22.

10 - Controle de processos fermentativos 

Em um cultivo microbiano se deve ter várias coisas que se deve preparar para o cultivo microbiano:
➔ preparo de inóculo,
➔ preparo de assepsia.

● microorganismo;
● meio de cultivo;
● esterilização e desinfecção;
● aparelhagem;
● processo fermentativo;
● separação de produto e subproduto;
● tratamento de águas residuais.

Além disso, se tem os tipos de cultivo microbiano propriamente ditos, que são os tipos de processo que se
podem fazer:
● processo contínuo
● processo descontínuo
● processo descontínuo alimentado
● processo semi contínuo

Depois que se faz o processo fermentativo se tem a ​separação do produto​.

Então, para se fazer um cultivo microbiano, o processo é dividido em 3 grandes

partes:
❖ preparado  
❖ a fermentação ou o cultivo microbiano propriamente dito 
❖ separação

Dentro do processo fermentativo, para que ele seja bem sucedido, é necessário que se façam alguns
controles dele. Não adianta nada que se tenha uma fermentação e não se consiga controlar esse
fermentação pois senão se perde todo o rendimento do processo.

Para Indústrias Farmacêuticas, o custo de matérias primas e o custo de operação é muito maior. ⇒ por isso, é
uma área que demanda muita regulamentação. Os regulatórios e a garantia de qualidade de uma certa forma
dão um suporte para tudo isso.

Para que se tenha automação se deve saber o que se deve saber o medir para que a
fermentação seja bem sucedida.
Dentro do fermentador, no processo fermentativo, é necessário controlar alguns parâmetros para que a
fermentação seja bem sucedida. Isso será controlado por um responsável técnico.

Para fazer a escolha dos controles se deve saber o que é importante para o crescimento microbiano e, para
isso, é necessário que que se tenha conhecimentos em bioquímica e, além disso, se deve ter conhecimentos
em microbiologia para saber como a célula se comporta (fungos, bactérias, células animais).
Noções de tecnologia também tem um papel importante.

Alguns itens podem ser controlados no reator:

❖ pH,
❖ Controle de Espuma,
❖ Oxigênio dissolvido,
 ❖ Sistema de Aeração,
❖ Temperatura,
❖ Agitação, etc

Dependendo do processo nem tudo isso será controlado. Mas se terão todos esses controles.
A vantagem da agitação e aeração é que se pode utilizar oxigênio.
➢ na fermentação aeróbica é importante controlar o oxigênio dissolvido.

Otimização do nível de oxigênio é importante para que se garanta o mínimo de oxigênio que deve existir
para que a célula possa respirar e produzir seus metabólitos.

➔ os fungos, por exemplo, são tão dependendentes de oxigênio que se a concentração de oxigênio
abaixar em um valor mínimo ele move e não se recupera mais a célula.

➔ É necessário saber o nível de oxigênio pois há organismos, como o fungo, que não podem ter um nivel
de oxigenio muito baixo pois ele morre e, se isso ocorrer, todos os dias de cultivo são perdidos e será
necessário matar todas as células, esvaziar o reator, remover o meio de cultura, será necessária a
esterilização inteira do reator, etc o que faz uma perda para a empresa bastante significativa.
◆ muitas empresas têm até alarme que mostra quando se tem um valor muito baixo de oxigênio e
há telas também para monitorar a sua concentração. Se pode aumentar a aeração e a agitação
para que se tenha uma reversão na queda de oxigênio dissolvido.

O ​controle de espuma também será importante → em um processo industrial aerado geralmente se gera
bastante espuma e isso ocorre pois muitos dos processos têm ​proteína como fonte de hidrogênio, que gera
espuma quando aerada. ⇒ Quando aumenta o nível de espuma, abre-se uma válvula que goteja anti
espumante, o que diminui a espuma.

É importante também se ​manter a célula em um pH ótimo pois o crescimento pode não ocorrer
adequadamente se a célula estiver em pH diferente ou pode ocorrer dela produzir um metabólito indesejado.

A ​agitação​ é também um fator importante.

