Idea de Introduccion

EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS FENÓLICOS
CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE RESIDUOS DE AGUACATE:

EPICARPIO Y SEMILLA (Persea americana)
JOHANNA CATALINA ROSERO ROSERO
UNIVERSIDAD DE NARIÑO
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SAN JUAN DE PASTO
2017
EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS FENÓLICOS
CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE RESIDUOS DE AGUACATE:
EPICARPIO Y SEMILLA (Persea americana)
JOHANNA CATALINA ROSERO ROSERO
Trabajo de grado para optar al título de Químico
Director:
NELSON H. HURTADO G.
Ph.D. en Ciencias Químicas
CODIRECTORA:
SILVIA CRUZ SÁNCHEZ.
Ph.D. en Ciencias Químicas
UNIVERSIDAD DE NARIÑO
FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SAN JUAN DE PASTO
2017
Las ideas y conclusiones aportadas en el siguiente trabajo son responsabilidad exclusiva
del autor.
Artículo 1ro del Acuerdo Nº. 324 de Octubre 11 de 1966 emanado por el Honorable
Consejo Directivo de la Universidad de Nariño.
Nota de aceptación:
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Nelson Humberto Hurtado Gutiérrez
Director
_____________________________
Juan Camilo Vargas Gallego
Jurado
_____________________________
José Hipólito Isaza
Jurado
AGRADECIMIENTOS
A Dios por ser el pilar de mi vida, ser la luz de mis días.
A mi madre por ser mi mayor ejemplo de amor incondicional, esfuerzo, sacrificio y

fortaleza.
Al docente Nelson Hurtado y coasesora Silvia Cruz por su orientación y colaboración

durante el desarrollo del proyecto
A la Red para la Bioprospección De Frutas Tropicales – RIFRUTBIO por la financiación de

este trabajo.
A los jurados evaluadores Juan Camilo Vargas Gallego y José Hipólito Isaza por el tiempo
dedicado a la revisión de este trabajo, su valiosa colaboración y por los conocimientos
entregados.
A los profesores y laboratoristas del programa de Química por toda su ayuda y atención
prestada en especial a los químicos David Arturo y Juan Pablo Jiménez encargados del
laboratorio de Cromatografía.
A mi familia por su cariño y apoyo incondicional y por enseñarme en cada momento a ser
una persona de bien, con principios y valores.
A mis amigos por llenar de mil sonrisas cálidas mis días, por brindarme su cariño sincero
e inextinguible al paso del tiempo. Mil gracias por encontrar siempre en ustedes un apoyo
en los momentos de dificultad y felicidad. Los quiero.
RESUMEN
En Colombia se produce una amplia gama de frutas tropicales, de las cuales existen muy
pocos estudios químicos. La investigación en el campo de los compuestos fenólicos de
origen natural provenientes de frutas, permite establecer el potencial de ellas como
alimento con propiedades biofuncionales y el desarrollo de productos con valor agregado
que puedan ser usados como aditivos en la industria farmacéutica y de alimentos. En el
marco de la RED NACIONAL PARA LA BIOPROSPECCIÓN DE FRUTAS TROPICALES-
RIFRUTBIO, se realizó el análisis cuantitativo de los compuestos fenólicos presentes en
sub-productos (semilla y epicarpio) del fruto de aguacate (Persea Americana Mill).
Inicialmente mediante un diseño experimental se evaluaron dos disolventes de extracción
(acetona/agua 70:30 y metanol/agua 80:20 v/v), el diseño tuvo en cuenta la parte del fruto
y el tipo de disolvente y como factor de respuesta se tomó la actividad antioxidante
(TEAC) y el contenido fenólico total (CFT). El análisis de varianza ANOVA permitió
establecer que los disolventes empleados no influyen significativamente (p<0,05, nivel de
confianza 95%) sobre los valores CFT y TEAC.
Se obtuvieron extractos enriquecidos en compuestos fenólicos por adsorción selectiva

sobre Amberlita XAD-7 a partir de los extractos obtenidos con acetona. Posteriormente los
extractos enriquecidos se fraccionaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño
(CET) utilizando como fase estacionaria Sephadex LH-20. En total se obtuvieron para la
semilla y epicarpio los siguientes extractos: extracto crudo de semilla (ECS) y epicarpio
(ECE), extracto purificado de semilla (EPS) y epicarpio (EPE) y las fracciones separadas
por (CET) para la semilla (F1S, F2S, F3S) y epicarpio (F1E, F2E, F3E). En todos los
extractos se cuantificó el contenido fenólico total (CFT), el contenido de flavonoides
totales (FT) y la actividad antioxidante mediante los métodos TEAC y DPPH. Los
extractos enriquecidos en compuestos fenólicos y sus fracciones se analizaron por
cromatografía líquida acoplada a un detector de arreglo de diodos (LC-DAD) y
cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas en modo tándem con interfase
electrospray (LC/MS-ESI). Estos análisis junto con el análisis de patrones permitieron
elucidar la estructura de la mayoría de los compuestos.
Los análisis realizados en la semilla y el epicarpio del aguacate, confirmaron la presencia

en la semilla de diferentes ácidos fenólicos (protocatéquico, quínico, cafeico,
cafeoilquínico, p-cumárico, cumaroilquínico, ferúlico, sinápico, y cítrico), un aldehído
(vainillina) y diversos compuestos fenólicos (catequina, epicatequina, rutina, quercetina-3-
O-glucósido, quercetina, apigenina, kaempferol, phloridzina, procianidinas diméricas tipo
B1 y B2 y procianidinas triméricas tipo A y B. En el epicarpio se identificaron glicósidos de
flavonoides como quercetina-3-O-glucósido, rutina, quercetina-3-O-arabinosido,
quercetina-3-O-ramnosido entre otros y procianidinas diméricas y triméricas tipo A y B.
En las fracciones más pesadas (F3S y F3E) se identificaron principalmente procianidinas
diméricas y triméricas.
Posteriormente se evaluó el contenido fenólico total (CFT), el contenido de flavonoides

totales (FT) y la actividad antioxidante de los extractos frente a los radicales libres ABTS y
DPPH mediante espectroscopía UV-Vis. El análisis de los datos mediante el
procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD) de Fisher y la prueba de múltiples
rangos permitió establecer que existen diferencias estadísticamente significativas (p<0.05,
nivel de confianza 95%) cuando se comparan los valores del CFT, FT y TEAC de todas
las muestras (extractos purificados y fracciones). Los extractos crudos de semilla y
epicarpio (ECS y ECE) mostraron valores relativamente bajos en el CFT y TEAC con
respecto a los extractos purificados (EPS y EPE), se encontró que estos valores son
mayores para EPE y EPS. El mayor CFT, FT y TEAC lo presentaron las fracciones con
peso molecular intermedio de la semilla y epicarpio (F2E y F2S) y las más pesadas (F3E y
F3S), siendo las fracciones F2E y F2S quienes presentan los mayores valores.
Comparando los valores TEAC de los extractos purificados y sus fracciones (semilla y
epicarpio) con el CFT, se observó una relación estadísticamente significativa (p<0.05)
entre estas características, para la semilla se encontró un r= 0,96945 y para el epicarpio
un r= 0,984621. El comportamiento de los extractos para el caso de la actividad
antioxidante evaluada por el método DPPH fue diferente, no se evidenció una clara
correlación entre los valores DPPH y CFT, sin embargo las fracciones más pesadas (F3S
y F3E) fueron las más antioxidantes (menor FRS50).
Con estos resultados se comprobó que los subproductos de la fruta estudiada son una
fuente promisoria de compuestos bioactivos que podrían ser de importancia en la industria
alimentaria y farmacéutica, siendo más interesantes las fracciones de mayor peso
molecular aisladas por cromatografía de exclusión por tamaño. La RED RIFRUTBIO
continuará con las investigaciones en este campo, para las fracciones más activas (F2S,
F2E, F3S y F3E) se evaluará el potencial efecto sobre la bacteria Helicobacter pylori
asociada con el desarrollo de cáncer gástrico, una enfermedad con alta ocurrencia en el
Departamento de Nariño.
ABSTRACT
Colombia produces a wide range of tropical fruits, of which there are very few chemical
studies. Research in the field of naturally occurring phenolic compounds from fruits allows
them to establish their potential as food with biofunctional properties and the development
of value added products that can be used as additives in the pharmaceutical and food
industry. The qualitative analysis of the phenolic compounds present in sub-products
(seed and epicarp) of the avocado fruit (Persea Americana Mill) was carried out in the
framework of the NATIONAL NETWORK FOR THE BIOPROSPECTION OF TROPICAL
FRUITS-RIFRUTBIO. Initially, two extraction solvents (70% acetone and 80% methanol)
were evaluated using the experimental design. The design took into account the fruit and
solvent type and the antioxidant activity (TEAC) were used as the response factor and the
total phenolic content (CFT). Analysis of variance ANOVA allowed to establish that the
solvents used did not significantly influence (p <0.05, 95% confidence level) on the CFT
and TEAC values.
Extracts enriched in phenolic compounds were obtained by selective absorption on

Amberlite XAD-7 of the methanolic extract from the by-products of the fruit. Subsequently
the enriched extracts were fractionated by size exclusion chromatography (CET) using as
Sephadex LH-20 stationary phase. Finally, the following extracts were obtained for the
seed and epicarp: crude seed extract (ECS) and epicarp (ECE), purified crude extract
enriched in seed phenolic compounds (EPS) and epicarp (EPE) and fractions separated
by (CET) for the seed (F1S, F2S, F3S) and epicarp (F1E, F2E, F3E). In all extracts total
phenolic content (CFT) and antioxidant activity were quantified using the TEAC and DPPH
methods. The extracts enriched in phenolic compounds and their fractions were analyzed
by liquid chromatography coupled to a diode array detector (LC-DAD) and liquid
chromatography coupled to mass spectrometry in Tandem mode with electrospray
interface (LC / MS-ESI). These analyzes, along with the analysis of patterns, allowed to
elucidate the structure of most of the compounds.
The analysis of avocado seed and epicarp confirmed the presence of different phenolic
acids (protocatechic, quinic, caffeic, caffeine, p-coumaric, cumaroilquinic, ferulic, synapic
and citric) in the seed, an aldehyde (vanillin) and various phenolic compounds (catechin,
epicatechin, rutin, quercetin-3-O-glucoside, quercetin, apigenin, kaempferol, phloridzine,
dimeric procyanidins B1 and B2 and trimeric procyanidins type A and B. In the epicarp
flavonoid glycosides such as quercetin -3-O-glucoside, rutin, quercetin-3-O-arabinoside,
quercetin-3-O-rhamnoside among others, and dimeric and trimeric procyanidin of type A
and B. In the heavier fractions (F3S and F3E) were identified mainly dimeric and trimeric
procyanidins.
The total phenolic content (CFT), total flavonoid content (FT) and antioxidant activity of
ABTS and DPPH free radicals by UV-Vis spectroscopy were evaluated. Data analysis
using Fisher's least significant difference (LSD) and multiple-rank test allowed the
establishment of statistically significant differences (p <0.05, 95% confidence level) when
comparing CFT, FT And TEAC of all samples (purified extracts and fractions). Crude seed
and epicarp extracts (ECS and ECE) showed relatively low values in CFT and TEAC with
respect to purified extracts (EPS and EPE), it was found that these values are higher for
EPE and EPS. The highest CFT, FT and TEAC fractions were presented with the
intermediate molecular weight fractions of the seed and epicarp (F2E and F2S) and the
heavier fractions (F3E and F3S), with the F2E and F2S fractions having the highest
values. Comparing the TEAC values of the purified extracts and their fractions (seed and
epicarp) with the CFT, a statistically significant (p <0.05) relationship was observed
between these characteristics, for the seed an r = 0.96945 was found and for the epicarp
r= 0.984621. The behavior of the extracts for the case of the antioxidant activity evaluated
by the DPPH method was different, there was no clear correlation between the DPPH and
CFT values, however the heavier fractions (F3S and F3E) were the most antioxidant
FRS50).
With these results, it was verified that the byproducts of the fruit studied are a promising
source of bioactive compounds that could be of importance in the food and pharmaceutical
industry, with higher molecular weight fractions being isolated by size exclusion
chromatography. The network RIFRUTBIO will continue with research in this field. For the
most active fractions (F2S, F2E, F3S and F3E) the potential effect on H. pylori bacterium
associated with the development of gastric cancer, a disease with a high occurrence in
Nariño department.
CONTENIDO
pág.
INTRODUCCIÓN 23
1. OBJETIVOS 24
1.1 OBJETIVO GENERAL 24
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 24
2. MARCO REFERENCIAL 25
2.1 ANTECEDENTES 25
2.2 MARCO CONTEXTUAL 30
2.2.1 AGUACATE (Persea Americana Mill): Origen, botánica, morfología y 30
estructura
2.2.2 Aguacate en Colombia. 31
2.2.3 Aguacate: composición química 32
2.3 MARCO TEÓRICO 32
2.3.1 Compuestos fenólicos y su presencia en frutos y alimentos 32
2.3.2 Clasificación de compuestos fenólicos 32
2.3.3 Métodos de extracción, separación y purificación de compuestos 38
fenólicos.
2.3.3.1 Separación y purificación. 39
2.3.4 Métodos de caracterización de compuestos fenólicos. 40
2.3.5 Cuantificación del contenido de fenoles totales. 41
2.3.6 Cuantificación del contenido de flavonoides totales 41
2.3.7 Capacidad antioxidante de compuestos fenólicos. 42
2.3.7.1 Métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante in-vitro. 43
2.3.7.1.1 Método ABTS 43
2.3.7.1.2 Método DPPH 45
2.4 ACTIVIDAD BIOLÓGICA 45
3. MATERIALES Y MÉTODOS 47
3.1 RECOLECCIÓN, CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS DEL FRUTO. 47
3.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS. 47
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL. 48
3.4 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO FENÓLICO TOTAL (CFT), 49
ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE AL TROLOX (TEAC).
3.4.1 Determinación del contenido de fenoles totales 49
3.4.2 Método ABTS (ácido 2,2`-azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)): 49

TEAC
3.5 PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS 50

FENÓLICOS
3.5.1 Fraccionamiento de los extractos purificados 50
3.6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL 53

MÉTODO DPPH
3.7 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES. 53
3.8 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC –ANALÍTICA Y 54

HPLC-MS
3.8.1 Análisis de compuestos fenólicos por HPLC-MS 54
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 55
4.1 CLASIFICACIÓN DEL FRUTO. 55
4.2 AISLAMIENTO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS Y DETERMINACIÓN 55

DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (TEAC) Y EL CONTENIDO
FENOLICO TOTAL (CFT)
4.2.1 Determinación de la actividad antioxidante 55
4.2.2 Determinación del contenido fenólico total (CFT) 57
4.3 Estudio de la variación de la actividad antioxidante bajo las diferentes 58

condiciones experimentales.
4.3.1 Estudio de la variación del contenido fenólico total (CFT) bajo las 60
diferentes condiciones experimentales.
4.4 PURIFICACIÓN Y FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS 61
CRUDOS (ECE Y ECS).
4.5 CONTENIDO FENÓLICO TOTAL DE FRACCIONES Y EXTRACTOS 62

PURIFICADOS
4.6 ESTUDIO COMPARATIVO DE LA TEAC DE LOS DIFERENTES 66

EXTRACTOS.
4.7 Actividad antioxidante (Método DPPH) 69
4.8 FLAVONOIDES TOTALES (FT) 73
4.9 IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC-ESI-MS 75

EN SEMILLA Y EPICARPIO
4.9.1 Identificación de compuestos fenólicos por HPLC-ESI-MS en semilla 75
4.9.1.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1S 81
4.9.2 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN EPICARPIO 101
4.9.2.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1E 105
4.9.2.2 Identificación de los compuestos fenólicos en F2E. 111
4.9.2.3 Identificación de los compuestos fenólicos en F3E 1222
CONCLUSIONES 1255
RECOMENDACIONES 127
PRODUCTOS DE LA INVESTIGACIÓN 128
BIBLIOGRAFIA 1299
ANEXOS. 141
LISTA DE TABLAS
pág.
Tabla 1. Metabolitos secundarios fenólicos encontrados en extractos 27

metanólicos obtenidos de tres diferentes variedades de aguacate.
Tabla 2. Estructuras de principales flavonoides presentes en alimentos. 36
Tabla 3. Datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado para la 56
determinación de la actividad antioxidante (TEAC).
Tabla 4. Contenido de fenoles totales (CFT) y capacidad antioxidante (TEAC) en
extractos crudos de semilla y epicarpio (Persea americana). 57
Tabla 5. Datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado para la 57
determinación del CFT.
Tabla 6. Análisis de Varianza para valores TEAC. 58
Tabla 7. Medias por Mínimos Cuadrados para TEAC con intervalos de confianza 59
del 95,0%
Tabla 8. Discriminación entre medias mediante LSD 59
Tabla 9. Pruebas de Múltiple Rangos para los valores TEAC en cada condición. 59
Tabla 10. Análisis de varianza para actividad antioxidante-Suma de cuadrados 60
tipo III.
Tabla 11. Prueba de Múltiples Rangos para concentración de fenoles totales por 61
condición.
Tabla 12. Contenido de fenoles totales, flavonoides totales, TEAC y DPPH para 62
extractos de semilla, epicarpio y sus fracciones aisladas de aguacate
(Persea americana).
Tabla 13. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de CFT. 63
Tabla 14. Pruebas de múltiples rangos para los valores CFT por Fracciones y 63
extractos purificados.
Tabla 15. Comparación del contenido de fenoles totales semilla y epicarpio 64
Persea americana con el de diferentes cultivos.
Tabla 16. Comparación del contenido de fenoles totales para semilla y epicarpio 65
Persea americana con el de variedades Hass y Fuerte.
Tabla 17. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores TEAC. 66
Tabla 18. Análisis de varianza de valores TEAC y CFT en fracciones y extractos 67
purificados de semilla y epicarpio de aguacate.
Tabla 19. Correlaciones para las diferentes características medidas en extractos 68
de semilla y epicarpio.
Tabla 20. Comparación de la actividad antioxidante (TEAC) en semilla y epicarpio 68
de aguacate con las variedades Hass y Shepard.
Tabla 21. Actividad antioxidante (TEAC) en semilla y epicarpio aguacate 69
variedades Hass y Fuerte.
Tabla 22. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de FRS50. 73
Tabla 23. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de FT. 74
Tabla 24. Compuestos fenólicos identificados por HPLC-MS en EPS y las 78
fracciones F1S, F2S y F3S.
Tabla 25. Compuestos fenólicos identificados por HPLC-MS en EPE y las 104
fracciones aisladas F1E, F2E y F3E.
LISTA DE FIGURAS
pág.
Figura 1. Estructura para los compuestos resveratrol (estilbeno) y 33
secoisolariciresinol (lignano).
Figura 2. Estructura representativa para los ácidos fenólicos. 34
Figura 3. Estructura de benzo-γ–pirona 35
Figura 4. Estructura básica de los flavonoides 35
Figura 5. Estructura representativa para una proantociandina con enlaces tipo 38
A y tipo B.
Figura 6. Reacción de quelación del ión Al3+ con flavonoides. 42
Figura 7. Estructura del catión radical ABTS•+ antes y después de la reacción 44
con el antioxidante.
Figura 8. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el 45
antioxidante.
Figura 9. Árbol de aguacate y muestras recolectadas. 47
Figura 10. Proceso para la obtención de los extractos crudos de semilla y 48
epicarpio.
Figura 11. Purificación de extractos crudos de semilla y epicarpio de aguacate 50
sobre columna con Amberlita XAD-7.
Figura 12. Fraccionamiento extracto purificado de semilla. 51
Figura 13. Fraccionamiento extracto purificado de epicarpio. 52
Figura 14. Fracciones de semilla y epicarpio de aguacate obtenidas a partir del 52
fraccionamiento mediante la resina de Sephadex LH-20.
Figura 15. Recta de calibrado para determinar la capacidad antioxidante 56
equivalente al trolox(TEAC).
Figura 16. Recta de calibrado para determinar el CFT. 58
Figura 17. Correlación entre TEAC y CFT para la semilla. 67
Figura 18. Curva de calibración para determinación de la actividad antioxidante 70
por el método DPPH.
Figura 19. Comportamiento del radical DPPH frente a diferentes concentraciones 70
de ácido gálico.
Figura 20. Comportamiento del radical DPPH a diferentes concentraciones de 71
ácido gálico.
extracto purificado de semilla (EPS).
extracto purificado de epicarpio.
Figura 23. Curva de calibración para determinación del contenido de flavonoides 74
totales
Figura 24. Cromatograma (HPLC-ESI-MS) del extracto purificado de semilla 76
(EPS) y fracciones F1S, F2S y F3S aisladas de semilla.
Figura 25. Algunas estructuras químicas identificadas en la semilla. 80
Figura 26. Espectros UV-Vis a 280 nm de los compuestos 20 y 7. 82
Figura 27. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 20 y 7. 82
Figura 28. Espectro MS/MS del compuesto 20. 83
Figura 29. Estructuras químicas de los compuestos 7 y 20. 83
Figura 30. Espectro UV–Vis de los compuestos 21 y 22. 84
Figura 31. Espectros de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 21 y 22. 84
Figura 33. Estructuras químicas de los compuestos 21 y 22. 85
Figura 34. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 23 86
Figura 35. Espectro MS/MS para el compuesto 23. 86
Figura 36. Estructura química del compuesto 23. 87
Figura 37. Espectro UV-Vis del compuesto 25 87
Figura 38. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 25. 88
Figura 40. Estructura química del compuesto 25 88
Figura 42. Espectro MS/MS para los compuestos 3 y 5. 90
Figura 43. a. Estructura química para procianidinas diméricas tipo B y b. 91
Posible mecanismo para la reacción tipo retro Diels-Alder
Figura 44. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para los compuestos 4 y 8. 93
Figura 45. Estructura química de los compuestos 4 y 8. 94
Figura 49. Estructura para procianidina dimérica tipo A. 96
Figura 50. Espectros de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 3, 5 y 34 97
Figura 52. Estructura para procianidinas triméricas (PC) tipo B (a) y 100
procianidinas triméricas (PC) tipo A(b)
Figura 54. Cromatograma (HPLC-ESI-MS) del extracto purificado de epicarpio 102
(EPE) y fracciones F1E, F2E y F3E.
Figura 55. Espectros de masas HPLCS-ESI-MS del compuesto 22. 106
Figura 56. Espectro UV-Vis del compuesto 25. 107
Figura 58. Espectro UV-Vis del compuesto 28 medida a 280nm. 108
Figura 61. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 31 y 32. 11010
Figura 62. Estructura química general para los compuestos 31 y 32. 110
Figura 63. Espectros MS/ MS para los picos 4 y 7. 111
Figura 70. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para el compuesto 16. 116
Figura 73. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 35 117
Figura 76. Espectro MS/MS para el compuesto 17 119
Figura 78. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para el compuesto 36. 121
Figura 81. Espectros MS-MS de los compuestos 4 y 7. 122
LISTA DE ANEXOS
pág.
Anexo A. Datos para la construcción de curvas de calibración. 141
Anexo B. Prueba de múltiples rangos para las metodologías 142

