Gen ApoE: Análisis, Resultados y Conclusiones.

Presentando por Adriana García, Luis Quintero, Isabella Villa y

Ricardo López del Programa de Medicina de la Universidad del
Norte

en la asignatura de Biología Molecular

a la profesora Alma Polo Barrios

Barranquilla, 8 de noviembre del 2019

 Gen ApoE: Análisis, Resultados y Conclusiones.

Gen ApoE: Análisis, Resultados y Conclusiones

Adriana García, Luis Quintero, Isabella Villa y Ricardo López

Resumen

Aproximadamente el 99% de la secuencia de ADN entre dos individuos diferentes es la misma,

la mayoría de diferencias fenotípicas como la susceptibilidad a enfermedades está dada por el
0,1% restante que tiene la capacidad de variar, a estas variaciones genéticas se les conoce
como polimorfismos, los cuales se refieren a la existencia de múltiples alelos en un gen. Uno
de los genes más estudiados es el ApoE que se encuentra en el cromosoma 19 en humanos
y codifica para la apolipoproteína E, esta es importante para la estructura y metabolismo de
las lipoproteínas, este gen presenta tres alelos importantes ApoE3, ApoE2 y ApoE4, que son
heredados de forma codominante dando como resultado seis genotipos de los cuales
solamente ApoE3/ApoE3 es normal, también se ha podido identificar que ApoE2 está
relacionado con la Hiperlipidemia tipo III y el Parkinson y ApoE4 con enfermedades como
aterosclerosis y Alzheimer. Teniendo en cuenta esta información, el objetivo del trabajo
realizado en los laboratorios es determinar qué genotipo está presente en las muestras de
sangre tomada a los estudiantes, para esto se utilizaron las técnicas de extracción de ADN
(humano, plasmidial y bacteriano), cuantificación y purificación del ADN, PCR, la adición de
enzimas de restricción y finalmente la electroforesis en gel de agarosa, estas serán descritas
con más profundidad en la sección de metodología; las mesas participantes en este informe
presentaban muestras diferentes, la mesa 7 con la muestra X610F2 dio como resultado ApoE3
homocigoto y la mesa 8 con la muestra 8JK3L dio como resultado ApoE3/ApoE4 heterocigoto,
en base a esto podemos concluir que la persona que donó la sangre utilizada por la mesa 7
presenta el genotipo normal a diferencia de la que fue utilizada por la mesa 8 que tiene la
predisposición a la enfermedad de Alzheimer.

Introducción.

