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UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS

GUIA PRÁCTICA MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL

MSc. ROBERTO VENTURA FLORES

Biólogo - Microbiólogo

LAMBAYEQUE 2019

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


CONTENIDO

Practica 1: Bioseguridad y buenas prácticas

Practica 2: Reconocimiento de materiales y equipos de laboratorio

Practica 3: Construcción de biorreactor a escala de laboratorio

Practica 4: Uso de base de datos para investigación

Practica 4: Modelamiento de proteínas por Homología

Practica 5: Reconocimiento y observación bacteriana

Practica 6: Reconocimiento de mohos y levaduras

Practica 7: Preparación medios de cultivo

Practica 8: Siembra, aislamiento e identificación de bacterias

Practica 9: Presentación grafica del crecimiento microbiano.

Practica 10: Producción de yogurt.

Practica 11: Producción de vino

Practica 12: Producción de vinagre

Practica 13: Producción de amilasas

Practica 14: Streptomyces productor de antibióticos

Practica 15: Bacterias degradadoras de hidrocarburos de petróleo

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


MET FCCBB/UNPRG - 001
METODO Edición N0 01

BIOSEGURIDAD Y BUENAS PRACTICAS Página 1 - 4

OBJETIVO: Conocer los principios de bioseguridad, equipos de protección personal y realizar buenas
prácticas en Microbiología

MATERIALES

Materiales: Mechero bunsen o de alcohol, alcohol 70%, encendedor, plumón indeleble, bolsas de
bioseguridad 36x24, bolsas amarillas, bolsas negras, botellas descartables, papel kraft, tijeras, grapas

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, respirador N-95, jabón líquido.

PROCEDIMIENTO.
 Antes de ingresar al laboratorio el alumno debe realizar el correcto lavado de manos y luego
emplear los equipos de protección personal (mandil, guantes, gorro, etc.)
 Durante el proceso de las muestras biológicas, se deberá cerrar las puertas del laboratorio.
 Cada estudiante es responsable de cumplir las buenas prácticas de microbiología:
a. Uso adecuado de Equipos de protección personal (EPP)
b. Al iniciar y terminar cada jornada de practica el estudiante deberá limpiar las superficies
del laboratorio con alcohol al 70% o clorhexidina.
c. Ningún estudiante deberá guardar, beber o comer alimentos dentro del laboratorio.
d. Una vez concluido el proceso de muestras ambientales y biológicas (orina, heces, etc.)
deberán ser colocados en bolsas rojas para su posterior autoclavado.
e. Los residuos de orina y las reacciones de muestras heces contenidas en tubos de ensayo
deberán eliminarse directamente al desagüe con abundante agua y por ningún motivo
deberán dejarse en los depósitos donde se encuentra las láminas y las laminillas.
f. Los residuos químicos deberán ser eliminados en las bolsas de color amarillo; mientras
que los residuos comunes en el recipiente con bolsa negra.
g. Los residuos punzocortantes y materiales de vidrios rotos deben ser colocados en las
cajas o recipientes resistentes a la perforación.
h. Para evitar la liberación de aerosoles de muestras biológicas extendidos en láminas
portaobjetos deberán permanecer hasta su secado a temperatura ambiente en el mismo
lugar donde se realizó el proceso y por ningún motivo acelerar el secado con flama del
mechero.
 Al término de cada jornada práctica deberán asegurar el registro de todos los datos
observados en el cuaderno correspondiente de microbiología.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


Figura 1. Infografía adaptada: ¿Cómo lavarse las manos? según recomendaciones de OMS (5).
0. Mojase las manos con agua
1. Deposite en la mano una cantidad de jabón líquido suficiente para cubrir todas las superficies
de la mano.
2. Frótese las palmas de la mano entre sí.
3. Frótese la palma de la mano derecha contra el dorso de la mano izquierda entrelazando los
dedos y viceversa
4. Frótese las palmas de las manos entre sí, con los dedos entrelazados.
5. Frótese el dorso de los dedos de una mano con la palma de la mano opuesta, agarrándose los
dedos.
6. Frótese con un movimiento de rotación el pulgar izquierdo, atrapándolo con la palma de la
mano derecha y viceversa.
7. Frótese la punta de los dedos de la mano derecha contra la palma de la mano izquierda,
haciéndose un movimiento de rotación y viceversa.
8. Enjuagase las manos con agua.
9. Séquese con una toalla desechable
10. Sírvase de la toalla para cerrar el grifo
11. Sus manos son seguras

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RESULTADOS Y DISCUSIÓN
a) En el siguiente cuadro describa 5 peligros de uno de sus laboratorios con su respectivo riesgo
y consecuencia

Peligro Riesgo Consecuencia


1

2
3

b) Esquematice una planta industrial que conoces y un laboratorio de ingeniería química donde
realiza sus prácticas. Describa:
a. ¿Qué deficiencias encuentras?
b. ¿Qué nivel de bioseguridad consideras que presenta?
c. ¿Qué grupos de microorganismos manipularías en el laboratorio conociendo el nivel de
riesgo?

CUESTIONARIO
1. Enumerar 5 residuos que deberán ser eliminados en bolsas negras, 5 en bolsas rojas y 5 en
bolsas amarillas
2. Mencione 5 diferencias entre mascarilla y respirador
3. Según los grupos de riesgo, mencione 5 microorganismos involucrados en cada uno.
4. En la industria alimentaria que otros EPP se debe emplear.
5. Esquematice pictogramas de obligación y advertencia en un laboratorio de nivel 2.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Instituto Nacional de Salud. Manual de procedimientos bioseguridad en laboratorios de ensayo,


biomédicos clínicos. Serie de normas técnicas N° 18, Lima 2005; 107 pág.
http://www.bvs.ins.gob.pe/insprint/salud_publica/nor_tec/18.pdf
2. Ley 29783 de seguridad y salud en el trabajo. http://www.munlima.gob.pe/images/descargas/Seguridad-
Salud-en-el-
Trabajo/Ley%2029783%20_%20Ley%20de%20Seguridad%20y%20Salud%20en%20el%20Trabajo.pdf
3. OMS. Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, 3ª Ed. En español. 2005.
http://www.who.int/topics/medical_waste/manual_bioseguridad_laboratorio.pdf
4. Centro de control y prevención de enfermedades. Bioseguridad en laboratorios de microbiología y
biomedicina, 4ª Ed. En español. 2005 http://www.uib.cat/digitalAssets/195/195210_cdc_bmbl_4.pdf
5. OMS. Como lavarse las manos. Infografía 2010.
https://www.who.int/gpsc/information_centre/gpsc_lavarse_manos_poster_es.pdf?ua=1

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MET FCCBB/UNPRG - 002
METODO Edición N0 01
RECONOCIMIENTO DE MATERIALES Y EQUIPOS DE Página 1 - 2
LABORATORIO

