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MICROBIOLÓGICAS
PROGRAMA
Unidade 1
Apresentação do curso - O laboratório de Microbiologia
O nascimento da Microbiologia: o legado de Semmelweiss; a obra de Pasteur; a teoria dos germes.
Normas de biossegurança. Boas práticas de laboratório.
A1. A distribuição dos microrganismos no ambiente
A2. O lavado das mãos
A3. Trabalhar mantendo a assepsia
Unidade 2
O cuidado do material básico no laboratório microbiológico.
A composição dos meios de cultivo, técnicas bacteriológicas; condições de incubação, esterilização; descarte do material
utilizado.
A4. O pH do meio e o crescimento microbiano
Unidade 3
Microscopia (revisão)
Características morfológicas de bactérias, fungos e algas. Ultraestrutura, formas latentes.
A5. Observações microscópicas de bactérias – métodos de coloração
A6. Observação e cultivo de fungos e algas
Unidade 4
Características bioquímicas dos microrganismos: exigências nutricionais, produção de enzimas. Os sistemas
miniaturizados de diagnóstico.
Cultivo e crescimento de microrganismos. Curva de crescimento típica.
As coleções de cultura (pesquisa)
A7. Obtenção de uma cultura bacteriana pura
A8. Caracterização bioquímica de microrganismos
A9. O número de microrganismos de uma cultura
Unidade 5
Fundamentos do controle dos microrganismos: agentes físicos (revisão) e agentes químicos. Avaliação do poder
antimicrobiano de desinfetantes e antissépticos. O modo de ação dos antibióticos. Resistência aos agentes químicos. O
controle dos microrganismos no cotidiano.
A10. Ação da luz ultravioleta
A11. Ação dos desinfetantes
A12. Ação dos produtos cosméticos (desodorantes)
A13. Ação dos produtos cosméticos (dentifrícios)
A14. Antibióticos e antifúngicos
O LABORATÓRIO DE MICROBIOLOGIA
PRECAUÇÕES BÁSICAS
O local de trabalho deve ser desinfetado com álcool antes do início de cada sessão de trabalhos práticos,
assim como ao termo das manipulações.
Antes e depois de qualquer manipulação, lavar as mãos e passar álcool.
Tomar cuidado com os cabelos.
No caso de ferimento acidental por material séptico, desinfetar-se imediatamente com álcool 70oGL.
Não esquecer que toda picada ou ingestão acidental oferece risco.
OS RECIPIENTES UTILIZADOS
Os recipientes de zinco ou cobre não devem ser utilizados. Esses metais se dissolvem nos meios de cultura,
que então se tornam tóxicos. Os recipientes de vidro são adequados.
As placas de Petri plásticas, estéreis, são atualmente cada vez mais empregadas. Depois de esterilizadas, as
placas de vidro podem ser utilizadas novamente.
Os meios de cultura devem ser acondicionados em tubos de diversos tamanhos, conforme o volume
desejado. Sua distribuição nas placas de Petri é feita após a esterilização das placas vazias.
Os tubos podem ser fechados com algodão em rama, por tarraxas metálicas ou vedados por simples cápsulas
metálicas móveis.
Tanto os recipientes como suas tampas devem estar rigorosamente limpos. Na limpeza, deve-se evitar a
utilização de detergentes que possam persistir após o enxugamento. Terminada a lavagem, o pH dos meios
não deverá sofrer modificações muito apreciáveis após agitação nos recipientes.
PIPETADORES (PERAS)
As peras são de borracha e possuem três “bolinhas” com as letras “A”, “S” e “E”. A primeira serve para retirar
todo o ar da pera antes de esta ser acoplada à pipeta; a segunda serve para fazer o líquido subir e a última
para expulsar o líquido. Além disso, para expulsar a última gota, quando se está trabalhando com pipetas
totais, é só apertar o orifício na extremidade lateral da pêra (ao lado da “bolinha” E).
Procedimento
OS INSTRUMENTOS DE TRABALHO
NORMAS DE SEGURANÇA
Segundo Pedro Teixeira e Silvio Valle, no livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", Rio de
Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.
UM POUCO DE HISTÓRIA
Depois de certo tempo, um caldo de carne exposto ao ar apodrece. A observação microscópica mostra muitos
tipos de microrganismos. Já que eles não são observados no caldo recém-cozido, podemos nos perguntar:
de onde eles vieram?
Até 1850-1860 se admitia a teoria da geração espontânea, isto é que os microrganismos podiam surgir
espontaneamente em consequência da alteração dos alimentos.