Primeramente, debemos dejar en claro que es un polimorfismo, ya que es algo de lo que vamos
a hablar en este trabajo, es una variación en un lugar determinado de una secuencia de ADN
en los cromosomas o locus que determina la posición de un gen o de un marcador genético
entre individuos de una población. En estos se pueden presentar cambios como: una base
nitrogenada, podría ser tan simple como el cambio de una Adenina por una Citosina, pero no
en realidad no es así de simple, suele ser más intrínseco y complejo de lo que creemos, se
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podría dar el caso de que se repita una secuencia del ADN en donde algunos individuos de
una población tenga un número de copias de una determinada secuencia, no obstante, los
polimorfismos producen cambios en la estructura de la proteína en el mecanismo de regulación
de la expresión, produciendo cambios fenotípicos, ejemplo el color del pelaje o la cantidad del
mismo. El polimorfismo, requiere de una mutación en una especie para determinar el cambio
del rasgo y una vez ocurrido, ese cambio es heredable a la descendencia.
Ahora hablemos un poco de la llamada Apolipoproteína E, que es básicamente lo más
importante de este trabajo, es una proteína plasmática constituyente de las lipoproteínas, que
tiene la función de mantener la estructura y regular el metabolismo de varias de estas. Los tres
alelos más comunes del gen de Apo E son: ε2, ε3 y ε4, los cuales producen tres isoformas de
la proteína llamada: E2, E3 Y E4. Estos tres alelos diferentes son heredados en forma
codominante dando como resultado seis genotipos: E2/2, E3/2, E3/3, E3/4, E4/4, E4/E2. el
genotipo E3/E3 es normal, la deficiencia de ApoE, causa hipercolesterolemia severa. Apoe E3
es la isoforma de la proteína más común con una frecuencia del 77% en la población, y
contiene una cisteína en la posición 112 y una arginina en la posición 158. Apoe E2, que posee
la más baja frecuencia, se encuentra en el 8% - 11% y contiene cisteína en ambas posiciones.
Apoe E4 se encuentra en 12% a 15% de la población y contiene arginina en ambas posiciones.
En el estudio d un gen ApoE polimórfico, se extrae ADN humano, con este, además del ADN
humano, se extrae ADN genómico bacteriano y plasmidial. para lograr extraer el genoma,
primero se debe lisar la membrana celular, para esto existen varias técnicas, pero estas se
basan principalmente en el uso de detergentes como lo es el Dodecilsulfato sódico (SDS) y el
Tritón X - 100, se usa Triton X - 100 como detergente para la lisis celular del ADN humano y el
SDS para la lisis de la membrana nuclear, para obtener una muestra pura, se debe precipitar
las proteínas y degradar el ARN, esto se hace mediante el uso de NaCl 6M, RNasas y acetato
de sodio. Para el estudio del gen ApoE, usamos la PCR usando primers específicos del gen
ApoE ε4, la solución Master Mix, el buffer de amplificación y desoxirribonucleótidos libres, se
logró amplificar las muestras de ADN. luego tratado con enzimas de restricción para producir
fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Estas enzimas de restricción hacen un proceso
de digestión restrictiva en el cual reconocen secuencias cortas y específicas en el ADN donde
cortan formando fragmentos de distintas longitudes. Los fragmentos de restricción se separan
mediante electroforesis en geles de agarosa a través del cual corren debido a un campo
eléctrico y su disociación obedece a la masa o a la carga eléctrica de las muestras según la
técnica utilizada. Esto proporciona un patrón de bandas que es único para un ADN en particular
debido a la diferencia en las secuencias del ADN en los individuos donde los sitios de
restricción varían. esto hace que la técnica sea dominante ya que nos permite distinguir
individuos homocigotos de los heterocigotos haciendo referencia a que nos permite ver con
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claridad los alelos que estudiamos y mediante el gel ver el tamaño de los alelos, pudiendo
diferenciar un individuo y otro. Para esta técnica, es importante seleccionar endonucleasas que
cortan en sitios específicos y no sea en secuencias degeneradas.
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Materiales y Metodología

1.Extracción de ADN a partir de sangre humana

Para esta práctica fue necesario el uso de un anticoagulante, sales, tampones y

detergente que permitieran la lisis de la membrana celular sin afectar casi a los
núcleos. La solución EDTA fue utilizada como anticoagulante, posteriormente se
añade Tritón X-100 y Tampón A para lograr la lisis celular, luego se lleva a la
centrifugadora para obtener los núcleos sedimentados al fondo, se descarta el
sobrenadante y se procede a lavar los núcleos con Tampón A solamente; una vez
obtenidos los núcleos limpios y libres de hemoglobina, se resuspenden en Tampón
B y SDS con el fin de solubilizar las proteínas y membranas, en este caso sería la
nuclear y se agrega NaCl para separar los polisacáridos de los ácidos nucleicos, se
lleva nuevamente a la centrifugadora pero en este caso se recupera el sobrenadante
y se desecha el pellet que corresponde a desechos celulares, al sobrenadante se le
agregan ARNasa y se incuba, posteriormente se añade acetato de sodio y etanol
frío para que se dé la precipitación del ADN el cual se verá como un floculado de
color blancuzco, luego se lava sucesivamente con etanol al 70% para limpiar el ADN
de cualquier residuo que haya podido quedar, se descarta el alcohol y se añade
agua Milli Q, se marca el tubo eppendorf y se conserva a la temperatura establecida
de -20°C.