INTRODUCCION

El laboratorio de microbiología es una infraestructura necesaria para realizar investigaciones,


experimentos, prácticas y trabajos de carácter científico; está dotado de equipos, medios de cultivos y
reactivos.
 Los Equipos, Aparatos, Materiales y Reactivos con los que cuente El laboratorio deben ser
ubicados en lugares que permitan su óptimo empleo, evitando colocaciones que contribuyan al
progresivo deterioro.
 Si se prepararan reactivos, todos estarán etiquetados con el nombre del compuesto, la
concentración, la fecha de preparación, la fecha de expiración, las condiciones de
almacenamiento y los riesgos que implica su manejo.
 Cada equipo y aparato tendrá una tarjeta de registro donde constataran sus características y las
observaciones pertinentes, una tarjeta de mantenimiento donde figurara la fecha y
especificaciones de cada procedimiento. Pero además se debe considerar:
 Diariamente: Inspección, aseo externo y/o verificación de temperatura del espectrofotómetro,
autoclave, balanza y micropipetas, etc.
 Semanalmente: cambio de agua y limpieza del Baño María y limpieza de la autoclave.
 Semestralmente: descongelamiento y limpieza de la refrigeradora. Tales procedimientos serán
registrados en tarjetas de reporte, en las que se consignaran: fecha, hora, procedimiento
ejecutado, nombre y firma del personal que lo efectuó

Esterilización: Proceso que consiste en la destrucción completa de todos los microrganismos como
bacterias, hongos, parásitos y partículas virales en forma irreversible (estado esporulado y
vegetativo). Ello se puede conseguir mediante esterilización física, gaseosa y esterilización química.
Los equipos más empleados en la esterilización física son la autoclave y el horno; en la
esterilización gaseosa el más empleado es el óxido de etileno y con menor frecuencia el
formaldehído gaseoso puesto que es un compuesto químico carcinogénico. Mientras que los
esterilizantes químicos más empleados son el ácido paracético y el glutaraldehído (2).

AUTOCLAVE: Es un recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un cierre hermético que
permite trabajar a alta presión para realizar una cocción o una esterilización con vapor de agua. Su
construcción debe ser tal que resista la presión y temperatura desarrollada en su interior. La presión
elevada permite que el agua alcance temperaturas superiores a los 100 °C. En microbiología la
temperatura empleada es de 121 ºC durante 15 minutos. La acción conjunta de la temperatura y el
vapor produce la coagulación de las proteínas de los microorganismos, entre ellas las esenciales para
la vida y la reproducción de éstos, hecho que lleva a su destrucción.

Horno: es comúnmente usado para deshidratar reactivos de laboratorio o secar instrumentos. El


horno aumenta su temperatura gradualmente conforme pase el tiempo, así como también sea su
programación, cuando la temperatura sea la óptima y se estabilice. Las temperaturas a considerar en
microbiología son: 160ºC/2 hora para esterilización de material de vidrio

Microscopio: instrumento formado por sistema de lentes con los que se consiguen imágenes
aumentadas de pequeños objetos. Son de dos clases; el de luz (óptico) y el electrónico según el
principio en el que se basa la amplificación.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


OBJETIVO: Reconocer equipos de laboratorio y preparar reactivos más comunes empleados en
microbiología
MATERIALES: probeta graduada de 100 mL, matraz Erlenmeyer de 250 mL, propipetas de jebe de
50 mL, tubos de vidrio estériles con tapa rosca de 16x125 mm y 13x100 mm, placas petri de 90 mm
de diámetro, parafilm, papel aluminio, crioviales, tubos de polipropileno de base cónica estériles de 15
mL de tapa rosca, gradillas para tubos de 16x125 mm, porta y cubreobjetos, plumón indeleble, bolsas
de bioseguridad 36x24. papel toalla, jabón líquido.

Figura 1. Materiales de laboratorio empleados en microbiología: a) Mechero bunsen; b) Vaso de


precipitación; c) Matraz; d) Probeta; e) Placas Petri; f) Tubos de ensayo; g) Asa microbiológica; h)
Pipetas; i) Micro pipeta monocanal; j) Micro pipeta multicanal; k) mortero; l) Piseta.

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Figura 2. Equipos empleados en microbiología: a) Microscopio; b) Balanza analítica;

c) Centrifuga; d) Estufa; e) Autoclave; f) Baño maría.

 El siguiente formulario deberá ser llenado por cada estudiante (describir 5 equipos de su
facultad)

FORMULARIO FOR-001 UNPRG


CONTROL DE USO DE EQUIPOS DE Edición Nº 1
LABORATORIO Página 1 de 1
Descripción del equipo de laboratorio
Equipo Marca Serie

Código patrimonial Ficha técnica Ubicación

Hora de Hora de
Fecha usuario Observaciones
inicio termino

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


METODO MET FCCBB/UNPRG - 003
Edición N0 01
CONSTRUCCIÓN DE BIORREACTOR A ESCALA DE
Página 1 - 2
LABORATORIO

OBJETIVO:

Diseñar, construir y funcionar un biorreactor a escala de laboratorio.

MATERIALES

Equipos: Laptop, retroproyector

Materiales: Botellas de vidrio y de plástico de 250 mL, 500 mL y un litro de capacidad, damajuanas
de 5 litros, tapones de jebe Nº 7 y 9, bomba de aireación, sistema de esterilización por vapor, silicona
o soldimix, manguera siliconada de 0.5 mm de diámetro, tubería hueca de 8 mm de diámetro, reglas
de 30 cm, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, taladro, recipiente para punzocortantes.

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

PROCEDIMIENTO

1. Construcción de Biorreactor columna de burbujeo

Construir un biorreactor de material de plástico y vidrio con accesorios caseros para un volumen
de 2 litros según figura 1

Tamaño del biorreactor

 Altura del tanque (HT): 33 cm

 Altura del líquido (HL): 18 cm

 Diámetro del tanque (DT): 10 cm

 HT / DT: 3.3 cm

 HL /DT: 1.8 cm

 Volumen: 2 Litros

Figura 1: diagrama de Biorreactor


columna de burbujeo

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RESULTADOS

Figura 2. Construcción Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de


de un fermentador burbujeo para producción de vinagre y vino

Practica 3: Esquematice un sistema de esterilización por vapor

Cuestionario:

1. Cuál es la utilidad del fermentador

2. Esquematice un biorreactor de escala industrial señalando sus partes.

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MET FCCBB/UNPRG - 004
METODO Edición N0 01
USO DE BASE DE DATOS PARA INVESTIGACIÓN Página 1 - 2

OBJETIVO:

Conocer el acceso y vinculación a diferentes bases de datos disponibles en el internet con fines de
investigación.

