MEDIOSS DE CULTIVO

Un material nutritivo preparatio para el crecimiento de microorganismos en un laboratorio se denomina

medio de cultivo. Algunas bacterias pueden crecer bien en casi cualquier medio de cultivo; otras requieren
medios especiales y otras no pueden crecer en ninguno de los medios inertes exis- tentes hasta ahora. Los
microbios que se introducen en un medio de cultivo para que comiencen a crecer se denominan inoculo. Los
microbios que crecen y se multiplican en un medio de cultivo se denominan cultivo.
' Supóngase que se desea cultivar un microorganismo deter- minado, tal vez los microbios provenientes de
una muestra clínica particular. ¿Qué criterios debe satisfacer el medio de cultivo? Primero, debe contener
los nutrientes adecuados para el microorganismo específico que se desea desarrollar. También debe
contener humedad suficiente, un pH ajustado de mai\era apropiada y una concentración conveniente de
oxígeno, tal vez ausente por completo. El medio que se va a sembrar debe ser estéril, es decir, en un
principio no debe contener microorganismos viables, de modo que el cultivo contenga sólo los microbios (y
su descendencia) que se agre- guen al medio. Por último, el medio de cultivo sembrado debe incubarse a la
temperatura correcta.
Se dispone de una amplia variedad de medios de cultivo para el crecimiento de microorganismos en el
laboratorio. Casi todos esos medios, disponibles en el comercio, están constituidos por componentes
mezclados con anterioridad y sólo precisan el agregado de agua y luego la esterilización. De manera
continua se elaboran y revisan medios de cultivo para ser utilizados en el aislamiento y la identificación de
bacterias que son de interés para los investigadores en los campos de la alimentación, el agua y la
microbiología clínica.
Cuando se desea que las bacterias se desarrollen sobre un medio sólido se agrega un agente solidificante
como el agar, que consiste en un polisacárido complejo proveniente de un alga marina que se utiliza desde
hace mucho tiempo como espesante de alimentos como jaleas y helados.
El agar posee algunas propiedades muy importantes que lo convierten en valioso para la microbiología y
nunca se encontró un sustituto satisfactorio. Pocos microorganismos pueden degradar el agar, de modo que
permanece en estado sólido. Además, el agar se licúa a una temperatura de alrededor de 100 °C (el punto
de ebullición del agua) y al nivel del mar permanece líquido hasta que la temperatura disminuye a cerca de
40 °C. Para el uso en el laboratorio el agar se mantiene en baños de agua a 50 °C. A esta temperatura no
altera a la mayor parte de las bacterias cuando se vierte sobre ellas (como se muestra en lafig. 6.16a). Una
vez que el agar se solidifica puede incubarse a temperaturas que se aproximan a los 100°C antes de c^ue
vuelva a licuarse; esta propiedad es particularmente útil cuando se desea cultivar bacterias termó- filas.
Los medios con agar suelen utilizarse en tubos de ensayo o placas de Petri. Los tubos de ensayo se
denominan tubos en pico de flauta o inclinados cuando el medio se solidifica manteniendo el tubo en un
ángulo adecuado para lograr una gran superficie para el crecimiento. Cuando el agar se solidifica en un tubo
de posición vertical, se denomina profundo. Los cultivos en placas de Petri, denominadas así en honor a su
inventor, se realizan en placas poco profundas con una tapa que cubre perfectamente la base para evitar la
contaminación.
MEDIOS DE CULTIVO
QUÍMICAMENTE DEFINIDOS
Para favorecer el crecimiento microbiano un medio debe proporcionar una fuente de energía así como
fuentes de carbono, nitrógeno, azufre, fósforo y cualquier otro factor de crecimiento que el organismo no
pueda sintetizar. Un medio químicamente definido es uno del que se conoce la composición química exacta.
En el caso de un organismo quimioheterótro- fo, el medio químicamente definido debe contener factores de
crecimiento orgánicos que actúen como fuente de carbono y energía. Por ejemplo, como se muestra en el
cuadro 6.2, se incluye glucosa en el medio para favorecer el crecimiento de la bacteria quimioeterógrafa E.
cali.
Como se describe en el cuadro 6.3, para cultivar especies de Neisseria deben agregarse muchos factores de
crecimiento orgánicos al medio químicamente definido utilizado (p. 320). Los organismos que requieren
varios factores de crecimiento se describen como “microorganismos con requerimientos especiales de
crecimiento”. Los organismos de este tipo, como Lactobacillus (p. 332), algunas veces se utilizan en pruebas
que determinan la concentración de una vitamina en una sustancia particular. Para llevar a cabo este ensayo
microbiológico se prepara un medio de crecimiento que contenga todos los requerimientos necesarios para
el desarrollo de la bacteria excepto la vitamina que se va a evaluar. Luego se combinan el medio, la sustancia
de prueba y la bacteria y se mide el ere-cimiento de bacterias. Este crecimiento bacteriano, que se refleja en
la cantidad de ácido láctico producido, será proporcional a la cantidad de vitamina presente en la sustancia
de prueba. Cuanto más ácido láctico se haya producido más células de Lactobacillus habrán podido crecer,
de modo que la cantidad de vitamina será mayor.