TEAC, DPPH y FT.
Anexo C. Gráficas de comparación de medias de extractos purificados 144

y fracciones de epicarpio y semilla obtenidos en las
metodologías de CFT, TEAC, DPPH y FT.
Anexo D. Análisis de varianza y gráficas de correlaciones 145
Anexo E. Concentraciones y % DPPH remanente para extractos 149

purificados y fracciones de semilla y epicarpio.
Anexo F. Gráficas para calcular FRS50 para ácido gálico extractos 150
purificados de semilla y epicarpio de aguacate y sus
respectivas fracciones.
Anexo G. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 152

presentes en F2E.
Anexo H. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para los compuestos 152

5 y 9 presentes en F2E.
Anexo I. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 153

presentes en F3E.
ABREVIATURAS
ABTS Ácido 2,2` -azinobis- (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)

CET Cromatografía de exclusión por tamaño
CFT Contenido fenólico total
DPPH 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo
ECS Extracto crudo de semilla
ECE Extracto crudo de epicarpio
FRS50 Concentración de antioxidante necesario para disminuir la
concentración de DPPH en un 50%
EAG Equivalente de ácido gálico
EPE Extracto purificado de epicarpio
EPS Extracto purificado de semilla
ESI Ionización electrospray
FT Contenido de flavonoides totales
HPLC Cromatografía líquida de alta eficiencia
HPLC- MS Cromatografía líquida de alta eficiencia acoplada a espectrometría de
masas
MS/MS Espectrometría de masas modo tandém
PAD Detector de arreglo de fotodiodos
RIFRUTBIO Red para la Bioprospección de Frutas Tropicales
TEAC Actividad antioxidante equivalente al trolox
tR Tiempo de retención
UV-Vis Ultravioleta visible
λmáx Longitud de onda de máxima absorción
GLOSARIO
AGLÍCONA: compuesto orgánico combinado con la porción azúcar de un glucósido y que

se obtiene por hidrólisis.
ANTIOXIDANTE: moléculas presentes de forma natural en muchos alimentos que tienen

la función de captar radicales libres responsables, entre otras cosas, del envejecimiento
de las células.
BIOACTIVO: sustancias que tienen un efecto en el tejido vivo o causa una reacción en él.
BIOPROSPECCIÓN: búsqueda sistemática, clasificación e investigación de nuevas

fuentes de compuestos químicos, genes, proteínas, microorganismos y otros productos,
que forman parte de la biodiversidad.
CROMATOGRAFÍA LÌQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC): técnica utilizada para

separar los componentes de una mezcla basándose en diferentes tipos de interacciones
químicas entre las sustancias analizadas y una columna cromatográfica.
DISEÑO EXPERIMENTAL: técnica estadística que permite identificar y cuantificar las

causas de un efecto dentro de un estudio experimental, en el cual se manipulan
deliberadamente una o más variables, vinculadas a las causas, para medir el efecto que
tienen en otra variable de interés.
EPICARPIO: capa externa de las tres que forman el pericarpio de los frutos formando la
ESPECTROMETRÍA DE MASAS TÁNDEM : técnica de espectrometría de masas que

utiliza dos (MS/MS) o más analizadores de masas.
FACTOR: variable independiente dentro de un diseño experimental.
FITOQUÍMICOS: componentes químicos naturales, biológicamente activos, que se

encuentran en los alimentos.
IN VITRO: proceso que se realiza fuera del organismo.
MACERACIÓN QUÍMICA: proceso en el que se mantiene en contacto una muestra

vegetal con un disolvente determinado por un periodo de tiempo prolongado.
RADICAL LIBRE: átomo o molécula que contiene al menos un electrón no apareado y

existente por un breve periodo de tiempo antes de reaccionar para producir un molécula
estable.
SUBPRODUCTO: en cualquier proceso industrial, producto que se obtiene además del
principal.
POLIFENOLES: Compuestos fenólicos solubles en agua, con pesos moleculares entre

500 y 3000 Da, que además de dar las reacciones fenólicas usuales, tienen propiedades
especiales tales como la habilidad de precipitar alcaloides, gelatina y otras proteínas.
VARIABLES RESPUESTA: característica del producto cuyo valor interesa mejorar

mediante el diseño de experimentos.
INTRODUCCIÓN
La identificación de compuestos fenólicos en una amplia variedad de frutas y vegetales va

más allá del interés por sus propiedades organolépticas como el color (antocianinas),
astringencia (taninos), amargura (flavanoles) sino por su alto valor nutricional relacionado
directamente con la disminución del riesgo de sufrir enfermedades de tipo crónico como
cáncer, deformaciones teratogénicas, trombosis, ulceras, alergias, inflamaciones e incluso
actividad anti-microbiana1. Una de las principales funciones que cumple esta familia de
compuestos es la de proteger células de procesos degenerativos debido a la presencia de
radicales libres mediante mecanismos antioxidantes. También actúan como quelantes de
cationes divalentes y como moduladores o inhibidores de la actividad de enzimas como
las topoisomerasas, protein-quinasas y ciclooxigenasa. Estas características han
permitido que la industria se enfoque en el desarrollo de productos con alto contenido
fenólico útiles en la industria de cosméticos, medicamentos, suplementos nutricionales y
alimentos funcionales. Esto sumado al especial interés en disminuir la cantidad de
antioxidantes artificiales cuyo uso es altamente restringido2.
Dentro de los vegetales superiores, las frutas y hortalizas constituyen una de las
principales fuentes de compuestos fenólicos. Como fruto de interés se encuentra el
aguacate (Persea americana) cuyo árbol es nativo de países como Colombia, México y
Venezuela y cuyo consumo ha incrementado debido a que cada vez es más valorado por
los consumidores, no solo por su singular sabor y textura3 sino también por sus beneficios
para la salud4,5.
La separación, aislamiento y caracterización de compuestos fenólicos en alimentos

específicamente en residuos de aguacate amplia no solo la posibilidad de incrementar el
número de fitoquímicos que puedan mejorar la calidad de vida de las personas, sino
también la alternativa de aprovechar subproductos de desecho (epicarpio y semilla) a
nivel industrial6 y de esta manera conseguir un aprovechamiento integral de esta fruta.
1
RICE-EVANS, Katherine ; MILLER, Nicholas y PAGANDA, George. Structure- antioxidant activity
relationships of flavonoids and phenolic acids. En: Free Radical Biology & Medicine, 1996. vol. 20,
no. 7, p. 933-956
2
Ibid., p. 933-956
3
GIFFONI, J.,et al. Chemical composition,toxicity and larvicidal and antifungal activities of Persea
Americana (avocado) seed extracts.En: Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical,
2009.vol. 42, no.2 ,p.110 .113.
4
HAIMING, Ding, et al. Chemopreventive characteristics of avocado fruit. En: Seminars in Cancer
Biology, 2007. vol. 17,no.5,p.386–94.
5
GIFFONI, et al. Op. Cit., p. 110.
6
BETANCUR-ANCONA, David, et al. Chemical and technological properties of avocado (Persea
americana Mill.)seed fibrous residues. En: Food and Bioproducts Processing, 2016. vol. 100. p.457-
463.
23
1. OBJETIVOS
1.1 OBJETIVO GENERAL
Identificar y cuantificar los compuestos fenólicos extraíbles presentes en epicarpio y

semilla de aguacate de la especie Persea Americana originaria del municipio de Sandoná.
1.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
 Evaluar dos métodos de extracción con disolventes (metanol 80% y acetona 70%) y
valorar en cada uno de ellos su actividad antioxidante a nivel in-vitro por medio de los
métodos ABTS Y DPPH.
 Cuantificar el contenido fenólico total y flavonoides totales en los extractos de
aguacate.
 Purificar mediante extracción en fase sólida y caracterizar químicamente de forma
preliminar los componentes fenólicos mayoritarios mediante técnicas cromatográficas
(cromatografía en columna, retención selectiva por resina, exclusión por tamaño,
cromatografía líquida de alta eficiencia) y espectrometría de masas.
24
2. MARCO REFERENCIAL
2.1 ANTECEDENTES
A continuación se darán a conocer los principales trabajos con referencia a la extracción y

la caracterización de compuestos fenólicos en semilla y epicarpio de aguacate.
En 2010 Gorinstein et al7 hicieron un estudio comparativo de las propiedades nutricionales

y bioactivas de frutos exóticos minoritariamente estudiados como durian, mango y
aguacate. Para el proceso de extracción evaluaron tres disolventes puros: metanol,
acetona y hexano. Los resultados mostraron que en el extracto de aguacate obtenido a
partir de metanol se encuentra el mayor contenido fenólico total (5,04±0,03 mg EAG/ g
peso seco). En el extracto de aguacate en acetona encontraron el mayor contenido de
flavonoles (12,715± mg catequina equivalente/ g peso seco) y el mayor contenido de
taninos (8,32±0,41 mg catequina equivalente/ g peso seco). Con respecto a la actividad
antioxidante equivalente a TROLOX el extracto de aguacate obtenido utilizando como
solvente agua mostró el mejor resultado (15,74±0,6μM Trolox/g peso seco), seguido del
extracto obtenido en metanol (13,83±0,7 μM Trolox/g peso seco), posteriormente el
obtenido con acetona (11,31±0,5 μM Trolox/g peso seco) y finalmente el extracto con
hexano (0,8 ±0,04 μM Trolox/g peso seco). Los resultados analizados con el método
DPPH mostraron una tendencia similar en donde el extracto acuoso presentó la mayor
actividad antioxidante (6,19± 0,3 μM Trolox/g peso seco) seguido del extracto
metanólico(10± 0,3 μM Trolox/g peso seco).
Liwey Gu et al8 en el año 2011 determinaron la capacidad antioxidante y el contenido

fenólico de ocho variedades de aguacate: Slimcado, Simmonds, Loretta, Choquette,
Booth 7, Booth 8, Tonagge y Hass. Durante la investigación, cuantificaron los principales
compuestos fitoquímicos antioxidantes presentes en semilla, pulpa y epicarpio de cada
variedad. Para el proceso de extracción emplearon una mezcla de acetona/agua/ácido
acético en proporciones 70:29.7:0.3, v/v/v.
Además, evaluaron el contenido fenólico aplicando el método de Folin-Ciocalteu. En las

semillas de las diferentes variedades de aguacate obtuvieron contenidos fenólicos en un
rango entre 19,22± 3,3 y 51,6± 1,6 mg EAG /g peso fresco y para el epicarpio valores
entre 4,6±0,3 y 12,6±0,3 mg EAG /g peso fresco. En este mismo trabajo los autores
evaluaron la actividad antioxidante por el método DPPH, los valores encontrados para la
semilla estuvieron entre 128,3±17,4 y 240,2±36,6 μmol TEAC/g peso fresco y para el
epicarpio entre 38,0±2,3 y 189,8±10,8 μmol TEAC/g peso fresco.
7
GORINSTEIN, Shela,et al.Comparative characterisation of durian, mango and avocado. En:
International Journal of Food Science and Technology, 2010. vol. 45,no.5, p.921 -929.
8
GU, Liwei; BOSTIC, Terrell y WANG, Wei. Antioxidant capacities, procyanidins and pigments in
avocados of different strains and cultivars. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2011.
vol. 122,no.4,p.1193-1198.
25
En general para todas las semillas de las diferentes variedades encontraron un mayor
contenido fenólico y actividad antioxidante que en los extractos aislados del epicarpio. Los
autores concluyen que la variedad Hass es la que tiene el mayor contenido fenólico
(51,6±1,6 mg EAG /g peso fresco) y la mayor actividad antioxidante (189,8 μmol TEAC
±10,8 g peso fresco). Finalmente cuantificaron e identificaron las procianidinas empleando
la técnica HPLC-MS.Para la separación utilizaron dos fases móviles A y B consistentes
en: A: cloruro de metileno/metanol/ ácido acético/ agua (82:14:2:2, v/v/v/v) y B:
metanol/ácido acético/agua (96:2:2 v/v/v). Las procianidinas identificadas en semilla y
epicarpio, empleando HPLC-ESI-MS en fase normal fueron: catequina, epicatequina,
dímeros tipo A y tipo B, trímeros tipo A y tipo B, tetrámeros pentámeros y hexámeros.
En el año 2011 Estéves et al9 llevaron a cabo un proceso de extracción de compuestos

fenólicos presentes en semilla, pulpa y epicarpio de las variedades de aguacate Hass y
Fuerte procedentes de Madrid, España. Para el proceso de extracción emplearon tres
disolventes: acetato de etilo, acetona/agua (70:30, v/v) y metanol/agua (80:20, v/v).
Posteriormente cuantificaron el contenido de fenoles totales (CFT) usando el ensayo
colorimétrico de Folin-Ciocalteu, para lo cual emplearon una curva estándar de ácido
gálico y expresaron los resultados como mg EAG /100g muestra seca. El contenido
fenólico más alto se obtuvo al emplear acetona como disolvente, seguido de metanol y
finalmente acetato de etilo. El CFT del epicarpio para la variedad Fuerte (17218±1446 mg
EAG/ 100g de muestra seca) fue mayor en comparación con el de la variedad Hass
(8997±3103 mg EAG/ 100g de muestra seca). Por su parte en la semilla de la variedad
Fuerte encontraron un mayor CFT (6912±1699 mg EAG/ 100g de muestra seca) que en la
variedad Hass (6082±863).
En la segunda etapa de la investigación, los autores realizaron una medición de la

actividad antioxidante por medio de dos metodologías: utilizando el radical ABTS y el
radical DPPH. En ambos procesos se expresaron los resultados como TEAC en mmol
equivalente de Trolox por g de muestra fresca. Los resultados mostraron que la mayor
actividad antioxidante se obtiene empleando acetona como disolvente de extracción,
seguido de metanol y finalmente acetato de etilo. La actividad antioxidante para el
epicarpio de la variedad Fuerte por el método TEAC (242,26±28,31 mmol Trolox/ g
muestra fresca) y DPPH (199,61±33,15 mmol Trolox/ g muestra fresca) arrojó mayores
valores en comparación con la variedad Hass (103,75±44,49 y 88,94±48,22 mmol Trolox/
g muestra fresca respectivamente). Por su parte en la semilla encontraron la misma
tendencia, la variedad Fuerte presenta los mayores valores de actividad antioxidante, por
el método ABTS (194,80±44,69 mmol Trolox/ g muestra fresca) y DPPH (167,50±42,08
mmol Trolox/ g muestra fresca) en comparación con los obtenidos para la variedad Hass
(158,29±26,27 y 130,26±36,80 respectivamente).
Finalmente identificaron los compuestos fenólicos presentes en semilla y epicarpio de

ambas variedades por medio de un análisis por cromatografía líquida de ultra-alta
resolución (UPLC). Para ello realizaron la separación de los compuestos en modo
gradiente empleando las fases móviles A (agua /0,5 % en ácido fórmico) y B (acetonitrilo
9
ESTÉVES, Mario, et al. Avocado (Persea americana Mill) Phenolics, In Vitro Antioxidant and
Antimicrobial Activities, and Inhibition of Lipid and Protein Oxidation. En: Journal of Agircultural and
Food Chemistry, 2011. vol. 59,no.10,p. 5625,5635.
26
/0,5% en ácido fórmico). Los resultados mostraron la presencia de compuestos fenólicos
como catequina, ácidos hidroxibenzoicos, ácidos hidroxicinámicos, flavonoles y
procianidinas. Dentro de los compuestos más abundantes en el epicarpio de ambas
variedades se encuentra la epicatequina (∼98%), mientras que la proporción entre
epicatequina y catequina fue incluso el 50% aproximadamente en la semilla. Cabe resaltar
que el epicarpio de la variedad Fuerte tuvo las mayores cantidades de procianidinas,
catequinas, ácidos hidroxicinámicos y flavonoles. Las semillas de la variedad Hass
presentaron cantidades significativamente altas de catequinas, procianidinas y ácidos
hidroxicinámicos comparadas con los resultados encontrados para el epicarpio.
Carrasco-Pancorbo et al10 en el año 2011 establecieron un método empleando HPLC-

DAD-ESI-TOF para la identificación de los constituyentes químicos en extractos
metanólicos de tres variedades de aguacate (Persea americana): Hass, Lamb-Hass y
Rugoro. Para el proceso de extracción utilizaron metanol, etanol, acetona y acetato de
etilo puro. Encontraron que, al emplear metanol como solvente se obtiene un perfil
cromatográfico con mayor número de señales y en mayor concentración.
Posteriormente, los autores optimizaron las condiciones de separación y detección

usando una mezcla estándar de 39 compuestos entre ácidos fenólicos y diferentes
categorías de flavonoides que podrían estar potencialmente presentes en los extractos
metanólicos. Para este propósito emplearon una columna cromatográfica C18
(4.6X450mm, tamaño de partícula de 1,8µm). El gradiente de elución que utilizaron fue
agua, ácido acético (0.5%) y acetonitrilo como fase móvil y una velocidad de elución de
1.6mL/min. En la tabla 1 se muestran los compuestos fenólicos encontrados en los
extractos procedentes de las tres variedades de aguacate.
Tabla 1. Metabolitos secundarios fenólicos encontrados en extractos metanólicos

obtenidos de tres diferentes variedades de aguacate.
Compuesto Formula m/z m/z Tiempo de Variedad de aguacate

experimental teórica retención
(min)
Ácido C7H6O4 153,0 196 153,0193 5,3 Rugoro Lamb- Hass
protocatecuico
Hass
Ácido gentisico C7H6O4 153,0201 153,0193 6,4 X X X

