UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS

FERMENTAÇÃO NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

Prática 2

Aplicação de Renina microbiana

Alunas:
Larissa Foltran (9784099)
Marina Cassab (9784078)

São Carlos, setembro de 2019

INTRODUÇÃO

A origem do queijo foi atribuída a um comerciante árabe, que

transportava leite em estômagos de bezerros. Em uma de suas viagens, notou
que o leite havia se tornado uma massa sólida, gelatinosa, com um líquido
amarelado à parte.¹ Assim como a criação de tantos outros produtos
alimentícios vindos de processos de fermentação, como o vinho e a cerveja, o
queijo foi um acidente que passou por transformações e aprimoramento
durante séculos, o que resultou em processos cada vez mais rebuscados e em
produtos cada vez mais apreciados mundo à fora.

Tempos depois, foram descobertas duas vias para a obtenção do queijo,

resultado de coagulação das proteínas do leite: ácida e enzimática.
Atualmente, a técnica mais usada é o uso da enzima quimosina²,
primeiramente isolada do estômago de bezerros, quando se alimentam
primordialmente de leite. Contudo, a protease pode ser obtida de várias formas,
sendo a mais aplicada a via microbiana, onde genes responsáveis pela
expressão da proteína renina são introduzidos no material genético do
microrganismo, fazendo com que a enzima seja um produto metabólico do
cultivo dos mesmos.3,4,5

A coagulação enzimática é um processo irreversível que envolve a

hidrólise específica da ligação entre o aminoácido fenilalanina na posição 105 e
a metionina na posição 106 de proteínas κ-caseína, responsáveis pela
formação das micelas de caseínas que estão em equilíbrio na dispersão
coloidal que forma o leite. A quebra das proteínas que revestem as micelas
culmina na liberação de estruturas mais polares que se ligam aos íons de
cálcio presentes em solução, formando uma rede de proteínas, cálcio e fosfato,
que aprisiona o soro em seu interior, o que confere aparência e consistência de
gel. Com o tempo e manipulação dessa massa gelatinosa, há liberação do soro
e formação do queijo, que poderá receber diferentes tratamentos ou ser
comercializado como frescal.6

A via ácida consiste na diminuição do pH do leite, até atingir o ponto

isoelétrico das proteínas, que é próximo de 4,6, fazendo com que a
neutralidade (externa) de cargas resulte na aproximação das estruturas e
precipitem na forma de complexos caseína-cálcio. Por não alterar as estruturas
das enzimas, é uma técnica reversível, saindo da região do pI da proteína.
Esse processo é mais usado para a produção de queijo tipo ricota, no
reaproveitamento do soro do leite.6

OBJETIVOS

Analisar a atividade proteolítica das enzimas vegetais, no caso a

papaína, com relação ao coalho, composto basicamente pela enzima renina de
origem microbiana. Explorar o uso da renina para produção de queijo, e o
reuso do soro de leite para fabricação de ricota por meio de acidificação com
ácido láctico.

PROCEDIMENTOS EXPERIMENTAIS

1) Preparo de Queijo Frescal: Coagulação da caseína do leite

Foi aquecido o leite até atingir a temperatura de 33-34º, tendo sido

adicionado 1 ml de solução de CaCl2 diluído em água para reposição de íons
cálcio, perdidos durante a pasteurização do leite UHT. Após o procedimento, foi
misturado coagulante diluído em água, conforme as instruções no rótulo da
embalagem do produto, até plena homogeneização no leite. O sistema foi
deixado em repouso absoluto por cerca de 60 minutos, mantendo o recipiente
tampado e em temperatura constante. Decorrido esse tempo, foi realizado o
corte da massa horizontal e verticalmente, com o auxílio de uma faca, para
reitrar o soro ainda em banho térmico. Com auxílio de uma colher, agitou-se
lentamente durante 10 minutos, cuidando para não quebrar demais a massa e
realizar efetiva separação do soro. Retirou-se a massa com uma peneira e
colocou na forma. Passados 10-15 minutos, virou-se o queijo e salgou-se a
face plana superior. O queijo foi conservado em geladeira de um dia para o
outro para posterior análise sensorial. O soro resultante da produção de queijo
frescal (soro doce) foi reaproveitado na etapa 3, para produção de ricota.