➔ Normalmente em uma indústria existe um dimensionamento do motor para que se faça a agitação
adequada → a dimensão do reator dele levar em conta a rotação e a viscosidade do meio. → se
aumentarmos muito a frequência de agitação, o motor pode não aguentar. → é necessário por isso
controlar a agitação para que ela não seja nem muito forte (para não quebrar o motor) e nem muito
fraca (agitação pequena vai acabar não atendendo a mistura necessária).

◆ Agitação tem o intuito de ​quebrar as bolhas de ar​, principalmente em um processo aeróbico,

para aumentar a transferência de oxigênio para o meio de cultura e também é importante para
espalhar as células no meio​.

Controle de pressão​: é importante que se tenha uma pressão positiva no reator.

➔ diferença entre pressão positiva e negativa​:
◆ na pressão negativa ocorre a entrada de ar dentro do reator → caso haja algum vazamento vai
entrar ar dentro do reator: isso é um problema pois não se está conseguindo mantê-lo
hermeticamente fechado.

Mas, normalmente em um reator se injeta ar ou ocorre a produção de gás → com isso, é melhor que se
mantenha uma pressão de ar interna maior que a externa pois ​caso haja qualquer tipo de vazamento a
tendência é o líquido ir de dentro para fora​, o que ​evitaria a entrada de microorganismos no meio de
reação.​
Controle de temperatura​: o processo fermentativo naturalmente libera uma grande quantidade de calor,
então é necessário um sistema para controle de temperatura, então a temperatura pode chegar em níveis
muito altos e pode matar o microorganismo ⇒ o controle é importante para garantir que o sistema vai ter uma
troca de calor eficiente no processo.

Controle do ar​: deve-se passar o ar por um filtro. Passa por um sistema de vapor e depois passa por um filtro.

Há uma lista do que pode ser controlado mas não necessariamente será necessário o controle de
tudo. Dependendo do processo se escolhe o que será controlado.

Controle de volume​: é importante saber o que ocorre com o volume para que se tenha um controle de
processo.
Ex: reator que em 10 dias diminui o volume de 100 para 60 → isso pode ter sido causado pela aeração, onde
se remove a umidade de meio. Nesse caso, para controlar esse problema se poderia colocar um condensador
e repor o volume com água e assim se mantém a mesma concentração de sais. Se colocasse mais meio de
cultura se aumentaria a concentração de sais do meio e iria mudar a osmolaridade do meio.
Por isso, quando se tem uma perda de volume é preferível se completar com água para não mexer na
osmolaridade do meio.
 
➔ Algumas  vezes  o  controle  de  volume  não  é  importante  mas  em  processos  aerados  ele  é 
importante pois é necessário que se saiba se está ocorrendo perda de volume. 
 
Controle de viscosidade​: é importante que se saiba esse fator pois os reatores são projetados para funcionar
com uma determinada viscosidade do meio. Existem processos em que a viscosidade aumenta muito, então é
necessário um controle disso.
Alguns reatores já são projetados para situações de grande viscosidade, com um agitador adequado para essa
viscosidade.
Ao controlar a viscosidade se pode ajudar a entender outros parâmetros ⇒ um cultivo pode ter aumento de
viscosidade e isso pode ser um indicativo de que algo diferente ocorreu: pode ter ocorrido contaminação com
um microrganismo que produz algum polímero, a matéria prima pode ter mudado, etc. → ao olhar esse
parâmetro físico de viscosidade é possível se inferir que ocorreu alguma mudança em parâmetros biológicos.

A ​densidade óptica pode ser comparada com o crescimento celular​. ⇒ quanto maior a densidade óptica,
maior a concentração celular.
➢ a densidade óptica pode ser comparada com a concentração de massa seca.

Cisalhamento​: é a diferença de velocidade entre camadas de líquido → quanto maior a agitação, mais
turbulento o regime e maior o cisalhamento pois haverá mais atrito.
Quanto maior o cisalhamento, maior o atrito para as células: são piores para as células que têm menos
possibilidade de aguentar atrito.
➔ Um agitador de turbina é extremamente agressivo para as células animais pois elas não tem parede,
tem apenas membrana, então ele não é indicado para o cultivo desse tipo de células, apesar de ser um
agitador que promove uma agitação excelente.
◆ Para microorganismos como fungos, células de bactérias ele até pode ser usado, mas
para cultivo de células de animais não.