Baseado em seus estudos sobre as fermentações, Louis Pasteur considera inadequada esta explicação. Para
ele, a alteração dos alimentos é uma consequência da presença de microrganismos. Mas, para convencer os
seus contemporâneos, Pasteur deverá demonstrar de maneira inequívoca a sua teoria.
A POEIRA DO AR
TERCEIRA EXPERIÊNCIA:
Crítica dos defensores da geração espontânea as terceira e quarta experiências: os resultados obtidos se
devem ao fato de ter até agora usado líquidos fervidos longamente.
QUINTA EXPERIÊNCIA: O sangue e a urina extraídos de um organismo sadio não se alteram quando
conservados ao abrigo do ar.
A teoria dos germes abriu novos caminhos na utilização industrial dos processos fermentativos, na
conservação dos alimentos e na luta contra as doenças infecciosas.
"Provavelmente, as primeiras formas de microrganismos habitavam a água. Com o passar do tempo, o solo
se tornou infectado e, agora, aí se encontra a maior parte deles. Do solo passam ao ar pelo vento, que levanta
partículas de poeira nas quais os microrganismos estão presentes. Desde que vivemos em contato com o ar,
aspiramos enormes quantidades de microrganismos cada vez que respiramos. O ar deposita-os em nosso
cabelo, roupa e pele. Do ar passam para nosso alimento e bebida. Estamos completamente cercados por
microrganismos e precisamos aprender a viver com eles. Felizmente, a maior parte não causa mal.
Relativamente são poucos que causam prejuízos. É contra os que causam doenças ou estragam nossos
alimentos que devemos nos prevenir" (Neder R.N. Microbiologia, São Paulo, Ed. Nobel, 1992).
Nesta atividade estudaremos a distribuição dos microrganismos em diferentes ambientes.
MATERIAL por grupo: 1 placa de Petri contendo meio nutriente estéril, 1 caneta de retroprojetor.
PROCEDIMENTO
RESULTADOS
1. Quantas colônias se desenvolveram na placa?
2. Complete a tabela com os dados da turma.
Tabela: Número de colônias em cada placa.
Grupo 1 2 3 4 5 6 7 8
Lugar de exposição
N0 de colônias
Onde foi exposta a placa que apresentou um número maior de colônias? Onde foi exposta a placa
que apresentou um número menor de colônias?
4. Em função dos resultados obtidos, qual a distribuição dos microrganismos no ambiente
estudado?
Material
Por aluno: 1 placa de Petri contendo ágar nutriente por aluno.
Por grupo: pia com água e sabão, álcool gel para as mãos, 1 pilot.
Procedimento
Trabalhar em dupla. Um dos alunos será responsável por abrir e fechar a placa, enquanto o segundo realiza
o procedimento.
1. Anotar na parte superior da placa de Petri contendo meio nutriente o nome do aluno. Na parte inferior,
delimitar com o pilot quatro regiões: A, B, C e D.
2. Com muito cuidado abrir a placa de Petri para que o aluno apoie o dedo polegar da mão dominante na
superfície do ágar. Fechar a placa.
3. Lavar as mãos com água. Deixar secar sem tocar absolutamente nada.
4. Com a ajuda do colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor B. Fechar a placa.
5. Repetir os itens 3 e 4, lavando as mãos com água e sabão e apoiando o polegar da mão dominante no
setor C.
6. Repetir os itens 3 e 4, esfregando as mãos com álcool e apoiando o polegar da mão dominante no setor
D. Sempre com a ajuda do/a colega, abrir a placa e apoiar o polegar da mão dominante no setor C. Fechar
a placa.
7. Em outra placa, o colega repetirá o procedimento, invertendo os roles.
RESULTADOS
Observar o crescimento microbiano nas quatro regiões das placas e registrar os resultados.
Comparar esses resultados com os que foram obtidos pelas outras duplas.
Pesquisa
Nem todos os germes são perigosos. Qual a diferença entre a flora microbiana local e a flora transiente? Qual
é perigosa?
Material
Por aluno: 1 tubo com caldo de carne (10%) estéril, 1 pipeta esterilizada, 3 tubos estéreis.
Procedimento
1. Com a pipeta, distribuir 2 mL de caldo de carne estéril em cada um dos três tubos.
Resultados
Discussão
1. Poderia dizer em que momento houve contaminação do material? Justifique sua resposta
Textos extraídos do livro "Biossegurança, uma abordagem multidisciplinar", de Pedro Teixeira e Silvio Valle,
Rio de Janeiro, Editora Fiocruz, 1996.