2. Cuantificación y pureza del ADN

Para esta práctica se utilizó la técnica de espectrofotometría ya que esta nos permite
confirmar que contamos con las cantidades suficiente de ADN y de calidad
adecuada antes de pasar al PCR. Esta técnica está basada en que el ADN tiene la
capacidad de absorber luz en el rango ultravioleta, entonces se ha establecido un
máximo de absorción de luz para esta molécula a 260 nm, también hay que tener
en cuenta que las proteínas que interaccionan con el ADN pueden absorber luz en
el rango ultravioleta, pero con un máximo de absorción de 280 nm. Primero se diluye
el ADN en Agua Milli Q porque esto permite que los datos sean más exactos, luego
se prepara el blanco que es Agua Milli Q que debe provenir del mismo lote de la que
fue utilizada para las diluciones del ADN, esta muestra blanco se lleva al
espectrofotómetro para que como su nombre lo indica nos sirva de base o de
referencia, posteriormente se realizan las mediciones de las diluciones de ADN a la
absorbancia de 260 y 280 nm y se copia la información de las lecturas realizadas
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por el equipo en una tabla, finalmente se procede a hacer los cálculos

correspondientes. Se utiliza la ecuación Lambert-Beer para hallar la concentración
de la solución que contiene el ADN y después de obtener los resultados del
espectrofotómetro se ha determinado que el cociente de las lecturas de absorbancia
a 260 nm y 280 nm deben estar en un rango de 1.8 y 2.0 para que pueda ser
considerada pura.

3. PCR

Esta técnica nos permitió amplificar el ADN, mediante la acción de una enzima ADN
polimerasa termoestable. Para esto se necesita desnaturalizar el ADN bicatenario
para separarlo y una vez esté de una sola hebra pueda unirse a los primers
sintéticos que definen la región de ADN que se va a amplificar, estos primers van a
ser alargados por la enzima ya antes mencionada. El procedimiento de preparación
de la reacción se tiene que dar a una temperatura de 0 – 4 °C, este proceso consiste
en añadir la Master Mix que contiene todas las enzimas y reactivos necesarios para
posteriormente llevar la muestra al termociclador, después estas deben ser
almacenadas a una temperatura de – 20°C u observadas mediante electroforesis.

4. Enzimas de restricción y RFLP

Como bien se conoce, esta técnica consiste en el uso de enzimas de tipo

endonucleasas de restricción, las cuales se encargan de fracturar y/o cortar los
enlaces fosfodiéster de secuencias específicas de una molécula de ADN. Dicha
técnica suele ser utilizada clínicamente para determinar la presencia de
polimorfismos o para la identificación de alteraciones en el ADN causadas por
mutaciones. Los resultados de la acción de las enzimas de restricción pueden ser
observados mediante técnicas electroforéticas utilizando como soporte agarosa o
poliacrilamida.

Para el desarrollo de esta técnica fue necesario el uso de enzimas de restricción,

exactamente las de grupo II ya que son las más específicas porque reconocen una
secuencia específica de 6 nucleótidos de longitud y realizan el corte entre alguno
de los nucleótidos que hacen parte de esta secuencia. Además de dichas enzimas,
fue imprescindible el uso de buffers, solución de albúmina de suero bovino (no todas
las enzimas necesitan la adición de BSA), ADN humano, genómico bacteriano y
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plasmidial, micropipetas con sus respectivas puntas, incubadoras y tubos
eppendorf.

El proceso en sí consiste en agregar la cantidad de reactivos y enzima sugeridos;

centrifugar, incubar la muestra durante 1-1.5 horas a 37ºC y por último almacenar
la muestra a una temperatura de 4ºC.

