CROMATOGRAFÍA: AISLAMIENTO Y PURIFICACÍON DE CLOROFILA Y CAROTENOS DE ESPINACA

Isabella Orozco 11200001, David Colorado 10120042

Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Química Orgánica I
Santiago de Cali, Colombia
Agosto 19 de 2011
belita_orozco@hotmail.com, obituary07@hotmail.com

1. Objetivos: Valores de Rf obtenidos:

Separar los diferentes componentes de la Distancia Rf

Muestra
hoja de espinaca por medio de la (cm)
cromatografía en columna, recolectando 0.17
en diferentes tubos de ensayo las 3A 0.5
sustancias aparentemente de diferentes 0.27
3B 0.8
colores y utilizando solventes de
diferentes composiciones.
3C 1.4 0.47
Purificar las clorofilas y los carotenos
encontrados en la hoja de espinaca por 0.23
medio de la cromatografía en capa fina. Y 4A 0.7
poder así identificar los diferentes 0.3 0.1
5A
componentes.
5B 0.7 0.23
Calcular el Rf de cada componente para
así poder identificarlos y determinar su 5C 1.2 0.4
polaridad.
5D 1.7 0.57

2. Resultados: 6A 0.27
0.8
Placa de Cromatografía de Capa Fina: 7A 0.07
0.2

Cálculos:

Rf para cada muestra:

𝐷𝑖𝑠𝑡𝑎𝑛𝑐𝑖𝑎 𝑟𝑒𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑑𝑎 𝑝𝑜𝑟 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎
Rf = 𝐹𝑟𝑒𝑛𝑡𝑒 𝑑𝑒𝑙 𝑠𝑜𝑙𝑣𝑒𝑛𝑡𝑒

Muestra 3ª
0.5
Rf= = 0.17
3.0
 3. Análisis de Resultados:

La Cromatografía representa el uso excepcional de un concepto como la extracción; pero

en este caso una de las dos fases con las que coexiste el compuesto de interés se mantiene
“fija” o estacionaria y la otra se mueve a través de ella o es móvil con respecto a la primera1.
Típicamente, las dos fases son insolubles entre si y además, presentan ciertas
interacciones o comportamientos frente a la sustancia de interés que hacen que esta sea
repelida o atraída.

En otras palabras: “es un método físico de separación en el que los componentes a separar
se distribuyen en dos fases, una de las cuales constituye un lecho estacionario de gran
desarrollo superficial y la otra un fluido que pasa a través o a lo largo del lecho estacionario
(fase móvil)”.2

Puede considerársele, en general, como un método de purificación, separación,

identificación y preparatorio; esta versatilidad es posible gracias a que la cromatografía
puede ser empleada con una gran variedad de metodologías, las cuales se presentan a
continuación:

Nombre de la Técnica Fase estacionaria Fase móvil Desplazamiento fase móvil Mecanismo de separación

Cromatorafia en Columna Abierta

C. sólido-líquido Sol. absorbente Líquido Gravedad Adsorción
C. líquido-sólido Liq. Absorbido en soporte sol. Líquido Gravedad Reparto, Adsorción
C. sobre geles Sol. Gel poroso Líquido Gravedad Tamaño
Electroferesis Sol. polímero Liq. ionico Emigración iónica Emigración iónica
C. intercambio ionico Sol. Cambiador ionico Líquido Gravedad Afinidad quimica

Cormatografia en Columna Cerrada

Sol. Absorbente Liq.
C. de gases Absorbido en soporte sol. Gas Presión Adsorción
C. liquida de alta Sol. Diversos y liq. Adsorción, reparto,
resolución Absorbidos en soporte sol. Liq. Presión afinidad quimica, tamaño

Cromatografia en Papel
C. adsorción en papel Sólido (papel) Líquido polar Capilaridad (gravedad) Adsorción
Liq. Polar absorbido en papel Reparto (adsorción, af.
C. de reparto en papel sólido Líquido no polar Capilaridad (gravedad) Quimica)
C. cambio iónica en papel Sólido Líquido Capilaridad (gravedad) Afinidad quimica
Electroferesis en papel Sólido (papel) Líquido iónico Emigración iónica Emigración iónica
Como objetivo principal de la práctica se
empleó una cromatografía en columna
abierta de tipo solido – líquido para
separar las distintas clorofilas y carotenos
contenidos en la espinaca; la cual fue
previamente homogenizada. Después,
para comprobar la eficiencia de la
cromatografía solido – líquido se empleó
una cromatografía de adsorción en papel.