Tempo de mistura
Distribuição das bolhas​: é importante pois se a bolha for muito grande a transferência de oxigênio será
menor então é necessário controlar isso. Quando começamos a aerar o volume do ar começa a incorporar no
líquido e se vê no reator que o volume total sobe pois ocorreu incorporação de ar dentro do líquido.
Gas  holdup​: Ex volume de 10 litros no reator → quando se começa a aerar, se vê que o volume sobe pois
houve incorporação de ar, fazendo o volume aparente ser maior.

Concentração celular

Viabilidade celular: é um ponto importante também para se ver. Com ele se vê a permeabilidade de
membrana → uma célula que não está bem biologicamente perde a capacidade de ter controle de
permeabilidade da membrana dela.
➢ mesmo um corante se ele entrar na célula ele pode mudar o seu metabólito pois pode ser um redutor ou
um oxidante.
○ Quando se forma NAD e FADH2 no meio das células, essas coenzimas tem uma capacidade
redutora → quando a célula não está bem, ela pode não formar essas coenzimas redutoras e
então ela está em um meio oxidante.

Esses métodos que observam a viabilidade de certa forma ajudam a entender o estado metabólico
das células e isso é importante.

Para ver se uma célula entrou em apoptose se vê a fluorescência, que vai indicar a atividade metabólica das
células (se ela está em um meio redutor ou em um meio oxidante).

Se uma célula estiver fazendo glicólise normalmente o meio terá uma característica redutora. Se não estiver ela
terá uma característica oxidante. → por isso que estudar a viabilidade celular através do meio oxidante ou
redutor ajuda a entender o estado metabólico da célula.

Ex:
Fermentação alcoólica industrial: se em uma usina que tem um volume de fermentação de 10%, ou seja, para
cada 1000 litros no reator, se tem 10.000 litros de células. Mas, se nessa usina só tiver 50% de viabilidade
celular, desses 10.000 litros de material, só 5.000 litros de células tem atividade metabólica e os outros 5.000
estão presentes mas não estão tendo atividade → se poderia então substituir esses 5.000 litros de células
inativas por 5.000 litros de meio de cultura, o que originaria mais material produtivo para a produção do
metabólito de interesse.

Morfologia

Composição celular

Velocidades de Cultivo

Potencial redox​:
As células geralmente trabalham com “alta” concentração de oxigênio (1 mg, 1,2 mg de oxigênio). Mas, há
casos em que a célula precisa de menos de 1 miligrama de oxigênio, de forma que não é possível mensurar
pelo equipamento. Para isso, se mede com um equipamento de óxido redução.

Diferença entre precursores e indutores​:

● Precursor: faz parte da molécula → um precursor pode ser tóxico e então é importante saber o quanto
se está colocando.
● Indutor: induz mas não faz parte da molécula que será formada.
É importante portanto ter o controle dos Precursores e Indutores.

Qual é a lógica empregada para usar um determinado volume de reator para os produtos
correspondentes?
➢ Valor agregado

➢ Para os produtos de biologia molecular os reatores são pequenos: isso devido ao valor agregado, que é
alto e se tem uma demanda baixa. Os produtos serão extremamente caros pois as matérias primas para
engenharia genética são muito caras → tudo isso faz com que se trabalhe com volumes menores.

➢ Para enzimas e antibióticos: o volume dos reatores aumenta. → 100 a 150m​3 de reator → amilases e
proteases.

Ex: uma empresa pode ter 10 reatores de 100m​3 ao invés de ter 2 reatores de 500m​3 ⇒ isso ocorre devido à
célula e a sua característica.

Quando se pensa em demanda se deve pensar também na característica da célula.

➔ Organismos que produzem penicilina e antibióticos de forma geral são meios que tem ou fungos ou
bactérias filamentosas, ou seja, o meio em que eles vivem acaba tendo uma ​viscosidade muito elevada​.
Então, quando se trabalha em um sistema em que a viscosidade é alta, se tem um limite para aumentar
o volume do reator pois chega um momento em que não se consegue misturar adequadamente.