MATERIALES
Equipos: Laptop, retroproyector
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

PROCEDIMIENTO:
 Base de datos: Son sitios de internet que contienen información con validación
experimental, actualizada y dinámica de datos: National Center for Biotechnology Information
(NCBI), Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), Uniprot BioCyc Pathway/Genome
Database Collection, Human Metabolome Database (HMDB), Argenfoods, etc.
1. Ingreso a la base de datos NCBI para búsqueda de Artículos científicos
 Ingresar al google y escribir NCBI.
 Hacer click en la base National Center for Biotechnology Information:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
 Asegurarse que en la pestaña diga “ALL Databases” y escribir una o dos palabras
claves de un tema de interés de preferencia en ingles y luego presionar search.
 Hacer click en la opción PubMed central - Full-text journal articles.
 Seleccionar el artículo de interés y guardar en una carpeta.

2. Ingreso a la base KEGG


 Ingresar al google y escribir KEGG.
 Hacer click en la base Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes:
https://www.genome.jp/kegg/
 Seleccionar la opción KEGG pathway ingresar
 Desplazar la barra y escoger el tema de interés ejemplo Metabolic pathways
 Otra opción es realizar el análisis de rutas metabólicas de dos o más
microorganismos en este caso se deberá
a) Ingresar al google y escribir KEGG
b) Hacer click en la base Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes
c) Seleccionar la opción KEGG pathway Genomes [Pathogen | Virus | Plant]
Y en el recuadro, Define organism group (enter organism codes or T numbers)
escribir los códigos de dos microrganismos en minúsculas y separadas entre ellos por
un espacio ejemplo eco stc
d) Hacer click en GO
e) Buscar la opción Pathway map y hacer click en ella
f) Analizar los resultados

Tarea: analizar la ruta metabólica de dos microorganismos de impacto industrial y dos


microorganismos causante de infección por alimentos.
Docente: MSC. Roberto Ventura Flores
3. Ingreso a la base de datos BioCyc: HumanCyc
 Ingresar al google y escribir BioCyc: https://biocyc.org/
 Hacer click en la base BioCyc Pathway/Genome Database Collection
 En la opcion sites (ventana superior izquierda) hacer click en la opción HumanCyc
 Hacer click en la base en la opción Search y luego search pathway
 Escribir en la opción Search for pathway by name: glycolysis y luego click en submit
query
 Analizar los resultados desplazando la barra.
 Luego hacer click en More Detail y hacer el análisis desplazando la barra

4. Ingreso a la base de datos BioCyc: MetaCyc


 Ingresar al google y escribir BioCyc: https://biocyc.org/
 Hacer click en la base BioCyc Pathway/Genome Database Collection
 En la opcion sites (ventana superior izquierda) hacer click en la opción MetaCyc
 Hacer click en la base en la opción Search y luego search pathway
 Escribir en la opción Search for pathway by name: homolactic fermentation y en
search/filter by organism escribir Lactobacillis y luego click en submit query
 Analizar los resultados desplazando la barra.
 Luego hacer click en More Detail y hacer el análisis desplazando la barra
 Tarea: Analizar la ruta heterolactic fermentation y luego pyruvate fermentation to
ethanol I y II

5. Ingreso a la base de datos HMDB


 Ingresar al google y escribir HMDB: http://www.hmdb.ca/
 Hacer click en la base Human Metabolome Database (HMDB)
 Escribir glucose y seleccionar la opción pathway (margen superior izquierdo de su
pantalla)
 Hacer click en la opción Search
 Analizar los resultados en la primera imagen

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

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MET FCCBB/UNPRG - 005
METODO Edición N0 01

MODELAMIENTO DE PROTEÍNAS POR HOMOLOGIA Página 1 - 2

Objetivo:

Analizar la estructuras primaria, secundaria y estructura tridimensional de una proteína.


A) Obtención de la secuencia blanco:
1. Ingresar a la página de NCBI: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/
2. Buscar la opción Protein en la pestaña que dice “ALL Databases”
3. Colocar el nombre de la proteina blanco de interés en la ventana superior y presionar “search”.
(Ejemplo Lysozyme de Bos taurus), que para efectos de esta práctica buscar el código de
acceso AAC37312.1 Realizar el análisis desplazando la barra de la derecha de arriba hacia
abajo.
4. Hacer click en la opción FASTA.
5. Copiar la secuencia en formato fasta y pegarle en block de notas.
6. Guardar el archivo.
7. Tarea: analizar una proteína de interés
B) Modelamiento de una secuencia problema: PREDICCIÓN DE CARACTERÍSTICAS 2D

Ingresar a la página web JPred: http://www.compbio.dundee.ac.uk/www-jpred/, o - PsiPred:


http://www.predictprotein.org/
1. Copiar la secuencia de interés (Lysozyme de Bos taurus) y pegarla en el espacio rectangular
superior y hacer Click en la opción make prediction.
2. Desplazar la barra de la izquierda para ver los E-value.
3. Hacer click en la opción “continue”.
4. Se abrirá la ventana con los resultados y puede demorar unos minutos.
5. Analizar los resultados desplazando la barra de izquierda a derecha.
C) Modelamiento 3D de una secuencia proteica por Homología:
1. Acceder al servidor de swiss model http://swissmodel.expasy.org/
2. Click en star modelling
3. Introducir la secuencia problema a modelar: Lysozyme de Bos taurus
4. En la opción Untitled Proyect: escribir un título ejemplo unprg Lysozyme y en la opción
Optional escribir su correo electrónico
5. Hacer click en Build Model, el proceso demora unos segundos
6. Analizar los resultados: Global y Local Quality Estimate y Comparison
7. En la opción Carton, dar movimiento a la estructura 3D y al pasar el cursor se evidencia la
secuencia. Pero además identificar la hoja beta, alfa de la proteína, etc.
8. Otra opción de visualizar más grande la estructura es haciendo click en el triángulo de color
negro
9. Hacer el análisis del precursor de la IL -8 (ingrese al NCBI con el siguiente código:
NP_001003200.1) y luego identifique la hélice alfa y beta de la proteína

10. Tarea: Realizar el modelamiento de una proteína de interés identificando y señalando la


hélice alfa, beta y también el asa y el jiro. Del mismo modo asegurarse si ha sido cristalizado
por rayos X

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 1. Exploración de predicción de estructura secundaria de Lysozyme de Bos taurus empleando JPRED 4.

Figura 2. Resultado del modelamiento 3D de Lysozyme de Bos taurus empleando swiss model.