Una cromatografía solido – liquido,

básicamente, corresponde al uso de una
fase liquida o móvil como trasportador o
eluyente y un sólido estacionario como
medio de detención; en el sistema semi
cerrado de una columna. El sólido se
utiliza como material absorbente y puede
estar constituido de gel de sílice, oxido de
aluminio, silicatos, celulosa, almidón y
hasta vidrio molido. El método consiste en
depositar la solución problema, en este
caso la espinaca homogenizada, sobre el
relleno estacionario adsorbente; una vez (Figura No 3: Clorofila a, b, d)
adsorbidos los componentes se pasa un
líquido eluyente que ayuda a separar los
componentes, por ello también se le
define como cromatografía en columna3.

La adsorción, la polaridad y la afinidad

son conceptos que hacen posible la
separación que se lleva a cabo dentro de
dicha columna cromatografía; y se
analizaran a partir de lo observado
durante la realización de la práctica para
el correspondiente ensayo.

La espinaca es una planta que posee en

la células de sus hojas orgánulos
llamados cloroplastos, estos a su vez
posee pigmentos de diferente color que
hacen posible la fotosíntesis por la
absorción de distintas longitudes de onda
aptas para la planta y para que esta
pueda obtener energía4.
(Figura No 4: Clorofila c1 y c2)
Para nombrar los tipos de clorofila
simplemente se escribe “Clorofila X”
donde X representa una de las 5
conformaciones que puede tener la
estructura básica de la clorofila (a, b, d, c1
o c2).

Dentro de estos pigmentos tenemos a las

Clorofilas y a los Carotenos:

(Figura No 5: Carotenoides)
. La estructura patrón de 40 carbonos se
denomina "caroteno". La numeración se
toma en cuenta como un dímero, por lo
que la mitad izquierda se numera
comenzando por el carbono que se
enlaza a dos metilos y se prosigue de
manera lineal hasta el carbono 15 (El
extremo opuesto del primer monómero);
se prosigue a numerar los metilos de
izquierda a derecha hasta el número 20.
La mitad derecha se numera de manera
homóloga de derecha a izquierda con
numeración primada. Dependiendo la
estructura de cada uno de los extremos,
se nombra el tipo de extremo de la
izquierda con las letras griegas de
acuerdo a la convención de la IUPAC.
Posteriormente se hace lo mismo con la
mitad derecha5.
Como se comentó anteriormente,
conceptos como la polaridad son
esenciales para entender el
comportamiento de una sustancia durante
un proceso de cromatografía de columna
solido – liquido, debido a que de ellos
dependerá el orden y el instante en que
se separen las sustancias.
El efecto de la polaridad se puede
entender esquemáticamente como sigue:
(Figura No 6)
En el paso “c)” se puede observar como
el soluto B se distancia del soluto A al
quedarse “retenido” este último; gracias al
efecto de la polaridad. Para un
cromatografía de columna suelen usarse
una fase móvil y una estacionaria que,
además se der inmiscibles y no
reaccionar, poseen polaridades opuestas;
así, en la mayoría de los casos se emplea
una fase estacionaria muy polar y una
fase móvil muy apolar o poco polar. Por
ende, los compuestos polares en la
muestra homogenizada de espinaca
interaccionaran fuertemente con la fase
estacionaria y débilmente con la móvil; en
contraste, los compuestos poco polares
interaccionaran débilmente con la
estacionaria y fuertemente con la móvil.
Dicho así, en el esquema de la figura No
6 el compuesto A es más polar que el
compuesto B.
A este concepto de polaridad durante un
proceso de cromatografía también puede
denominársele afinidad5.
Entonces, al analizar las posibles
conformaciones estructurales de las
Clorofilas y las posibles conformaciones
de los Carotenos, no es difícil deducir que
las clorofilas pueden llegar a ser más
polares; en especial la Clorofila b y d que
poseen mayo cantidad de oxígenos
unidos, a su estructura básica, a través de
dobles enlaces que aumentan la
polaridad. Enseguida y en el mismo orden
decreciente de polaridad tenemos a las
clorofilas c1 y c2 que por su menor
tamaño les es fácil ser polares gracias a
los átomos de oxígenos ubicados en su
estructura básica. De tercero tenemos a la
clorofila a que, aunque también posee
átomos de oxígeno, su tamaño le impide
ser más polar que las clorofilas
nombradas con anterioridad.