Ácido 4- C7H6O3 137,0242 137,0244 6,9 X X -
hidroxibenzoico
Ácido C16H18O9 353,0879 353,0878 7,5 X - -
clorogénico
Catequina C15H14O6 289,0701 289,0718 7,7 X - -
Ácido cafeico C9H8O4 179,0353 179,0350 8,3 X X X
Epicatequina C15H14O6 289,0718 289,0718 9,3 X X -
Vanilina C8H8O3 151,0396 151,0401 9,9 X X X
Ácido p-cumarico C9H8O3 163,0400 163,0401 10,3 X - -
Ácido ferúlico C10H10O4 193,0494 193,0506 11,4 X X X
Ácido sinapinico C11H12O5 223,0616 223,0612 11,6 X X X
Ácido benzoico C7H6O2 121,0295 121,0295 12,5 X X X
10
CARRASCO-PANCORBO, Alegría; HURTADO-FERNÁNDEZ, Elena y FERNÁNDEZ-
GUTIÉRREZ, Alberto. Profiling LC-DAD-ESI-TOF MS Method for the Determination of Phenolic
Metabolites from Avocado (Persea americana). En: Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2011. vol. 59,no. 6, p 2255–2267.
27
Ácido trans- C9H8O2 147,0454 147,0452 16,8 - - X
cinamico
Laricitrina C16H12O8 331,0452 331,0459 17,1 X - -
Naringenina C15H12O5 271,0618 271,0612 18,7 X - -
Crisin C15H10O4 253,0493 253,0506 24,3 X - -
Kaempferide C16H12O6 299,0543 299,0561 25,3 X - -
X: indica la presencia de los compuestos en las muestras de aguacate.
Fuente: Adaptado de CARRASCO-PANCORBO, et al. (2011).
En otro trabajo realizado por Kosińska et al11, se determinó la capacidad antioxidante en

semilla y epicarpio de aguacate de la especie Persea americana Mill variedades Hass y
Shepard. Para la extracción de los compuestos fenólicos emplearon metanol al 80% en un
baño termostático a 60 ºC por 15 minutos.
Luego evaluaron el contenido de fenoles totales en el epicarpio de ambas variedades

empleando para ello el método de Folin-Ciocalteu. Los valores se expresaron como mg
catequina equivalente/g peso seco. En general para el epicarpio de los frutos obtuvieron
mayores contenidos fenólicos que para las semillas. El contenido fenólico total del
epicarpio variedad Hass (25,32±0,242 mg CE/ g peso seco) mostró un mayor valor que la
variedad Shepard (15,61±0,241 mg CE/ g peso seco). Por su parte para la semilla
variedad Shepard (13,04±0,211 mg CE/ g peso seco) obtuvieron un mayor contenido
fenólico que para la variedad Hass (9,51±0,161 mg CE/ g peso seco).
Para calcular la capacidad antioxidante de los extractos emplearon el método TEAC. Los
resultados se expresaron como mmol Trolox equivalente/ g peso seco. Los extractos de
epicarpio mostraron un mayor poder reductor del catión-radical ABTS que los extractos de
semilla. Con respecto a las variedades, los autores concluyen que el extracto de epicarpio
en la variedad Hass tiene una mayor actividad antioxidante TEAC (0,161±0,0024 mmol
Trolox equivalente/ g peso seco) que la variedad Shepard (0,112±0,0034 mmol Trolox
equivalente/ g peso seco). Publican también que no existen diferencias significativas entre
los valores TEAC en las semillas de ambas variedades: 0,094±0,0007 mmol Trolox
equivalente/ g peso seco variedad Hass y 0,091±0,0047 mmol Trolox equivalente/ g peso
seco variedad Shepard. Los extractos metanólicos de epicarpio en la variedad Hass
mostraron una mayor actividad antioxidante en comparación con los otros extractos
analizados.
Los autores también evaluaron la actividad antioxidante por el método DPPH expresando
los resultados como valores de FRS50 (mg de peso seco). El epicarpio variedad Hass
(0,358 mg peso seco) mostró la actividad antioxidante más alta seguido del epicarpio
variedad Shepard (0,112 mg peso seco), semilla variedad Hass (0,091 mg peso seco) y
semilla variedad Shepard (0,094 mg peso seco). Finalmente los extractos obtenidos
fueron analizados por la técnica HPLC-PAD logrando identificar cuatro clases de
compuestos fenólicos: monómeros de flavanoles, proantocianidinas, ácidos
hidroxicinámicos y glicósidos de flavonoles. En las semilla de ambas especies se
identificó al acido 3-O-cafeoilquinico, el ácido 3-O-p-coumaroilquinico y procianidinas
triméricas tipo A. Se encontraron diferencias en la composición del epicarpio de ambas
11
KOSIŃSKA, Agnieszka, et al. Phenolic Compound Profiles and Antioxidant Capacity of Persea
Americana Mill. Peels and Seeds of Two Varieties. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2012. vol 60, no.18, p.4615-4616.
28
variedades. En la variedad Hass se encontraron procianidinas diméricas y (+)-catequina,
sin embargo estos compuestos no se encontraron en la variedad Shepard. Finalmente se
identificaron el ácido 5-O-cafeoilquinico y derivados de quercetina en ambas variedades.
Ana López Cobo et al12 en el año 2016 llevaron a cabo una extracción sólido-líquido de los
compuestos presentes en semilla, pulpa y epicarpio de aguacate empleando para ello una
mezcla de metanol/agua (80:20, v/v). Realizaron la determinación de los compuestos
fenólicos polares por medio de la técnica HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS. De igual forma
aplicaron la técnica HPLC-FLD-MS para determinar flavan-3-oles en las muestras. Los
autores lograron identificar siete compuestos en la semilla y once en el epicarpio. Dentro
del epicarpio mencionan compuestos como perseitol, ácido quínico, penstemide, ácido
clorogénico, derivados de la quercetina como quercetina diclucósido y derivados del ácido
cafeico como el ácido clorogénico. Para la semilla encontraron derivados de alcoholes
fenólicos como el hidroxitirosol 1-glucósido, derivados de ácido hidroxicinámicos como el
ácido 3-O-p-coumaroilquinico e isómeros del ácido cafeoilquinico.
Con respecto al uso que podrían tener estos extractos se encontró un estudio publicado
por Estéves et al13 en 2012 quienes evaluaron el efecto de la adición de compuestos
fenólicos aislados a partir de epicarpio de aguacate (Persea americana) sobre procesos
de oxidación en frituras de porcino. Los extractos ricos en compuestos fenólicos se
obtuvieron a partir de una extracción sólido-líquido empleando como disolvente acetona:
agua 70:30 (v/v). La caracterización del extracto de epicarpio indicó un alto contenido de
fenoles (6082 ± 863 mg EAG/100 g materia seca). Los mayores constituyentes fenólicos
encontrados fueron catequina (237.8 ± 4.2 mg/100 g materia seca), ácidos
hidroxicinámicos (282.7 ± 6.9 mg/100 g materia seca),) flavonoles((2.5 ± 0.7 mg/100 g
materia seca), y procianidinas (4592.0 ± 129.4 mg/100 g materia seca ). La actividad
antioxidante del extracto medida por el método DPPH mostró un valor de 130.26 ± 36.80
mmol Trolox/g materia fresca.
El resultado final, indicó que los subproductos del aguacate utilizados lograron inhibir
algunos cambios químicos inducidos por proteínas oxidantes. Se resalta que la eficiencia
de estos procesos depende de varios factores como la proteína objetivo y las rutas de
oxidación para que se pueda destacar la especificidad de las acciones antioxidantes de
los procesos bioquímicos en aguacate. Finalmente, la investigación sugiere que los
extractos obtenidos pueden ser recomendados como agentes aditivos sobre productos
cárnicos que pueden prevenir procesos de tipo oxidativo mejorando el valor nutricional de
estos productos cárnicos.
12
GÓMEZ-CARAVACA, Ana María, et al. HPLC-DAD-ESI-QTOF-MS and HPLC-FLD-MS as
valuable tools for the determination of phenolic and other polar compounds in the edible part and
by-products of avocado. En: Food Science and Technology, 2016, vol. 73,p. 505-513.
13
ESTÉVES, Mario, et al. Formation of Lysine-Derived Oxidation Products and Loss of Tryptophan
during Processing of Porcine Patties with Added Avocado Byproducts. En: Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 2012. vol. 60, no.15,p.3917-3926.
29
Finalmente en el año 2011 Chávez et al14 obtuvieron extractos fenólicos a partir del
epicarpio del fruto de Persea americana (palto) empleando agua como disolvente, el
contenido fenólico total fue 77,13±2 mg EAG / g muestra. Al probar la actividad inhibitoria
del extracto sobre la enzima ureasa de Helicobacter pylori, se obtuvo un valor de IC50 de
1.02 μg EAG/mL comprobando la eficiencia sobre la inhibición de la ureasa, la que
constituye uno de los factores más importantes en el proceso de colonización de la
bacteria Helicobacter pylori.
2.2 MARCO CONTEXTUAL
2.2.1 AGUACATE (Persea Americana Mill): Origen, botánica, morfología y estructura
En el libro de Yahia15 se reporta que por medio de datos arqueológicos se logró

determinar que el centro del origen de esta fruta es la parte central de México, pasando
por Guatemala hasta el Centro de América. El aguacate está botánicamente clasificado
en tres razas (Antillana, Mexicana y Guatemalteca) que poseen diferencias debido a la
madurez del fruto y su contenido de aceite. Los frutos de la raza Antillana tienen larga
variabilidad de forma y bajo contenido de aceite. La raza Mexicana corresponde a frutos
semitropicales, pequeños, alargados, de piel delgada y alto contenido de aceite. Los
frutos subtropicales de la raza Guatemalteca en su mayoría son redondos, con espesor
de piel y contenido intermedio de aceite16.
El aguacate es una planta dicotiledónea que pertenece al orden Ranales, familia Laurácea
y género Persea. Este último está conformado por 150 especies distribuidas, en las
regiones tropicales y subtropicales. Los árboles que pertenecen a este género se
caracterizan por tener hojas coriáceas y aromáticas; inflorescencias axilares o
subterminales, dispuestas en panículas corimbosas o racimosas; flores pediceladas o
sésiles, hermafroditas, con ovario globoso y sub-globoso, estilo delgado, estigma
triangular peldado; frutos en bayas globosas o elípticas17. Entre las especies se encuentra
la Persea americana clasificada por Miller, la cual desarrolló varias subespecies por su
aislamiento geográfico, que originó diferentes tipos botánicos18.
En general esta especie se caracteriza por ser perenne, muy vigorosa, de crecimiento
erecto y cuyos árboles en ambientes nativos puede alcanzar hasta los 30 m de altura19.
14
CHÁVEZ, Felipe, et al. Los polifenoles antioxidantes extraídos del epicarpio de Palta (Persea
americana var. Hass) inhiben la ureasa de Helicobacter pylori. En: Boletín Latinoamericano y del
Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas, 2011.vol. 10, no.3, p. 265 - 280.
15
YAHIA, E. M. y WOOLF, A. B. Avocado (Persea American Mill.). En: YAHIA. Elhadi (Ed.).
Postharvest biology technology of tropical and subtropical fruits: Açai to Citrus. No. 207.
Cambridge: Woodhead Publishing in Food Science, Technology and Nutrition, 2011. p.125-185.
16
Ibid., p.127
17
BERNAL ESTRADA, Jorge, et al. Manual técnico, actualización tecnológica y buenas prácticas
agrícolas en el cultivo de aguacate. 2 ed. Medellín: Corporación Colombiana de Investigación
Agropecuaria (CORPOICA), 2014. p.1-410
18
YAHIA y WOOLF. Op. cit., p.126.
19
RESTREPO, Juan, et al. Manejo fitosanitario del cultivo del aguacate Hass (Persea americana
Mill. Medidas para la temporada invernal. Bogotá D.C.: Instituto Colombiano Agropecuario (ICA),
2012. p.1-75
30
La fruta muestra gran variabilidad en tamaño, forma y peso, dependiendo de la variedad,
las condiciones climáticas y las prácticas de agricultura seguidas durante su crecimiento.
La forma de la fruta puede variar de esférica, a ovalada e incluso en forma de pera. El
peso puede estar en rangos de 70 a 190 g20. A continuación se indican los datos de la
clasificación taxonómica del fruto21.
Reino: Vegetal
Orden: Ranales
División: Espermatofita
Subdivisión: Angiosperma
Clase: Dicotiledoneas
Subclase: Dyalipetalae
Familia: Laurácea
Género: Persea
2.2.2 Aguacate en Colombia.
El cultivo de aguacate está presente en Colombia desde la época precolombina. Se sabe

que las primeras siembras de este cultivo se realizaron en los Montes de María22. La
producción de aguacate se lleva a cabo desde el nivel del mar hasta los 2200 msnm.
Cabe resaltar que la gran variedad de aguacates existentes se debe a las condiciones
agroclimáticas ideales de las regiones productoras23.
Entre los principales productores de aguacate se encuentran los departamentos de

Tolima, Bolívar, Antioquia y Santander24. En Colombia se pueden encontrar cultivos de las
tres razas de aguacate: mexicana, guatemalteca y antillana, siendo ésta última la raza
más adaptada a las condiciones climáticas del país. Dentro de las variedades
pertenecientes a la raza Antillana se encuentra el aguacate común criollo, uno de los más
conocidos y consumidos en Colombia25. Los frutos se caracterizan por tener cuellos
largos, epicarpio liso y bajo contenido de aceite26.
20
DE ARRIOLA, María del Carmen; MENCHÚ, Juan Francisco y ROLZ, Carlos. The Avocado. En:
INGLETT, George y CHARALAMBOUS, George (Eds.). Tropical Foods: Chemistry and Nutrition.
New York: Academic Press, Inc.,1979.p. 609-624.
21
BERNAL ESTRADA, et al. Op. cit., p. 17.
22
YABRUDY, Javier. El aguacate en Colombia: Estudio del caso de los Montes de María, en el
Caribe Colombiano. En: YABRUDY, Javier (Ed.). Centro de Estudios Económicos Regionales
(CEER). No.171. Cartagena: Editorial Banco de la República, 2012, p. 1-45
23
RÍOS-CASTAÑO, D. Y TAFFUR-REYES,R.Variedades de aguacate para el trópico: caso
Colombia. En: Actas V Congreso Mundial del Aguacate, 2003.vol.2,p.143-147.
24
YABRUDY. Op cit., p.9.
25
BERNAL ESTRADA, et al. Op cit., p.59-64.
26
AMÓRTEGUI, Ignacio; CAPERA, Edgar y GODOY,José. El cultivo del aguacate: módulo
educativo para el desarrollo tecnológico de la comunidad rural. Ibagué: Corporación para la
Promoción del Desarrollo Rural y Agroindustrial del Tolima (PROHACIENDO). MADR-PRONATTA,
2001. p.1-49
31
2.2.3 Aguacate: composición química
El consumo de aguacate está aumentando debido a los numerosos beneficios que posee
para la salud, características relacionadas directamente con su composición. Esta fruta es
considerada una importante fuente de energía, principalmente por sus altas cantidades de
lípidos; específicamente, el aguacate es rico en grasas monoinsaturadas, como el ácido
oleico. También contiene hidratos de carbono C7 como la D-manoheptulosa27; proteínas;
fibra dietética; vitaminas E, C, B2, B5 y B6; potasio; magnesio y fósforo. Por otra parte,
tiene una considerable cantidad de pigmentos como carotenoides (β-caroteno,
criptoxantina, luteína, isoluteina, zeaxantina, etc), las clorofilas (clorofilas a y b);
antocianinas (cianidina 3-O-glucósido); esteroles (β-sitosterol, campesterol,
estigmasterol); y compuestos fenólicos (ácidos fenólicos y flavonoides)28.
2.3 MARCO TEÓRICO
2.3.1 Compuestos fenólicos y su presencia en frutos y alimentos
Los compuestos fenólicos son antioxidantes que abundan en nuestras dietas. Provienen
exclusivamente de los alimentos de origen vegetal29. Estos metabolitos secundarios de las
plantas son determinantes en la calidad sensorial y nutricional de una gran variedad de
frutas y hortalizas30 sin contar con su importancia morfológica y fisiológica en la
constitución de las mismas31. Estos compuestos están constituidos por un amplio número
de estructuras heterogéneas formando desde moléculas simples hasta compuestos
altamente polimerizados32.
2.3.2 Clasificación de compuestos fenólicos
Los compuestos fenólicos comprenden miles de moléculas que han sido clasificados
dentro de diferentes grupos basados en el número de anillos fenólicos que ellos contienen
27
COWAN, A.K y WOLSTENHOLME, B.N. Avocado. En: SMITHERS, Geoffrey (Ed.). Reference
module in food science: Encyclopedia of food and healt. Oxford: Elseiver, 2016.
28
CARRASCO-PANCORBO, Alegría, et al. Merging a sensitive capillary electrophoresis–ultraviolet
detection method with chemometric exploratory data analysis for the determination of phenolic
acids and subsequent characterization of avocado fruit. En: Journal of Agricultural and Food
Chemistry, 2013, no. 4. vol. 141, p.3492–3503.
29
FÉSTY, D. Antioxidantes: Guía práctica: ¿Qué son? ¿Qué funciones realizan? ¿Qué beneficios
aportan? . Barcelona: Ediciones Robinbook, 2003. p.257.
30
TOMÁS-BARBERÁN, F.A.;FERRERES, F. y GIL, M. I., Antioxidant phenolic metabolites from
fruits and vegetables and changes during postharvest storage and processing. En: RAHMAN, Atta-
ur (Ed.).Studies in Natural products Chemistry: Bioactive natural products (Parte D).Amsterdam:
Elseiver, 2000.p. 739-735
31
IGNAT, Ioana ; VOLF, Irina y POPA, Valentin. A critical review of methods for characterization of
polyphenolic compounds in fruits and vegetables. En: Food Chemistry, 2011.vol.126,no.4, p. 1821–
1835.
32
REIS GIADA, Maria de Lourdes. Food Phenolic Compounds:Main Classes,Sources and Their
Antioxidant Power. En: MORALES-GONZALES, Jose A. (Ed.). Biochemistry, Genetics and
Molecular Biology: Oxidative Stress and Chronic Degenerative Diseases- A role for Antioxidants. p.
87-112.
32
y cómo esos anillos están enlazados33. Hacen parte de esta clasificación los fenoles
simples (estilbenos, lignanos, ácidos fenólicos y flavonoides34) y los polifenoles también
conocidos como taninos.
Los estilbenos son compuestos fenólicos que poseen dos anillos bencénicos unidos por
un puente de etano o eteno. Están distribuidos altamente en las plantas superiores
actuando como fitoalexinas y reguladores del crecimiento; Los lignanos son dímeros de
fenilpropano que se ciclan en diferentes caminos. Se caracterizan por hacer parte de los
fitoestrógenos los cuales actúan como factores protectores de los sistemas inmune y
cardiovascular35. En la figura 1 se muestra la estructura química para los compuestos
resveratrol y secoisolariciresinol clasificados como estilbeno y lignano respectivamente.
Figura 1. Estructura para los compuestos resveratrol (estilbeno) y secoisolariciresinol

(lignano).
Estilbenos (Resveratrol) Lignanos (secoisolariciresinol)
Fuente: Adaptado de HURST R. y HURST S. (2013)
Por su parte los ácidos fenólicos están presentes en las plantas como derivados
sustituidos del ácido hidroxibenzoico y el ácido hidroxicinámico, siendo estos últimos los
más comunes36. Los ácidos hidroxibenzoicos poseen una estructura general C6-C1 y los
ácidos hidroxicinámicos se caracterizan por tener como estructura base el ácido trans-3-
fenil-propenoico37. El ácido cafeico es uno de los más comunes ácidos hidroxicinámicos al
cual se le atribuyen procesos de bloqueo selectivo durante la biosíntesis de leucotrienos,
33
IGNAT, VOLF y POPA. Op. cit., p.1822.
34
D´ ARCHIVIO, Massimo, et al. Polyphenols, dietary, sources and bioavailability. En: Annali
dellÌstituto Superiore di Sanità, 2007. vol. 43, no. 4, p.348 –361.
35
BLASA, Manuela, et al. Fruit and vegetable antioxidants in health. En: WATSON, Ronald y
PREEDY, Victor (Eds.).Bioactive Foods in Promoting Health: Fruits and Vegetables. San Diego,
CA: Academic Press Inc., 2010.p. 37-58.
36
SHAHIDI, Fereidoon y AMBIGAIPALAN, Priyatharini. Phenolics and polyphenolics in foods,
beverages and spices: Antioxidant activity and health effects –A review. En: Journal of functional
foods, 2015.vol.18,p. 820–897.
37
PIETTA, Piergiorgio; MINOGGIO, Markus y BRAMATI,Lorenzo. Plant polyphenols:structure,
occurrence and bioactivity. En: RAHMAN, Atta-ur (Ed.). Studies in Natural Products Chemistry.
Oxford: Elseiver Inc., 2003. p. 257-312.
33
compuestos asociados a daños en procesos de inmunorregulación38. En la figura 2 se
muestra la estructura básica para esta clase de compuestos fenólicos.
Figura 2. Estructura representativa para los ácidos fenólicos.
Ácidos hidroxibenzoicos Ácidos hidroxicinámicos
Ácido p-hidroxibenzoico: R1=R2= H Ácido p-cumárico: R1=R2= H