5. Electroforesis en gel de agarosa

Se utilizó la cámara de electroforesis horizontal, una fuente de poder, gel de

agarosa, buffer y transiluminador. Mediante esta técnica electroforética se logró
determinar el peso molecular de las moléculas separadas, en la que el ADN de
carga neta negativa se sometió a un campo electromagnético y se evidenció como
migraron al polo positivo. Primero se posicionó el gel de agarosa, ubicando los
pozos de siembra cerca al cátodo, después se añadió el buffer de corrido;
posteriormente se procedió a sembrar estas junto a un marcador de peso molecular.
Se llevó a cabo el corrido electroforético, al sacar los geles se utilizó bromuro de
etidio para teñirlos, y ser incubados después; luego se lavaron con agua y
posicionados sobre el transiluminador, por medio del cual se pudo apreciar las
bandas de ADN en el gel.

Resultados

1.Extracción de ADN humano a partir de sangre humana.

Esta técnica fue utilizada con el propósito de lograr extraer ADN genómico de una
muestra de sangre, la cual fue donada voluntariamente por un estudiante previo a
la práctica. Como resultado del procedimiento realizado se obtuvo ADN genómico
extraído de células nucleadas de la sangre, como los leucocitos. Se logró apreciar
la presencia de ADN en los tubos eppendorf ya que al agregar etanol absoluto se
comenzó a evidenciar la aparición de una mota de color blancuzco. El ADN extraído
se encontraría libre de ARN y otros componentes de la célula debido al uso ARNasa,
etanol, agua y las respectivas sales que se mencionan en el procedimiento.
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Figura 1. ADN humano extraído de muestras de sangre humana.

2. Cuantificación y pureza del ADN

Al realizar la técnica de cuantificación y pureza por medio de espectrofotometría, se

pudieron observar los siguientes resultados. Cabe aclarar que no hay un método
exacto para cuantificar ADN y este método nos otorga una aproximación más no un
número exactamente igual al real.

Medición ADN humano ADN bacteriano ADN plasmidial

Absorbancia a 260 0.091 0.170 0.036

nm

Absorbancia a 280 0.053 0.129 0.035

nm

Relación A260/280 1.71698 1.31782 1.02857

Concentración 455 μg/ml 850 μg/ml 180 μg/ml

Absorbancia del 0 0 0
agua mili Q a 320
nm

Tabla 1. Resultados de espectrofotometría de las muestras de la mesa #7

En los resultados de la mesa #7 se puede apreciar que la relación A260/280 de

todas las muestras es menor a 1.8 por lo cual hay presencia de sales y proteínas,
esto puede evidenciar una falla en los métodos de purificación.

Medición ADN humano ADN bacteriano ADN plasmidial

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Absorbancia a 260 0.123 0.092 0.014

nm

Absorbancia a 280 0.087 0.058 0.009

nm

Relación A260/280 1.413 1.586 1.556

Concentración 615 μg/ml 460 μg/ml 70 μg/ml

Absorbancia del 0 0 0
agua mili Q a 320
nm

Tabla 2. Resultados de espectrofotometría de las muestras de la mesa #8.

En los resultados de la mesa 08 se puede evidenciar que la relación A260/280 en

todas las muestras es menor a 1.8 lo cual indica una pequeña presencia de
proteínas y sales que puede ser resultado una falla en los métodos de purificación;
también se puede identificar una baja concentración de ADN plasmidial. Al comparar
los resultados de ambas mesas se puede apreciar que faltó precisión al momento
de la purificación de las muestras de ADN ya que ambas presentan restos de
proteínas y sales en ellas. La mesa #8 en general logró conseguir muestras de ADN
más puras que la mesa #7.

3. Reacción en cadena de la polimerasa

Al realizar la técnica de PCR obtenidas al emplear las técnicas de extracción y

purificación de muestras de sangre humana y por el ADN obtenido por la extracción
y purificación de ADN bacteriano de E.coli, se espera obtener segmentos
amplificados del segmento target del que se busca amplificar. Los targets serán las
regiones polimórficas del gen apoE. Al haberse realizado la técnica y terminado el
proceso en el termociclador no se podía corroborar si en verdad se había
amplificado la secuencia, esto se debía confirmar posteriormente empleando una
técnica electroforética, para de esta forma evidenciar la banda y confirmar o no la
presencia del gen.