“Os agentes biológicos apresentam um risco real ou potencial para o homem e para o meio ambiente. Por
esta razão, é fundamental montar uma estrutura que adapte a prevenção aos riscos encontrados nos
laboratórios de pesquisa.
Os agentes biológicos se dividem em quatro grupos, onde são considerados como critérios: a patogenicidade
para o homem; a virulência; o modo de transmissão, a endemicidade e a existência ou não de profilaxia e de
terapêutica eficazes.
Segundo a resolução nº1 de 1988 do Conselho Nacional de Saúde, Cap. X art. 64, atualizada na portaria n0
1914 de 2011 do Ministério da Saúde, os microrganismos que afetam o homem, os animais e as plantas
podem ser classificados em grupos de risco de 1 a 4 por ordem crescente.
Classe de risco 1 (baixo risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos conhecidos por
não causarem doenças no homem ou nos animais adultos sadios. Exemplos: Lactobacillus sp. e Bacillus
subtilis.
Classe de risco 2 (moderado risco individual e limitado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos
que provocam infecções no homem ou nos animais, cujo potencial de propagação na comunidade e de
disseminação no meio ambiente é limitado, e para os quais existem medidas terapêuticas e profiláticas
eficazes. Exemplos: Schistosoma mansoni e o vírus da Rubéola.
Classe de risco 3 (alto risco individual e moderado risco para a comunidade): inclui os agentes biológicos que
possuem capacidade de transmissão por via respiratória e que causam patologias humanas ou animais,
potencialmente letais, para as quais existem usualmente medidas de tratamento e/ou de prevenção.
Representam risco se disseminados na comunidade e no meio ambiente, podendo se propagar de pessoa a
pessoa. Exemplos: Bacillus anthracis e o vírus da Imunodeficiência Humana (HIV).
Classe de risco 4 (alto risco individual e para a comunidade): inclui os agentes biológicos com grande poder
de transmissibilidade por via respiratória ou de transmissão desconhecida. Até o momento não há nenhuma
medida profilática ou terapêutica eficaz contra infecções ocasionadas por estes. Causam doenças humanas
e animais de alta gravidade, com alta capacidade de disseminação na comunidade e no meio ambiente. Esta
classe inclui principalmente os vírus. Exemplos: Vírus Ebola e o vírus Lassa.”
O nível de segurança (Biosafety Level) dos laboratórios depende dos microrganismos com os quais se
trabalhe. A estrutura e os métodos de trabalho são diferentes em cada nível. Veja na apresentação do filme
OUTBREAK (1996).
Toda vez que se fizer semeadura é interessante seguir as regras que recomendamos, para que o material não
seja contaminado.
Tomando todas as precauções de esterilidade, como flambado das bocas dos tubos, alças de platina, etc.,
uma alçada do material a ser semeado é introduzida no tubo. Deixar esse material na parede interna do tubo,
logo acima de líquido. Recolocar o tampão, após flambar a boca do tubo e mexer por rotação para permitir
completa mistura do meio com o material semeado.
A alça e o fio de platina devem ser flambados antes de depois de qualquer operação de semeadura. Para
tanto devem ser aquecidos ao rubro e a parte inferior do cabo deve ser passada na chama duas a três vezes.
O material não deve ser colhido com alça quente; esta deve ser esfriada na parede interna do tubo de ensaio.
A posição exata para flambar a alça é em ângulo de 45·, em relação à mesa de trabalho. Deve ser utilizado
o cone interno da chama do bico de Bunsen.
Toda vez que se fizer semeaduras utilizando-se tubos de ensaio, deve-se flambar a boca dos mesmos
imediatamente após a retirada e antes da colocação do tampão de algodão. Este nunca deve ser deixado
sobre a mesa de trabalho; deve ser mantido seguro pelo dedo mínimo da mão direita.
Objetivo: Observar como o pH afeta o crescimento microbiano e como o crescimento microbiano afeta o pH.
Material
o Teste com E.coli: 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 4, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 6, 1
tubo com caldo nutriente estéril, 1 tubo com caldo nutriente estéril pH = 10. Um estante, 1 frasco com
desinfetante, indicador universal, 1 alça, bico de Bunsen, caneta pilot, cultura de E. Coli.
o Teste com S. Cerevisiae: Os mesmos elementos, com meio nutriente sacarosado e um cultivo de S.
Cerevisiae.
o Controles: Prever duas séries de tubos como controles da mudança de cor.
Procedimento
Resultados:
2. Como se sabe que os microrganismos cresceram? Como se sabe que houve alguma mudança de pH?
Discussão
1. Em função dos resultados da turma, qual dos dois microrganismos cresce entre valores mais amplos de
pH?
