Cultivo Celular

TRASPASO CELULAR, PREPARACIÓN DE PLACAS.

Reactivos/soluciones:

• Medio DMEM, FBS 10%, con antibiótico.

• Buffer PBS 1x

• Tripsina 2,5%.

Todos previamente calentados a 37°C.

Materiales:

• Placas de 60 ml

• Placas de 6 pocillos

• Micropipetas: 1000 ul, 100 ul, 20 ul.

• Puntas: azules, amarillas.

• Pipetas falcon.

Procedimiento:

1. Trabajar en cámara limpia (EtOH 70°, UV), y con flujo constante.

2. La placa de 60 mm debe tener una confluencia de 70-80%

3. Extraer medio con pipeta falcon.

4. Agregar 1ml de buffer PBS 1x, con pipeta falcon, suavemente,

evitando que se despeguen las células.

5. Dejar 30 segundos, y retirar el buffer con micropipeta de 1000.

6. Agregar 300 ul de tripsina 2.5% (diluida con 900 ul de PBS 1x),

dejar reposar 3-5 minutos, dentro de la incubadora.

7. Usando pipeta con punta amarilla, despegar células de la placa,

disgregándolas. Hasta ver un liquido homogéneo, libre de grumos.

8. Agregar el volumen de células al centro de la placa:

Cultivo Celular
a) Placa de 60 mm  60 ul.
b) Placa de 6 pocillos  20 ul/ pocillo.
9. Agregar con pipeta falcon la cantidad de medio:

a) Placa de 60 mm  3 ml.

b) Placa de 6 pocillos  2 ml/pocillo

10. Disgregar células con punta amarilla, mezclar bien, eliminar

burbujas.

11. Rotular: Fecha, volumen celular, N° de traspaso, iniciales.

12. Dejar en incubadora.

Traspaso celular, Notas:

• Si se preparan placas de un Viernes, para Lunes (sin revisarlas el

fin de semana) el volumen de células que se agrega es menor:
o Placas de 60 mm  40 ul.
o Placas de 6 pocillos  15 ul / pocillo.

• De una placa de 60 mm, con confluencia 80%, se puede obtener

una placa de 6 pocillos y dos placas de 60.

CAMBIO DE MEDIO

Reactivos/soluciones:

• Medio DMEM, FBS 10%, con antibiótico. (Calentado a 37%)

Materiales:

• Pipetas falcon

Procedimiento:

1. Trabajar en cámara limpia (EtOH 70°, UV), y con flujo constante.

2. Extraer todo el medio antiguo, con pipeta falcon.

3. Agregar 1 ml de medio fresco, gota a gota, con pipeta falcon,
evitando despegar las células.
4. Dejar 30-60 segundos.
Cultivo Celular
5. Extraer el medio, completamente.
6. Agregar medio fresco, 3 ml para placa de 60mm o 2 ml para cada
pocillo de una placa de 6. Con pipeta falcon, suavemente, para no
despegar las células.
7. Dejar placas en incubadora.
Cultivo Celular

CONGELAMIENTO DE CÉLULAS

Reactivos/soluciones:

• PBS 1x, previamente calentado a 37°C

• Tripsina 2,5% , previamente calentado a 37°C
• Medio de crioconservación (-20 °C), debe estar a 4°C.

Materiales:

• Micropipetas: 1000 ul, 100 ul.

• Puntas: azules, amarillas.
• Tubos eppendorf de 1,5 ml esteriles.
• Tubos criogénicos de 2 ml.
• Pipetas falcon.
• Mr. Frost con 250 ml de isopropanol.

Procedimiento:

1. Trabajar en cámara limpia (EtOH 70°, UV), y con flujo constante.

2. Usar una placa de 60 mm, por tubo criogénico.

3. La placa debe tener una confluencia de 70-80%

4. Extraer medio de cultivo, con pipeta falcon.

5. Lavar con 1 ml de buffer PBS 1x, usando micropipeta de 1000.

6. Agregar 300 ul de tripsina 2.5% (diluida con 900 ul de PBS 1x),

dejar reposar 3-5 minutos, dentro de la incubadora.

7. Usando pipeta con punta amarilla, despegar células de la placa,

disgregándolas. Hasta ver un liquido homogéneo, libre de grumos.

8. Colocar las células disgregadas con tripsina, en un microtubo de

1.5 ml estéril.

9. Centrifugar a 120 xg, por 10 minutos.

Cultivo Celular
10. Eliminar sobrenadante.

11. Resuspender pellet celular con 1 ml de medio de

crioconservación.

12. Traspasar células con medio a tubo criogénico, eliminar burbujas.

13. Rotular tubo: “HEK 293”, fecha.

14. Poner en sistema Mr. Frost (con isopropanol).

15. Guardar directamente a -80 (primer compartimiento, caja

verde “HEK-293”).

DESCONGELAMIENTO DE CÉLULAS (2 días)

Reactivos/ soluciones:

• Medio DMEM, precalentado a 37°C.

Materiales:

• Placas de 60 mm

• Micropipetas: de 1000, de 100.

Procedimiento:

Día 1

1. Sacar tubo criogénico desde -80°C

2. Colocar el tubo criogenico en un flotador.

3. Colocarlo, directamente, en el baño a 37°C, durante 3 minutos,

agitando constantemente, hasta que se descongele por completo.

4. Trabajar en cámara limpia (EtOH 70°, UV), y con flujo constante.

5. De un tubo criogenico se preparan 2 placas de 60 mm.

6. Del tubo sacar la mitad del contenido, aproximadamente, 400 ul

para cada placa.

7. Agregar, con pipeta falcon, 4 ml de medio fresco a cada placa y

resuspender las células.
Cultivo Celular
8. Con punta amarilla disgregar las células en el medio.

9. Agitar circularmente la placa.

10. Rotular: fecha, “descongeladas”, iniciales.

11. Colocar placas en incubadora

Día 2

1. Revisar células al microscopio.

2. Si la mayoria está flotando, dejar placa en incubadora.

3. Si las células están bien pegadas a la placa seguir el protocolo.

4. Trabajar en cámara limpia (EtOH 70°, UV), y con flujo constante.

5. Extraer medio antiguo, usando pipeta falcon.

6. Agregar 3 ml de medio fresco, con pipeta falcon, suavemente,

evitando despegar las células.

7. Colocar en incubadora.