UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

INSTITUTO DE QUÍMICA DE SÃO CARLOS

FERMENTAÇÃO NA INDÚSTRIA DE ALIMENTOS

Produção de invertase de Aspegillus niger por fermentação semi-sólida e

determinação da atividade de invertase em extrato enzimático bruto.

Alunas:
Larissa Foltran (9784099)
Marina Cassab (9784078)

São Carlos, outubro de 2019

INTRODUÇÃO

Os fungos são importantes produtores de enzimas e na prática em

questão estudou-se a produção da invertase pelo Aspergillus Niger. Ele é um
fungo filamentoso presente no solo e suas colônias apresentam a coloração
preta oriunda da formação de esporos assexuais. Esses esporos são
denominados de conidiosporos e são produzidos por mitose em corpos de
frutificação chamados de conidióforos, que estão presentes nas extremidades
das hifas reprodutivas. Na Figura 1 há a ilustração do explicado acima,
ressaltando que os esporos podem ser disseminados por ação do vento ou de
animais.2

Figura 1 - Produção de esporos assexuais em fungos filamentosos.2

Com relação ainda aos fungos temos que são microrganismos eucariotos
não fotossintéticos que podem ser unicelulares ou multicelulares. Os fungos
filamentosos são multicelulares e formam longos filamentos denominados hifas,
que se ramificam e expandem formando uma massa visível denominada de
micélio. Esses microrganismos apresentam uma estrutura denominada de corpo
de frutificação que é responsável pela geração de esporos, conforme ilustrado
na Figura 1. Nas Figura 2 e 3 são ilustradas a imagem da morfologia desses
fungos.1
 Figura 2 - Morfologia de fungos filamentosos.1

Figura 3 - Representação da estrutura do Aspergillus Niger.

Como dito acima, estudou-se a invertase produzida por Aspergillus Niger.
A invertase fungica é extracelular, ou seja, excretada para fora da célula e
apresenta um papel muito importante para a produção de alimentos. Ela catalisa
a hidrólise da sacarose ou a síntese de frutooligossacarídeos. Na prática em
questão focou-se na reação hidrolítica. 3

A sacarose é um dissacarídeo não-redutor formado por uma unidade de

glicose e uma de frutose em uma ligação glicosídica α 1->2. Sob a ação da
enzima há a hidrólise dessa ligação gerando como produto uma quantidade
equimolar de glicose e frutose, sendo que ambos são açúcares redutores. Vale
ressaltar que essa mistura equimolar é denominada de açúcar invertido uma vez
que tem-se a inversão da polarização da luz (direita para esquerda). O interesse
comercial consiste no fato de que os produtos da reação apresentam um maior
poder edulcorante e ponto de congelamento, uma menor cristalização e uma
maior tolerância à pressão osmótica, sendo aplicado em diversas formulações,
como balas e refrigerantes. Na Figura 4 há a ilustração da reação catalisada pela
invertase.3

Figura 4 - Reação catalisada pela invertase.

Como citado acima, a sacarose não é redutora e a glicose e frutose são
açúcares redutores. Isso ocorre pois ambos os monossacarídeos apresentam a
extremidade anomérica livre e disponível para participar de uma reação de
oxidorredução em meio alcalino. Utilizando essa característica pode-se fazer a
determinação pelo método de Somogyi-Nelson, que será explicado adiante.3

Com relação à produção de enzimas a partir de microrganismos, temos

que essa ocorre através da fermentação que é o processo no qual os
microrganismos catalisam a conversão de uma substância (substrato) em um
produto, a enzima. Em escala industrial a fermentação ocorre em reatores, no
entanto em laboratório pode-se realizar, por exemplo, em tubos de ensaio e
erlenmeyers. Há diversas técnicas para a produção de enzimas, como a
fermentação submersa e a semi-sólida, que foi a utilizada nessa prática.1,2

A fermentação semi-sólida é muito utilizada para fungos filamentosos, que

é o caso em questão, e consiste basicamente no cultivo de microrganismos em
suportes sólidos sob baixo teor de umidade. Esses suportes geralmente são
resíduos industriais agrícolas capazes de fornecer carbono e energia ao
microrganismo, como grãos, farinhas, palhas, fibras e cascas, por exemplo, de
arroz. Vale ressaltar que o uso dessa matéria prima barateia o custo de operação
do processo. Ademais, nessa fermentação os níveis de umidade são
semelhantes aos encontrados no ambiente natural dos microrganismos. O
processo pode ocorrer facilmente em bandejas ou frasco e é necessário controlar
somente a umidade e a temperatura. Na Figura 5 há a ilustração desse tipo de
processo em escala industrial.1,2

Figura 5 - Ilustração do processo em escala industrial.2

OBJETIVOS

Os objetivos dessa prática consistem no estudo e aplicação da técnica de

fermentação semi-sólida para produção de uma enzima extracelular, seguida da
extração e análise de sua atividade.

PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

1- Produção de invertase de Aspergillus niger por fermentação semi-sólida.

Primeiramente inoculou-se com alça de níquel-cromo a linhagem de fungo

no meio de farelo de trigo. Agitou-se vigorosamente o frasco e incubou-o por 7
dias a 30 ºC.

2- Extração da Enzima.

Acrescentou-se 50ml de água destilada ao farelo de trigo inoculado com

o microrganismo selecionado e usando um bastão de vidro triturou-se o meio até
a desintegração. Em seguida, deixou-o em extração por 35 minutos, agitando-o
a cada 15 minutos. Por fim, filtrou-se em papel filtro e obteve-se a preparação
enzimática bruta. Diluiu-se a enzima bruta em 1:10 e 1:20 em água.

3- Determinação da atividade de invertase.

Inicialmente pipetou-se 4 mL de solução de sacarose na concentração de

10 mg/mL (em tampão acetato 0,05M pH 5,6) em 3 tubos de ensaio, numerados
(1:10, 1:20 e branco). Incubou-os por 10 minutos em banho-maria à 40ºC.
Então, adicionou-se 1mL do extrato bruto diluído 1:10 e 1:20 sendo que no tubo
branco colocou-se 1 ml de água destilada. Os tubos foram agitados e incubados
por 20 minutos. Após a incubação retirou-os do banho maria e colocou-os em
banho de gelo para paralisar a reação. Em seguida determinou-se a
concentração de açúcar redutor formado pelo método de Somogyi-Nelson.

4- Determinação de Açúcares Redutores por Somogyi-Nelson

Colocou-se 0,5 mL da amostra de cada um dos tubos (diluídos na

proporção de 1:10 e 1:20 e branco) e 1 mL do reagente SNI em tubos de ensaio
previamente identificados. Eles foram agitados e colocados em banho maria em
ebulição por 6 minutos. Após este período os tubos foram colocados em banho
de gelo até atingirem a temperatura ambiente. Então adicionou-se 1 mL do
reagente SNII e agitou-os. Em seguida foram deixados em repouso por 5
minutos. Por fim, adicionou-se 10 mL de água destilada em cada tubo e misturou-
os por inversão. Após isto a absorbância foi medida a 540 nm contra o tubo
“Branco”.

Vale ressaltar que para a realização do tubo branco realizou-se o mesmo

procedimento. No entanto, não se adicionou sacarose.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os esporos do fungo Aspergillus niger foram inoculados num sistema

esterilizado com farelo de trigo umedecido, e armazenado em erlenmeyer
vedado. Foi exposto à temperatura de 30ºC em estufa pelo período de 7 dias, e
optou-se pela fermentação semi-sólida pela praticidade de recuperação do
produto desejado ao final do processo e, também, semelhança com o habitat
natural desse espécime, favorecendo seu crescimento saudável.

A fonte de nutrientes escolhida para o crescimento do fungo foi o farelo

de trigo, que é obtido a partir da moagem da casca externa mais rígida da planta
de trigo, durante o processamento para obtenção de produtos de trigo. Em
organismos mais complexos, consiste em fonte de fibras uma vez que, por não
ser solúvel, passa pelo sistema digestório sem sofrer degradação, passando
apenas por hidratação e consequente aumento de volume, resultando em melhor
do trânsito intestinal. Contudo, para essa finalidade, foi usado como fonte de
carbono e nitrogênio para o adequado crescimento do fungo.4,5

A composição bromatológica média do farelo de trigo está expressa na

Figura 6 a seguir:

Figura 6: Composição bromatológica média do farelo de trigo.6

O farelo concentra minerais e vitaminas, além de carboidratos insolúveis,

por se tratar da casca do trigo. Suas proteínas, por outro lado, apresentam alta
degradabilidade, sendo esta a maior contribuinte para a constituição proteica.
Seu maior conteúdo de carboidratos é de carboidratos estruturais, do tipo lignina,
celulose e hemicelulose, fato que é explicado pela origem do alimento; a casca
dos grãos de trigo têm função de proteção, por isso devem ser rígidas,
característica conferida pela existência de polissacarídeos estruturais como os
mencionados.6

O fungo A. niger tem capacidade de degradar vários compostos para

obtenção de fonte de carbono, sendo que os carboidratos insolúveis estruturais,
além dos lipídeos presentes no farelo de trigo, representam grande fonte de C
para síntese de moléculas essenciais para a nutrição e multiplicação celular.
Ademais, o conteúdo proteico é significativo, sendo o responsável pelo
fornecimento de nitrogênio para as células, exercendo papel importante para a
produção de aminoácidos, bases nitrogenadas e estruturas complexas, bem
como os minerais, micronutrientes, representam o conteúdo necessário para a
função de cofatores nessas sínteses.7,8

Como tratava-se de um sólido extremamente seco, foi necessário hidratar

o farelo com água na proporção 1:1 para devolução do conteúdo hídrico,
essencial para o crescimento do microrganismo, já que influencia diretamente na
atividade metabólica e na pressão osmótica das células com relação ao
ambiente, favorecendo o melhor aproveitamento dos nutrientes e transporte para
dentro das paredes celulares.

A Figura 7 compara o crescimento do fungo inoculado e encubado por 7

dias nas condições já ditas, com relação ao ambiente de farelo de trigo estéril:
 Figura 7: Sistema de farelo de trigo umedecido sem fungo (à esq.) e após a
fermentação semi-sólida, com fungo encubado por 7 dias (à dir.).

Para melhor entendimento do cultivo do microrganismo e do crescimento

celular, foi analisada a cultura por meio de microscopia. Para isso, retirou-se uma
pequena amostra de um dos cultivos feitos e colocou-se sobre a lâmina, obtendo
a seguinte foto, apresentada como Figura 8:

Figura 8: Foto de microscopia do fungo cultivado.

 Na Figura 8, microscópica, é possível observar as estruturas íntegras, que
compõe a unidade celular do fungo A. niger. A partir dela, foi possível identificar
as estruturas que formam o corpo frutífero, sendo observada a formação dos
conidiosporos, que se apresentaram negros, por conta de sua maturação
completa. Isso garante o pleno desenvolvimento do microrganismo, tendo
passado por todas as etapas de crescimento e metabolismo, uma vez que se
encontra em processo de esporulação. Como explicado anteriormente, o fungo
A. niger recebe esse nome devido à coloração negra que desenvolve quando
está produzindo esporos, sua estrutura reprodutiva assexuada, que podem ser
vistas em forma de conídeos.

Após os dias de crescimento, era esperado que o fungo tivesse produzido

moléculas para sua sobrevivência, dentre elas a enzima invertase, responsável
pela hidrólise da sacarose em glicose e frutose, que é um produto extracelular.
Portanto, foi prosseguido o procedimento para recuperação dessa enzima em
especial, sendo avaliada sua atividade posteriormente, para comprovação de
sua síntese e integridade.

Para extração da enzima β-frutofuranosidase, foi feita a homogeneização

do substrato e das células do fungo, perante adição de água no ambiente de
farelo. Isso ajuda na solubilização da enzima, já que é hidrossolúvel e está
dispersa de maneira não uniforme no substrato sólido. A mistura foi então
agitada e filtrada para obtenção do filtrado, que contém vários metabólitos
celulares, contudo apenas interessa a enzima invertase, sendo que a
coexistência de outras moléculas não interfere em sua atividade em questão. 8

A partir do extrato bruto, foram realizadas diluições de 1:10 e 1:20 para

avaliação da atividade enzimática sob o substrato sacarose. Foram aplicados
volumes definidos de ambas as soluções sobre a sacarose, tendo sido reservado
um tubo para a sacarose sem a enzima como controle da reação de hidrólise.
Os tubos foram então levados a banho-maria em temperatura de 40ºC,
temperatura ótima para a ação enzimática, bem como a solução com o substrato
apresentava pH aproximadamente 5,6, faixa ótima para a enzima também.
Então, as condições foram ajustadas para máxima atividade da enzima,
favorecendo a conversão de sacarose em glicose e frutose para avaliação plena
da atividade.9

Após o período de incubação para reação catalisada pela enzima, os

tubos foram levados para análise de açúcares redutores pelo método de
Somogyi-Nelson, tendo sido feito um tubo a mais como controle dessa etapa,
sem adição de solução de sacarose.