4.Enzimas de restricción y RFLP

Al realizar la técnica con las enzimas de restricción se buscaba obtener los

polimorfismos de longitud en las distintas muestras de ADN. En esta técnica se
empleó tanto el ADN genómico humano, como el ADN genómico bacteriano de
E.coli y el ADN plasmidial de E.coli. Al terminar el proceso se espera obtener los
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polimorfismos del ADN humano que serán posteriormente serán analizados en la

electroforesis en gel de agarosa. El ADN bacteriano y plasmidial también serán
utilizados en la técnica de electroforesis, pero no ayudarán a la identificación del
gen ApoE.

5.Electroforesis en gel de agarosa

Figura 2. Resultado del recorrido electroforético en gel de agarosa. El gel de la

izquierda corresponde al gel de la mesa #7 y el de la derecha al gel de la mesa #8.

De izquierda a derecha las bandas corresponden a: ADN bacteriano, ADN

plasmidial, ADN humano, marcador de peso molecular, PCR ApoE 2, PCR ApoE 3,
PCR ApoE 4, enzima de restricción humana, enzima de restricción bacteriana.

El gel de la mesa 7 nos permite identificar claramente la banda de ADN bacteriano

y plasmidial, lo cual indica una buena cantidad y presencia de estos, la banda
correspondiente al ADN humano no se alcanza a observar; también se puede
evidenciar la banda de PCR ApoE3 y no se evidencia ninguna otra banda de PCR,
lo cual indica que este es un individuo ApoE 3 homocigoto; además se logran
apreciar las bandas de las enzimas de restricción, tanto humana como bacteriana.

En el gel de la mesa 8 se observa con dificultad la banda de ADN bacteriano, se

puede apreciar claramente la banda de ADN plasmidial y también podemos
observar con claridad la banda de ADN humano; con respecto a las bandas de PCR,
podemos identificar la banda de PCR ApoE3 y la banda de ApoE 4, lo cual indica
que es un individuo heterocigoto ApoE3 y ApoE4; la banda de enzima de restricción
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humana se aprecia claramente mientras que la banda de enzima de restricción
bacteriana no se logra a observar claramente.

Conclusiones

Como consecuencia de lo expuesto a lo largo del informe, es válido afirmar que a

partir de los procedimientos realizados en cada laboratorio; desde la extracción del
ADN a partir de sangre humana, hasta la electroforesis en gel de agarosa, fue
posible obtener la información necesaria acerca del gen ApoE, específicamente, a
partir de muestras de sangre de donantes anónimos, se pudo encontrar información
relacionada con los polimorfismos del gen mencionado.

Vale aclarar que de esta forma es probable determinar la posibilidad que tiene una
persona de presentar Alzheimer a lo largo de su vida.

Si bien cada procedimiento realizado en el laboratorio fue de suma importancia para

lograr obtener el resultado, la electroforesis en gel de agarosa nos permitió observar
la existencia de los distintos polimorfismos del gen ApoE en distintas muestras. De
tal forma fue posible determinar que la muestra trabajada por la mesa 08 del grupo
2 obtuvo un heterocigoto ApoE3 y ApoE4, mientras que la mesa 07 del mismo
grupo, obtuvo homocigoto APOE3.

En relación a las técnicas antes expuestas, referentes a la extracción de ADN

humano y su posterior estudio, resulta pertinente aclarar que no fueron las únicas
realizadas a lo largo del semestre puesto que se desarrollaron otras técnicas tales
como la extracción de ADN genómico bacteriano, extracción de ADN plasmidial, así
como las técnicas de PCR, enzimas de restricción y RFLP.

En definitiva, a partir de las distintas prácticas realizadas (anteriormente

mencionadas) fue posible tanto aprender las técnicas correctas para ejecutar cada
una de estas, como lograr diferenciarlas entre sí; destacando características propias
de dichas prácticas que permitieran comprender la importancia que tienen y tendrán
a lo largo de nuestra vida y profesión.

Bibliografía

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