Figura 3. Diferentes representaciones del modelamiento 3D de Lysozyme de Bos taurus empleando

swiss model. a: modelo cartoon, b: modelo tube, c: modelo trace, d: modelo spacefill.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


MET FCCBB/UNPRG - 006
METODO
Edición N0 01

RECONOCIMIENTO Y OBSERVACIÓN BACTERIANA Página 1

OBJETIVO: Reconocer estructuras bacterias mediante observación microscópica empleando las


coloraciones diferenciales.
MATERIALES:
Material biológico: Yogur, cultivos microbianos, etc.
Reactivos: fucsina fenicada, azul de metileno, alcohol acido, alcohol acetona cristal violeta,
safranina.
EPP: Guantes, mandil, respirador, papel toalla, jabón líquido
Otros: lamina portaobjeto de 75 x 25 mm y lamina cubreobjetos de 22 x22mm, microscopio, plumón
indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24, piseta, mechero bunsen o de alcohol, encendedor, etc.
PROCEDIMIENTO
a) Examen directo
 En el centro de una lámina portaobjeto colocar una gota de agua destilada
 Tomar con el asa de kolle previamente flameada la muestra de yogurt y/o cultivo
bacteriano y homogenizar en la gota de agua formando una capa fina.
 Colocar una laminilla sobre la muestra
 Observar la muestra con objetivo 40X

b) Coloración GRAM: Emplea cuatro reactivos; Cristal violeta, solución de lugol, decolorante alcohol
acetona y safranina. El procedimiento se realizará de acuerdo a las recomendaciones establecidas
en el Manual de Procedimientos Bacteriológicos en Infecciones Intrahospitalarias (3):

 En el centro de una lámina portaobjeto realizar un frotis con ayuda de un asa bacteriológica de
una muestra ambiental (suelo) y biológico (orina, heces) y dejar secar a temperatura ambiente.
 Agregar sobre la muestra el reactivo Cristal Violeta y dejar durante 2 minutos, transcurrido el
tiempo lavar la lámina a chorro lento.
 El segundo paso consiste en agregar sobre la muestra la solución de Lugol, dejar durante un
minuto y transcurrido el tiempo lavar la lámina a chorro lento.
 Después agregar sobre la muestra el decolorante Gram alcohol acetona, dejar durante 30
segundos y transcurrido el tiempo lavar la lámina.
 Finalmente agregar el reactivo de safranina durante un minuto, luego lavar a chorro lento.
 Dejar secar la lámina y luego agregar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra.
 Observar la muestra con el objetivo 100X del microscopio
 Esquematizar las observaciones

CUESTIONARIO
1. Describir el fundamento de la coloración Gram.
2. Describir los fijadores físicos y químicos para las coloraciones diferenciales
3. Dibujar la pared celular de una bacteria Gram positiva y Gram negativa señalando cada una
de sus partes

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MET FCCBB/UNPRG - 007
METODO
Edición N0 01

RECONOCIMIENTO DE MOHOS Y LEVADURAS Página 1

OBJETIVO: Reconocer las estructuras fúngicas de mohos y levaduras


MATERIALES
Equipos: Microscopio.
Materiales: Gradillas para tubos de 20x150 mm, lamina portaobjeto de 75 x 25 mm y lamina
cubreobjetos de 22 x22mm, bisturí, pinzas, mechero bunsen, encendedor, plumón indeleble, bolsas
de bioseguridad 36x24. Ansas microbiológicas en punta

Reactivos: Hidróxido de potasio al 10% y azul de lactofenol


Muestra biológicas: Cultivos fúngicos, frutas en descomposición
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

PROCEDIMIENTO
a. Observación de estructuras fúngicas ambientales:
 Dejar pan y frutas en el ambiente durante 8 días o en todo caso cascaras de frutas en
estado de descomposición
 En dos láminas portaobjetos colocar una pequeña muestra de raspado de la región
afectada y colonizada del pan y de las frutas.
 A una de las láminas agregar 1gota de Hidróxido de potasio al 10% sobre la muestra y en
la otra lamina una gota de azul de lactofenol
 Colocar sobre la muestra una laminilla
 Observar al microscopio a objetivos de 10X y 4OX
 Esquematizar la estructura observable

b. Observación de estructuras levaduriformes:


 En el centro de una lámina portaobjeto colocar una gota de azul de lactofenol
 Con el asa micológica previamente flameada coger una alícuota de la cepa de Candida sp.
 Cubrir la muestra con una laminilla cubre objeto
 Observar la muestra con el objetivo 10X y 40X del microscopio
 Esquematizar las observaciones

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MET FCCBB/UNPRG - 008
METODO
Edición N0 01

PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Página 1

OBJETIVO: Identificar y preparar los medios más comunes empleados en microbiología

MATERIALES
Equipos: Autoclave, balanza analítica, potenciómetro, refrigeradora, centrifuga, termómetros, horno,
baño maría u horno microondas, estufa, jeringa dispensadora, cabina de bioseguridad, micropipetas
automáticas, microscopio.
Materiales: probeta graduada de 100 y 500 mL, matraz Erlenmeyer de 500 mL, propipetas de jebe de
50 mL, tubos de vidrio estériles con tapa rosca de 16x125 mm y 13x100 mm, placas petri de 90 mm
de diámetro, parafilm, papel aluminio, crioviales, tubos de polipropileno de base cónica estériles de 15
mL de tapa rosca, gradillas para tubos de 16x125 mm, mechero bunsen o de alcohol, encendedor,
plumón indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24.
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

AGAR SANGRE AGAR MC CONKEY AGAR SABOURAUD


 Preparar de acuerdo a las  Preparar de acuerdo a las  Preparar de acuerdo a las
indicaciones del fabricante, indicaciones del fabricante. indicaciones del fabricante.
sirven como base el medio  Autoclavar a 121°C, 15 libras /
TSA o Mueller Hinton.  Autoclavar a 121°C, 15 libras / pulg2 por 15 minutos
 Autoclavar el medio base a pulg2 por 15 minutos
 Distribuir asépticamente 25 mL
121° C, 15 libras / pulg2 por  Distribuir asépticamente 25 mL de de medio en placas Petri.
15 minutos. medio en placas Petri.
 Dejar enfriar hasta 50 ºC y  Composición
agregar 5% de sangre.  Composición
 Peptona 20 gr - Peptona 10 gr
 Distribuir asépticamente 25 mL
de medio en placas Petri.  Lactosa 10 gr - Glucosa 20 gr
 Sales biliares 1.5 gr
 Dejar 48h a temperatura  NaCl 5 gr - Agar 15 gr
ambiente y luego refrigerar  Rojo neutro 0.05 gr
 Cristal violeta 0.001 gr - Agua destilada 1000 mL
 Agar 15 gr
 Agua destilada 1 Litro
 Ph 7.2
 El agar Mc conkey es un medio
selectivo para el aislamiento de
enterobacterias obtenidas a partir
de muestras como heces, orina,
alimentos, aguas residuales,
productos lácteos, etc.