2) Análise de atividade enzimática: aplicação de enzima microbiana

Foi feita a reconstituição do leite em pó conforme instruções do fabricante,

sendo separado 8 mL de leite em pó desnatado em 3 tubos de ensaio
numerados, adicionando 1 mL de solução 0,5% de CaCl2. Os tubos foram
levados a aquecimento em banho-maria a 35°C por 10 minutos para equilibrar
a temperatura. Em seguida, adicionou-se 1 mL de solução das diferentes
proteases nos tubos, tendo sido adicionado 1 mL de água destilada no tubo de
controle. Agitou-se bem e foram levados a aquecimento novamente a 35°C.
Observou-se as transformações do leite após 10, 30 minutos e após 1 hora de
incubação, sendo testado sensorialmente as amostras após 1 hora, não
podendo ser engolidas.
3) Preparo da Ricota: Precipitação ácida de proteínas do soro,
lactoalbuminas e lactoglobulinas.

Aqueceu-se o soro do queijo Frescal até atingir a temperatura de 70ºC e,

em seguida, adicionou-se 100 mL de leite ao soro, levando para
aquecimento novamente até atingir 80ºC. Foi colocado ácido lático (solução
diluída 1:1, conforme o fabricanete) até atingir pH < 4,5. O sistema foi
levado à fervura e, após alguns minutos, flocos brancos de proteínas foram
observados no soro. O precipitado foi coletado por filtração, e a massa foi
refrigerada até teste sensorial no dia seguinte.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

 Ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre a caseína do leite

Nessa etapa visualizou-se a ação de diferentes enzimas proteolíticas sobre

as caseínas do leite. As caseínas são as frações majoritárias de proteínas do
leite (80%) e são divididas em α, β, γ e κ, diferenciando entre si pela quantidade
de fosfoserinas.7

Para o estudo realizou-se o procedimento descrito no tópico acima e os

resultados são ilustrados na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1 - Resultados para diferentes enzimas proteolíticas.

60 min.
10 min. 30 min. 60 min. Sabor de
Tubo Tratamento
Coagulado? Coagulado? Coagulado? leite ou
amargo
1 Controle Não Não Não Leite
 Coalho
2 comercial Não Não Sim Leite
(1:50)
Solução de
3 Precipitado Precipitado Precipitado Amargo
Papaína

Nas Figuras 1, 2 e 3 pode-se visualizar o representado acima.

Figura 1 – Frasco controle em 10, 30 e 60 min.

Figura 2 – Frasco coalho comercial em 10, 30 e 60 min.

 Figura 3 – Frasco papaína em 10, 30 e 60 min.

Como esperado, o frasco do controle não apresentou mudança alguma.

No entanto, o frasco do coalho comercial apresentou um coágulo. Esse
coágulo é oriundo da ação da renina, que cliva especificamente as ligações
Phe105-Met106 da κ-caseína.7

A κ-caseína é uma glicoproteína responsável por manter a integridade

das micelas de caseína e evitar a coagulação. Isso ocorre pois ela apresenta
menos sítios de interação com o cálcio, uma vez que possui um número menor
de fosfoserinas. Sendo assim, ela reveste a superfície, protegendo da
coagulação. Quando a renina cliva a ligação Phe 105-Met106 da κ-caseína, ela
libera a parte hidrofílica para a solução e a superfície da micela torna-se
revestida de para-κ-caseína, que é incapaz de estabilizar e provoca a
exposição das outras frações de caseína (α, β, γ). Essas por sua vez,
apresentam um maior número de fosfoserinas e interagem com o cálcio,
formando um coágulo, conforme visualizado na prática. Ademais, esse frasco
manteve o sabor de leite, uma vez que houve a clivagem de uma ligação
específica.7

Com relação ao frasco 3, a adição da papaína gerou um precipitado, ou

seja, uma massa sólida no fundo do tubo de ensaio. A papaína é uma protease
vegetal que não apresenta especificidade. Dessa forma promoveu uma
hidrólise excessiva, impedindo a formação desse gel. Ademais, essa hidrólise
libera aminoácidos livres que contribuem para o sabor desagradável do produto
obtido, conforme detectado sensorialmente.8

Nessa etapa, é importante ressaltar que houve um problema com a solução

de CaCl2 adicionada. Ela deve ser adicionada para garantir que haverá cálcio
suficiente para formar o gel com as caseínas. No entanto, a solução estava
velha e a quantidade de cálcio baixa. Dessa forma, o coágulo formado por ação
da renina foi pequeno. No entanto, como a papaína não precisa de Ca 2+ para
sua ação, agiu independentemente e o precipitado foi obtido com sucesso.

 Preparo do queijo frescal: coagulação da caseína do leite

O mesmo princípio visualizado no tubo 2 foi utilizado nessa etapa, dessa

vez em um nível maior. Inicialmente, realizou-se o experimento com uma
solução de CaCl2 velha e não houve a coagulação do leite. Ao refazer usando
uma nova, o experimento deu certo. Isso ocorreu pois na velha provavelmente
havia pouco Ca2+, que é fundamental para a formação do coágulo, uma vez
que ele forma uma rede de interação com as caseínas que é capaz de
aprisionar água e açucares dentro, o chamado gel de caseína. O coágulo
obtido no experimento refeito é ilustrado na Figura 4.