2. Para um microrganismo, qual seria a vantagem de crescer em uma faixa de pH mais ampla?
3. Sugira alguma razão para as mudanças de pH observadas.
4. Pesquise alguma aplicação ligada à tecnologia de alimentos.
1. Ligue o microscópio.
3. Abaixe a platina e coloque a lâmina no chariot, com a lamínula voltada para cima.
4. Ajeite a distância entre as lentes oculares, de maneira a trabalhar em posição confortável. A menos de
trabalhar individualmente, evite ajustar as lentes oculares a seus olhos.
5. Torça o parafuso macrométrico até chegar bem próximo da lâmina. (ATENÇÃO: Esta operação deverá ser
realizada pelo lado de fora e não pela ocular, pois assim procedendo você evitará quebrar a lamínula,
estragando o material e perdendo tempo).
6. Olhando pela ocular e torcendo o parafuso macrométrico no sentido contrário, você suspenderá
vágarosamente o canhão, até ver alguma coisa. Se não aparecer nada, é por que você não centralizou o
corte. Use os parafusos do charriot para mexer a lâmina e coloque a parte corada bem na passagem da
luz.
7. A focalização final deverá ser feita com o micrométrico, torcendo-o para frente e para trás até conseguir
o ponto onde a imagem tem maior nitidez, o foco. Não gire o parafuso micrométrico indefinidamente
para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado mecanismo. Use-o somente para ajustar o
foco e para as observações de profundidade.
8. Certifique-se de que a região que quer observar se encontra no médio do campo antes de girar o revolver
e passar para a objetiva de médio aumento (10x). Melhore o foco se for necessário. As objetivas secas
são parafocais, ou seja, se a estrutura está focalizada com uma, estará muito perto de sê-lo com outras.
9. Repita o mesmo procedimento para usar o maior aumento (40x). Se você não estiver conseguindo foco,
não force o microscópio. Volte para o menor aumento, veja se a lamínula está voltada para cima e tente
outra vez. Se não conseguir, chame o professor.
10. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a
objetiva de menor aumento e eleve a platina. Coloque a intensidade de luz no mínimo, verifique que o
condensador se encontra elevado e o diafragma aberto. Desligue o microscópio.
Observação: A finalidade do condensador é a de reunir toda a luz num feixe estreito, mas de grande
intensidade luminosa. Junto ao condensador existe o diafragma, que funciona da mesma maneira que o
diafragma das máquinas fotográficas, ou melhor, que funciona como sua íris, aumentando ou diminuindo o
tamanho da pupila, regulando assim a entrada de luz. Só mexa no condensador e no diafragma em condições
especiais. Normalmente o condensador funciona elevado e o diafragma aberto.
LEMBRE QUE
o O aumento de uma imagem vista ao microscópio óptico é sempre o produto dos aumentos fornecidos
pela ocular, multiplicado pelos aumentos fornecidos pela lente objetiva usada. Portanto, se você estiver
usando uma ocular de 10X e uma objetiva de 45X, a imagem observada estará aumentada quantas vezes?
________
o Toda vez que for usar o microscópio, use sempre a objetiva de menor aumento em primeiro lugar, pois
ela lhe dará maior visão do material. Em seguida, use o segundo aumento. Repare que quanto maior for
o aumento, menor será a área observada.
o A objetiva 100X deverá ser usada em microscopia de imersão, isto é, coloca-se sobre a lâmina uma gota
de óleo de cedro e sobre esta gota, mergulha-se a objetiva. A função do óleo de cedro é proporcionar
maior iluminação ao canhão evitando a dispersão dos feixes luminosos.
1. Para transportá-lo use as duas mãos, uma segurando o braço do microscópio e a outra o sustentando pela
base. NUNCA carregue o aparelho usando apenas uma das mãos!!!
2. Não gire o micrométrico indefinidamente para mover o canhão, pois poderá estragar o seu delicado
mecanismo. Use-o somente para ajustar o foco e para as observações de profundidade.
3. Não passe os dedos nas lentes para limpá-las. O vidro das lentes é facilmente arranhável (mais que o vidro
comum), por isso, só devemos usar um papel especial, bem macio, para limpá-las.
4. Evite molhar o microscópio enquanto estiver trabalhando. Se isso ocorrer, seque-o com um pano bem
macio.
5. Não desmonte qualquer parte do microscópio. Este é um instrumento muito caro, portanto, todo cuidado
é pouco.
6. Quando acabar o trabalho com o microscópio, retire da platina o que estiver observando, coloque a
objetiva de menor aumento e abaixe o canhão. Guarde o aparelho num local adequado, tendo o cuidado
de verificar se está pronto para ser usado.