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MET FCCBB/UNPRG - 009
METODO
Edición N0 01
SIEMBRA, AISLAMIENTO E IDENTIFICACIÓN DE
Página 1
BACTERIAS

OBJETIVO: Realizar la siembra y aislar de bacterias a partir de muestras biológicas.

MATERIALES
Equipos: Estufa.
Materiales: Tubos de vidrio estériles con tapa rosca de 16x125 mm y 13x100 mm, placas petri de
90 mm de diámetro conteniendo medio de cultivo, parafilm, crioviales, tubos de polipropileno de
base cónica estériles de 15 mL de tapa rosca, gradillas para tubos de 16x125 mm, lamina
portaobjeto de 75 x 25 mm y lamina cubreobjetos de 22 x22mm, mechero bunsen o de alcohol,
encendedor, plumón indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24. Ansas calibradas de 0,001 (3mm de
diámetro) o 0,01 (4mm de diámetro),
Medios de cultivo: Mac conkey y agar sabouraud
Muestra biológicas: Chicha fermentada, refrescos de manzana y cebada.
EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

PROCEDIMIENTO
a. Siembra.
 Introducir el asa calibrada de platino o descartable de 0,001 (3mm de diámetro) o 0,01 (4mm
de diámetro) dentro del frasco que contiene la muestra en forma vertical tratando de
seleccionar una alícuota.
 El inoculo se deberá sembrar cuidadosamente en la placa que contiene agar Mac Conkey por
agotamiento y estría, para obtener crecimiento uniforme en toda la superficie de la misma.
 La muestra de chicha deberá sembrarse también en la placa que contiene agar sabouraud por
agotamiento y estría, para obtener crecimiento uniforme en toda la superficie de la misma.
 Para la obtención de mohos se deberá abrir una placa conteniendo agar sabouraud y dejar
expuesto por 10 minutos y luego cerrar la placa.

b. Incubación
 Concluida la siembra, colocar la placa en forma invertida en estufa a 370 C / 24 horas en
condiciones aeróbicas. Si no hay crecimiento bacteriano dejar incubar hasta 48 horas.
 En el caso de las placas que contienen agar sabouraud dejar incubando hasta por 8 días.

c. Lectura.
 La evaluación de crecimiento bacteriano se realizará a las 24 horas, si no hay evidenciarse se
dejará incubando hasta 48 horas.
 La evaluación consiste en realizar el recuento de colonias, considerando que una colonia es
una agrupación de bacterias formada a partir de la reproducción de una Unidad Formadora de
Colonia (UFC).

Esquematizar sus resultados

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MET FCCBB/UNPRG - 010
METODO
Edición N0 01
PRESENTACIÓN GRAFICA DEL CRECIMIENTO
Página 1 de 2
MICROBIANO

OBJETIVO:

1. Determinar la curva de crecimiento, velocidad de crecimiento y tiempo de generación de un


cultivo bacteriano

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, jeringa dispensadora, micropipetas automáticas.

Materiales: Tubos de vidrio estériles con tapa rosca, tips estériles, tuberculinas, agujas
hipodérmicas N° 21, jeringas de 5 y 10 mL, laminas portaobjetos, ligadura, gradillas para tubos
20x150 mm, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, respirador, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: Tripticasa soya, caldo nutritivo, Mueller Hinton.

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%),

Muestra biológicas: Escherichia coli

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

Otros: Solución salina estéril (SSE), agua destilada.

PROCEDIMIENTO:
 Sembrar una cepa bacteriana de E. coli en agar nutritivo o Tripticasa soya e incubar a 37ºC
por 24 horas
 Cosechar las células en 150 ml de caldo nutritivo e incubar a 37ºC/ 16 a 18 h.
 Inocular 0.02 ml del cultivo anterior en 200 ml de caldo nutritivo y extraer 1 ml para la
determinación de la población inicial. haciendo diluciones según la tabla y sembrando por el
método de siembra en superficie. Emplear 0.1ml de las dos últimas diluciones.
 Incubar el caldo nutritivo a 37°C por 11 horas en agitación constante.
 A los tiempos de 2, 4, 6, 8, 10, 11 horas tomar muestras de 1ml y realizar diluciones según la
tabla y sembrar por duplicado 0.1 ml de las 2 últimas diluciones por el método de siembra en
superficie.
 Luego incubar a 37°C por 24 horas.
 Realizar los recuentos respectivos
 Graficar en papel semilogarítmico o logarítmico los recuentos de los sobrevivientes versus
tiempo de incubación y determinar la curva de crecimiento.
 Diferenciar las fases y calcular las, velocidad de crecimiento, tiempo de generación.
 Graficar la recta de regresión, aplicando las formulas correspondientes.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


Horas Diluciones de siembra N° de tubos N° de placas
0 10-3, 10-4 4 4
2 10-4, 10-5 5 4
4 10-6, 10-7 7 4
-8 -9
6 10 , 10 9 4
8 10-12, 10-13 12 4
10 10-14, 10-15 15 4

factor dilución = 0.1

Formulas
a) Numero de generaciones (n)
n= 3.3 (log Nf –log N0)
b) Tiempo de generación (tg): Tg = t / n o tg = 1 / v
c) Velocidad de crecimiento (v): V = n / t
d) Constante de la velocidad de crecimiento (K)
k = 2.3 (log Nf –log N0) / t o k = ln / tg = 0.693/ tg.
e) Curva de regresión
Y = a + bx

RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Llenar la tabla con los valores encontrados
Tiempo Nº m.o/mL logy lny X2 xyI
X Y (yI)
0
2
4
6
8
10
Σ= 30 Σ= Σ= Σ= Σ=

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


MET FCCBB/UNPRG - 11
METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE YOGURT Página 1

OBJETIVO:

1. Producir yogurt como alimento probiótico.

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, incubadora de tecnoport 60x60, licuadora, cocina,


balanza analítica.

Materiales: olla, balde de plástico, probeta, táper, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos,
vasos, botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: Agar rugosa.

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), ácido cítrico, bicarbonato de sodio,
bisulfito de sodio.

Muestra biológicas e insumos: fresas, cultivo de Lactobacillus, azúcar blanca, leche en polvo

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarilla.

Otros: Solución salina estéril (SSE),


PROCEDIMIENTO

a) Materia prima: leche 5 litros, azúcar blanca 10% (500 gr para 5 L)


b) Pasteurización: en una olla disolver la leche con el azúcar blanca y 50 gramos de leche en
polvo. proceder a hervir por unos segundos y luego enfriar bruscamente con agua helada
hasta 42 0C.
c) Cultivo bacteriano: asegurarse que la leche pasteurizada se encuentre a 42 0C para agregar
el cultivo bacteriano y luego homogenizar.
d) Incubación: introducir la olla conteniendo la leche y el cultivo bacteriano a una caja tecnoport
que en su interior contiene 2 vasos de agua a 100 0C. y proceder a cerrar inmediatamente
junto a una bolsa negra y dejar por 4 horas.
e) Descremado: después de las 4 horas retirar de la superficie la zona coagulada (nata) y luego
hacer un batido ligero
f) Almíbar: agregar el almíbar (licuar 500 gr de fresa + 150 gramos de azúcar y proceder a
hervir a fuego lento por 30 minutos) y hacer un ligero batido.
Nota: la fruta para el almíbar debe estar entre el 10 a 12%
g) Refrigeración. Conservar en refrigeración con la finalidad de evitar la fermentación.