Ácido protocatéquico: R1= OH, R2=H Ácido cafeico: R1= OH, R2= H
Ácido vanílico: R1= OCH3, R2=H Ácido ferúlico: R1= OCH3, R2= H
Ácido siríngico: R1=R2= OCH3
Fuente: Adaptado de HURST R. y HURST S. (2013)
Sin embargo cuando se discute sobre compuestos fenólicos en plantas, los flavonoides
son el grupo predominante debido a que su cantidad corresponde a las dos terceras
partes de la dieta en compuestos fenólicos39.
Actualmente se han encontrado más de 8.000 compuestos fenólicos de los cuales se

incluyen por lo menos más de 4.000 flavonoides, y el número sigue creciendo40. Los
flavonoides son los principales responsables de las virtudes antioxidantes de las frutas y
verduras41. El término flavonoide es un nombre colectivo para los pigmentos de las
plantas, en su mayoría derivados de la benzo-𝛾-pirona, el cual es sinónimo de cromona
(figura 3)42.
38
KOSHIHARA ,Yasuko., et al. Cafeic acid is a selective inhibitor for leukotriene biosynthesis . En:
Biochimica Biophisica Acta, 1984. vol. 792, no.1 , p. 92-97.
39
ROBBINS, Rebecca. Phenolic acids in foods: An overview of analytical methodology. En: Journal
of Agricultural and Food Chemistry, 2003.vol.51,no.10, p. 2866–2887.
40
HARBORNE, Jeffrey ; BAXTER, Herbert y MOSS, Gerard. Phytochemical dictionary: Handbook
of bioactive compounds from plants.London: Taylor & Francis Ltd., 1999. p 1-985
41
IGNAT, VOLF y POPA. Op.cit., p. 1821
42
HAVSTEEN, Bent H. The biochemistry and medical significance of the flavonoids. En:
Pharmacology & Therapeutics,2002.vol.96, no. 2-3, p. 67– 202. ,
34
Figura 3. Estructura de benzo-𝜸–pirona
Fuente: HAVSTEEN (2002)
Los flavonoides se caracterizan por la presencia de un esqueleto difenilpropano (C6-C3-

C6). En la figura 443 se indica la estructura básica y el sistema de numeración de
flavonoides. La estructura de este tipo de compuestos origina dependiendo del grado de
ciclización , el grado de insaturación y oxidación en el anillo C 44. La tabla 245 muestra las
familias más importantes de flavonoides en alimentos, clasificados por su estructura.
Figura 4. Estructura básica de los flavonoides
Fuente: VALLS, et al. (2009)
43
VALLS, Josep, et al. Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and
flavanols. En: Journal of Chromatography A, 2009. vol.1216, no.43, p.7143–7172.
44
CUYCKENS, Filip y CLAEYS, Magda. Mass spectrometry in the structural analysis of flavonoids.
En: Journal of Mass Spectrometry, 2004.vol.39, no.1, p. 1-15.
45
Ibid.,p. 7145.
35
Tabla 2. Estructuras de principales flavonoides presentes en alimentos.
Clase Estructura Ejemplos Existencia en

alimentos
Apigegina Apio
Flavonas Luteolina Vino blanco
Quercetina Cebolla
Flavonoles Miricetina Cerezas
Kaempferol Manzanas
Rutina
Flavanona Naringenina Jugo de

Hesperidina naranja y
Eriodictiol limón
Flavanoles, Catequina Cocoa y

Proantocianidinas y Epicatequina chocolate,
Taninos Epigalocatequina vino, te,
Procianidina B1, manzanas.
trimero C1
Genisteina Legumbres:
Isoflavonoides Daidzein soya
Glycitein
Antocianinas Malvidin, Bayas (uvas,

Cianidin Malvidin-3- arandanos,
glucosido cerezas)
Fuente: Adaptado de VALLS, et al. (2009)
Cabe mencionar que en la naturaleza, la mayoría de flavonoides se encuentran como

glicósidos. Estos pueden formarse por la sustitución de varios tipos de azúcares a través
de los grupos hidroxilo del esqueleto flavonoide en el caso de los O-glicósidos o enlazarse
directamente a átomos de carbono del anillo A formando los C-glicósidos46. La glucosa es
el azúcar más común en este tipo de compuestos no así la galactosa, la ramnosa, la
46
STOBIECKI, Maciej. Review: Application of mass spectrometry for identification and structural
studies of flavonoid glycosides. En: Phytochemistry, 2000. vol. 54, no. 3, p.237-256.
36
xilosa y la arabinosa47. En general el efecto de la glicosilación les permite a los
flavonoides ser menos reactivos e incrementar su solubilidad en agua y de esta manera
ser almacenados en las vacuolas de las células48. Las tres clases de flavonoides que han
atraído más atención en el área de los alimentos nutracéuticos y funcionales son la
antocianinas, los flavonoides y los isoflavonoides49.
Finalmente se tiene a los compuestos polifenólicos o taninos los cuales se presentan en la

naturaleza en forma hidrolizable y condensada. Estos se caracterizan por ser solubles en
agua; tener masas moleculares entre 50050 y 3000-500051 Da; poseer 12-16 grupos
fenólicos y 5-7 anillos aromáticos por cada 1000 unidades de masa molecular relativa; y
tener características de astringencia debido a la complejación intermolecular52.
El ácido gálico y el ácido elágico constituyen las unidades básicas de los taninos
hidrolizables esterificados a un núcleo en la molécula, comúnmente glucosa o monómeros
de flavanol como catequina. Por su parte los taninos condensados, (llamados
proantocianidinas), son los principales polímeros de flavonoides, los cuales se componen
de moléculas de catequina enlazadas formando dímeros, olígomeros y polímeros 53 que
están unidos por enlaces C4 y C8 (o C6)54.
Existe una clasificación adicional la cual indica el tipo de enlace interflavano (figura 5).
Entre estas moléculas se encuentran las proantocianidinas tipo B en donde las unidades
monoméricas se enlazan por el C4 en la unidad superior y las posiciones C6 o C8 por la
unidad inferior. Las proantocianidinas tipo A por su parte contienen un enlace éter
adicional entre la posición C2 en la unidad superior y el grupo hidroxilo de las posiciones
C7 o C5 de la unidad inferior55. Son potentes antioxidantes, aunque son escasamente
absorbidos por el intestino y son considerados factores anti-nutricionales debido a su
capacidad de precipitar proteínas e inhibir enzimas digestivas56.
47
CUYCKENS y CLAEYS. Op. Cit., p. 3.
48
CUYCKENS, Filip y CLAEY Magda. Determination of the glycosylation site in flavonoid mono-O-
glycosides by collision-induced dissociation of electrospray-generated deprotonated and sodiated
molecules. En: Journal of Mass Spectrometry, 2005.vol. 40, no. 3, p. 364–372.
49
Ibid.,p. 7145.
50
HASLAM, E. Practical Polyphenols: From Structure to Molecular Recognition and Physiological
Action. 1998, Cambridge: Cambridge University Press, .
51
YOSHIDA, T.; ITO, H., e ISAZA MARTÍNEZ, J.H..Pentameric ellagitannin oligomers in
melastomataceous plants--chemotaxonomic significance.En:Phytochemistry,2005.vol. 66, no. 17,
p.1972-1983.
52
ISAZA MARTÍNEZ, J.H. Taninos o polifenoles vegetales. En: Scientia Et Technica,2007.vol.13,
no.33,.p. 13-18.
53
HURST, Roger y HURST, Suzanne. Fruits and vegetables as functional foods for exercise and
Inflammation. En: Ronald Ross Watson y PREEDY,Victor (Eds.). Bioactive foods and chronic
disease states: Bioactive Food as Dietary Interventions for Arthritis and Related Inflammatory
Diseases. Oxford: Elsevier Inc., 2013.p. 319-336.
54
LUCCI, Paolo; SAURINA, Javier y NÚÑEZ, Oscar. Trends in LC-MS and LC-HRMS analysis and
characterization of polyphenols in food. En: Trends in Analytical Chemistry, 2017. vol.88.p.1-24.
55
Ibid., p.4.
56
BLASA, et al. Op. cit.,p.43.
37
Figura 5. Estructura representativa para una proantociandina con enlaces tipo A y tipo B.
Fuente: NAVARRO,et al. (2014)
2.3.3 Métodos de extracción, separación y purificación de compuestos fenólicos.
La extracción de los compuestos fenólicos está influenciada por varios parámetros entre
los cuales se encuentran el tamaño de partícula del fruto y los solventes empleados para
llevar a cabo el proceso de extracción. Para el tamaño de partícula se debe tener en
cuenta que al emplear partículas finas, se incrementa el área superficial de la muestra
promoviendo una ruptura de la pared celular de la planta y mejora el proceso de
extracción57.
La elección del disolvente más apropiado dependerá de su selectividad, miscibilidad,

densidad, recuperación, precio, presión de vapor, viscosidad y estabilidad química y
térmica58. Solventes como metanol, etanol, acetona, propanol, acetato de etilo y
dimetilformamida han sido usados comúnmente a diferentes concentraciones para la
extracción de compuestos fenólicos en productos frescos. Usualmente, los solventes
menos polares son considerados los más adecuados para la extracción de fenoles
lipofílicos59.
Una vez determinadas estás condiciones se procede a someter la muestra a un proceso

de extracción sólido-líquido (SLE), en la cual a partir de un proceso de transferencia de
57
KIM, Dae-Ok. y LEE, Chang Yee. Extraction and isolation of polyphenolics. En: Current Protocols
in Food Analytical Chemistry , 2002. NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc. p. I:I1:I1.2
58
HAMINIUK, Charles , et al. Phenolic compounds in fruits – an overview. En: International Journal
of Food Science and Technology, 2012. vol. 47, no. 10, p.1-22.
59
ESTÉVES, et al. Op.Cit., p. 5625-5635
38
masa de los compuestos solubles de la matriz de la planta hacia el disolvente, se logran
recuperar los compuestos fenólicos de los tejidos de las frutas hasta llegar a un estado de
equilibrio60. El proceso puede llevarse a cabo a temperatura ambiente o en frío para evitar
la degradación de los pigmentos. Una desventaja de esta técnica es que la co-extracción
de sustancias como proteínas, azúcares y ácidos orgánicos61 puede interferir en la
cuantificación de compuestos fenólicos especialmente en el método de Folin-Ciocalteu.
2.3.3.1 Separación y purificación.
La cromatografía de capa delgada (CCD) puede indicar la naturaleza de los compuestos

fenólicos presentes en la muestra y las cantidades de flavonoides individuales presentes
en un extracto purificado por cromatografía en columna. Las técnicas cromatográficas
modernas como HPLC permiten identificar una amplia gama de flavonoides por medio de
los tiempos retención después de obtener los extractos purificados.
Entre los diferentes métodos disponibles para la separación, caracterización y

cuantificación de compuestos fenólicos, la técnica HPLC ha dominado en los últimos
veinte años62. La cromatografía líquida de alta eficiencia en fase reversa constituye una de
las principales técnicas para la separación de compuestos fenólicos presentes en plantas
y alimentos. La separación se efectúa debido a la relativa no polaridad de los compuestos,
en donde la interacción hidrofóbica entre las regiones superficiales no polares de los
analitos y la superficie no polar de los ligandos en la fase estacionaria permite los
mecanismos de retención y posterior separación63. La fase estacionaria posee una
polaridad menor que la de la fase móvil y se caracteriza por estar hecha de compuestos
hidrofóbicos como C4, C8 y C1864. Generalmente se emplean dos fases móviles durante la
separación las cuales suelen estar constituidas por un solvente acuoso acidificado y un
solvente orgánico. La acidificación de una de las fases móviles se realiza con el fin de
evitar la ionización de los grupos hidroxi en los compuestos fenólicos mejorando así la
resolución y la reproducibilidad de los picos característicos. Con respecto a los solventes
orgánicos más utilizados son metanol y acetonitrilo. Este último provee una mejor
resolución de los picos sumado a que emplea un menor tiempo de análisis, aunque su
mayor toxicidad hace que el metanol sea escogido la mayoría de las veces65.
La separación de los compuestos puede llevarse a cabo en modo isocrático o en modo

gradiente dependiendo del número y tipo de analitos sumado a la naturaleza de la matriz.
Cuando se emplea cromatografía líquida en fase reversa, generalmente los compuestos
60
CORRALES, M. Extraction of anthocyanins from grape skins assisted by high hydrostatic
pressure. En: Journal of Food Engineering, 2009.vol.90,no.4,p.415–421.
61
IGNAT, VOLF y POPA. Op. cit., p.1826
62
KONTOGIANNI, G.Vassiliki. Novel Techniques Towards the Identification of Different Classes of
Polyphenols (Capítulo 8). En: WATSON, Ronald(Ed.).Polyphenols in plants: Isolation purification
and extract preparation. San Diego CA: Academic Press Inc., 2014.p.159-185
63
BOYSEN, Reinhard y HEARN, Milton. High Performance Liquid Chromatographic Separation
Methods. En: LIU, Hung-wen y MANDER, Lew (Eds.). Comprehensive Natural Products II:
Chemistry and Biology. Oxford: Elsevier Inc., 2010. 5-45.
64
GUZZETA, A. Reverse Phase HPLC Basics for LC ⁄ MS. [En línea]. [Citado el 15 de agosto de
2016]. Disponible en: < http://www.ionsource.com/tutorial/chromatography/ rphplc.htm >.
65
KONTOGIANNI . Op. cit., p.164.
39
polares eluyen primero, seguido de los flavonoides diglicósidos, posteriormente los
monoglicósidos y las aglíconas66.
Finalmente hay que hacer referencia en el diseño de múltiples detectores acoplados a los
equipos de cromatografía líquida de alta eficiencia para la cuantificación y detección de
compuestos fenólicos ejemplo de ellos son: detectores de índice de refracción,
fluorescencia, electroquímico, dispersión de luz, espectrometría de masas y UV/Vis67.
Entre ellos el detector UV/Vis con detector de arreglo de fotodiodos (PAD) es uno de los
más extensamente utilizados para la elucidación de compuestos fenólicos en materiales
basados en plantas, analizando un número específico de longitudes de onda68. Esto se
debe a la existencia de enlaces dobles conjugados en los compuestos fenólicos lo cual les
permite absorber luz ultravioleta o ultravioleta-visible69.
2.3.4 Métodos de caracterización de compuestos fenólicos.
Los colores característicos emitidos por los flavonoides permiten su caracterización por
medio de espectroscopía UV-Vis. Perfiles a 240 y 280 nm han sido ampliamente utilizados
para determinar diferentes familias de compuestos fenólicos: λ=280 nm es particularmente
útil para la determinación de ácidos fenólicos; λ=320 nm (aproximadamente) es una
longitud de onda adecuada cuando no se han determinado las diferentes subclases de
flavonoides y se recomienda trabajar con 440 y 520 nm (aproximadamente) cuando se
desea determinar antocianinas70.
La cromatografía líquida acoplada a espectrometría de masas es un método eficiente para

detectar y cuantificar compuestos fenólicos presentes en plantas y fluidos biológicos71.
Está técnica permite generar moléculas cargadas y fragmentos de moléculas por medio
de altas energías de ionización y medir de esta forma las relaciones masa-carga de estas
especies72. La detección de los compuestos fenólicos se lleva a cabo en modo ión
negativo y modo ión positivo73.
66
KONTOGIANNI . Op. cit p.164.
67
THOMPSON, Richard. y LOBRUTTO, Rosario. Role of HPLC in process development. En:
KAZAKEVICH, Yuri y LOBRUTTO, Rosario.HPLC for Pharmaceutical Scientists. New Jersey: John
Wiley & Sons, Inc., 2006.p. 641–677.
68
HAMINIUK, et al. Op. cit., p.10 .
69
STALIKAS, Constantine. Phenolic acids and flavonoids: occurrence and analytical methods
(Capítulo 5). En: UPPU, R.M, et al (Eds.). Free Radicals and Antioxidant Protocols. Serie: Methods
in Molecular Biology. San Diego CA: Editorial Humana Press, 2010. p. 65–90.
70
CARRASCO-PANCORBO, HURTADO-FERNÁNDEZ, FERNÁNDEZ-GUTIÉRREZ. Op.Cit., p.
2225-2257
71
LAMUELA-RAVENTÓS, Rosa María, et al. Improved characterization of polyphenols using liquid
chromatography (Capítulo 14). En: WATSON, Ronald (Ed.). Polyphenols in plants. Oxford: Elseiver
Inc.,2014. p. 261-292.
72
MARCANO, D.; HASEGAWA M. Fitoquímica orgánica, Universidad Central de Venezuela,
Consejo de Desarrollo Científico y Humanístico.2 ed. Venezuela: Editorial Torino, Venezuela, 2002.
p.594
73
LAMUELA-RAVENTÓS, et al. Op. cit., p.272.
40
2.3.5 Cuantificación del contenido de fenoles totales.
Aunque la naturaleza química exacta del reactivo de Folin-Ciocalteu aún no se conoce,

se sabe que contiene complejos de ácido fosfomolíbdico / fosfotúngstico. Este ensayo se
basa en la transferencia de electrones en medio alcalino por parte de los compuestos
fenólicos produciendo la reducción de especies de molibdeno, formando complejos azules
que pueden ser detectados espectrofotométricamente a 750-765nm. Los complejos
azules son independientes de la estructura de los compuestos fenólicos, lo que evita la
posibilidad de coordinación con complejos formados entre el metal y estos compuestos. El
átomo de molibdeno dentro del complejo es generalmente aceptado como el sitio de
reducción donde los iones de Mo+6 son reducidos a Mo+5 por aceptación de electrones
donados por los antioxidantes fenólicos74. El ácido gálico se utiliza como patrón de
referencia y los resultados se expresan como equivalentes de ácido gálico (EAG) por
100g de fruta75.
2.3.6 Cuantificación del contenido de flavonoides totales.
La medida del contenido de flavonoides totales ha sido discutida por muchos autores (Dai
et al., 199576 ; Moreno et al., 200077; Sakanaka et al., 200578). Este método consiste en
formar un complejo de aluminio-flavonoide en presencia de medio básico que presenta
una coloración rosa salmón que absorbe a 490 nm (Figura 6). La reacción se lleva a cabo
en presencia de nitrito de sodio, el cual genera inicialmente una reacción de oxidación de
los grupos hidroxilo en C2´ y C3` en el anillo B del compuesto flavonoides. Posteriormente
en presencia del cloruro de aluminio se da una reacción de nitrosilación en C5` (anillo B).
En esta etapa el aluminio forma un complejo de coordinación con el grupo carbonilo en
C2` y un enlace con C3` formando un compuesto coloreado amarillo. Finalmente la
adición de hidróxido de sodio permite que el oxígeno del grupo nitrosilo en C5` se reduzca
formando el complejo coloreado de color rosa-salmon79. Cabe resaltar la capacidad que
posee el cloruro de aluminio para forma complejos con grupos o-hidroxilo y con grupos
hidroxil-cetona vecinos para formar complejos lábiles ante la presencia del ácido de tal
modo que este desaparece con el agregado de HCl, no así en el segundo caso en el que
74
SHAHIDI, Fereidoon ; ZHONG, Ying. Measurement of antioxidant activity. En: Journal of
functional foods, 2015. vol.18, p.757–781
75
KRISHNAIAH, Duduku.; ROSALAM, Sarbatly y RAJESH, Nithyanandam. A review of the
antioxidant potential of medicinal plant species. En: Food Bioproducts Processing, 2011. vol. 89,no.
3, p. 217–233.
76
DAI, G.H., et al. Involvement of phenolic compounds in the resistance of grapewine callus to
downy mildew (Plasmopara viticola). En: European Journal of Plant Pathology,1995. vol.101, no.5,
p. 541–547.
77
NIEVA MORENO, María, et al. Comparison of the free radical scavenging activity of propolis from
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78
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79
ZHU, Hongbin, et al. Analysis of Flavonoids in Portulaca oleracea L. by UV–Vis
Spectrophotometry with Comparative Study on Different Extraction Technologies. En:Food
Analytical Methods, 2010.vol.3, p. 90-97
41
el complejo es estable80. El contenido de flavonoides totales se expresa como mg de
catequina por cada g de muestra81.
Figura 6. Reacción de quelación del ión Al3+ con flavonoides.
Fuente: Adapatado de ZHU, et al. (2010)
2.3.7 Capacidad antioxidante de compuestos fenólicos.
Las reacciones químicas de los radicales libres se dan constantemente en las células del
cuerpo y son necesarias para la salud, pero el proceso debe ser controlado con una
adecuada protección antioxidante que puede ser brindada por moléculas endógenas u
exógenas (compuestos fenólicos, vitamina E, vitamina C, carotenoides) capaces de
neutralizar la acción oxidante de estas especies82.
Los compuestos fenólicos presentes en una gran variedad de verduras y frutas pueden
actuar como antioxidantes de varias formas especialmente por medio de la captura de
80
LOCK, O. Colorantes Naturales.1 ed. Lima: Fondo Editorial de la Pontificia Universidad Católica
del Perú, 1997. p.279
81
PEÑARRIETA, J. M., et al. Total antioxidant activity in Andean food species from Bolivia. En:
Revista Boliviana de Química, 2005. vol. 22, no.1,p.89-93.
82
AVELLO, M. y SUWALSKY, M. Radicales Libres, Estrés Oxidativo y Defensa Antioxidante
Celular. En : Revista Atenea- Universidad de Concepción, 2006.vol.494, p.161-172.
42
radicales libres y la donación de átomos de hidrógeno. Los compuestos fenólicos son
efectivos antioxidantes en una amplia gama de sistemas de oxidación química siendo
capaces de capturar radicales alquil, peroxil, superóxido, radicales hidroxil, óxidos nítricos
y peroxinitratos en medios acuosos u orgánicos. Estás características se deben a la
presencia de grupos hidroxilo y la habilidad que posee un anillo aromático para soportar
en su estructura electrones libres por deslocalización de ellos en el sistema de electrones
83.
Cabe resaltar que una sustancia fenólica puede ser considerada como antioxidante si
posee la capacidad de retrasar o prevenir la oxidación mediada por radicales estando en
una concentración menor que la del sustrato a oxidar. Además se debe tener en cuenta
que los radicales formados después de la captura deben tener una estabilidad
considerable84.
2.3.7.1 Métodos para la evaluación de la capacidad antioxidante in-vitro.
Existen tres mecanismos por los cuales los compuestos antioxidantes pueden detener la
acción de un radical: transferencia de átomos de hidrógeno, transferencia de electrones y
una combinación de ambos85. Se han desarrollado una gran variedad de métodos para la
medición de la actividad antioxidante a nivel in-vitro como los métodos TEAC Y DPPH los
cuales combinan los dos mecanismos de acción frente a radicales libres. En cada método
las condiciones de operación como pH, solubilidad, solventes y medida de la longitud de
onda varían produciendo resultados diferentes86. Aunque estos métodos no pueden
reproducir mecanismos antioxidante in-vivo, son útiles para clasificar la actividad
antioxidante de sustancias y alimentos que las contienen87.
2.3.7.1.1 Método ABTS.
El método ABTS mide la capacidad que poseen lo antioxidantes para capturar al catión
radical estable ABTS•+ (2,2 -azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato), un cromóforo azul-
verdoso que posee máximos de absorción a 414, 645, 734 y 815 nm y disminuye en su
intensidad debido a la presencia de antioxidantes88. Hay que aclarar que se ha preferido la
83
ROBBINS. Op. cit.,p. 2867.
84
KAPOOR, Harish y KAUR, Charanjit. Review Antioxidants in fruits and vegetables- the
millennium's health. En: International Journal of Food Science and Technology,2001.vol.36,no.
7,p.703-725.
85
RASCO, Bárbara, et al. Determination of total phenolic content and antioxidant capacity of onion
(Allium cepa ) and shallot (Allium oschaninii )using infrared spectroscopy. En: Food Chemistry,
2011.vol.129, no.2,p. 637-644
86
KAPOOR y KAUR. Op. cit.,p.716
87
GARCÍA PARRILLA, M.C., et al. Radical scavenging ability of polyphenolic compounds towards
DPPH free radical. En: Talanta, 2007.vol.71,no.1,p.230–235.
88
SEGUNDO, Marcela, et al. Methodological aspects about in vitro evaluation of antioxidant
properties. En: Analytica Chimica Acta, 2008. vol. 63, p.1-19.
43
determinación a 734nm debido a que la interferencia de otros componentes absorbentes y
de turbidez de la muestra en esta longitud se reduce al mínimo89.
El catión radical ABTS puede ser generado de diferentes maneras, por ejemplo por medio
de una reacción química usando dióxido de manganeso o persulfato de potasio, por
reacciones enzimáticas usando metmioglobina, peroxidasa o por alguna reacción
electroquímica (Figura 7). Se ha adoptado un tiempo de reacción que va desde 1 a 30
minutos. La concentración restante de ABTS•+ se mide después de un tiempo de reacción
fijo y los resultados se expresan como equivalentes de Trolox por gramo de extracto
(TEAC / g)90.Una de las ventajas de este método es que puede ser evaluada en un amplio
rango de pH lo que implica un mayor análisis del efecto del pH sobre mecanismos
antioxidantes. Finalmente la solubilidad del radical ABTS•+ en agua y disolventes
orgánicos permite la determinación de la capacidad antioxidante tanto en muestras
hidrofílicas como lipofílicas91.
Figura 7. Estructura del catión radical ABTS•+ antes y después de la reacción con el
antioxidante.
Fuente: Image bank Quim. Nova.
89
ARNAO, Marino. Some Methodological Problems in the Determination of Antioxidant Activity
Using Chromogen Radicals: A Practical Case. En: Trends in Food Science and Technology, 2011.
vol.11, p. 419-421
90
ESTÉVES, et al. Op. cit.,p. 5627
91
SEGUNDO, et al. Op. Cit., p.14
44
2.3.7.1.2 Método DPPH
El DPPH• es un radical libre estable que reacciona con compuestos que pueden donar un
átomo de hidrógeno. El mecanismo de reacción se basa en una transferencia de
electrones (ET) por lo que la capacidad de eliminación de radicales DPPH• está
fuertemente influenciada por el disolvente y el pH de la reacción.
En este ensayo, el cromógeno púrpura radical DPPH• se reduce por acción de un