➔ Mas, na produção de ácido glutâmico usa como microorganismo uma bactéria que cresce uma isolada
da outra, formando uma suspensão que não tem viscosidade alta e é mais fácil de trabalhar. Nesse
caso, como não se tem um aumento grande de viscosidade, é possível trabalhar com volumes grandes
de reator.

Mas há bactérias que crescem separadamente uma da outra e isso ajuda que possa ser cultivada em reatores
maiores pois a viscosidade e menor. Além disso, se diminui a chance de contaminação dessas células.

Então é necessário olhar tanto o parâmetro da ​característica da célula​ quanto de d

​ emanda​ do
processo para ​escolher o volume de reator​ que será adequado para o processo.

Sistema para transferência de inóculo para um reator (germinador):

➔ Quando se vai inocular em um germinador, o ar entra filtrado e faz com que o líquido suba vai por um
tubo e entra no fermentador → nesse caso, o líquido então será pressurizado com ar.
➔ Mas, o líquido também pode entrar por gravidade no fermentador.

➔ O sistema de conexão pode ser controlado: há um inóculo no sistema que será flambado e se faz a
conexão e, uma vez que se faz isso se fecha a válvula de vapor e o inóculo entra no reator.
➔ Quando a válvula é aberta se esteriliza o sistema e se fecha a válvula em que se tem acesso ao
fermentador.

Se faz uma transferência de um fermentador menor para um fermentador maior → tal transferência pode ser
feita a partir de diferença de pressão.
➔ No sistema de amostragem o material sai do fermentador e vai para o fermentador maior em um
sistema sempre protegido por vapor para evitar contaminação.
Na indústria se deve ter um compressor de ar para a esterilização do ar quando é utilizado ar atmosférico.

Há também: Sistema para reter o óleo → passa depois por um sistema de condensação do vapor da água →
reduz-se a pressão → vai para o fermentador.

➔ Sempre a pressão é de 80 a 120.

➔ O ar chega no compressor e é reduzida a sua pressão para 1 atmosfera geralmente ⇒ depois ele passa
por um sistema de voltâmetro, que é um tubo de vidro com uma esfera de metal em que, quanto maior a
vazão de ar, mais ela sobe e assim ele mede a pressão.
➔ Normalmente, ele é calibrado para 1 atmosfera ⇒ se o compressor estiver com 8 atmosferas de vai
reduzir a pressão dele para que o ar chegue em 1 atmosfera.

Importância do controle de inóculo

É muito importante que se saiba qual será a fase em que a célula será retirada para ser colocada no reator
(fermentador). Ex: foram feitos 2 testes:
➢ células em fase exponencial
➢ célula em fase de morte

O cultivo de célula, quando se pegou a célula na fase ótima de crescimento (fase lag - exponencial) ela chegou
a 4,5g/L. Quando pegou na fase líquida, próxima da morte da célula, chegou a 2,5g/L.

É importante portanto saber qual o momento exato para a transferência pois isso interfere bastante na
produção do produto (que se quer que seja máxima).
Coluna A e Coluna B → microrganismo A
​ spergillus niger​, produtor de ácido cítrico.
➔ Coluna A: baixas concentrações de Manganês e Ferro.
➔ Coluna B: a mesma cepa foi colocada para crescer em altas concentrações de Manganês e Ferro, sem
limitação deles.

O que se nota na morfologia na coluna A diferente da coluna B?

A coloração das células está mais viva quando a célula possui Manganês e Ferro no meio para seu
crescimento.
➔ O fungo quando está em um meio de cultura bom ele espalha suas hifas para crescer mais: um fungo ​A.
​ uando tem magnésio e ferro no meio fica com as hifas espalhadas e produz ácido cítrico.
niger q
➔ na coluna A ele não produz ácido cítrico.

Portanto, a morfologia é um parâmetro importante de comparação.

Pela morfologia é possível saber se a célula está produzindo o metabólito que se quer ou não.

Nesse caso deve-se também colocar um nível do mineral que seja controlado.

Ex: Células imobilizadas

➔ Enzimas e células podem ser imobilizadas
➔ Quando se trabalha com células imobilizadas, se tiverem células livres há algo errado no processo.