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MET FCCBB/UNPRG - 12
METODO Edición N0 01

ELABORACIÓN DE VINO Página 1 de 4

OBJETIVO:

1. Elaborar vino tinto empleando Saccharomyces cerevisiae

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor tipo tanque batch
anaerobio, autoclave, horno, cocina, balanza analítica, refractómetro, alcoholímetro.

Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, tapas de goma, cánulas de plástico
recipientes de plástico, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera,
botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: agar sabouraud.

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), bicarbonato de sodio, metabisulfito de
sodio, acido tartárico.

Muestra biológicas e insumos: uva, levadura de panificación, azúcar blanca

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarillas.

Otros: Solución salina estéril (SSE),

PROCEDIMIENTO

a) Obtención del mosto


 Selección: uvas en buen estado
 Lavado y pesado: pesar aproximadamente 10kg de uva y proceder a lavar con hipoclorito
para determinar su rendimiento
 Desgranado: seleccionar y separar los granos del racimo en condiciones optimas
 Estrujado o chapeado: triturar los granos de uva procurando no dañar las pepas y luego
medir el volumen y realizar:

Medición y corrección del PH: ajustar el pH a 3.5 con ácido tartárico.

Corrección del Azúcar - determinación de 0BRIX: la escala Brix se emplea en la industria


alimentaria para medir la cantidad de azucares en zumo de frutas refractómetro para poder
iniciar la fermentación, se debe tener un máximo de 24 °Brix. Para ajustar el °Brix requerido
(24 °Brix) se adiciona la cantidad de azúcar blanca determinada, según la fórmula:

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°Brix inicial = 19; ° Brix Final = 24; Peso del mosto hipotético = 5 Kg

Por tanto, deberemos agregar 329 gr de azúcar blanca a nuestro mosto como
corrección de azúcar. Asimismo, considerar que nuestro volumen final será de 5329
mL (5000 mL + 329 gr de azúcar)

b) Fermentación
 Agregar las uvas chapeadas (mosto corregido) al biorreactor previamente esterilizado
 Sulfitado: adicionar 0.20 gr de metasulfito de potasio por litro de mosto.
 Adición de levadura: agregar 0.3 gr de Saccharomyces cerevisiae por litro de mosto. En
este caso se deberá activar previamente disolviendo la levadura en agua fría temperada o
en 100 mL de mosto a 30 0C/ 10 minutos para luego agregar al fermentador primario o
biorreactor.
 Cerrar el biorreactor y dejar en fermentación anaerobia a temperatura ambiente durante 6
a 8 días. observando previamente la formación de un sombrero de orujos en la parte
superior del fermentador.
 Consideración diaria: realizar movimientos cada día tratando de sumergir el sombrero con
la finalidad de extraer el máximo colorante de la cascara y evitar desarrollo de bacterias
acéticas en los espacios de aire en el hollejo.
c) Descube
 Trasegar o separar el mosto fermentado de los residuos de levadura y solidos precipitados
empleando un colador a un recipiente de vidrio limpio. Finalmente exprimir los hollejos del
colador hasta obtener el máximo de vino con ayuda de una tela o gasa
d) Fermentación secundaria
 Transferir el vino al biorreactor para llevar a cabo la fermentación secundaria y dejar por 15
días.
e) Trasiego
 El primer trasiego se hace de 15 días después del descube (final de la fermentación
secundaria).
 El segundo y tercer trasiego se llevan a cabo luego de otros 15 días.
f) Clarificación
 para acelerar el proceso de clarificado se usa bentonita en una proporción del 0.1%
 un vino bien preparado se aclara por si solo espontáneamente después de 6 meses.
g) Embotellado
 el vino se deja en botellas debidamente llenas y cerradas; el llenado y el encorchado
realizar en forma manual.
 Se sometieron a pasteurización (80°C/15 min)

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Figura 2. Construcción Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de
de un fermentador burbujeo para producción de vino

RESULTADOS

a) Análisis organoléptico del vino

Análisis Puntaje

Aspecto

Aroma

Color

Sabor

Muy bueno Bueno Regular Malo Muy malo

5 4 3 2 1

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


b) Parámetros

Parámetros Cantidad

Peso inicial de uvas ………………………………. gr

Cantidad de Mosto Puro ………………………………. mL

Acidez ………………………………. pH

Brix deseado ……………………………….

Brix inicial ……………………………….

Cantidad de Azúcar ………………………………. gr

Volumen de CO2 producido ………………………………. mL

Volumen de vino producido ………………………………. mL

Aspecto ……………………………….

Aroma ……………………………….

Color ……………………………….

Sabor ……………………………….

Grados alcohólico ……………………………….

Tarea a desarrollar:
1. colocar sus imágenes del proceso en secuencia hasta la obtención del producto final
2. realizar un flujograma de su proceso

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MET FCCBB/UNPRG - 13
METODO
Edición N0 01

ELABORACIÓN DE VINAGRE Página 1 de 3

OBJETIVO:

1. Producir de vinagre de plátano de seda empleando Acetobacter aceti en un biorreactor de


columna de burbujeo.

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor tipo tanque batch
anaerobio, biorreactor de columna de burbujeo, autoclave, horno, cocina, licuadora, balanza
analítica, refractómetro, alcoholímetro.

Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, tapas de goma, cánulas de plástico
recipientes de plástico, colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera,
botellas, mechero bunsen, parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: medio Lee.

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), ácido cítrico, bicarbonato de sodio,
bisulfito de sodio.

Muestra biológicas e insumos: plátano, levadura seca de panificación, azúcar blanca

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, mascarillas.