antioxidante a su correspondiente hidrazina de color amarillo pálido (Figura 8). La
capacidad de eliminación del radical se evalúa generalmente en medios orgánicos por
medio de un seguimiento de la disminución de la absorbancia a 515-528 nm hasta que la
absorbancia permanece constante92. Los resultados se interpretan como la concentración
eficaz (FRS50), es decir la cantidad de antioxidante necesario para disminuir en un 50% la
concentración inicial de la concentración de DPPH•.
El radical DPPH • es estable, disponible comercialmente, y no tiene que ser generado

antes del ensayo como en el caso del radical ABTS•+. Por lo tanto, se considera un
método espectrofotométrico fácil y útil con respecto a la detección/medición de la
capacidad antioxidante tanto de compuestos puros como de muestras complejas.
Figura 8. Estructura del DPPH antes y después de la reacción con el antioxidante.
Fuente: ALAM, BRISTI, y RAFIQUZZAMAN (2013).
2.4 ACTIVIDAD BIOLÓGICA
Los flavonoides ejercen un efecto protector sobre algunos tipos de enfermedades

coronarias según investigaciones holandesas. El estudio muestra que la enfermedad
coronaria en personas de edad avanzada se correlaciona inversamente con la ingesta de
flavonoides provenientes de una dieta basada en el consumo de té, cebollas, manzanas y
vino tinto93.
92
SEGUNDO, et al. Op. Cit., p.14
93
HERTOG, M. G., et al. Dietary antioxidant flavonoids and risk of coronary heart disease: The
Zutphen elderly study. En: The Lancet, 1993. vol. 342, no.8878, p.1007-1011.
45
La actividad biológica de los fenilpropanoides y su papel como agentes antimicrobianos
son bien reconocidos, además de sus propiedades como agentes antialérgicos y
antiinflamatorios a través la inhibición de la lipoxigenasa94 y su acción como
antimutagénico95.
Se ha demostrado que la quercetina es mediadora en la disminución de la línea celular

p53 asociada con un tipo de cáncer de mama96 y otros estudios indican que la actividad
inhibidora del crecimiento inducido por este mismo compuesto en los ovarios puede estar
mediada por la modulación de la transformación del factor de crecimiento Y97.
Además de la actividad antirradicalaria de los compuestos fenólicos, cabe mencionar su

actuación como: modulador de la actividad de una amplia gama de enzimas y receptores
celulares98; actividad anticarcinogénica; actividad anti-arteriosclerotica; actividad anti-
inflamatoria; inhibición de la liberación de histamina y actividad espasmolítica; actividad
hepatoprotectora; actividad antiviral, antimicrobiana y actividad estrogénica99,100,101,102,103.
94
SUD'INA, G. F. et al. Caffeic acid phenethyl ester as a lipoxygenase inhibitor with antioxidant
properties. En : Federation of European Biochemical Societies,1993. vol.329, no.1-2, p.21-24.
95
NAMIKI, Mitsuo. Antioxidants/antimutagens in food. En: Critical Reviews in Food Science and
Nutrition, 1990.vol.29, no.4, p.273-300.
96
AVILA, M. A., et al. Quercetin mediates the down-regulation of mutant p53 in the human breast
cancer cell line MDA-MB468. En: Journal of Cancer Research, 1994. vol. 54, no.9, p.2424- 2428.
97
MANCUSO, S., et al. Quercetin enhances transforming growth factor beta l secretion by human
ovarian cancer cells. En: International Journal of Cáncer, 1994.vol.57,no.2,p.211-215.
98
MIDDLETON, E. Jr.; KANDASWAMI, C. y THEOHARIDES, T.C.The effects of plant flavonoids on
mammalian cells: implications for inflammation, heart disease, and cancer. En: Pharmacological
Reviews, 2000.vol 52, no.4,p. 673-751.
99
PIETTA, MINOGGIO y BRAMATI. Op. cit., p. 293
100
DAI,Q., et al. Fruit and vegetable juices and Alzheimer ’s disease: The Kame Project. En: The
American Journal of Medicine,2006. vol.119,no.9,p.751 .759.
101
DE PASCUAL-TERESA, S. y SANCHEZ-BALLESTA,M.T. Anthocyanins:From plant to health.A
review. En: Phytochemistry, 2008. vol. 7,p. 281 .299.
102
PAN, M.H.; LAI, C.S. y HO,C.T. Anti-inflammatory activity of natural dietary flavonoids.En: Food
and Function, 2010.vol.1,p.15-31.
103
SCALBERT, A., et al. Dietary polyphenols and the prevention of diseases.En: Critical Reviews in
Food Science and Nutrition, 2005. vol.45,no.4,p.287 –306.
46
3. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 RECOLECCIÓN, CLASIFICACIÓN Y CARACTERÍSTICAS DEL FRUTO.
Los frutos de aguacate se recolectaron en el municipio de Sandoná localizado a 48 km de

la ciudad de San Juan de Pasto, el municipio se encuentra a 1848 msnm y posee una
temperatura promedio de 19,8 °C104. La recolección de los frutos se realizó mediante un
muestreo aleatorio simple, en total se recolectaron catorce frutos (figura 9), los que se
caracterizaron por tener un tamaño uniforme, una coloración verde brillante y un estado
óptimo para consumo. La clasificación taxónomica del fruto se llevó a cabo en el herbario
de la Universidad de Nariño y la Universidad Nacional.
Figura 9. Árbol de aguacate y muestras recolectadas.
Fuente: Esta investigación.
3.2 OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS CRUDOS.
Inicialmente los frutos se lavaron con agua desionizada para eliminar las impurezas. Se
pesó cada fruto y posteriormente se separó manualmente el epicarpio y la semilla de cada
aguacate. En total se procesaron 600 g de epicarpio y 600 g de semilla.
Independientemente se procesaron 50g de epicarpio y semilla. Las muestras se colocaron

en un erlenmeyer de 500 mL. Se adicionó la cantidad de metanol/agua (80:20, v/v)105
suficiente para cubrir toda la superficie del material vegetal, se selló cada recipiente con
papel celofán y se sometió a un proceso de maceración química durante 24 horas106.
104
ALCALDÍA DE SANDONÁ- NARIÑO [en línea]. [citado el 28 de septiembre del 2016]. Disponible
en: <http://www.sandona-narino.gov.co/informacion_general.shtml>
105
KOSIŃSKA, et al. Op.cit., p. 4614.
106
SHAHIDI, Fereidoon y NACZK, Marian. Phenolics in cereals, fruits and vegetables: Occurrence,
extraction and analysis. En: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2006, vol. 41,no.5,
p.1523–1542
47
El extracto crudo (EC) de las dos partes del fruto se filtró empleando papel filtro Whatman
Nº.1, luego se rotaevaporó el solvente empleando un rotaevaporador Heidolph a 40 ºC y
finalmente se secó cada extracto sobre una plancha de calentamiento a una temperatura
de 45º C. El mismo proceso se evaluó empleando acetona/agua (70:30, v/v)107. El proceso
de extracción utilizando los dos tipos de solventes se realizó por triplicado (Figura 10),
obteniendo finalmente el extracto crudo de semilla (ECS) y el extracto crudo de epicarpio
(ECE).
Figura 10. Proceso para la obtención de los extractos crudos de semilla y epicarpio.
Separación manual de epicarpio y semilla
Maceración Filtración Rotaevaporación Secado
EC Epicarpio EC Semilla
3.3 DISEÑO EXPERIMENTAL.
Con el fin de encontrar el mejor solvente de extracción de los compuestos fenólicos, se

realizó un diseño bifactorial, cada factor con dos niveles así:
1. Parte del fruto: epicarpio y semilla

2. Disolvente de extracción : metanol 80% y acetona 70%
107
ESTÉVES, et al. Op. cit., p.5626.
48
Para el análisis de los datos se utilizó el programa Statgraphics Centurion 16.1.15. Se
realizaron tres réplicas por cada experimento utilizando como variable respuesta la
actividad antioxidante equivalente a TROLOX (TEAC).
3.4 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO FENOLICO TOTAL (CFT), ACTIVIDAD

ANTIOXIDANTE EQUIVALENTE AL TROLOX (TEAC).
3.4.1 Determinación del contenido de fenoles totales
Se mezclaron 200 μL de los extractos obtenidos con 200 μL del reactivo fenólico de Folin-
Ciocalteu, seis minutos después se adicionan 2000 μL de carbonato de sodio Na2CO3 al
7% (p/v)108. La mezcla se agitó y se dejó reposar durante dos horas a temperatura
ambiente, posteriormente se midió la absorbancia a 765nm usando un espectrofotómetro
Pharo UV-Vis (Merck). El contenido fenólico se calculó a partir de una curva estándar
preparando soluciones de 10, 30, 60, 100, 150 y 180 ppm de ácido gálico y expresando
los resultados como mg de ácido gálico por g de extracto seco.
3.4.2 Método ABTS (ácido 2,2`-azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)): TEAC
Para medir la actividad antioxidante equivalente al trolox (TEAC) se preparó una solución
trabajo que contenía ABTS en concentración 7 mmol y persulfato de potasio 2,45 mmol.
La mezcla se dejó en reposo a temperatura ambiente en un cuarto oscuro durante 15
horas. Luego la solución trabajo de ABTS se diluyó en metanol para obtener una
absorbancia medida a 734 nm de 0,9±0,04.
Posteriormente una alícuota de 20 μL de cada extracto diluido se adicionó a 2000 μL de

solución del radical ABTS y se agitó durante un minuto. Se dejó reposar a temperatura
ambiente en la oscuridad por seis minutos y luego se midió la absorbancia a 734 nm. La
actividad antioxidante de las muestras se calculó por interpolación a partir de una curva
estándar construida a partir de soluciones de 0,5, 1, 1,5, 2 y 2,5 mM de TROLOX. Los
valores TEAC se expresaron en mmol TROLOX / g de extracto seco109.
108
CHUN, OCK, et al. Comparison of ABTS/DPPH assays to measure antioxidant capacity in
popular antioxidant-rich US foods. En: Journal of Food Composition and Analysis, 2011.vol.24,no.
7,p.1043-1045
109
KOSIǸSKA, et al. Op. cit., p. 4614.
49
3.5 PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS FENÓLICOS
Los extractos crudos de semilla y epicarpio de aguacate con mayor actividad antioxidante
se purificaron utilizando una resina polimérica (Amberlita XAD-7) empacada en una
columna cromatográfica de dimensiones: largo 23,5 cm y diámetro interno 2 cm (Figura
11). Este proceso se realizó con el fin de eliminar compuestos co-extraídos durante la
maceración como azúcares, aminoácidos, proteínas entre otros. Como paso preliminar
fue necesario activar la resina con 300 mL de H2O: HCl (0,01%). Posteriormente se
cargaron independientemente 2,056 g de ECS y ECE realizando lavados con agua tipo II
hasta completar un volumen de 500 mL. Finalmente se eluyeron los compuestos fenólicos
retenidos con una mezcla de metanol/ácido acético (19:1, v/v).
Figura 11. Purificación de extractos crudos de semilla y epicarpio de aguacate sobre
columna con Amberlita XAD-7.
(a) (b)
(a) Semilla (b) Epicarpio
3.5.1 Fraccionamiento de los extractos purificados.
El proceso de separación de los compuestos fenólicos se realizó sobre una resina de

Sephadex LH-20, la cual fue activada inicialmente con 500 mL de H2O:HCl (0,01%) y
acondicionada con 1 L de agua tipo II. Una vez activada la resina, se disolvieron
independientemente 0,25 g de los extractos EPS y EPE en la mínima cantidad de la fase
móvil inicial y se cargaron en las columnas de dimensiones: largo 26 cm y diámetro
interno 2 cm.
50
Para la elución de los compuestos fenólicos se empleó la metodología propuesta por
Yang et al110 y modificada por Basante111 empleando tres fases móviles diferentes: los
compuestos fenólicos de bajo peso molecular eluyeron con 400 mL de metanol/agua
(30:70, v/v), en este proceso se recolectaron un total de 32 fracciones (de 10 mL cada
una) obteniendo las fracciones F1S (Fracción 1 para la semilla) y F1E (Fracción 1 del
epicarpio). Los compuestos fenólicos de tamaño molecular intermedio eluyeron con 450
mL de metanol/agua (60:40, v/v), recolectando para el caso del EPS la fracción F2S
(Fracción 2 de la semilla) y para el EPE la fracción F2E (Fracción 2 del epicarpio).
Finalmente los compuestos poliméricos (de mayor peso molecular) eluyeron con 250 mL
de acetona/agua (60:40, v/v) obteniendo las fracciones F3S (Fracción 3 de la semilla) y
F3E (Fracción 3 del epicarpio). Se realizó un seguimiento por espectroscopía UV-Vis a
cada una de las fracciones obtenidas con el fin de determinar la forma de elución de los
compuestos fenólicos y de esta forma iniciar el cambio de fase móvil. En las figuras 12 y
13 se puede observar el proceso de fraccionamiento de los extractos purificados de
semilla y epicarpio respectivamente.
Figura 12. Fraccionamiento extracto purificado de semilla.
(a) (b) (c)
a. Fracción 1(F1S) b. Fracción 2(F2S) c. Fracción 3 (F3S)
110
YANG, Baoru, et al. Analysis of Hydrolyzable Tannins and Other Phenolic Compounds in Emblic
Leafflower (Phyllanthus emblica L.) Fruits by High Performance Liquid Chromatography-
Electrospray Ionization Mass Spectrometry. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2012.vol. 60,no.35,p. 8672-8683.
111
BASANTE, Jessica. Estudio de la composición y actividad antioxidante In Vitro de la fracción
polifenólica de subproductos de aguacate (Persea americana Mill), semilla y epicarpio. San Juan
de Pasto, 2016, 141p. Trabajo de grado (Químico).Universidad de Nariño. Facultad de Ciencias
Exactas y Naturales.Departamento de Química.
51
Figura 13. Fraccionamiento extracto purificado de epicarpio.
(a) (b) (c)
a. Fracción 1(F1E) b. Fracción 2(F2E) c. Fracción 3 (F3E)
Finalmente para cada fracción se rotaevaporó el disolvente y se llevó a sequedad a una

temperatura de 45ºC obteniéndose en total 6 fracciones (figura 14).
Figura 14. Fracciones de semilla y epicarpio de aguacate obtenidas a partir del

fraccionamiento mediante la resina de Sephadex LH-20.
(a) (b) (c)
(d) (e) (f)
Fracciones obtenidas durante el fraccionamiento: (a) F1S (b) F2S (c) F3S
(d) F1E (e) F2E (f) F3E.