Procedimento.
Pesquisar: Qual a composição de um meio de cultivo líquido para algas? Poderíamos cultivar algas em meio
sólido?
Os fungos e seus esporos encontram-se, nas mais diversas condições ambientais. A colheita, isolamento e
cultura não apresentam, por isso, dificuldades. O problema é, ao contrário, o de não deixar contaminar por
fungos as culturas de outros organismos, especialmente de bactérias.
Misturar 6,0 g de farinha de milho com água até obter uma papa e ferver até obter
um mingau. Filtrar por gaze. Juntar 1,5 g de ágar. Aquecer até o ágar estar dissolvido.
Completar o volume até 100 mL com água, distribuir em tubos pequenos e esterilizar
na autoclave (ou na panela de pressão) durante 20 minutos (121oC).
A cultura em lâminas permite acompanhar o desenvolvimento de um fungo sem que os esporos se espalhem
pelo ar contaminando outras culturas e eventualmente, desencadeando reações alérgicas. O procedimento
mais simples é o de colocar um pedaço de fita durex sobre as hifas e cola-lo na lâmina. Contudo, se quisermos
observar o crescimento dos fungos, o melhor procedimento é o seguinte:
A. Inocular um tubo de ágar nutriente, liquefeito e resfriado (45-50oC), com uma cultura de fungos em pão
ou fruta; rolar o tubo entre as palmas da mão para distribuir bem o inoculo;
B. Flambar uma lâmina e uma lamínula, pingar uma gota da cultura na lâmina e colocar a lamínula de tal
maneira que o ágar se espalhe até mais ou menos 5 mm de seus bordos;
C. Colocar a lâmina em uma placa de Petri contendo uma bolota de algodão carregado de água; a umidade
do algodão retarda o ressecamento do meio; incubar por 2 a 4 dias à temperatura ambiente.
D. Fazer observações microscópicas periódicas e desenhar – ou fotografar - o aspecto dos fungos na cultura.
Identificar as estruturas.
Material
Lâminas de vidro, algodão, álcool 95 o GL, álcool 90 oGL, papel absorvente, cultura de Bacillus megatherium,
padrões Gram negativos (G-) e Gram positivos (G+), soluções corantes (azul de metileno, cristal violeta,
fucsina ou safranina, lugol), nigrosina (= tinta da índia), bico de Bunsen, alça de Níquel-cromo, microscópio.
Procedimento
1. Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão mista de bactérias na lâmina identificada com o nome
do aluno.
2. Deixar secar espontaneamente.
3. Fixar o esfregaço à lâmina, segurando-a com um pregador de madeira e passando-a três vezes sobre a
chama do bico de Bunsen, com a parte do esfregaço para cima.
NOTA: Com outros corantes como o cristal violeta ou a fucsina, o procedimento pode
ser o mesmo bastando alterar o tempo de tratamento (2 a 60 segundos com cristal
violeta e 15 a 30 segundos com fucsina).
OS MEIOS DE CULTURA
OS MEIOS DE CULTURA
A composição dos meios de cultura varia ao infinito. No entanto podemos, grosseiramente, dividir os meios
em duas categorias:
o Os meios ditos complexos cuja composição não é bem definida (extrato de carne, de levedura, de
peptona, de malte, etc.).
o Os meios sintéticos de composição determinada
Os meios que servirão de substrato para o cultivo bacteriano podem se apresentar como meios líquidos ou
sólidos. Geralmente, se acrescenta como agente solidificante o ágar, um açúcar obtido a partir de algas
marinhas. Este suporta perfeitamente o autoclavado (salvo a pH < 4 ou a pH > 9), derrete quando a
temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce de 500C.
a) Misturar os componentes nas proporções indicadas e adicionar água destilada até completar o volume
desejado. Se for necessário, para dissolver os componentes, esquentar no Banho Maria.
b) Determinar o pH e ajustá-lo se necessário.
c) Distribuir o meio em tubos sem enchê-lo totalmente.
d) Tampar
e) Esterilizar.
Observação
Na falta dos componentes acima, o caldo pode ser preparado como a seguir: Cortar em pedaços pequenos
500 g de carne sem gordura, acrescentar 900 mL de água e manter na geladeira por 12 horas. Esquentar
devagar e ferver por 10 minutos. Acrescentar 5 g de sal (não iodado). Tirar a espuma, deixar esfriar e filtrar
duas vezes. Completar o volume a 1000 mL.