Otros: Solución salina estéril (SSE),

PROCEDIMIENTO

a) Obtención del mosto


 Selección: 1 kg de plátano en buen estado
 Trozado: después del pelado pesar para determinar su rendimiento
 Licuado de la pulpa: usar agua caliente ± 70 0C para evitar el ennegrecimiento y luego
medir la pulpa obtenida (ejemplo 1L)
 Mosto corregido: diluir 2L de agua hervida fría por cada litro de pulpa obtenida
obteniendo 3L y luego realizar:
Corrección del azúcar: añadir 120 gramos de azúcar por litro de mosto diluido ejemplo,
360 gramos para los 3L obtenidos hasta el momento.
Corrección de la acidez: agregar 0.75 gramos de ácido cítrico a los 3 litros de mosto
diluido
Nota. Por cada 10 litros de mosto diluido agregar 2.5 gr de ácido cítrico

b) Fermentación alcohólica
 Biorreactor estéril: Agregar el mosto corregido tibio (± 30 0C)
 Adición de levadura: agregar 1 gr de Saccharomyces cerevisiae por litro de mosto
corregido. En este caso se deberá activar previamente disolviendo la levadura en un
recipiente con agua hervida temperada, mosto y 3 cucharaditas de azúcar a 30 0C, tapar
Docente: MSC. Roberto Ventura Flores
el recipiente por 10 minutos. La activación se notará por la formación de burbujas en la
superficie y en ese estado agregar al fermentador primario o biorreactor.
 Cerrar el biorreactor y dejar en fermentación anaerobia a temperatura ambiente durante
20 días. el uso del alcoholímetro facilita un mejor control del proceso de fermentación.
observando previamente la formación de un sombrero de orujos en la parte superior del
fermentador.
 Consideración diaria: realizar movientes cada día tratando de sumergir el sombrero con
la finalidad de extraer el máximo colorante de la cascara y evitar desarrollo de bacterias
acéticas en los espacios de aire en el hollejo.

c) Descube y acondicionamiento del mosto alcohólico


 Trasegar o separar el mosto alcohólico procurando no mezclar los residuos de levadura y
solidos precipitados de la fruta abriendo la llave del biorreactor a un recipiente de vidrio
limpio y medir el volumen obtenido.
 Corrección del grado alcohólico (1:2): diluir el mosto alcohólico obtenido 140 (1 parte) con
agua hervida fría (2 partes) = mosto alcohólico 100.
 Corrección de acidez acética: Para 1L de mosto alcohólico 100 añadir 0.75 L de vinagre
iniciador (5% acidez y 00 alcohol). En este caso se activa previamente el Acetobacter aceti
en mosto de uva o cerveza.

h) Fermentación Acética.
 Transferir el mosto alcohólico corregido al biorreactor de columna de burbujeo estéril.
 para llevar a cabo la fermentación acética dejar por 60 días a 240 C. después de 10 diez
días evidenciar la aparición de un velo blanquecino en la superficie.
 Transcurrido los 15 días evaluar cada semana la producción de ácido acético por
titulación:
 Abrir el caño del biorreactor y obtener 10 mL de vinagre en un matraz Erlenmeyer y
adicionar 20 mL de agua destilada
 Adicionar 2 – 3 gotas de fenolftaleína
 Titular con NaOH 0.1 N, hasta color rosado tenue y registrar el gasto
 Calculo de la acidez acética.

 Donde
Vg: volumen de gasto de la base
N: normalidad de la base= 0.1N
Me: meliequivalentes de ácido acético= 0,06
VMx: volumen de la muestra en mL tomado para la titulación
i) Filtrado
 Filtrar la mitad del volumen del vinagre separado del biorreactor empleando una capa de
tocuyo o doble capa de gasa estéril. En la superficie de un recipiente.
 Añadir nuevo mosto alcohólico acondicionado a la mitad del vinagre que quedo en el
biorreactor. La obtención de vinagre y la adición de mosto alcohólico acondicionado se
realiza cada 20 días sucesivamente.

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j) Vinagre acondicionamiento
 Adicionar al vinagre filtrado 0.15 gramos de bisulfito de sodio por cada 1.5 litros d
vinagre o 0.25 gr de sal por cada litro de vinagre para detener la fermentación
acética.
k) Envasado
 Remojar botellas de 250 – 300 cm3 de capacidad con detergente y dos cucharaditas de
soda caustica por 10 litros de agua
 Escurrir las botellas
 Llenar las botellas con un embudo limpio
 Colocar corchos o tapones de plástico más un capuchino sobre ellos
 Almacenar a temperatura ambiente en lugar fresco y seguro.

Figura 2. Construcción Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de


de un fermentador burbujeo para producción de vinagre

Tarea a desarrollar:
1. colocar sus imágenes del proceso en secuencia hasta la obtención del producto final
2. realizar un flujograma de su proceso

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


MET FCCBB/UNPRG - 14
METODO
Edición N0 01
ELABORACIÓN DE AMILASA Página 1 de 4

OBJETIVO:

1. Obtener amilasas de Aspergillus niger utilizando almidón de yuca como sustrato en un


biorreactor de columna de burbujeo

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, autoclave, horno, termómetros, jeringa dispensadora, biorreactor de


columna de burbujeo, cocina, balanza analítica,

Materiales: damajuana de 4 litros, balde de plástico, probeta, balón de 200 mL, micropipetas, tubos
de ensayo, cámara de neubawer, tapas de goma, cánulas de plástico recipientes de plástico,
colador, embudo, termómetro, cucharas cuchillos, vasos, manguera, botellas, mechero bunsen,
parafilm, plumón indeleble, jabón líquido, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: agar sabouraud, agar almidón, caldo almidón

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%), lugol, fehling A, Fehling B.

Muestra biológicas e insumos: Aspergillus niger

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, respirador N-95,

Otros: Solución salina estéril (SSE),

PROCEDIMIENTO

a) Obtención de Aspergillus niger


 Recolectar 5 – 10 gr de suelo agrícola en frascos estériles y transportar hasta su
procesamiento.
 Sembrar por agotamiento y estría en agar almidón 1%
 Seleccionar la cepa de A. niger mejor productora de amilasas
 Realizar una suspensión de esporas en 100 mL de solución salina estéril.
 Estandarizar la suspensión a una concentración de 108 esporas / mL. Para ello realizar el
recuento en una cámara de Neubawer.
 Inocular los 100 mL de la suspensión de esporas al biorreactor de columna de burbujeo.
b) Obtención de almidón de yuca
 Rayar la yuca y proceder a licuar
 Depositar en un recipiente y dejar sedimentar por un día
 Eliminar el sobrenadante y el sedimento extender en papel kraf
 Secar en el horno removiendo cada cierto tiempo a fin de no formar una masa
 Moler o triturar los gránulos en un mortero. La harina obtenida constituye el almidón
 Almacenar en un frasco estéril.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


c) Preparación del caldo almidón
 KH2PO4 0.5 gr
 K2HPO4 0.5 gr
 MgSO4.7H2O 0.2 gr
 (NH4)2so4 0.2 gr
 Almidón de yuca 10gr
 Agua destilada 1000 mL-
 Ph 5.5.