52
Una vez obtenidas las fracciones, mediante la metodología descrita anteriormente sección
4.5.1) se determinó el CFT y la TEAC de las diferentes muestras.
3.6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL MÉTODO DPPH
Para determinar la capacidad antioxidante por el método DPPH se preparó una solución
trabajo de DPPH con una concentración de 0,063 mM, a partir de ésta se prepararon
soluciones de concentración 0,0025, 0,005, 0,0075, 0, 01, 0,02, 0,03, 0,04 y 0,05 mM de
DPPH, con estos datos se construyó una curva de calibración Absorbancia (515 nm) Vs
concentración de DPPH. Para la evaluación de la capacidad antioxidante de cada uno de
los extractos se midieron 1950 μL de solución de DPPH 0,063 mM y posteriormente se
registró el valor de la absorbancia a 515 nm, luego se adicionaron 50 μL de cada uno de
los extractos a analizar en un rango de concentración de 70–200 g/L de antioxidante y
finalmente se leyó la absorbancia a los 60 minutos de reacción. Posteriormente se graficó
el % de DPPH remanente en cada muestra y la concentración de antioxidante empleada.
Mediante interpolación de los datos obtenidos para cada extracto de semilla y epicarpio
en la curva de calibración anteriormente descrita, se calculó el parámetro FRS50, valor que
mide la concentración de antioxidante necesaria para disminuir en un 50% la
concentración del radical DPPH. Los datos se expresaron como g de antioxidante por
cada kg de DPPH. Bajo la misma metodología se verificó la funcionalidad del método
empleando ácido gálico como patrón de referencia112.
3.7 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES.
Para el análisis de flavonoides totales se utilizó la metodología publicada por Peñarrieta et

al113.Se mezclaron 200 μL de los extractos diluidos con 800 μL de agua ultrapura y
posteriormente se adicionaron 60 μL de una solución de NaNO2 5% y se agitó. Después
de 5 min, se adicionaron 60 μL de una solución de AlCl3.6H2O al 20% seguido de 400 μL
de NaOH 1 M. Transcurridos 5 minutos se midió la absorbancia a 415 nm usando un
espectrofotómetro. El contenido de flavonoides totales se calculó mediante interpolación a
partir de una curva estándar de catequina construida con soluciones de concentración 10,
30, 60, 100, 150 y 200 ppm. Los resultados se expresaron como mg de catequina /g de
extracto seco114.
112
SÁNCHEZ-MORENO J., y FULGENCIO, S. A procedure to measure the antiradical efficiency of
polyphenols. En: Journal of the Science of Food and Agriculture, 1998.vol. 76,no.2, p. 270-276.
113
PEÑARRIETA,et al. Op. Cit., p.91
114
ORTIZ-MORENO, Alicia . Phenolics, betacyanins and antioxidant activity in Opuntia joconostle
fruits. En: Food Research International, 2011,vol.44,no.7,p. 2160–2168
53
3.8 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC –ANALÍTICA Y HPLC-MS
Los extractos purificados y fracciones de semilla y epicarpio fueron analizados por

cromatografía líquida de alta eficiencia en modo analítico HPLC con detector de arreglo
de fotodiodos. El equipo HPLC utilizado para los análisis fue un Waters 1525 consistente
de una bomba HPLC binaria y un detector de arreglo de fotodiodos Waters 2998. Se
empleó una columna analítica C18 de dimensiones 150mm x 4, 6mm x 3 µm.
La separación se llevó a cabo de acuerdo al sistema empleado por Kosiǹska et al115

utilizando como fases móviles para la elución las siguientes: Fase A: agua/ácido acético
(98:2, v/v) y fase B: agua/acetonitrilo/ácido acético (78:10:2, v/v). Las muestras se
disolvieron en 1mL de fase móvil B y posteriormente se filtraron en un papel con diámetro
de poro de 0,45μm. El análisis se llevó a cabo en modo gradiente como se muestra a
continuación: 0-15min 100% A; 15-20 min 20%A; 20-30min 0%A, 30 min 100%A. La
velocidad de flujo fue de 1 μL/min y el volumen inyectado fue de 20 mL.
3.8.1 Análisis de compuestos fenólicos por HPLC-MS
El análisis por espectrometría de masas se realizó en un equipo UHPLC Dionex Ultimate

3000 RS acoplado a un espectrómetro de masas híbrido cuadrupolo-orbitrap QExactive
con fuente HESI en modo negativo. El cromatógrafo estaba equipado con una columna
Xbridge BEH C18 (100 mm x 2.1 mm, 2.5 μm). Para el análisis: la fase móvil A consistió de
H2O al 0,1% en ácido trifluoroacético y la fase móvil B fue metanol al 0,1% en ácido
trifluoroacético.
El análisis se llevó a cabo en modo gradiente como se muestra a continuación: 5% B (1

min), 100% B (2 min), 5%B (3 min), 5-100% B (10 min). La velocidad de flujo fue de 0,5
mL /min. La temperatura de la columna fue de 40 °C.
115
54
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
4.1 CLASIFICACIÓN DEL FRUTO.
A partir de una revisión de las características morfológicas de la muestra y una

comparación con los ejemplares presentes en el Herbario de Investigaciones- Herbario
PSO- y el Herbario de la Universidad Nacional , el ejemplar recolectado en el municipio de
Sandoná fue clasificado taxonómicamente como especie Persea americana Mill,
perteneciente a la famila Lauraceae, con número de Voucher 576780. En la muestra
recolectada se determinó que en la fruta el % de semilla es de aproximadamente el 15,5%
y el % de epicarpio es del 9,3%.
4.2 AISLAMIENTO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS Y DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE (TEAC) Y EL CONTENIDO FENOLICO TOTAL (CFT)
Los porcentajes de extracción del proceso de maceración con metanol 80% (extractos
crudos) fueron de 1,08% para el epicarpio (ECE) y de 4,57% para la semilla (ECS). Los
extractos aislados con acetona (70%) fueron superiores a los encontrados con metanol,
3,28% para el epicarpio y de 5,53% para la semilla.
Una vez obtenidos los extractos ECE y ECS usando los dos tipos de solventes (metanol y
acetona) y con el propósito de valorar la eficiencia de extracción tomando como factor de
respuesta la actividad antioxidante (TEAC) se procedió a determinar esta propiedad en
los diferentes extractos. Para los extractos igualmente se determinó el contenido fenólico
total (CFT).
4.2.1 Determinación de la actividad antioxidante.
Para medir la actividad antioxidante mediante el método TEAC de las diferentes muestras
se construyó una recta de calibrado empleando Trolox como patrón de referencia. En la
tabla 3 se registran estos resultados. La ecuación de regresión hallada mediante el
método de los mínimos cuadrados fue A = 0,944111-0,285867* [C] (r=0,99608), donde A
es la absorbancia medida a 734 nm y C es la concentración del trolox en mmol /L. Todos
los análisis se realizaron por triplicado, la representación gráfica de la recta se muestra en
la figura 15.
55
Tabla 3. Datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado para la
determinación de la actividad antioxidante (TEAC).
Concentración de trolox (mM) Absorbancia ± desviación estándar

0,5 0,781±0,006
1 0,692±0,018
1,5 0,507±0,037
2 0,370±0,019
2,5 0,227±0,017
Figura 15. Recta de calibrado para determinar la capacidad antioxidante equivalente al

trolox(TEAC).
Gráfica del Modelo Ajustado
Absorbancia promedio = 0,944111 - 0,285867*Concentración mM Trolox
0,82
Absorbancia (uA) 734 nm
0,72
0,62
0,52
0,42
0,32
0,22
0 0,5 1 1,5 2 2,5
Concentración Trolox (mM)
Fuente: Esta investigación
La funcionalidad del método se comprobó determinando el valor TEAC de un estándar

conocido (ácido ascórbico). Para el patrón se encontró un valor de 0,945 mmol
Trolox/mmol de compuesto que está en concordancia con el publicado en la literatura
científica, Re y colaboradores116 reportan un valor TEAC para este antioxidante de 1,05
mmol Trolox/mmol de compuesto. En la tabla 4 se presentan los valores TEAC (promedio
de tres réplicas) para ECE y ECS aislados utilizando los dos tipos de solventes.
116
RE, R, et al. Antioxidant Activity Applying an Improved ABTS Radical Cation Decolorization
Assay. En: Free Radical Biology and Medicine,1999. vol. 26, no.9. p. 1231-1237.
56
Tabla 4. Contenido de fenoles totales (CFT) y capacidad antioxidante (TEAC) en
extractos crudos de semilla y epicarpio (Persea americana).
Muestra CFT a mg EAG/g TEAC a mmol trolox

extracto crudo / g extracto
Crudo
ECE-metanol 495 ±42 5,4± 1,5
ECE-acetona 528±42 5,8 ± 1,5
ECS–metanol 205± 45 2,6± 1,8
ECS–acetona 329 ± 44 3,2 ± 1,7

a
Media calculada a partir de tres experimentos
4.2.2 Determinación del contenido fenólico total (CFT).
Para cuantificar los fenoles extraídos con cada tipo de solvente se implementó el método
de Folin-Ciocalteu que utiliza como patrón de referencia el ácido gálico. En la tabla 5 se
presentan los datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado. Mediante el
método de los mínimos cuadrados se obtuvo la ecuación de correlación: A = -
0,022933+0,00543445* [C] (r=0,999614), donde A es la absorbancia medida a 765 nm y
C la concentración de ácido gálico en mg /L. Todos los análisis se realizaron por
triplicado, la representación gráfica de la recta de calibrado se muestra en la figura 16.
Tabla 5. Datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado para la

determinación del CFT.
Concentración de ácido gálico (mg/L) Absorbancia ± desviación estándar

10 0,019±0,003
30 0,127±0,003
60 0,283±0,005
100 0,498±0,003
150 0,725±0,011
180 0,879±0,005
57
Figura 16. Recta de calibrado para determinar el CFT.

Absorbancia = -0,0229033 + 0,00503475*Concentración de fenoles totales
1

0,8
0,6
0,4
0,2
0
0 30 60 90 120 150 180
Concentración ácido gálico ( mg/L)
En la tabla 4 se presentan el CFT (promedio de tres réplicas) para ECE y ECS aislados
utilizando los dos tipos de solventes.
4.3 Estudio de la variación de la actividad antioxidante bajo las diferentes

Se realizó un análisis de varianza (ANOVA) que descompone la variabilidad de los valores

TEAC bajo las diferentes condiciones experimentales (parte del fruto y tipo de solvente).
La tabla 6 muestra que el valor p<0.05 para las condiciones parte del fruto y solvente
evidencia un efecto estadísticamente significativo de éstos sobre los valores TEAC
obtenidos.
Tabla 6. Análisis de Varianza para valores TEAC.
Fuente Suma de Gl Cuadrado Razón- Valor-P

Cuadrados Medio F
EFECTOS
PRINCIPALES
A:CONDICIÓN 21,2302 3 7,07674 27,13 0,0003
RESIDUOS 1,82624 7 0,260892
TOTAL 23,0565 10
(CORREGIDO)
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
En la tabla 7 se muestra la media de los valores TEAC para cada condición y los errores
estándar de cada media, los cuales son una medida de la variabilidad debida a las
réplicas. Las condiciones acetona-epicarpio y acetona-semilla obtuvieron los valores
medios más altos de actividad antioxidante TEAC. Las dos columnas de la derecha
muestran los intervalos de confianza al 95% para cada una de las medidas.
58
Tabla 7. Medias por Mínimos Cuadrados para TEAC con intervalos de confianza del
95,0%
Error Límite Límite

Nivel Casos Media Est. Inferior Superior
MEDIA GLOBAL 11 4,18979
CONDICION
Acetona – Epicarpio 3 5,71138 0,294897 5,01406 6,40871
Acetona – Semilla 3 3,12161 0,294897 2,42429 3,81893
Metanol – Epicarpio 2 5,38364 0,361173 4,5296 6,23768
Metanol – Semilla 3 2,54253 0,294897 1,8452 3,23985
Para determinar cuáles medias son significativamente diferentes de otras, se aplicó un

procedimiento de comparación múltiple. En la tabla 8 se identifican dos grupos
homogéneos que muestran la no existencia de diferencias estadísticamente significativas
entre la actividad antioxidante TEAC de los compuestos fenólicos aislados de la semilla
utilizando los dos tipos de solventes (acetona y metanol). Este mismo comportamiento se
presenta para el caso de los extractos aislados del epicarpio. El método que se empleó
para discriminar entre las medias es el procedimiento de diferencia mínima significativa
(LSD) de Fisher.
Tabla 8. Discriminación entre medias mediante LSD.
CONDICION Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos

Metanol : Semilla 3 2,54253 0,294897 X
Acetona : Semilla 3 3,12161 0,294897 X
Metanol : Epicarpio 2 5,38364 0,361173 X
Acetona : Epicarpio 3 5,71138 0,294897 X
Además, mediante la prueba de múltiples rangos, que aplica un procedimiento de

comparación para mostrar las diferencias estimadas entre cada par de medias, se pudo
establecer que existen diferencias estadísticamente significativas a un nivel de confianza
del 95% cuando se comparan los valores TEAC de los extractos de semilla y epicarpio
(ECS y ECE). En la tabla 9 se puede observar que independientemente del solvente
existen diferencias en los valores TEAC para cualquier combinación epicarpio-semilla.
Tabla 9. Pruebas de Múltiple Rangos para los valores TEAC en cada condición.
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

Acetona : epicarpio - Acetona : semilla * 2,58978 0,986161
Acetona : epicarpio - Metanol : epicarpio 0,327744 1,10256
Acetona : epicarpio - Metanol : semilla * 3,16886 0,986161
Acetona : semilla - Metanol : epicarpio * -2,26203 1,10256
Acetona : semilla - Metanol : semilla 0,579081 0,986161
Metanol : epicarpio - Metanol : semilla * 2,84111 1,10256
* indica una diferencia significativa.
59
En la tabla 10 se muestra el análisis de varianza para cada condición establecida de
manera individual. Se obtuvo que la parte del fruto es el factor principal que influye sobre
la variable respuesta mencionada, al registrar un valor p< 0,05. Teniendo en cuenta que
los valores-P prueban la significancia estadística de cada uno de los factores, el resultado
muestra que el factor parte del fruto tiene un efecto estadísticamente significativo sobre la
actividad antioxidante con un 95,0% de confianza. La suma de cuadrados tipo III
determina la contribución de cada factor eliminando los efectos de los demás factores.
Tabla 10. Análisis de varianza para actividad antioxidante-Suma de cuadrados tipo III.
Fuente Suma de Gl Cuadrado Razón- Valor-P

Cuadrados Medio F
EFECTOS PRINCIPALES
A:Parte del fruto 19,6631 1 19,6631 75,37 0,0001
B:Solvente 0,54822 1 0,54822 2,10 0,1904
INTERACCIONES
AB 0,0421136 1 0,0421136 0,16 0,6998
RESIDUOS 1,82624 7 0,260892
TOTAL (CORREGIDO) 23,0565 10
Todas las razones-F se basan en el cuadrado medio del error residual
4.3.1 Estudio de la variación del contenido fenólico total (CFT) bajo las diferentes
Siguiendo el mismo procedimiento mostrado anteriormente, el análisis de varianza

(ANOVA) para el contenido fenólico total en las diferentes condiciones experimentales
mostró un comportamiento similar, es decir, existe un efecto estadísticamente significativo
de los factores sobre los valores del CFT. En la tabla 11 se muestra para este caso solo la
prueba de múltiples rangos, se puede establecer que existen diferencias estadísticamente
significativas (nivel de confianza 95%) cuando se comparan los valores del CFT de los
extractos de semilla y epicarpio (ECS y ECE). Se puede observar que
independientemente del solvente existen diferencias en los valores del CFT para la
mayoría de combinaciones epicarpio-semilla, sin embargo en este caso, cuando se usa
metanol como solvente del epicarpio y acetona como solvente de la semilla
(Metanol:epicarpio - Acetona:semilla) no se observan diferencias significativas, esto
probablemente se debe a que el reactivo Folin-Ciocalteu no posee una selectividad
específica para compuestos fenólicos, reacciona también con sustancias que puedan ser
fácilmente oxidadas por los aniones de tungsteno-heteropolifosfomolibdato (coloración
amarilla) que adquieren una coloración azul después de la reducción117.
117
WU, Li-chen, et al. Antioxidant and antiproliferative activities of red pitaya. En: Food Chemistry,
2006. vol. 95,no.2, p. 319–327
60
Tabla 11. Prueba de Múltiples Rangos para concentración de fenoles totales por
condición.
Condición Sig. Diferencia +/- Límites

Acetona Epicarpio- Metanol Epicarpio 108,211 178,06
Epicarpio-acetona - Semilla-acetona * 274,683 159,262
Epicarpio-acetona - Semilla-metanol * 398,71 159,262
Epicarpio-metanol - Semilla-acetona 166,472 178,06
Epicarpio-metanol - Semilla-metanol * 290,499 178,06
Semilla-acetona - Semilla-metanol 124,027 159,262
Estos resultados permiten establecer que el tipo de solvente (acetona ó metanol) no

influye significativamente en la cantidad de fenoles (CFT) extraídos de la semilla y
epicarpio del fruto de aguacate, ni en la capacidad antioxidante TEAC de los extractos
aislados con estos dos solventes, además, el extracto crudo aislado del epicarpio (ECE)
tiene mayor contenido fenólico y actividad antioxidante (TEAC) que el extracto crudo de la
semilla (ECS).
4.4 PURIFICACIÓN Y FRACCIONAMIENTO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS (ECE Y

ECS).
Luego del proceso de maceración con acetona los ECE y ECS se purificaron mediante
retención selectiva de los compuestos fenólicos sobre Amberlita XAD-7, en este proceso
se aislaron 1,049 g de extracto purificado de la semilla (EPS) y 1,3094 g de extracto
purificado del epicarpio (EPE) que corresponden al 52,45% y 65,47% respectivamente.
Estos resultados están en concordancia con lo discutido anteriormente, es decir, el
extracto purificado de epicarpio contiene una mayor cantidad de compuestos fenólicos.
Posteriormente los EPS y EPE se fraccionaron mediante cromatografía de exclusión por

tamaño, utilizando Sephadex LH-20 como fase estacionaria. A continuación se indica el
número de fracciones recolectadas y su respectivo porcentaje de recuperación durante el
proceso. Para el epicarpio se recolectaron tres fracciones nombradas como F1E (6,36%),
F2E (21,46%) F3E (62,8%). En la semilla se aislaron F1S (12%), F2S (19,88%) y F3S
(62,68%). Los altos porcentajes de recuperación de F3E y F3S (fracciones más pesadas)
muestran que este tipo de compuestos son los que están en mayor proporción.
En el siguiente apartado se indica los resultados obtenidos para las metodologías CFT,
TEAC, DPPH y FT desarrolladas en las diferentes muestras de semilla y epicarpio, los
datos se muestran en la tabla 12.
61
Tabla 12. Contenido de fenoles totales, flavonoides totales, TEAC y DPPH para extractos
de semilla, epicarpio y sus fracciones aisladas de aguacate (Persea americana).
Muestra CFT (mg EAG/g TEAC (mmol EC50 g FT (mg

Semilla extracto seco) Trolox / g antioxidante/ catequina / g
extracto seco) kg DPPH extracto seco)
ECS 329±43 3,2 ±1,7
EPS 1303±128 18±6,4 90±45 595±114
F1S 588±136 7,6±7,5 191±91 190±124
F2S 957±131 13±6,9 104±49 530±114
F3S 752±133 12 ±7,1 86±62 529±114
Muestra CFT (mg EAG/g TEAC (mmol EC50 g FT (mg

Epicarpio extracto seco) Trolox / g antioxidante/ catequina / g
extracto seco) kg DPPH extracto seco)
ECE 528±42 5,7 ± 1,5
EPE 1058±130 12± 6,9 83±42 670±114
F1E 364±139 4,8± 7,8 374±155 150±127
F2E 1051±130 14 ± 6,8 85±29 712± 115
F3E 964±131 12± 6,9 80±63 561± 114
4.5 CONTENIDO FENÓLICO TOTAL DE FRACCIONES Y EXTRACTOS PURIFICADOS.
Los extractos crudos de semilla y epicarpio (ECS y ECE) muestran valores relativamente
bajos en el CFT con respecto a los extractos purificados (EPS y EPE), lo que evidencia
una buena eficiencia del proceso de purificación, incrementando aproximadamente cuatro
veces la concentración de los fenoles en el EPS (1303 mg EAG /g extracto) y dos veces
en el EPE (1058,036 mg EAG /g extracto). La tabla 12 resume los resultados obtenidos
para el contenido fenólico (CFT) de los extractos crudos, purificados y las fracciones
aisladas de semilla y epicarpio de aguacate.
El análisis de los datos mediante el procedimiento de diferencia mínima significativa (LSD)

de Fisher muestra que para la mayoría de las muestras el CFT es estadísticamente
diferentes (p<0.05). La única pareja de datos en el que el CFT no es estadísticamente
diferente es para la fracción dos del epicarpio (F2E) y el extracto purificado del epicarpio
(EPE) (Tabla 13). Estos resultados se evidencian en la gráfica de medias para los valores
de CFT obtenidos en las diferentes muestras (Ver Anexo C). La interpolación de cada una
de las medias con sus respectivos intervalos de incertidumbre indica que no existen
diferencias significativas entre las medias correspondientes.
62
Tabla 13. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de CFT.
Fracciones Casos Media LS Sigma LS Grupos Homogéneos
F1E 3 366,267 20,4438 X

F1S 3 510,049 20,4438 X
F3S 3 674,938 20,4438 X
F2S 3 881,16 20,4438 X
F3E 3 970,267 20,4438 X
F2E 3 1058,27 20,4438 X
EPE 3 1065,38 20,4438 X
EPS 3 1229,6 20,4438 X
En la Tabla 14 se muestra la prueba de múltiples rangos en donde se pudo establecer

que existen diferencias estadísticamente significativas (nivel de confianza 95%) cuando se
comparan los valores del CFT de todas las muestras (extractos purificados y fracciones).
Se puede observar que existen diferencias en los valores del CFT para la mayoría de
parejas de muestras. El mayor CFT lo presentaron las fracciones intermedias de la semilla
y epicarpio (F2E y F2S) y las fracciones más pesadas (F3E y F3S) aisladas de la semilla y
epicarpio (Tabla 14).
Tabla 14. Pruebas de múltiples rangos para los valores CFT por Fracciones y extractos
purificados.
Contraste Sig. Diferencia +/- Límites