Figura 4 – Coágulo.
 Após a formação desse gel, realizou-se o processo dessoração. Nessa
etapa, cortou-se o gel para liberar a água aprisionada dentro. O resultado
obtido é ilustrado na Figura 5.

Figura 5 – Produto dessorado.

Posteriormente, filtrou-se o produto e salgou-o. O queijo frescal obtido é

ilustrado na Figura 6 abaixo.

Figura 6 – Queijo frescal.

 Por fim, através da análise sensorial verificou-se que o queijo frescal obtido
apresentava um sabor parecido com o comercial, no entanto a textura ficou
mole.

 Preparo da ricota: precipitação ácida de proteínas do soro,

lactoalbuminas e lactoglobulinas

O filtrado obtido da produção do queijo frescal é denominado de soro doce.

Ele é rico em proteínas hidrossolúveis (lactoalbuminas e lactoglobulinas) e em
lactose e pode ser utilizado para a fabricação da ricota, conforme realizado na
prática.7,8

A preparação seguiu o procedimento descrito no tópico experimental e o

mecanismo foi baseado na precipitação ácida. Inicialmente, elevou-se a
temperatura a 70ºC para provocar a desnaturação das proteínas e em seguida,
adicionou-se o ácido. Essa adição de prótons neutraliza as cargas negativas
das proteínas até alcançar o ponto isoelétrico. Esse ponto consiste no valor de
pH o qual a proteína apresenta carga líquida igual a zero. Dessa forma, com a
neutralização, as proteínas passam a interagir, formando o precipitado,
conforme visualizado na prática. O resultado obtido é ilustrado na Figura 7.7,8

Figura 7 – Proteínas precipitadas.

 Essa massa protéica precipitada foi mais uma vez moldada em uma forma e
depois retirada, tendo ao fim a ricota, como mostrada na Figura 8.

Figura 8 – Ricota.

Sensorialmente a ricota ficou agradável ao paladar, com um sabor típico e

textura macia.

O filtrado obtido dessa etapa é denominado de soro ácido. Ele ainda é rico
em lactose e pode ser utilizado para a fabricação de ração, meio de cultura e
xaropes. A ausência de turvação demonstra a eficácia na remoção das
proteínas. O resultado está na Figura 9.

Figura 9 – Filtrado ácido.

CONCLUSÃO

Nessa prática realizou-se o estudo das proteases agindo sobre o leite.

Por meio dos resultados obtidos foi possível verificar e diferenciar a atuação da
papaína e do coalho comercial sob o leite em diferentes aspectos, como a
textura e o sabor. Em seguida, utilizando o coalho comercial realizou-se o
queijo frescal, por meio do mecanismo de ação da renina. Por fim, com o soro
resultante produziu-se a ricota por meio da precipitação ácida.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] RIBEIRO, E. P. Queijos. p. 225-253 In: SCHMIDELL, W. et al.

Biotecnologia Industrial, São Paulo: Edgar Blucher, 2001. v. 4, p. 225-253.

[2] SPREER, E. Lactologia industrial; leche, preparacion y elaboracion,

maquinas, Instalaciones y aparatos, produtos lacteos. Zaragoza: Acribia,
1975.

[3] ESCOBAR, J.; BARNETT, S. Syntesis of Acid Protease from Mucor miehei :
Integration of Production and Recovery. Process Bioch., Oxford, v. 30. n.8, p.
695-700, 1995.

[4] SILVEIRA, G. G.; CONTIERO, J. Production of microbial rennin from Mucor

miehei in Batch Fermentation. European Journal of Pharmaceutical
Sciences, Stockholm, v.13, suppl. 1, p. S38, 2001.

[5] SEKER, S.; BEYENAL, H.; TANIOLAÇ, A. Modeling Milk Cotting Activity in
the Continuous Producion of Microbial Rennet from Mucor miehei. Journal of
Food Science. Chicago, v.64, n. 3, p. 525-529, 1999.

[6] SILVEIRA, Guilherme Garcia da. Resíduos agroindustriais como potenciais

substratos para a produção de renina microbiana por Mucor miehei utilizando
fermentação em estado sólido. 2007.

[7] Fennema O. R. ; Damodaran, S. ; Parkin, K. L. Química de Alimentos

de Fennema – 4ª ed. - Editora Artmed, 2010.
[8] Koblitz, M.G. Bioquímica de Alimentos, Teoria e Aplicações Práticas. Ed.
Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, RJ. 242p. 2008. 663/664?54 K75b. 09
exemplares na BSCCA.