A ESTERILIZAÇÃO
A esterilização pode ser definida como a destruição completa de todo organismo vivo por processos de
aquecimento, filtração ou qualquer outro método físico ou químico.
Algumas soluções (vitaminas, antibióticos, etc.) não podem ser esterilizadas por calor sem sofrer graves
alterações. As preparações que contêm compostos termolábeis são esterilizadas por filtração. Todo o
equipamento de filtração é previamente esterilizado em autoclave.
As membranas Millipore são esterilizadas por ebulição suave durante 20 minutos em água destilada; deve-
se tomar cuidado para que não toquem as paredes do recipiente. Deixa-se esfriar, e retiram-se as membranas
da água com uma pinça estéril, colocando-as imediatamente sobre o respectivo disco de suporte.
Sistema Millipore
Também se podem esterilizar meios líquidos com filtros descartáveis que podem ser acoplados a seringas.
Este método é de grande utilidade na preparação de meios de cultivo para células vegetais porque permite
esterilizar hormônios sem perda de atividade.
Pesquisa: Existem outras formas de esterilização? Quais? Quais as vantagens e as desvantagens desses
métodos?
A SEMEADURA EM PLACA
A TÉCNICA BÁSICA
Em uma amostra de microrganismos colhida na natureza encontraremos diversos tipos misturados. Para
poder caracterizar a atividade de cada um deles devemos estudar culturas contendo um único tipo de
microrganismo (cultura pura).
Somente com semeadura em placa é que podem ser obtidas colônias isoladas. É perda de tempo e material
simplesmente espalhar a amostra sobre a placa, esperando fazer um diagnóstico bacteriológico. A arte da
semeadura só é aprendida através de repetidas práticas diárias.
A técnica de esgotamento do inóculo é uma técnica de rotina para o isolamento de bactérias em culturas
puras. Se a semeadura não for satisfatória, não se obtêm colônias isoladas, devendo-se requisitar nova
amostra.
A placa de Petri deve conter um meio de cultura, no qual o organismo a ser isolado cresça
caracteristicamente. O meio de cultura deve estar bem seco, pois se estiver úmido, a água de condensação
pode arrastar as bactérias sobre a superfície da placa.
As placas de Petri deverão ser abertas próximo ao bico de Bunsen, para evitar contaminação com germes do
ar. A figura abaixo mostra as três formas possíveis de segurar a placa durante o procedimento. Experimente
as três com uma placa vazia antes de escolher a que melhor se adapte a suas possibilidades.
Uma alça do material a ser semeado é colocada na parte superior do meio de cultura. Tocar somente a
superfície do meio, tratar de não perfurar o ágar. Esse é o chamado inóculo inicial.
Flambar a alça de platina e, a partir do inóculo inicial, semear em ângulos retos ao inóculo, retirando linhas
de semeadura, paralelas umas às outras. Virar a placa e semear em ângulos retos às linhas paralelas já feitas,
de modo que o resultado seja uma série de linhas formando pequenos quadrados sobre a superfície do meio.
As colônias isoladas devem aparecer no final da semeadura. Se houver crescimento de bactérias nos centros
dos quadrados formados pelo processo da semeadura, será obviamente contaminação.
Uma vez semeadas, as placas devem ser incubadas com a tampa voltada para baixo.
Material
Placa de Petri contendo meio de cultura, tubo com solução salina estéril, pipeta estéril, alça de níquel-cromo,
caneta pilot, bico de Bunsen, suspensão mista de bactérias.
Procedimento
1. Transferir, com uma pipeta estéril, 0,1 mL da suspensão mista de bactérias para um tubo contendo 4,9 mL
de solução salina estéril (diluição 1:50).
2. Agitar bem e homogeneizar.
3. Flambar a alça e retirar uma gota pequena de suspensão mista de bactérias diluída e semeá-la sobre a
superfície de um meio sólido (ágar simples).
ATENÇÃO: A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema apresentado a
seguir (método de esgotamento). Entre um setor e outro, a alça deve ser esterilizada.
Resultados
1. Desenhe a aparência da placa (ou fotografe a placa) mostrando a distribuição do material inoculado.
Desafio
Como você procederia para obter uma cultura pura de uma das colônias observadas?
OS CRITÉRIOS UTILIZADOS
1. TAMANHO
2. FORMA
3. ELEVAÇÃO
4. BORDOS
5. ESTRUTURA
Seres vivos visíveis a olho nu são relativamente fáceis de classificar pelas suas características morfológicas.