EPE – EPS * -164,227 61,2907
EPE - F1E * 699,111 61,2907
EPE - F1S * 555,329 61,2907
EPE - F2E 7,11111 61,2907
EPE - F2S * 184,218 61,2907
EPE - F3E * 95,1111 61,2907
EPE - F3S * 390,44 61,2907
EPS - F1E * 863,338 61,2907
EPS - F1S * 719,556 61,2907
EPS - F2E * 171,338 61,2907
EPS - F2S * 348,444 61,2907
EPS - F3E * 259,338 61,2907
EPS - F3S * 554,667 61,2907
F1E - F1S * -143,782 61,2907
F1E - F2E * -692,0 61,2907
F1E - F2S * -514,893 61,2907
F1E - F3E * -604,0 61,2907
F1E - F3S * -308,671 61,2907
F1S - F2E * -548,218 61,2907
F1S - F2S * -371,111 61,2907
63
F1S - F3E * -460,218 61,2907
F1S - F3S * -164,889 61,2907
F2E - F2S * 177,107 61,2907
F2E - F3E * 88,0 61,2907
F2E - F3S * 383,329 61,2907
F2S - F3E * -89,1067 61,2907
F2S - F3S * 206,222 61,2907
F3E - F3S * 295,329 61,2907
A continuación se presenta una comparación del contenido fenólico total (CFT) de los
extractos ECS y ECE con datos publicados en la literatura científica para otras variedades
de aguacate. Los datos se expresaron en mg EAG / g de material vegetal (MV). En la
tabla 15 se observa que el CFT no superó al de ninguna de las semillas de las ocho
variedades estudiadas por GU et al118. Sin embargo, al analizar el CFT para el epicarpio
se observa que este superó al de las mismas ocho variedades (Slimcado, Simmonds,
Loretta, Choquette, Boot 7, Boot 8, Tonnage y Hass). El proceso para la obtención de los
extractos que se referencian se menciona en la sección 2.4.
Tabla 15. Comparación del contenido de fenoles totales semilla y epicarpio Persea
americana con el de diferentes cultivos.
Muestras Cultivos Contenido de fenoles totales

(mg EAG/g material vegetal )
ECS Persea americana Mill 18,2±2,4*
ECE Persea americana Mill 17,3±1,4*
Slimcado 19,2±3,3
Simmonds 40,2±1,9
Loretta 31,5±2,2
Semilla Choquette 33,4±1,5
Booth 7 33,4±5,0
Booth 8 35,7±0,8
Tonnage 33,1±0,9
Hass 51,6±1,6
Slimcado 4,6±0,3
Simmonds 7,4±0,2
Epicarpio Loretta 7,6±0,8
Choquette 13,9±1,1
Booth 7 13,2±0,2
Booth 8 8,1±0,6
Tonnage 4,3±0,1
Hass 12,6±0,3
* CFT (mg EAG/g material vegetal)
Fuente: Adaptado de GU, BOSTIC y WANG (2010).
118
GU, BOSTIC y WANG. Op. cit., p. 195-196
64
De otro lado, comparando el contenido fenólico publicado por Estevés et al119 para las
variedades Hass y Fuerte de la especie Persea americana con el obtenido en este estudio
para los extractos crudos de semilla y picarpio (tabla 16), se observa que el contenido
fenólico total de ECS y ECE en mg EAG /100g muestra fresca están muy por debajo del
obtenido en las variedades Hass y Fuerte al utilizar acetona al 70% como disolvente de
extracción con excepción del extracto de semilla obtenida con acetato de etilo en el cual
en extracto ECS superó el valor respectivo del contenido fenólico total.
Tabla 16. Comparación del contenido de fenoles totales para semilla y epicarpio Persea
americana con el de variedades Hass y Fuerte.
mg EAG /100g muestra fresca

Disolvente para Persea americana Hass Fuerte
la extracción Mill
ECS Acetona 70% 1820*±241
ECE Acetona 70% 1732*±138
Acetato de etilo 3293±925 4054±1008
Epicarpio Acetona (70%) 8997±3103 17218±1446
Metanol (70%) 7841±2447 13770±2557
Acetato de etilo 1699±408 2029±715
Semilla Acetona (70%) 6082±863 6912±1699
Metanol (70%) 3511±988 4164±1048
* CFT mg ácido gálico/100g material vegetal.
Fuente: Adaptado de ESTÉVES, et al. (2011)
También se comparó el contenido fenólico total de los extractos crudos aislados de

semilla y epicarpio con el reportado en la literatura para otros frutos encontrándose que el
contenido fenólico de los extractos ECS y ECE de Persea americana supera el de frutos
como el banano120 (1010±198 mg EAG/100 g peso fresco), la mora121 (851±4,8 mg
EAG/100 g peso fresco), la fresa122 (622 ± 16 mg EAG/100 g peso fresco) y la guava123
(462± 128 mg EAG/100 g peso fresco) en cuyos casos la extracción se llevó a cabo
empleando una mezcla de metanol/agua (50:50, v/v) y posteriormente acetona/agua
(70:30, v/v). Al comparar el contenido fenólico con el epicarpio del fruto Fig124(Ficus carica
L.) (463 mg EAG / 100g de peso fresco) y la del capulí125 (1494±385 mg EAG / 100g de
peso fresco), se observa que el epicarpio del aguacate en estudio mostró un mayor valor
en el contenido fenólico. Finalmente al comparar el contenido fenólico total tanto del
119
ESTÉVES, et al. Op.Cit., p.5629.
120
VASCO, Catalina; RUALES, Jenny y KAMAL-ELDIN, Afaf. Total phenolic compounds and
antioxidant capacities of major fruits from Ecuador. En: Food Chemistry, 2008. vol. 111,no.4,p.
816–823.
121
RIOS DE SOUZA, Vanessa, et al. Determination of the bioactive compounds, antioxidant activity
and chemical composition of Brazilian blackberry, red raspberry,strawberry, blueberry and sweet
cherry fruits. En: Food Chemistry, 2014. vol.156, p.362–368
122
Ibid., p. 366.
123
VASCO, RUALES y KAMAL-ELDIN. Op. cit., p. 820.
124
ZOHAR, Kerem, et al. Antioxidant Activities and Anthocyanin Content of Fresh Fruits of Common
Fig (Ficus carica L.). En: Journal of Agricultural and Food Chemistry,2006.vol.54,no.20,p.7717-7723
125
VASCO, RUALES y KAMAL-ELDIN. Op. cit., p.820
65
epicarpio como de la semilla con el encontrado para una variedad específica de
frambuesa126 (348 mg EAG/100 g de peso fresco) se concluye que los valores no superan
al de Persea americana en estudio.
Cabe resaltar que en los resultados anteriormente citados para frutos diferentes al
aguacate se utilizó la totalidad del fruto mientras que en el presente estudio se empleó
una parte específica del aguacate lo que hace más significativo el resultado al tratarse de
un sub-producto.
4.6 ESTUDIO COMPARATIVO DE LA TEAC DE LOS DIFERENTES EXTRACTOS.
En la tabla 12 se presentan los valores TEAC para los diferentes extractos y fracciones.
Los resultados muestran una mayor actividad antioxidante en ECE que en ECS.
Estadísticamente se comprobó que los valores TEAC de los extractos purificados son
mayores que los extractos crudos, esto evidencia la eficiencia del proceso de purificación
mencionado anteriormente. En la semilla el valor TEAC del EPS se incrementó
aproximadamente cinco veces con respecto al ECS y dos veces para el caso del
epicarpio, siendo el EPS el que tiene, en comparación con EPE, la mayor actividad
antioxidante.
La actividad antioxidante de las fracciones muestra diferencias estadísticamente

significativas entre las muestras (Tabla 17).Igual que para el caso del CFT, las fracciones
intermedias de epicarpio y semilla F2E, F2S, F3S, F3E son las que presentan la mayor
actividad antioxidante, siendo las fracciones F2E y F2S las que presentan los mayores
valores. Las diferencias estadísticas obtenidas entre las diferentes parejas de muestras se
pueden verificar por medio de la prueba de múltiples rangos (Anexo B) y la gráfica de
comparación de medias (Anexo C). La mayor actividad antioxidante (TEAC) de los
extractos EPS Y F2E está relacionada con el mayor CFT de estos extractos, compuestos
con reconocida actividad antioxidante127. La capacidad de estos compuestos de donar
hidrógeno les permite reducir con mayor facilidad este tipo de radicales sintéticos.
Tabla 17. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores TEAC.
Casos Media Grupos Homogéneos
F1E 3 4,75613 X
F1S 3 7,56208 X
F3E 3 11,9304 X
F3S 3 12,0159 X
EPE 3 12,0858 X
126
ÇEKIÇ,. Çetin y ÖZGEN, Mustafa . Comparison of antioxidant capacity and phytochemical
properties of wild and cultivated red raspberries (Rubus idaeus L.). En:Journal of Food Composition
and Analysis, 2010. vol. 23, no.6, p.540–544
127
CAI, Y.; SUN, M. y CORKE, H. Antioxidant activity of betalains from plants of the
Amaranthaceae. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003. vol. 51, no 8, p. 2288-2294.
66
F2S 3 12,5677 XX
F2E 3 13,7103 X
EPS 3 18,3662 X
Comparando los valores TEAC de los extractos purificados y las fracciones de la semilla
con el CFT se observa una relación estadísticamente significativa (p<0.05) entre estas
características y las muestras de semilla y epicarpio (para la semilla r= 0,96945 y para el
epicarpio r= 0,984621). En la figura 17 y tabla 18 se presentan las correlaciones para el
caso de la semilla.
Tabla 18. Análisis de varianza de valores TEAC y CFT en fracciones y extractos

purificados de semilla y epicarpio de aguacate.
Fuente Suma de GL Cuadrado Razón-F Valor-P

Cuadrados Medio
Modelo 55,3722 1 55,3722 31,24 0,0305
Residuo 3,54483 2 1,77242
Total (Corr.) 58,917 3
Figura 17. Correlación entre TEAC y CFT para la semilla.

Y = 0,0902695 + 0,0139489*X r= 0,960945
19
TEAC mM Trolox/ g extracto
17
15
13
11
7
580 780 980 1180 1380
CFT mg ácido gálico/ g extracto
Fuente: Está investigación.
De igual forma el análisis de los valores TEAC y DPPH evidenció para el caso del
epicarpio (r= -0,99) igualmente correlaciones entre estas características (Anexo D), sin
embargo para las muestras de la semilla no se obtuvo la correlación esperada.
Finalmente al comparar las variables FT y TEAC para el caso del epicarpio se observa
una relación estadísticamente significativa entre estas características (p<0.05, nivel de
confianza al 95%). El coeficiente de correlación obtenido (cercano a uno) indica una
relación fuerte entre las variables de estudio. En la semilla no se presentó tal correlación.
En la tabla 19 se muestran las correlaciones realizadas para las diferentes metodologías
empleadas.
67
Tabla 19. Correlaciones para las diferentes características medidas en extractos de
semilla y epicarpio.
Correlación Muestra Coeficiente de

correlación (r)
CFT/TEAC Semilla 0,96945
Epicarpio 0,984621
CFT/FT Semilla ----
Epicarpio 0,990898
CFT/DPPH Semilla -0,65
Epicarpio -0,99
TEAC/ DPPH Semilla ----
Epicarpio -0,976988
FT/TEAC Semilla ----
Epicarpio 0,987465
FT/DPPH Semilla -0,981704
Epicarpio -0,965498
Al analizar la tendencia de la actividad antioxidante TEAC de los extractos crudos de

semilla y epicarpio con el reportado por Kosinska et al128 en las variedades Hass y
Shepard (tabla 20), se observa que la actividad antioxidante de los extractos de semilla y
epicarpio en estudio superan al obtenido en la semilla (0,094±0,0047 mmolTrolox/g peso
seco ) y el epicarpio (0,161±0,0024 mmolTrolox/g peso seco) para la variedad Hass y para
el epicarpio (0,112±0,0034 mmolTrolox/g peso seco) y semilla (0,112±0,0034
mmolTrolox/g peso seco) de la variedad Shepard.
Tabla 20. Comparación de la actividad antioxidante (TEAC) en semilla y epicarpio de

aguacate con las variedades Hass y Shepard.
Variedad TEAC(mmol Trolox/g

peso seco)
ECS Persea americana Mill 0,177*±0,095
ECE Persea americana Mill 0,187*±0,050
Epicarpio Hass 0,161±0,0024
Epicarpio Shepard 0,112±0,0034
Semilla Hass 0,094±0,0007
Semilla Shepard 0,091±0,0047
* mmol Trolox/ g material vegetal en base húmeda
Fuente: Adaptado de KOSIǸSKA,et al.(2012).
Sin embargo, al comparar los resultados de actividad antioxidante TEAC de los extractos
ECS y ECE con los obtenidos por Estevéz et al129 (tabla 21), se observa que la actividad
antioxidante equivalente a TROLOX de las variedades Hass y Fuerte empleando los tres
disolventes de extracción supera al obtenido en los extractos de estudio.
128
KOSIǸSKA, et al. Op. cit.,p.4615
129
ESTÉVES, et al. Op.cit., p. 5630
68
Tabla 21. Actividad antioxidante (TEAC) en semilla y epicarpio aguacate variedades Hass
y Fuerte.
TEAC(mmol Trolox/g
muestra fresca)
Hass Fuerte
Acetato de etilo 16,12±6.98 34,82±12,61
Epicarpio Acetona 103,75±44,49 242,26±28,31
Metanol 74,06±23,17 185,87±26,91
Acetato de etilo 21,57±7,51 38,15±12,78

Semilla Acetona 158,29±26,27 194,80±44,69
Metanol 78,93±26,73 121,61±31,87
Fuente: Adaptado de ESTEVÉZ, et al. (2011)
Para finalizar se evaluó la actividad antioxidante TEAC obtenida con el de otros frutos
encontrados en la literatura. Los resultados obtenidos indican que la actividad antioxidante
de los extractos de semilla (176,55 μmol Trolox/ g material vegetal) y epicarpio (186,8
μmol Trolox/ g material vegetal) superan el de frutos como la granada130 (40,61 ± 0,11
μmol Trolox/ g fruto fresco), frambuesas131(21,5 μmol Trolox/g peso fresco) y moras132
variedad Jumbo (146,89±4,59 μmol Trolox/g peso fresco).
Algunas verduras como el repollo rojo (2,53±0,49 mmol Trolox Equivalente/ 100 g peso
fresco) y la zanahoria morada (3,83±0,07 mmol Trolox equivalente/ 100 g peso fresco)
mostraron actividades antioxidantes menores133 que las de los extractos de semilla (117,7
mmol Trolox/ 100 g material vegetal) y epicarpio (186,8 mmol Trolox/ 100 g material
vegetal) de Persea americana en estudio.
4.7 Actividad antioxidante (Método DPPH)
Igualmente esta característica se evaluó mediante el método DPPH. Para ello se procedió
a construir una curva de calibración que relacionara concentración de DPPH Vs
Absorbancia. Los datos obtenidos para la construcción de la curva de calibración se
muestran en el anexo A. La ecuación de correlación encontrada fue y= 12,2848-
0,00162375 (r=0,998525) donde y es la absorbancia medida a 515 nm y x es la
concentración de DPPH en mmol /L. La representación gráfica de la curva de calibrado se
muestra en la figura 18.
130
HUA-BIN, LiA, et al. Antioxidant capacities and total phenolic contents of 62 fruits. En : Food
Chemistry, 2011. vol. 129, no.2,p.345 –350
131
ÇEKIÇ y ÖZGEN. Op. cit., p. 542
132
SARIBURUN, Esra, et al. Phenolic Content and Antioxidant Activity of Raspberry and Blackberry
Cultivars. En :Journal of Food Science, 2010. vol. 75, no.4, p. 328-335
133
KUCHARSKA , Alicja, et al. Characterization of phenolic compounds and antioxidant and anti-
inflammatory properties of red cabbage and purple carrot extracts. En: Journal of Functional Foods,
2016, vol. 21,p. 33–146
69
Figura 18. Curva de calibración para determinación de la actividad antioxidante por el
método DPPH.

Absorbancia promedio = -0,00162375 + 12,2848*Concentración DPPH mM
0,6
Absorbancia (uA) 515nm
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
Concentración DPPH (mM)
Inicialmente se estudió el método con un patrón de ácido gálico, antioxidante catalogado

con una eficiencia anti-radical intermedia134. En el anexo A se indica las concentraciones
utilizadas de ácido gálico para la construcción de la recta de calibrado y el respectivo %
de DPPH remanente.
Figura 19. Comportamiento del radical DPPH frente a diferentes concentraciones de

ácido gálico.
120
% DPPH remanente
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Tiempo (minutos)
0,029 g/L 0,039 g/L 0,048 g/lL 0,058 g/L 0,068 g/L
En la figura 19 se observa que al incrementar la concentración de antioxidante, el % de

DPPH remanente en la solución disminuye y posteriormente se estabiliza al completar un
tiempo de reacción de 35 minutos. A partir de estos resultados se graficó el % de DPPH
134
SÁNCHEZ-MORENO, LARRAURI y SAURA-CALIXTO. Op. cit., p.270-276.
70
remanente Vs la concentración de antioxidante utilizado. Con el propósito de evaluar el
FRS50, parámetro que indica la concentración de antioxidante necesaria para disminuir la
concentración del radical DPPH hasta en un 50%. Este parámetro se expresa en g de
antioxidante / kg de DPPH.
Figura 20. Comportamiento del radical DPPH a diferentes concentraciones de ácido

gálico.
60
y = 126,62e-33,39x
50 r = 0,9452
%DPPH remanente
40
30
20
10
0
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08
Concentración ácido gálico g/L
A partir de la ecuación obtenida de la regresión exponencial (figura 20) se obtuvo un valor

de FRS50 igual a 0,031 g ácido gálico/ kg de DPPH. Al comparar este resultado con el
reportado por Sánchez-Moreno et al135 (0,026 g antioxidante/ g DPPH) se observa una
similitud entre los datos.
Teniendo como base estos resultados se procedió a medir la actividad antioxidante de los
extractos purificados EPS, EPE y fracciones F1S, F1E, F2S, F2E, F3S y F3E de semilla y
epicarpio de aguacate (Anexo E). En las figuras 21 y 22 se indica el comportamiento de
los extractos EPS y EPE frente al radical DPPH. Se observa que el % de DPPH
remanente tanto en EPS como en EPE se estabilizó en un tiempo de 60 minutos. De igual
forma cabe resaltar que a medida que se incrementó la concentración de antioxidante el
% de DPPH remanente disminuyó y se requirió una menor cantidad de tiempo para
obtener el FRS50.
135
SÁNCHEZ-MORENO, LARRAURI y SAURA-CALIXTO. Op. cit., p.270-276.
71
Figura 21. Comportamiento del radical DPPH a diferentes concentraciones de extracto
purificado de semilla (EPS).
%DPPH Remanente 120

100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo(minutos)
0,087 g/L 0,116 g/L 0,136g/L 0,155 g/L 0,174g/L
Figura 22. Comportamiento del radical DPPH a diferentes concentraciones de extracto

purificado de epicarpio.
120
%DPPH remanente
100
80
60
40
20
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo(minutos)
0,068 g/L 0,087 g/L 0,116 g/L 0,136 g/L 0,165 g/L
A partir de las gráficas del %DPPH remanente Vs concentración de antioxidante se

calculó los valores de FRS50 para los extractos purificados y fracciones tanto de semilla
como de epicarpio (Anexo F). Los valores de FRS50 registrados en la tabla 12 indican que
para las fracciones F3S Y F3E se obtuvieron los menores valores de FRS50 (86,25 kg
antioxidante/ kg DPPH y 79,73 kg antioxidante/ kg DPPH) respectivamente.
Estos resultados indican que estas muestras requirieron una menor cantidad de
antioxidante para reducir hasta el 50% la concentración inicial de DPPH. Se destaca que
72
las muestras con mayor FRS50 fueron las fracciones F1S y F1E, esto indica que son las
muestras con menor capacidad antioxidante DPPH, lo que está en concordancia con lo
encontrado por el método TEAC. En general no se encontró diferencias estadísticamente
significativas (nivel de confianza del 95%) en la mayor parte de las muestras excepto para
la fracción F1E (Tabla 22). Estos resultados se evidencian en la prueba de múltiples
rangos (Anexo B) y la gráfica de comparación de medias (Anexo C).
Tabla 22. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de FRS50.

F3E 3 79,7328 X
EPE 3 82,5355 X
F2E 3 84,6592 X
F3S 3 86,2467 X
EPS 3 90,0667 X
F2S 3 104,251 X
F1S 3 191,018 X
F1E 3 373,474 X
Al comparar los valores de DPPH con CFT se obtuvo un coeficientes de correlación

cercano a 1 para el epicarpio, en la semilla no se encontró esta tendencia (Tabla 20). Sin
embargo, la comparación con los valores de FT dieron coeficientes de correlación
cercanos a 1, lo cual indica una relación estadística fuerte entre las variables
mencionadas (p< 0,05, nivel de confianza del 95%). Estos resultados muestran que a
medida que incrementa el CFT y la cantidad de FT se obtienen valores de FRS50 menores
(muestras que poseen mayor actividad antioxidante).
4.8 FLAVONOIDES TOTALES (FT)
En el anexo A se registran los datos para la construcción de la curva de calibración

necesaria para determinar el contenido de flavonoides totales, se empleó catequina como
patrón de referencia. En el proceso se encontró la correlación y= -0,00905278 +
0,00371361 X (r= 0,995738) donde y es la absorbancia medida a 415 nm y X es la
concentración de trolox en mmol /L (figura 23).
73
Figura 23. Curva de calibración para determinación del contenido de flavonoides totales
Promedio de absorbancia = -0,00905278 + 0,00371361*Concentración catequina
0,8

0,6
0,4
0,2
0
0 40 80 120 160 200
Concentración catequina (mg/L)
Al evaluar el contenido de flavonoides totales en los extractos crudos y fracciones de

semilla y epicarpio (Tabla 12), se observa que en la semilla el EPS presenta el mayor
contenido de flavonoides totales (595±114 mg catequina / g extracto) y en epicarpio la
fracción F2E es quien tiene el mayor contenido (712±115 mg catequina / g extracto. En
general se observa diferencias estadísticas en la mayoría de muestras exceptuando F3S,
F3E y F2S (Tabla 23). Las diferencias estadísticas entre los pares de muestras se indican
en la tabla de múltiples rangos (Anexo B) y la gráfica de comparación de medias (Anexo
C).
Tabla 23. Discriminación entre medias mediante LSD para los valores de FT.