En el grupo de los carotenoides tenemos

compuestos menos polares que la
clorofila a, pero en orden decreciente de
polaridad tenemos primero al carotenoide
que pude formarse con el grupo: “ᴪ” pues
las cadenas lineales de carbonos suelen
(Figura No 7)6
ser más polares o presentan mayor
afinidad que los compuestos cíclicos
Ahora, al revisar la Placa obtenida por una
hidrocarbonados. Y como compuestos
cromatografía por adsorción de papel se
menos polares tenemos a lo carotenoides
obtuvo:
que se pueden formar a partir de los
demás grupos incluidos en la Figura No 5.

Desacuerdo con lo anterior podemos

deducir que las clorofilas b, d, c1 y c2
tuvieron gran afinidad por la fase
estacionaria; que las clorofila a y el
carotenoide ᴪ presentaron una afinidad
moderada y que los demás carotenoides
diferentes del ᴪ presentaron muy baja
afinidad por la fase estacionaria.

En cuanto a la fase móvil, el solvente, se (Figura No 8)

usaron varios; se inició con una fase móvil
poco polar y a medida que se separaban
los compuestos en el homogenizado de
espinaca se aumentó la polaridad de la
fase móvil. De esta manera, se inició con
una solución de hexano, luego con una
solución 70% hexano : 30% acetona, 80%
acetona : 20% metanol y por ultimo una
solución de acetona.
Según el siguiente esquema, la clorofila a
posee un color verde oscuro, la clorofila b
posee un color verde claro y los
carotenoides un color amarillo – marrón.
Permitiendo deducir que,
experimentalmente, la clorofila a es el
pigmento menos polar en la espinaca,
seguido de la clorofila b y d un poco más
polares y como compuesto más polar se
dedujo a los carotenoides. En contraste
con lo afirmado a partir del análisis de las
estructuras de los pigmentos (clorofilas y
carotenoides), pues resultaron ser mas
polares los carotinoides que las clorofilas
b y d.
En cuanto a las clorofilas c1 y c2 se
encontró que son menos comunes entre
las especies de plantas y que son propias
de las algas rojas7. A falta de presencia de
colores rojos durante las dos
cromatografías se dedujo que este tipo de
clorofilas no se encuentran en la especie
de espinaca analizada. Por lo tanto la
espinaca contiene clorofila a, b y
carotenos; pues de la clorofila d se sabe
que es muy rara y absorbe luz en
longitudes de onda cercanas al infrarrojo8.
Al realizar un mejor análisis de la Figura
No 8 se puede observar cómo, a pensar
del cuidado que se pueda tener, al realizar
un cromatografía de columna solido –
líquido es bastante probable que las
“fracciones” o muestras obtenidas
contengan distintos compuesto cuando lo
que se busca, en cuanto a eficiencia, es
que cada “fracción” este compuesta por
un único compuesto. Se consideró muy
probable porque determinar cuándo
empieza y cuando termina una “fracción”
depende del experimentador y su
capacidad para diferenciar colores.
Para corregir este imprevisto se puede
recurrir al uso de un “revelador” el cual
consiste en una sustancia que intensifica
los colores de las fracciones en la
columna permitiendo identificarlas con
mayor facilidad2.
Cromatografía por Adsorción en Papel:
Este tipo de cromatografía consiste en el
uso de una placa que posee, en una de
sus caras, una lámina uniforme de una
sustancia adsorbente. Sobre la placa se
ubican ordenadamente muestras de la
sustancia que se desea analizar y se pone
en contacto con un disolvente adecuado
por el extremo cercano a las muestras, sin
que dicho solvente toque las muestras;
evitando que las diluya.
Las muestras empiezan a subir por la
lámina de absorbente gracias a la
capilaridad del solvente sobre placa y a su
vez “arrastra” a la muestra superándole
gracias a la absorbancia de la placa por
los compuestos del soluto o muestra2.
Durante la realización de la práctica este
método de cromatografía se empleó para
verificar la eficiencia de la cromatografía
de columna solido – líquido realizado con
anterioridad.
Al observar la Figura No 8 se puede
concluir que las muestras 3 y 5 se
encontraron considerablemente
“contaminadas” o mal purificadas
mediante la cromatografía de columna