O método baseia-se na determinação de açúcares redutores, que são

aqueles que apresentam a extremidade anomérica livre e disponível para
participar de uma reação de oxidorredução em meio alcalino. No caso, o grupo
aldeído do açúcar redutor reduz o íon cúprico do reativo de Somogyi (reagente
I) a óxido cuproso. Em seguida, o óxido cuproso reage com o ânion arseno-
molibdato (reagente II) produzindo um composto de coloração azul. Essa
coloração azul apresenta o máximo de absorbância em 540 nm. Sendo assim,
utiliza-se esse comprimento de onda para realizar o estudo da amostra uma vez
que a intensidade de absorção é proporcional a concentração de açúcares
redutores. A reação em questão é ilustrada na Figura 9.2

Figura 9 - Determinação de açúcares redutores por Somogyi-Nelson.

A sacarose, por si só, não é um açúcar redutor, por conta dos tipos de
ligações formadas entre as subunidades, porém os açúcares gerados pela
hidrólise são redutores e serão esses os medidos para avaliação da atividade da
enzima.

Era esperado que os tubos de controle para o método Somogyi-Nelson,

sem sacarose, e o branco da etapa anterior, sem a enzima e com sacarose, não
apresentassem cor característica da reação de redução dos íons de molibdênio,
o que foi comprovado experimentalmente. Os tubos que continham o preparado
bruto enzimático nas duas concentrações, houve mudança de coloração para
azul intenso, evidenciando a transformação.

Foram analisados os conteúdos de açúcares por absorbância, sendo que

os resultados obtidos pela espectrometria estão listados na Tabela 1 a seguir:

Tabela 1- Dados de espectro UV-vis para método Somogyi-Nelson

Amostra Abs
1:10 1,389
1:20 1,051
Controle (sem enzima) -0,13

A correlação entre a absorção (A) e a concentração (c) é dada pela lei de

Beer-Lambert, apresentada a seguir, na qual ε representa a absortividade molar
da substância e l, o caminho percorrido pela radiação no meio que contém o
composto, que corresponde à largura da cubeta utilizada:

𝐴 = 𝜀 . 𝑐. 𝑙

Para a determinação das concentrações dos açúcares redutores nas

amostras, foi utilizada a curva de calibração feita pelo técnico de laboratório,
representada no Gráfico 1 a seguir, bem como sua equação de reta:

Curva de calibração - Somogyi-Nelson

1.4

1.2 y = 2.1469x + 0.114

R² = 0.9365
1

0.8
Abs

0.6 Abs

0.4 Linear (Abs)

0.2

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
Concentração (mg/mL)
 Gráfico 1: curva de calibração do método Somogyi-Nelson.

Aplicando a relação da equação da reta, para cálculo os conteúdos de

açúcares redutores tanto na amostra que recebeu tratamento com a solução 1:10
(C) quanto para 1:20 (C’), e determinação das velocidades de catálise, levando
em consideração os fatores de diluição do preparo a partir do extrato bruto e da
diluição feita para o método de Somogyi. Seguem os cálculos:

1,389 = 2,1469𝐶 + 0,114

𝐴𝑅𝑇
𝐶 = 0,594 𝑚𝑔
𝑚𝑙
𝐴𝑅𝑇 𝑚𝑔
0,594 𝑚𝑔 . 10 . 5 = 59,4
𝑚𝑙 𝑚𝑙
180𝑔
59400 μg ∶ = 330 μmol ∶ 20 min = 16,5 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝐴𝑅𝑇 /min
𝑚𝑜𝑙

1,051 = 2,1469𝐶 ′ + 0,114

𝐴𝑅𝑇
𝐶 ′ = 0,436𝑚𝑔
𝑚𝑙
ART mg
0,436mg . 20.5 = 43,6
ml ml
g
43600 μg ∶ 180 = 242,2 μmol ∶ 20 min = 12,1 𝜇𝑚𝑜𝑙 𝐴𝑅𝑇/𝑚𝑖𝑛
mol

A partir dos valores de velocidades obtidos, foi realizada a determinação

da atividade da enzima, que consiste na quantidade de enzima que produz 1
mmol do produto, ou seja, o fator que expressa sua eficiência. Seguem os
cálculos:

16,5 𝜇𝑚𝑜𝑙 − 1𝑚𝑙

1 𝑚𝑚𝑜𝑙 − 𝑥
𝑥 = 0,06
12,1𝜇𝑚𝑜𝑙 − 1𝑚𝑙
1 𝑚𝑚𝑜𝑙 − 𝑥
𝑥 = 0,08
As atividades calculadas demonstram a capacidade catalítica da enzima,
sendo os valores um pouco diferentes por problemas de diluição ou durante a
execução do teste de Somogyi-Nelson, para a quantificação dos açúcares
redutores. Contudo, os conteúdos de açúcares que reduziram os íons de
molibdênio foram parecidos, indicando eficiência similar.

Portanto, pode-se concluir que a atividade enzimática foi semelhante, uma

vez que se trata da mesma enzima, sob as mesmas condições, com pequenos
desvios por conta de problemas, principalmente no processo de determinação
de açúcares redutores.

CONCLUSÕES

A fermentação semi-sólida mostrou-se bem eficiente para o crescimento

do fungo A. niger uma vez que mimetiza o ambiente natural onde o
microrganismo se contra, como cascas de árvores e superfícies rugosas, além
de fornecer excelentes fontes de carbono e nitrogênio, o que favoreceu a
nutrição e multiplicação celular. A água adicionada foi responsável por devolver
o conteúdo hídrico, já que se trata de uma fibra seca provinda da casca dos
grãos de trigo. Isso promove um ambiente mais adequado para o fungo,
controlando a pressão osmótica da célula, além de favorecer a solubilização e
transporte dos componentes do trigo para a célula e vice-versa, uma vez que o
produto desejado é extracelular.

A enzima foi realmente obtida pela extração do sistema farelo + fungos,

demonstrando eficiência do processo de fermentação, além de efetiva atividade
enzimática, testada e confirmada pelo método de Somogyi-Nelson para
quantificação do teor de açúcares redutores. Contudo, foram detectados níveis
menores do que o esperado para a hidrólise de sacarose, mas, ainda assim,
demonstrando atividade sobre o substrato em questão. O desvio do esperado
pode ser por problemas entre a concentração da enzima em relação ao
substrato, não tendo sido tão eficiente por conta do elevado nível de substrato
comparado com os sítios catalíticos, por pelo procedimento de determinação por
Somogyi-Nelson, que precisava de condições específicas de temperatura.

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

[1] Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P.V., Clark, D.P. Microbiologia de
Brock. 12ª ed – Porto Alegre: Artmed, 2010.
[2] Nitschke, M. Notas de aula. 2019.

[3] Koblitz, M.G. Bioquímica de Alimentos, Teoria e Aplicações Práticas. Ed.

Guanabara Koogan, Rio de Janeiro, RJ. 242p. 2008. 663/664?54 K75b. 09
exemplares na BSCCA.

[4] Farelo de Trigo e seus benefícios! Linhaça.net. Disponível em:

https://www.linhaca.net.br/farelo-trigo-seus-beneficios/. Acesso em: 11/10/19.

[5] As diferenças entre germe de trigo e fibra de trigo. Jasmine Alimentos.

Disponível em: https://www.jasminealimentos.com/wikinatural/fibra-de-trigo-x-
germe-de-trigo/. Acesso em: 11/10/19.

[6] Fontes alternativas de energia para bovinos leiteiros – parte 6. Milkpoint.

Disponível em: https://www.milkpoint.com.br/artigos/producao/fontes-
alternativas-de-energia-para-bovinos-leiteiros-parte-6-43853n.aspx. Acesso em:
11/10/19.

[7] NOVAKI, Lexandra et al. Produção de invertase por fermentação em estado

sólido a partir de farelo de soja. Engevista, v. 12, n. 2, 2010.

[8] DIAS, Emanuele Cardoso et al. ANÁLISE DA PRODUÇÃO DA ENZIMA

INVERTASE A PARTIR DA FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO
UTILIZANDO SUBSTRATOS NÃO CONVENCIONAIS. Revista Saúde &
Ciência Online, v. 7, n. 2, p. 352-369, 2018.

[9] AFONSO, Sara de Oliveira Mateus. Aspergillus niger: sua utilização na

indústria farmacêutica. 2015. Tese de Doutorado.