Ex: Encomenda de 1 tonelada de spirulina. É necessário saber o quanto de gás carbônico será necessário para
que 1 tonelada de spirulina cresça.
➢ o carbono representa 50% da célula. Se for produzida 1.000 kg de spirulina, serão necessário 500kg de
carbono.
➢ Depois se pode fazer uma regra de 3:
44g de CO2 ------------12g de C
x CO2---------------------500g de C

Ao saber qual a composição básica de microorganismo se pode prever o quanto será necessário de
carbono, fósforo, nitrogênio, etc para o dimensionamento de um meio de cultura, para que se produza
o que se quer.

Quando é uma fermentação não só para produção de células, mas também para a produção de produto, pelo
menos se tem uma noção, ao olhar as informações que se tem na literatura, do quanto será formado de células
e então se consegue manter o meio bom para a formação de células e também para o metabolismo na
produção de energia.

Para a célula se manter viva ela precisa de energia para a sua manutenção celular, além da energia para o seu
crescimento.

O ​controle de substrato​ é importante para que se tenha um valor ideal de produto.

O ​controle de pH​ é importante pois ​determina as vias metabólicas​:
➔ Inicialmente ocorre uma diminuição de pH pois ocorre a formação de ácidos mas depois de um tempo a
situação da célula passa a ficar crítica em relação ao pH. Assim, se nota que a célula vai reduzir o
ácido, transformando-o em um álcool (redução do ácido).
◆ ácido butírico é transformado em butanol
◆ ácido acético é transformado em etanol

➔ O pH é importante então para saber o que está ocorrendo na célula e a reação que está ocorrendo.
Além disso, se deve controlar para que o pH fique dentro da faixa de normalidade (ex: spirulina com
meio pH 11 é um pH muito elevado para ela e deve ser colocado gás carbônico).

Se o pH aumentar muito ou baixar muito a célula pode parar de crescer e isso vai ser ruim.

Métodos de medição 
➢ se pode medir diretamente o oxigênio e o pH → se tem eletrodos que se plugam no reator e eles dão
um valor praticamente automaticamente.

Sistema offline​: se retira uma amostra e se faz a medida fora do reator.

Sistema online​: continuamente se retira uma fração de líquidos → FIA → é um sistema de bombas peristálticas
que misturam as substâncias e dá um valor direto.

Há ​métodos não invasivos e não destrutivos (não destroem a amostra) como fluorescência, infravermelho
próximo, etc.

Gráfico PHB vs concentração de frutose 

➢ PHB está subindo
➢ Se fez a medida online e a offiline

● Na análise tanto online quanto offline se analisa a frutose

○ online: sistema FIA
○ offline: referência
 ● Tanto um quanto o outro tem o mesmo perfil. → Com isso é mostrado que não é necessário retirar uma
amostra para analisar, o próprio sistema retira a amostra de forma online o tempo todo já é suficiente
para monitorar a concentração de frutose, sem que seja necessário um operador.

Ex: medida de antibiótico por cromatografia líquida e infravermelho próximo. 

➢ No meio de cultura se tem células, metabólitos, fontes de nitrogênio, minerais, metabólitos, etc.

➢ Para fazer o procedimento da ​micro cromatografia​: se retira a suspensão celular e se faz uma filtração
em uma membrana 0,22, por exemplo, e se remove as células. Depois, se faz uma diluição e se injeta
no cromatógrafo, que vai separar componente por componente de tal forma que quando chegar no
detector, se chega apenas o antibiótico e, como se fez uma calibração do cromatógrafo, se consegue
ver a concentração.

➢ Infravermelho próximo NIC​: se emite um feixe de luz (um espectro de absorção) → se consegue
analisar todos os componentes e um dos espectros é o do antibiótico.
○ Há uma linearidade entre o método de HPLC (método clássico) e o infravermelho próximo, que é
muito mais rápido, mais barato e não gera resíduos.
○ Porém esse processo não é muito preciso como o HPLC. Para fazer um laudo ainda pode ser
que seja necessário usar a cromatografia.
○ Mas, para um acompanhamento rápido do processo, é muito útil.