solido – liquido. Mostrando lo que al
juzgar por su color son carotenos. Según
los colores observados se infirió en que
en la muestra 2 se constituía de clorofila a
y b además de carotenos; en la muestra 3
no se observó nada; en la muestra 4 se
obtuvo un caroteno; en la muestra 5 se
presentaron carotenos y trazas de
clorofila; y tanto en la muestra 6 como en
la 7 se observaron colores que se
determinaron como carotenos.
A juzgar por la sencillez con la que se
puede realizar una cromatografía por
adsorción de papel o de capa fina, se
concluyó con que el comportamiento de
las muestras ya venía dado por la
cromatografía de columna.
Para analizar una placa de una
cromatografía de capa fina se suele
emplear una luz ultravioleta; a la ausencia
de este método para analizar la placa se
le atribuyo que en la muestra 2 no se
observase nada. Además, para
comprobar la eficiencia del solvente
empleado en una cromatografía por
adsorción de papel o de capa fina suele
emplearse un concepto denominado Rf o
Factor de Retención; un valor pequeño de
Rf indica que el compuesto de interés
presenta mayor afinidad por la fase
estacionaria que por la fase móvil, en
otras palabras, es mas “retenido”. Por el
contrario, un valor elevado de Rf indica
que el compuesto de interés presenta
mayor afinidad por la fase móvil que por
la fase estacionaria, e otras palabras, es
“poco retenido”. Por lo tanto, los
compuestos con los Rf más bajos serán
los más polares, como,
experimentalmente determinado, lo
fueron los carotinoides; y los compuestos
con los Rf más altos serán las menos
polares, como se encontró que fueron las
clorofilas a y b.
4. Conclusiones:
Según el análisis hecho a la placa de
cromatografía de capa fina, a partir de las
muestras recolectadas como eluatos en la
cromatografía de columna solido – liquido,
se determino que los carotinoides pueden
ser compuestos mas polares que las
clorofilas a y b; aun sin poseer “grupos” o
átomos electronegativos que
estructuralmente sugieran su polaridad.
A partir del hecho de que en la placa de
cromatografía de capa fina se obtuvieron
variedad de compuestos en algunas
muestras (Véase Figura No 8), se infirió
en que durante la realización de una
cromatografía de columna solido – liquido
es de gran ayuda el uso de un “revelador”
que facilite la visibilidad de la separación
de los compuestos dentro de la columna;
y no permita que por errores personales
el experimentador recoja eluato de
compuestos distintos en la misma
muestra.
La cromatografía de capa fina puede
usarse como “método preparatorio” antes
de emplear cualquier otro procedimiento
de identificación, separación o
purificación; gracias a su bajo costo
económico y al poco tiempo que requiere.
Además porque permite identificar o crear
un idea de que posibles compuestos se
encuentran en la muestra sobre la cual se
desea trabajar.
5. Bibliografía:
1. D. C. Harris, “Análisis Químico
Cuantitativo”, 3ra Edicion, REVERTE,
2003, Barcelona – España, pp. 553 – 557.
2.https://www.itescam.edu.mx/principal/s
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Visitada el día Miércoles 14 de
Septiembre del 2011 a las 20hs.
3. J. V. Morales Ortiz, J. A. Sánchez
Manzanares, “Física y Química Vol. III:
Química I”, 1ra Edición, MAD, 2003, pp.
299 – 301.
4. http://fichas.infojardin.com/hortalizas-
verduras/espinaca-espinacas-
espinafre.htm | Visitada el día Miércoles
14 de Septiembre del 2011 a las 20:30hs.
5.http://es.wikipedia.org/wiki/Carotenoide
| Visitada el dia Miercoles 14 de
Septiembre del 2011 a las 21hs.
6.http://www.virtual.unal.edu.co/cursos/ci
encias/2000051/lecciones/cap02/anexo_
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Septiembre a las 14hs.
7.http://www.slideshare.net/etnografiaver
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Jueves 15 de Septiembre del 2011 a las
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8.http://www.rallt.org/boletin/boletin%203
00-
360/Bol.%20301_%20Coliflor%20roja.pdf
Visitada el dia Jueves 15 de Septiembre
del 2011 a las 15hs.