Microrganismos só podem ser vistos com ajuda do microscópio e sendo muito parecidos resulta impossível
diferenciá-los. Por isso é necessário estudar as características metabólicas, quer dizer a maneira pela qual o
microrganismo desenvolve os processos bioquímicos vitais. Atualmente, a utilização de sistemas
miniaturizados simplifica a tarefa.
Objetivo: Utilizar alguns testes bioquímicos para caracterizar diferentes microrganismos (E. coli, B. subtilis
e M. luteus).
Material
Três culturas bacterianas diferentes (A, B e C), placas de Petri contendo ágar nutriente, placa de Petri
contendo ágar-leite, placa de Petri contendo ágar-amido, 3 tubos contendo caldo glicosado e indicador de
pH, 3 tubos contendo caldo lactosado e indicador de pH, 3 tubos contendo caldo com sacarose e indicador
de pH, solução desinfetante, alça, pipetas Pasteur estéreis, bico de Bunsen, fita adesiva, caneta pilot.
Procedimento
1. Rotular os tubos.
2. Em condições assépticas inocular com a pipeta Pasteur a cultura A nos três tubos contendo caldo
glicosado, caldo lactosado e caldo sacarosado respectivamente.
3. Repetir o item anterior com a cultura B.
4. Repetir o item B com a cultura C.
5. Incubar o material a temperatura ambiente. .
Resultados
1. Descreva as colônias A, B e C.
2. Quais das 3 culturas produzem amilase?
3. Quais das 3 culturas produzem protease?
4. Houve fermentação de carboidratos? Como pode ser acompanhada?
Discussão
Identifique as culturas A, B e C sabendo que as colônias de E. coli e B. subtilis são brancas e as M. luteus são
amarelas; M. luteus e B. subtilis produzem proteases e fermentam a sacarose; B. subtilis produz amilases;
M. luteus, B. subtilis e E. coli fermentam a glicose; E. coli fermenta a lactose.
O número de microrganismos em uma cultura pode ser estimado colocando um volume determinado desta
em ágar nutriente a 37.0C de maneira que cada célula possa se multiplicar dando origem a uma colônia.
Depois de 24 á 48 horas de incubação poderemos observar e contar as colônias. Aceitando que cada uma
delas resulta da multiplicação de um indivíduo isolado é possível calcular o número de microrganismos na
cultura.
Material: cultura de E.coli (diluição / 10-4), placas de Petri contendo meio nutriente, 5 tubos de ensaio com
4,5 mL de água destilada estéril, 1 tubo de solução salina, desinfetante, seringa de 1 mL pipeta
Pasteur calibrada, fita adesiva, caneta pilot, estufa a 370.C.
Procedimento.
Resultados:
3. Quantas vezes a cultura original foi diluída nessa gota? (Dica: de A para B a cultura foi diluída 10 vezes)
Discussão: Sugira diferentes aplicações para esta técnica. Como poderia melhorá-la? Prepare um protocolo
apropriado.
Lâmpadas especiais que emitem luz UV com comprimento de onda microbicida são utilizadas para reduzir o
número de microrganismos no ar, em superfícies de salas cirúrgicas e em salas assépticas onde produtos
esterilizados são distribuídos em garrafas ou ampolas estéreis.
Nesta atividade estudaremos a ação germicida da luz ultravioleta sobre diferentes tipos de microrganismos,
tais como E. coli, B. subtilis, M. luteus, S. cerevisiae ou Rhodotorula.
Material (por grupo): 4 placas de Petri estéreis com meio nutriente para as bactérias e com meio nutriente
sacarosado para as leveduras; swab estéril; 1 pipeta Pasteur estéril, culturas de vários
microrganismos, 4 cartões de cartolina preta vazados, fluxo laminar com luz UV.
Procedimento:
5. Expor as placas à luz UV durante 1 min. (placa 1), 5 min. (placa 2), 10 min. (placa 3) e 20 min. (placa 4).
Resultados
1. Observe o crescimento dos microrganismos na região da placa correspondente à área vazada dos cartões.
Registre as observações de seu grupo no quadro a seguir.
Microrganismo _________________________________
CRESCIMENTO
Discussão
4. A luz UV agiu do mesmo modo sobre os diferentes microrganismos? Se a resposta for negativa, explique.
5. Uma caneta de luz UV é utilizada em alguns países para descontaminar os telefones celulares. Você acha
esse método adequado?
A propaganda de muitos desinfetantes se refere a “ação germicida” destes produtos. Nesta atividade vamos
pesquisar a ação de diversas concentrações de um desinfetante sobre culturas de Escherichia coli.