d) Fermentación en biorreactor
 Agregar al biorreactor 900 mL de caldo almidón en condiciones de esterilidad
 Inocular 100 mL de la suspensión de esporas de A. niger al biorreactor de columna de
burbujeo. Equivalente al 10% V/V del total del caldo de fermentación.
 Asegurar que el sistema de purificación del aire tenga una solución de NaCl 20%.
 Dejar en fermentación aeróbica por 3 días o hasta el consumo total del almidón (valore con
lugol).
e) Filtración y determinación de hidrolisis de almidón
 Vaciar el caldo de fermentación hidrolizado en un matraz estéril
 Filtrar con papel wattman y separar la biomasa fúngica del caldo de fermentación
 Pesar la biomasa obtenida.
 El filtrado obtenido se valora con lugol y fehling según las siguientes recomendaciones:
Prueba de lugol: determinación de almidón
 En un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de caldo fermentado y una gota de lugol
 Lectura; color azul= almidón positivo; incoloro=almidón negativo implica producción de
amilasas
Prueba de fehling: determinación de glucosa
 En un tubo de ensayo agregar 0.5 mL de caldo fermentado + 0,5 mL de reactivo fehling
A + 0,5 mL de reactivo fehling B (benedict)
 Lectura; precipitado rojo ladrillo = glucosa positiva, implica producción de amilasas;
color azul = glucosa negativo
f) Separación de la glucosa
 Dejar decantar en el matraz estéril
 Visualizar un sedimento blanco y dulce (glucosa)
 Pese y determine la concentración de glucosa obtenida.

Figura 3. Construcción de Biorreactor columna de


burbujeo para producción de vinagre

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


RESULTADOS

a) Parámetros obtenidos

Análisis Resultado

Tiempo de consumo total de almidón

Concentración de la biomasa
obtenida

Concentración de glucosa obtenida

Prueba de lugol

Prueba de fehling

Tarea a desarrollar:
1. colocar sus imágenes del proceso en secuencia hasta la obtención del producto final
2. realizar un flujograma de su proceso

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


MET FCCBB/UNPRG - 015
METODO
Edición N0 01

ACTIVIDAD ANTIBIÓTICA de Streptomyces spp Página 1 - 2

OBJETIVO:

1. Aislamiento de actinomicetos con actividad antimicrobiana

MATERIALES:

Equipos: Estufa, refrigeradora, termómetros, jeringa dispensadora, micropipetas automáticas.

Materiales: Tubos de vidrio estériles con tapa rosca, placas petri de 90 mm de diámetro, pinzas
planas estériles, reglas, hisopos estériles, gradillas para tubos 13x100 mm, mechero bunsen,
parafilm, plumón indeleble, respirador, guantes, bolsas de bioseguridad 36x24.

Medios de cultivo: agar avena, agar sabouraud.

Reactivos: Alcohol 70%, Lejía (Hipoclorito de sodio al 5%)

Muestra biológicas: suelo.

EPP: Mandil, guantes, papel toalla, jabón líquido.

Otros: Solución salina estéril (SSE), agua destilada, escala de Mcfarland 0.5.

PROCEDIMIENTO:

a. Aislamiento de actinomicetos con actividad antimicrobiana

 Para esta actividad seguir las recomendaciones de Parada Romina 2017 (8) con ciertas
modificaciones. Recolectar 5 -10 g de muestra de suelo a una profundidad entre 2 a 8 cm
y luego deberán colocar en frascos estériles y conservar a temperatura ambiente hasta su
procesamiento.

 Agregar 1 grano de suelo a un tubo de dilución conteniendo 9 mL de agua estéril (dilución


(10 -1) y someter a calentamiento a 70 ºC durante 15 minutos. Luego realizar diluciones
seriadas hasta obtener una dilución final de 1x10-3 g/mL de muestra.

 De cada dilución sembrar 100 uL en placas petri conteniendo agra avena e incubar a
temperatura ambiente durante 7 a 30 días.

 Seleccionar las colonias características de actinomicetos y conservar en medio solido de


agar avena a 4 ºC.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


b. Determinación de antagonismo in vitro de Streptomyces spp por estrías
perpendiculares

 En una placa petri conteniendo agar sabouraud (SDA) sin antibiótico realizar una siembra
por estría en el diámetro central de la placa e incubar por 7 a 10 días a 30 ºC.

 Posteriormente sembrar microorganismos resistentes (S. aureus MRSA, E. coli BLEE y P.


aeruginosa) e incubar nuevamente los medios durante 24 horas a 35 ºC

 Analizar el antagonismo por determinación cualitativa de la zona de inhibición.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Figura 1. Pegar fotos de aislamiento de Streptomyces spp

Figura 2. Colocar fotos del antagonismo de Streptomyces spp.

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores


REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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2016 https://www.sciencedirect.com/book/9780128012246/biotechnology-for-
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3. The Cancer Genome Atlas - Cancer Genome – TCGA. https://cancergenome.nih.gov/
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5. Óscar Coltell, María Arregui, Antonio Fabregat, Olga Portolés. La bioinformática en la práctica
médica: Integración de datos biológicos y clínicos. Rev Méd Chile 2008; 136: 645-652
6. David R. Koepsell DR, Ruiz MH. Ética de la Investigación, Integridad Cientíca. 1ª ed. México
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7. Contreras-Moreira B. Modelado comparativo de proteínas Homology modelling 2013.
http://digital.csic.es/bitstream/10261/59335/3/modelado_comparativo_BContrerasMoreira.pdf
2. Martinez J. La bioinformática como herramienta para la investigación en salud humana. Salud
Pública Mex 2007; 49: 64 - 6.

8. Zhang Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction. BMC Bioinformatics. 2008. 9: 1-
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10. Demain AL, Fang A. The natural functions of secondary metabolites. Adv Biochem Eng
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11. Ruiz B, Chavez A, Forero A, Garcia- Huante Y, Romero A, et al .Production of microbial


secondary metabolites: regulation by the carbon source. Crit Rev Microbiol. 2010; 36(2):146-
67. doi: 10.3109/10408410903489576.
12. Parada RB, Marguet ER, Vallejos M. Aislamiento y caracterización parcial de actinomicetos de
suelos con actividad antimicrobiana contra bacterias multidrogo-resistentes. Rev. Colomb.
Biotecnol. 2017; 19 (2): 15-23.
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14. Velázquez LPA, Aragón MC, Romero AC. Extracción y purificación de ADN. Herramientas
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15. Murray P, Rosenthal K, Pfaller M. Microbiología médica. 6ª ed. Elsevier. España 2010. Pag
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18. Prescott, L, J. Harley, D. Klein. 2008. Microbiología. 7a edición. Ed. Mc Graw Hill. México.
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19. Villanueva C. manual de prácticas: diseño de bioprocesos y biotecnología microbiana. UNPRG

REFERENCIAS LINKOGRÁFICAS
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22. BioCyc: https://biocyc.org/

Docente: MSC. Roberto Ventura Flores