MEDIOS COMPLEJOS
Los medios químicamente definidos suelen reservarse para el trabajo experimental del laboratorio o para el
crecimiento de bacterias autótrofas. Casi todas las bacterias heterótrofas y los hongos, como aquellos con
los que se trabaja en un curso de introducción al laboratorio, se cultivan de modo sistemático en medios
complejos, compuestos por nutrientes como extractos de levaduras, carne o plantas o digeridos de
proteínas de estas y otras fuentes. Entre los diferentes lotes del medio puede haber leves variaciones de la
composición química.
En el cuadro 6.4 se muestra una fórmula utilizada con mucha frecuencia.
En los medios complejos los requerimientos de energía, carbono, nitrógeno y azufre de los microorganismos
son aportados sobre todo por las proteínas. Las proteínas son moléculas grandes y relativamente insolubles
que sólo la minoría de los microorganismos pueden utilizar de forma directa, si bien una digestión parcial
por ácidos o enzimas las reducen a cadenas más cortas de aminoácidos denominadas peptonas. La mayoría
de las bacterias pueden digerir estos fragmentos pequeños y solubles.
Los extractos de carne o de levadura le proporcionan al medio las vitaminas y otros factores de crecimiento
orgánicos. Las vitaminas y los minerales solubles provenientes de las carnés o las levaduras se disuelven en
el agua de extracción, que luego se evapora de modo que se produce una concentración de estos factores;
estos extractos también proporcionan nitrógeno orgánico y compuestos de carbono. Los extractos de
levadura tienen contenidos particularmente elevados de vita- minas del complejo B. Si un medio complejo
se halla en una forma líquida se denomina caldo nutritivo. Cuando se agrega agar se denomina agar
nutritivo. (Esta terminología puede generar confusiones; recuérdese que el agar propiamente dicho no es un
nutriente.)

MEDIOS SELECTIVOS Y DIFERENCIALES

En los procedimientos de microbiología clínica y de salud pública con frecuencia es necesario detectar la
presencia de microorganismos específicos asociados con enfermedad o malas condiciones higiénicas. Para
esta tarea se utilizan medios selectivos y diferenciales. Los medios selectivos están diseñados para suprimir
el crecinyento de bacterias no deseadas y favorecer el crecimiento de las deseadas. Por ejemplo, el agar
sulfito de bismuto se utiliza para aislar la bacteria gram- negativa que produce la fiebre tifoidea, Salmonella
typhi, de las heces. El sulfito de bismuto inhibe a las bacterias gramposi- tivas y también a la mayor parte de
las bacterias intestinales gramnegativas (distintas de S. typhi). El agar dextrosado de Sabouraud, con un pH
de 5,6, se utiliza para aislar hongos que se desarrollan mejor que la mayor parte de las bacterias a este pH.
Los medios diferenciales permiten distinguir con mayor facilidad las colonias del microorganismo deseado
de otras colonias que crecen en la misma placa. De manera similar, los cultivos puros de microorganismos
tienen reacciones identifi- cables con los medios diferenciales, sea en tubos o en placas. El agar sangre (que
contiene eritrocitos) es un medio muy uti- lizado por los microbiólogos para identificar especies bacterianas
que destruyen los eritrocitos. Estas especies, como la bacteria Streptococcus pyogenes que causa la angina
estreptocóci- ca, muestran un halo claro alrededor de sus colonias (beta-hemólisis, p. 333) donde han Usado
los eritrocitos circundantes (fig. 6.8).
En ocasiones se combinan las características selectivas y diferenciales en un único medio. Supóngase que se
desea aislar la bacteria común Staphylococcus aureus, encontrada en la vía aérea nasal. Este
microorganismo tolera las concentraciones elevadas de cloruro de sodio; además puede fermentar el
hidrato de carbono manitol para formar ácido. El agar mani- tol salado contiene 7,5% de cloruro de sodio,
que inhibe el crecimiento de otros microorganismos y por ende selecciona (favorece el crecimiento de) S.
aureus. Este medio con alto contenido de sal también contiene un indicador de pH que cambia el color si se
produce la fermentación del manitol en el medio con formación de ácido; por consiguiente, las colonias de
S. aureus que fermentan el manitol son diferenciadas de las colonias de bacterias que no lo fermentan. Las
bacterias que crecen en presencia de concentraciones elevadas de sales y fermentan el manitol con
producción de ácido pueden identificarse con facilidad por el cambio de color en el medio. Es probable que
estas colonias correspondan a S. aureus y su identificación puede confirnnarse con pruebas adicionales. En
la figura 6.9 se muestra el aspecto de colonias bacterianas en diversos medios diferenciales.

CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO
En ocasiones es necesario utilizar un cultivo de enriquecimiento porque las bacterias presentes en pequeña
cantidad pueden no detectarse, en especial si hay otras bacterias presentes en cantidades mucho mayores.
Esto sucede con frecuencia en muestras de suelo o materia fecal. El medio (medio de enriquecimiento) para
un cultivo de enriquecimiento suele ser líquido y proporciona nutrientes y condiciones ambientales que
favorecen el desarrollo de un microbio particular pero no de otros. En este sentido también es un medio
selectivo, pero está destinado a aumeritar las cantidades muy pequeñas del microorganismo deseado hasta
niveles detectables.
Supóngase que se desea aislar de una muestra de suelo un microorganismo que puede crecer en presencia
de fenol y que se encuentra presente en cantidades mucho más pequeñas que otras especies. Si la muestra
de suelo se coloca en un medio de enriquecimiento líquido en el que el fenol es la única fuente de carbono y
energía, los microorganismos que no puedan metabolizar el fenol no se desarrollarán. El medio de cultivo se
incuba durante algunos días y luego se transfiere una alícuota pequeña a otro recipiente con el mismo
medio. Tras una serie de pasajes la población sobreviviente estará constituida por bacterias capaces de
metabolizar el fenol. Entre estos pasajes se deja transcurrir cierto tiempo para que las bacterias se
desarrollen en el medio; este es el estadio de enriquecimiento (véase el recuadro del capítulo 28). Los
nutrientes del inoculo original se diluyen rápidamente con los sucesivos pasajes. Cuando la última dilución
se siembre en un medio sólido de la misma composición sólo se desarrollarán colonias de microorganismos
capaces de utilizar el fenol. Un aspecto destacable de esta técnica particular es que el fenol resulta letal para
la mayoría de las bacterias.

. La mayoría de los materiales infecciosos, como por ejemplo pus, esputo y orina, contienen varias
clases diferentes de bac- terias, lo que también sucede con las muestras de suelo, agua
o alimento. Si estos materiales se siembran en una placa en la superficie de un medio sólido se formarán
colonias que serán copias exactas del microorganismo original. En teoría una colonia visible se origina en
una única espora o célula vege- tativa o en un grupo de los mismos microorganismos adherí- dos entre sí en
agregados o cadenas. Las colonias microbianas a menudo tienen un aspecto distintivo que distiiigue los
microorganismos entre sí (véase fig. 6.9). Las bacterias deben distribuirse de un modo lo bastante amplio
como para que las colonias estén visiblemente separadas entre sí.
La mayor parte de los trabajos bacteriológicos requieren cultivos puros, o clones, de bacterias. El método de
aislamiento empleado con más frecuencia para obtener cultivos puros es el método de siembra por estría
en placa (fig. 6.10). Se introduce un ansa de inoculación estéril en un cultivo mixto que contenga más de un
tipo de microbio y se lo distribuye en forma estriada sobre la superficie del medio nutritivo; las bacterias se
desprenden del ansa y pasan al medio. Las últimas células que se desprenden del ansa están bastante
separadas como para crecer en colonias aisladas. Estas colonias pueden tomarse con un arisa de inoculación
y sembrarse en un tubo de ensayo que contenga el medio nutritivo para formar un cultivo puro de un solo
tipo de bacteria.
El método de siembra por estría en placa funciona bien cuando el microorganismo que se desea aislar está
presente en grandes cantidades en relación con la población total. En cambio, cuando el microorganismo
que se desea aislar está presente sólo en cantidades muy pequeñas estas deben incrementarse
mediante el empleo de un enriquecimiento selecti- vo antes de que se lo pueda aislar con el
método de siembra por estría en placa.