución hipotónica de KCl 0.075Ma 36.5°C, resuspender
suavemente, aforar a 7 ml con solución hipotónica, homogenizar suavemente por
inversión sin generar espuma. Incubar nuevamente a 36,5°C – 37°C por 15
minutos si la temperatura ambiente es superior a los 18°C, de lo contrario dejar 25
minutos.

4.3.5 Agregar 2 ml de solución fijadora (solución de carnoy), homogenizar suavemente

por inversión y centrifugar a 2000 RPM durante 15 minutos.

4.3.6 Eliminar el sobrenadante, adicionar 1 ml de solución fijadora (solución de carnoy),

resuspender suavemente, aforar a 7 ml con solución fijadora y homogenizar.
Centrifugar nuevamente a 2000 RPM durante 10 minutos. Desechar el
sobrenadante. El lavado con solución fijadora se repite hasta que el sobrenadante
sea transparente y el pellet sea blanco.
4.4 MONTAJE

4.4.1 Al pellet obtenido en el procedimiento anterior, agregarle aproximadamente 1 ml

de solución fijadora y resuspenda.

4.4.2 Una lámina de las que limpió en el procedimiento 4.2, colocarla en el piso con un
ángulo de inclinación de 45° aproximadamente. Tomar la muestra resuspendida
con una pipeta pasteur, realizar el montaje sobre la lámina, dejando caer sobre la
lámina, desde una altura de 150 cm, dos o tres gotas. Las gotas no pueden quedar
sobrepuestas. Dejar secar la lámina al aire.

4.5 TINCIÓN

4.5.1 Filtrar el colorante Giemsa, empleando un papel filtro y un embudo.

4.5.2 Con una pipeta pasteur cubrir las láminas con la solución de Giemsa, agregando
aproximadamente 4 ml (realizar este proceso en el lugar indicado para ello), dejar
actuar el colorante por 15 minutos, lavar adicionando agua corriente con un vaso
de precipitado, dejar secar y observar al microscopio de campo claro.

4.5.3 Una vez secas las láminas, llevar al microscopio y realizar el conteo metafasético
(objetivo 40X), que consiste en contar 100 células, indicando cuantas se
encuentran en metafase y cuantas no.

4.5.4 Localizar cromosoma e identificar los diversos tipos. En el caso de cromosomas

acrocéntricos identificar los tallos y satélites y realizar repeticiones de las
observaciones para comprobar la constancia en la composición cromosómica.
Tomar fotografías.

5. ANÁLISIS DE RESULTADOS

Para el análisis de resultados tenga en cuenta los siguientes aspectos:

 Realice un análisis detallado de cada una de las soluciones y/o mezclas obtenidas en el
laboratorio, teniendo en cuenta sus componentes y la acción que realiza cada uno de
ellos.

 Explique la importancia del manejo de los tiempos durante el desarrollo de la práctica,

en especial el del cultivo por 72 horas.
 Justifique por qué se realiza el montaje por goteo desde una altura de 150cm.

 Organizar en el formato los cariotipos que encuentra al final de la guía y realizar el

diagnóstico de cada uno de ellos. Para que le sea más fácil el manejo de las imágenes,
imprímalas en papel grueso (cartulina o fotográfico). Realice el diagnóstico de cada uno
de ellos y justifíquelos desde las características principales de cada una de las
cromosopatías identificadas en ellos.

 Sobre las fotografías tomadas de los cromosomas, indique su clasificación, para ello
emplee el formato que encuentra al final de ésta guía.

6. PREGUNTAS ADICIONALES
En el informe de laboratorio responda las siguientes preguntas:
 Consulte los criterios sobre los cuales se elabora un cariotipo.

 Indague bajo qué criterios, quién y cuándo puede solicitar el cariotipo como una
herramienta de diagnóstico.

 De una explicación sucinta de las técnicas de bandeo G, R, C, Q y fish.

7. BIBLIOGRAFÍA

Gardner, R.J.M. and Sutherland, G.R. (1996) Chromosome Abnormalities and Genetic
Counseling. 2a ed. New York. Oxford University Press. 478 p.

Hillis, M. David, Moritz, Craig and Mable, Bárbara. (1991) Molecular Systematics. Ed.
Sinauer Associates Inc. Publishers.

Luque, J., y Herráez, Á. (2012). Texto ilustrado de Biología Molecular e Ingeniería

Genética. España: Ed. Elsevier

Rooney, D. (2001) Human Cytogenetics: Constitutional Analysis. A Practical Approach.

Tercera Edición. Oxford University Press.

Salamanca, F. (1993) Citogenética Humana: Fundamentos y Aplicaciones Clínicas. Editorial

Médica Panamericana. Primera Edición.

Segal, C. (2005). Manual de Prácticas Biología Molecular de la Célula L. México: UNAM

Sessions, K. Stanley. 1996. Chromosomes: Molecular Cytogenetics. In: Hills, D.M., Moritz,
C. &

Snustad, D., Simmons, M., y Jenkins, J. (1997) Principles of Genetics. Editorial John Wiley
and Sons, Inc. Primera Edición.

Solari, A. (1999) Genética Humana: Fundamentos Y Aplicaciones en Medicina. Editorial

Médica Panamericana. Segunda Edición.

Suzuki, D.T. Griffiths, A.J.F., Miller, J.H. and Lewontin, R.C. (1992) Genética. 4 a ed.
Editorial Interamericana Mc Graw Hill.

Zavala, J. (2005). Manual de Técnicas Básicas de Biología Molecular. Mérida: Ediciones de

la Universidad Autónoma de Yucatán

7. PLANTILLAS DE CORRECCIÓN
Debe incluirlas en el documento según corresponda.

7.1 Plantilla para preinforme

NOTA NOTA
ITEM
MÁXIMA OBTENIDA
ENCABEZADO 0,1
OBJETIVOS 0,2
PREGUNTAS 1,0
LISTA DE MATERIALES 0,5
FICHAS DE SEGURIDAD DE REACTIVOS 1,0
DIAGRAMAS DE FLUJO
Cultivo 0,2
Cosecha 0,4
Limpieza de láminas 0,2
Montaje y tinción 0,4
Organización de cariotipos 0,3
BIBLIOGRAFÍA 0,5
REDACCIÓN Y ORTOGRAFÍA 0,2
TOTAL 5,0
7.2 Plantilla para informe

NOTA NOTA
ITEM
MÁXIMA OBTENIDA
ENCABEZADO 0,1
OBJETIVOS 0,3
RESULTADOS
Cultivo 0,2
Cosecha 0,2
Montaje y tinción 0,2
Organización de cariotipos 0,2
ANÁLISIS DE RESULTADOS
Cultivo 0,4
Cosecha 0,5
Montaje y tinción 0,4
Organización de cariotipos 0,4
PREGUNTAS 0,5
CONCLUSIONES
Cultivo 0,2
Cosecha 0,3
Montaje y tinción 0,2
Organización de cariotipos 0,2
BIBLIOGRAFÍA 0,5
REDACCIÓN Y ORTOGRAFÍA 0,2
TOTAL 5,0
 FORMATO PARA LA ORGANIZACIÓN DE CROMOSOMAS

CARIOTIPO:
________________________________________

Dx:
______________________________________________

1 2 3 4 5

6 7 8 9 10 11 12

13 14 15 16 17 18

19 20 21 22 X Y
CARIOTIPO 1
CARIOTIPO 2
CARIOTIPO 3
CARIOTIPO 4