Discos de papel de filtro de 5 mm de diâmetro, água sanitária (diluição 50%), 1 placa de Petri contendo ágar
nutriente estéril, 4 tubos com 1,5 mL de água esterilizada, 1 pipeta de 1 mL estéril, 1 pipeta Pasteur estéril,
desinfetante, 1 tubo com 5 mL de ágar nutriente estéril (ágar brando), pinças, bico de Bunsen, estufa a 30C,
cultura pura de Escherichia coli, pilot.
Observação 1: com outros desinfetantes recomenda-se partir de 0,2 mL e preparar a diluição seriada em
tubos com 1,8 mL de água esterilizada.
Observação 2: O ágar derrete quando temperatura passa de 900C e solidifica quando a temperatura desce
de 500C.
Procedimento
B. PREPARAÇÃO DA PLACA
Em condições assépticas
1. Inocular o tubo contendo ágar nutriente liquefeito (ágar brando) com 1 mL de uma cultura pura
de Escherichia coli. Misturar bem.
2. Verter o conteúdo do tubo na placa. Deixar
solidificar.
D. O TESTE
Depois de rotular a placa dividindo-a em 5 setores, trabalhar em condições assépticas:
1. Acrescentar no centro da placa um disco-controle.
2. Molhar um disco com o desinfetante diluído (tubo 4), abrir a placa e colocá-la na superfície do
meio.
3. Repetir o procedimento com as outras diluições do desinfetante (tubos 3, 2 e 1).
4. Incubar a 30C durante 48 horas antes de proceder à leitura do teste.
Resultados
1. Prepare um desenho (ou fotografia) mostrando a aparência da placa e indicando o diâmetro das zonas
de inibição ao redor dos discos.
Discussão:
5. A descarga de água no vaso sanitário dilui os desinfetantes. Comente em função de seus resultados.
Diferentes tipos de microrganismos se desenvolvem na pele, isto é nas dobras e partes mais úmidas
associadas às glândulas sudoríparas. O cheiro da transpiração é o resultado da ação destes microrganismos.
Os desodorantes inibem o crescimento dos microrganismos responsáveis pelo cheiro da transpiração. Nesta
atividade estudaremos a ação de diferentes desodorantes sobre o crescimento de Micrococcus luteus.
Material
1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky,
3 desodorantes diferentes (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril, caneta pilot, bico de
Bunsen.
Procedimento
Resultados
Discussão
Material
1 placa contendo ágar nutriente estéril, 1 cultura de Micrococcus luteus, 1 pipeta estéril, 1 alça de Drigalsky,
3 dentifrícios ou três soluções anti-placa bacteriana (A, B e C), 4 discos de filtro esterilizados, 1 pinça estéril,
pilot, bico de bunsen.
Procedimento
Resultado
Discussão
1. Os dentifrícios estudados têm alguma ação sobre as bactérias? Qual é o mais eficiente?
2. Alguns dentifrícios contêm substâncias que inibem o crescimento bacteriano. Quais os outros
ingredientes de um dentifrício e qual a sua função?
O uso indiscriminado de antibióticos na clínica teve como consequência um aumento de formas resistentes,
dificultando o combate aos microrganismos. Atualmente, no Brasil, a venda de antibióticos só é possível com
receita médica.
Então, como levar a ação germicida ao laboratório de ensino? Desinfetantes, dentifrícios e desodorantes
representam algumas das opções possíveis. Outra possibilidade são as soluções antifúngicas de uso tópico
destinadas ao tratamento de micoses superficiais, de baixo custo e venda livre nas farmácias. Estes produtos
podem ser testados com Saccharomyces cerevisiae, uma levedura vendida comercialmente que é utilizada
habitualmente nas atividades práticas por não apresentar risco nenhum.
Desvio de função de um produto comercial? Não, se tivermos em conta que Não temos a pretensão de avaliar
sua eficiência. Para isso, a sociedade conta com organizações específicas que seguem protocolos estritos
antes de dar a autorização correspondente.
Objetivo
Evidenciar a ação germicida de uma solução antifúngica de uso tópico e venda livre nas farmácias.
Materiais
Uma placa contendo ágar nutriente estéril (Sabouraud), 1 cultura em caldo de Saccharomyces cerevisiae, 1
pipeta estéril, 1 swab estéril, uma solução antifúngica, 5 discos de papel de filtro estéreis, 1 pinça estéril,
pilot.
Procedimento
Perguntas
BIBLIOGRAFIA
PELCZAR M., REID R e KRIEG N. R. Microbiologia. São Paulo, Makron Books, 1996
WYMER P. Practical Microbiology and Biotechnology for Schools. London, Mac Donald and Co., 1987