F1E 3 150,135 X
F1S 3 190,676 X
F3S 3 531,216 X
F2S 3 531,667 X
F3E 3 563,198 X
EPS 3 596,982 X
EPE 3 672,207 X
F2E 3 714,55 X
Estos resultados están en concordancia con lo analizado anteriormente para CFT y

actividad antioxidante para la semilla, es decir se observa que EPS tiene los mayores
valores de contenido fenólico y actividad antioxidante. Sin embargo al hacer el mismo
análisis para el epicarpio, la fracción F2E aunque no tiene el mayor contenido fenólico
total, mostró los mayores valores tanto para actividad antioxidante como para el contenido
de flavonoides totales. A partir de esta observación se puede inferir en una primera
instancia que compuestos fenólicos específicos de tipo flavonoide presentes en la fracción
F2E de epicarpio son los responsables del alto valor de actividad antioxidante obtenido
aunque el contenido fenólico haya sido bajo en comparación con el de EPE. Hay que
tener en cuenta que la prueba de flavonoides totales es específica para compuestos que
74
poseen grupo o-hidroxilo, de manera que si en el extracto purificado están presentes
flavonoides que no cumplan con este requisito no se tendrá en cuenta para la medición
final de tal propiedad. Cabe resaltar que el extracto EPE contiene compuestos fenólicos
de bajo peso molecular (fracción I) los cuales no aportan en gran medida con la actividad
antioxidante y como resultado se obtiene un valor TEAC menor en comparación con el de
F2E. Reportes en la literatura136 indican que la presencia simultánea de algunos
compuestos fenólicos puede generar una actividad antioxidante menor de la esperada,
como el observado entre el ácido elágico y la catequina. Este hecho se origina debido a la
posible existencia de hidrógenos donadores entre los grupos carbonilos del ácido elágico
y los grupos o-dihidroxi de la catequina.
Al comparar los valores de FT y TEAC en epicarpio (Tabla 20) se evidenció una relación
estadísticamente significativa entre estas pruebas (p< 0,05, nivel de confianza del 95%)
aunque en la semilla no se haya obtenido. El coeficiente de correlación para el modelo
ajustado indica una relación moderadamente fuerte entre las variables de estudio. Este
resultado indica que a medida que incrementa el contenido de flavonoides totales en las
muestras, la actividad antioxidante TEAC incrementa. De manera similar al comparar los
valores de FT con CFT se obtuvo un coeficiente de correlación cercano a uno para el
epicarpio. Esta tendencia no se evidenció en la semilla.
4.9 IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC-ESI-MS EN

SEMILLA Y EPICARPIO
4.9.1 Identificación de compuestos fenólicos por HPLC-ESI-MS en semilla.
El análisis de los compuestos fenólicos se realizó por HPLC-ESI-MS en modo negativo.

Mediante el uso de una mezcla de estándares de compuestos fenólicos fue posible
identificar algunos compuestos del extracto purificado de semilla (EPS) y sus fracciones
F1S, F2S y F3S. Cabe resaltar que la mínima diferencia de los valores m/z obtenidos para
los estándares y los compuestos fenólicos identificados permitió corroborar la presencia
de estos en los diferentes extractos y fracciones. En la figura 24 se presenta el
cromatograma del EPS y en la tabla 24 se registran las masas y los tiempos de retención
(tR) de los diferentes compuestos.
136
MEYER, Anne; HEINONEN, Marinay FRANKEL, Edwin. Antioxidant interactions of catechin,
cyanidin, cafeic acid, quercetin, and ellagic acid on human LDL oxidation. En: Food Chemistry,
1998.vol. 61, no.1-2,p. 71-75.
75
Figura 24. Cromatograma (HPLC-ESI-MS) del extracto purificado de semilla (EPS) y
fracciones F1S, F2S y F3S aisladas de semilla.
RT: 0.00 - 15.00 5

3.56 NL:
100 5.22E9
TIC MS
95
3.48
4 EPS 160921_E
PS_Johann
90 a_flavonoid
es_FS1
85
80
75 8
4.26
70
65 11
60
Relative Abundance
55
50
45
40 2.98 3.00 14
5.53
35 10 6.18
4.86 12 18
30 5.14 7.30
0.47 3 7 16
25
10.70 4.08 6.12
10.30 10.84
20 0.99 1.01 10.20 10.89 13.17 13.25
13 15 17 9.95 11.00
15
2 6 5.65 6.30 6.81
7.47
9.46
9.61 11.20
11.48
13.10
4.34 9.03
7.73 8.52 11.74 12.44
10 1.46 2.82 13.41 13.74
0.43 1.68 14.72
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
RT: 0.00 - 15.01

100
3.40 21 NL:
3.43 8.36E9
TIC MS
95 F1S 161122_F1
S_Johanna
90 _flavonoide
s_FS
85
80
75
70 3.48
65 3.49
25
5.38
60
Relative Abundance
3.52 7
55
2.82 20 3.94
23 26
50 2.81 2.84 6.01
4.73
45 2.90
40
3.97 24 5.42
22 4.99 27
35 2.94 4.01 7.12
5.46
30
1
4.38
5.98
6.08
25 6.14
19 5.96
6.67 7.29
20
0.64 0.88 7.34
0.91 7.63 9.66 9.97 10.16 13.23
15 0.48 7.64 9.16 9.51 10.60
8.33 10.70
10 0.40
10.97
2.57 2.72 11.29 13.32
5 11.55 12.17
1.16 1.45 13.46 13.77
14.74
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
76
RT: 0.00 - 15.00
3.34 NL:
100 8.16E9
95 4
F2S TIC MS
161122_F2
4.14
90
3.42 8 S_Johanna
_flavonoide
3.32 4.12 s_FS
85
4.16
80
4.18
75
3.47
70
4.22
65 3.49
60 3.51
Relative Abundance
55
50 3.55
3.58
45
4.28
40 3.62
4.30
35 5
3.64
30 4.36
3.12
4.39
25 3.07
17
20 3 2.93 4.43
5.51
2.90 4.49 9.79 9.86 9.83
15 1.23 1.25 5.00 5.60
6.16
28 8.54
8.91 9.22 10.32
10.75
13.21
10 0.48 1.36 6.19 7.76 8.02 10.88

11.18
5
0.83 1.53 2.62 2.76 11.51 11.81
12.65 13.39
13.70 14.76
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
RT: 0.00 - 15.00

10.07 13.21 NL:
100 9.86 1.16E9
10.29
32 9.74 TIC MS
95
3.39 33 9.66 F3S 161122_F3
S_Johanna
90 3 3.68
5 9.49
10.33 _flavonoide
3.15 23.70 4.09 10.48 s_FS
85 10.57
80 9.29 9.37 10.60
9.22 10.66
75
8.96 10.73
4.15
70 10.82
8.87
65 8.73
10.85
60 34 8.42
8.22
Relative Abundance
4.87 8.08
55
30 31 7.98 10.94
7.87
50 2.72 3.00 7.72 11.04
4.20
7.45 11.08
45 4.90
11.11
4.24 7.31
40 6.67 7.17 11.18
0.47 4.26
35 4.96 6.49
4.31 6.45 11.32
5.16 13.32
30 6.09 11.35
29 5.24 11.43
11.49
25 2.51
11.63
20 11.80
12.62 13.45
15 13.53
1.25 1.27 1.32 2.39
13.69
1.20 1.97
10 13.88
14.75
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
77
Tabla 24. Compuestos fenólicos identificados por HPLC-MS en EPS y las fracciones F1S,
F2S y F3S.
N° Compuesto tR λmáx Fórmula m/z medido

pico molecular
EPS
1 Ácido quínico 0,51 _ C7H12O6 191,0561
2 Ácido protocatéquico 2,15 _ C7H6O4 153,0194
3 Procianidina dimérica 3,22 _ C30H26O12 577,1348

tipo B1
4 Catequina 3,48 _ C15H14O6 289,0717

tipo B2
6 Ácido cafeico 3,96 _ C9H8O4 179,0349
7 Ácido clorogénico 4,00 C16H18O9 353,0878
(Ácido 5-O-
cafeoilquínico)
8 Epicatequina 4,26 _ C15H14O6 289,0718
9 Vainillina 4,27 _ C8H8O3 151,0396

10 Acido p-cumárico 4,74 _ C9H8O3 163,0402
11 Ácido ferulico1 mayor 5,07 _ C10H10O4 193,0506

12 Ácido sinápico 5,15 _ C11H12O5 223,0611
13 Ácido ferulico2 minor 5,43 _ C10H10O4 193,0506
14 Rutina 5,55 _ C27H30O16 609,146
15 Quercetina-3-O- 5,59 _ C21H20O12 463,0886

Glucósido
16 Phloridzin 5,95 _ C21H24O10 435,1296
17 Quercetina 6,60 _ C15H10O7 301,0354
18 Apigenina 7,25 _ C15H10O5 269,0456
F1S
19 Ácido cítrico 0,67 __ C6H8O7 191,01984
20 Ácido 3-O- 2,85 322,1 C16H1809 353,08795

cafeoilquínico
7 Ácido 5-O- 3,94 324,5 C16H1809 353,08781
cafeoilquínico
21 Ácido 3-O-p- 3,43 311,3 C16H1908 337,09289
coumaroilquínico
78
22 Ácido 4-O- p- 4,36 311,3 C16H1908 337,09289
coumaroilquínico
23 Penstemide 4,73 _ C20H28O11 443,15591
24 No identificado 4,99 _ C19H28O10 415,16116
25 Ácido (1`S, 6`R) -8`- 5,38 263,5 C21H30O10 441,17662

hidroxiabscisico- β-D-
glucosido.
F2S

tipo B1
tipo B2
4 Catequina 3,39 _ C15H14O6 289,07184
16 Phloridzin 5,51 _ C21H24O10 435,1296
28 Kaempferol 7,1 _ C15H10O6 285,04031
F3S

tipo A
31 Procianidina trimérica 3,0 _ C45H38O18 865,19958

tipo B
tipo B1
tipo B
tipo A
tipo B2
tipo B
79
En la figura 25 se muestran algunas de las estructuras de los compuestos identificados.
Figura 25. Algunas estructuras químicas identificadas en la semilla.
(19) (2) (9) (1)
(6) (10) (11)
(12) (17)
(28) (18)
Fuente: Adaptado de Haminiuk, et al. (2012)
80
4.9.1.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1S
La mayoría de los compuestos fenólicos en F1S coinciden con los identificados en el

extracto purificado de la semilla (EPS), sin embargo en F1S no se identificó phloridzin,
apigenina y rutina. Un compuesto adicional identificado en F1S fue ácido cítrico. En la
figura 24 se muestra el cromatograma de la fracción F1S en modo negativo.
Mediante el análisis de los patrones de fragmentación del espectro de masas se

caracterizaron parcialmente diferentes compuestos fenólicos de la semilla de aguacate.
En la semilla se identificaron dos isómeros del ácido cafeoil-quínico (C16H1809) (pico 20),
éste mostró un tR de 2,85 min, ʎmáx 324,5 nm absorción característica del ácido
clorogénico137(Figura 26), un ión pseudomolecular en m/z 353u [M-H]- y un ión fragmento
en m/z 191u [M-H-162]- debido al ácido quínico138. La identificación de este compuesto
también se confirmó por comparación con una mezcla comercial de estándares.
Los espectros de masas de los picos 20 y 7 (Figura 27) tienen en común el pico base en
m/z 191 característico de la unión en 3-OH ó 5-OH139. Para el espectro del pico 20(Figura
28) se observa un fragmento en m/z 179 [ácido cafeico-H]- que es más significativo para
compuestos 3-OH140, también se observa un fragmento en m/z 135 [M-H-CO2]- debido a la
descarboxilación del ácido cafeico141, la cual es típica para ácidos hidroxicinámicos142, así
este compuesto se identificó como 3-O-cafeoilquínico. El pico 7 con tr 3,94 min y ʎmáx de
322,1nm (Figura 26) fue identificado mediante el uso de estándares como 5-O-
cafeoilquínico sumado a que el patrón de fragmentación del 4-cafeoilquínico muestra un
pico base MS/MS a m/z 173143. Estos derivados clorogénicos ya han sido identificados en
epicarpio (variedad Hass y Shepard)144 y pulpa de aguacate (Persea americana variedad
Rugoro145), en la figura 29 se presentan las estructuras de los compuestos identificados.
137
KOLNIAK-OSTEK, Joanna y OSZMIAǸSKI, Jaa. Characterization of phenolic compounds in
different anatomical pear (Pyrus communis L.) parts by ultra-performance liquid chromatography
photodiode detector-quadrupole/time of .flight-mass spectrometry (UPLC-PDA-Q/TOF-MS.En:
International Journal of Mass Spectrometry, 2015. vol.392, p.154 –163
138
KOSIǸSKA,et al. Op. cit.,p.4617.
139
SU, Dan, et al. Comparative pharmacokinetics and tissue distribution study of mono-, and di-
caffeoylquinic acids isomers of Ainsliaea fragrans Champ by a fast UHPLC- MS/MS method.En:
Fitoterapia, 2014. vol. 99, no, p. 139-152.
140 n
GOUVEIA, Sandra y CASTILHO, Paula. Validation of a HPLC-DAD-ESI/MS method for
caffeoylquinic acids separation, quanti .cation and identi .cation in medicinal Helichrysum species
from Macaronesia.En: Food Research International, 2012. vol.45,no.1,p.362-368.
141
PAPETTI, et al. Op. Cit., p. 1065
142
MARTÍNEZ-LAS,Ruth, et al. Polyphenolic profile of persimmon leaves by high resolution mass
spectrometry (LC-ESI-LTQ-Orbitrap-MS. En: Journal of Functional Foods, 2016.vol. 23,p. 370–377
143 n
CLIFFORD, MICHAEL N. et al. Hierarchical Scheme for LC-MS Identification of Chlorogenic
Acids.En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2003.vol.51,p.2900-2911
144 GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p.508
145
CARRASCO-PANCORBO, HURTADO-FERNÁNDEZ y FERNÁNDEZ-GUTIÉRREZ. Op. cit.,
p.2264.
81
Figura 26. Espectros UV-Vis a 280 nm de los compuestos 20 y 7.
12.626 Peak 2 16.217 Peak 5
223.5 324.5 1.20 223.5
1.00
(20) 1.00 (7)

0.80
0.80
0.60
AU
AU
0.60
0.40
0.40 322.1
0.20
0.20
0.00 0.00
250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00 250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00
nm nm
Figura 27. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 20 y 7.

161122_F1S_Johanna_flavonoides_FS #637 RT: 2.85 AV: 1 NL: 1.82E9
T: FTMS - p ESI Full ms [100.0000-1000.0000]
353.08795
C 16 H 17 O 9 = 353.08781
0.41449 ppm
100
95
(20)
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
707.18335
15 C 45 H 27 O 7 N 2 = 707.18237
1.37899 ppm
191.05611
10 C 7 H 11 O 6 = 191.05611
451.05499 641.15125 817.18549 957.26587
-0.02493 ppm C 31 H 29 O 15 = 641.15119
5 C 37 H 7 = 451.05532 C 55 H 29 O 8 = 817.18679 C 58 H 41 O 12 N 2 = 957.26650
205.59323 267.42883 -0.73369 ppm 0.08087 ppm -1.59723 ppm -0.65676 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

353.08795
C 16 H 17 O 9 = 353.08781
100
0.41449 ppm
(7)
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
190.05098
C 10 H 8 O 3 N = 190.05097 707.18304
20
0.06932 ppm C 45 H 27 O 7 N 2 = 707.18237
15 449.10898 0.94745 ppm
262.07202 C 21 H 21 O 11 = 449.10893
10
C 13 H 12 O 5 N = 262.07210 0.09717 ppm
641.15100 803.20447 929.21735
5 -0.28342 ppm C 31 H 29 O 15 = 641.15119 C 50 H 31 O 9 N 2 = 803.20350 C
52 H 37 O 15 N 2 = 929.21994
-0.29992 ppm 1.20025 ppm -2.79302 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
82
onoides_dd1
70
Relative Abundance
60
50
40
30 3.03
3.93
20 3.99
4.04
10
3.15 3.81 4.10
2.65 2.80 3.25 3.36 3.59 4.15 4.27 4.51 4.64 4.76 4.92
0
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6
Figura 28. Espectro MS/MS del compuesto 20. Time (min)
161020_EPS_Johanna_flavonoides_dd1 #1412 RT: 3.03 AV: 1 NL: 2.48E7

F: FTMS - p ESI d Full ms2 353.2156@hcd60.00 [50.0000-380.0000]
135.04533
C 8 H 7 O 2 = 135.04515 191.05635
1.34068 ppm C 7 H 11 O 6 = 191.05611
100 1.25292 ppm
90
80
Relative Abundance
70
179.03523
60 C 9 H 7 O 4 = 179.03498
1.39936 ppm
50
40 85.02966
C 4 H 5 O 2 = 85.02950
30 1.79592 ppm
20 111.04541 155.03560
C 6 H 7 O 2 = 111.04515 C 7 H 7 O 4 = 155.03498
10 2.31749 ppm 3.97809 ppm
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380
m/z
Figura 29. Estructuras químicas de los compuestos 7 y 20.
Ácido 5-O-cafeoilquínico Ácido 3-O- cafeoilquínico
Fuente: SASSAKI,et al. (2011)
Los picos 21 y 22 con tiempos de retención 3,43 y 4,36 min respectivamente se

identificaron como ácido 3-O-p-cumaroilquínico146 y 4-O-p- cumaroilquínico, el espectro de
masas de ambos compuestos muestran un ión pseudomolecular en m/z 337 [M-H]-
(C16H18O8). Para 21 se encontró una λmáx 311,3 nm (Figura 30) y un ión fragmento en m/z
163 [ácido cumárico-H]- 147(Figura 31). En el pico 22 se observó una λmáx 311,3nm (Figura
30), sin embargo la discriminación entre los dos isómeros se basó en el patrón de
fragmentación de 22, el espectro MS/MS muestra un ión fragmento [ácido quínico-H-H20]
en m/z 173 (Figura 32) que es característico del ácido 4-O-p- coumaroilquínico148. Las
estructuras de los compuestos 21 y 22 se muestran en la figura 33. El isómero 21 ya ha
146
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p. 508
147
QIAO ,Yan-jiang, et al. A strategy for comprehensive identi .cation of sequential constituents
using ultra-high-performance liquid chromatography coupled with linear ion trap–Orbitrap mass
spectrometer, application study on chlorogenic acids in Flos Lonicerae Japonicae.En:
Talanta,2016.vol. 147, p.16–27.
148
Ibid., p. 24.
83
sido identificado en semilla de aguacate Persea americana Mill149 variedades Hass y
Shepad150.
Figura 30. Espectro UV–Vis de los compuestos 21 y 22.

19.161 Peak 8
15.035 Peak 4
223.5
223.5
1.20
1.00
(21) 1.00
(22)
0.80
0.80
311.3
AU
0.60
AU
0.60
0.40
0.40
0.20 0.20
311.3
0.00 0.00
250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00 250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00
nm nm
Figura 31. Espectros de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 21 y 22.

337.09296
C 16 H 17 O 8 = 337.09289
0.19530 ppm
100
95
90
(21)
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20 163.03993
C 9 H 7 O 3 = 163.04007
15 -0.82899 ppm
10 683.17871
239.05605 451.12439 C 40 H 29 O 10 N = 683.17969 829.24133
C 11 H 11 O 6 = 239.05611 945.32080
5 C 21 H 23 O 11 = 451.12458 -1.43935 ppm C 49 H 37 O 11 N 2 = 829.24028 C 55 H 49 O 13 N 2 = 945.32401
-0.27524 ppm -0.43235 ppm 1.26609 ppm -3.39767 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

337.09314
C 16 H 17 O 8 = 337.09289
0.73849 ppm
100
95
90
85
80
(22)
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
667.18872
25 C 43 H 27 O 6 N 2 = 667.18746
401.14548
173.04547 C 18 H 25 O 10 = 401.14532 1.88986 ppm
20
C 7 H 9 O 5 = 173.04555 0.39174 ppm
15 -0.43618 ppm
447.15088
C 19 H 27 O 12 = 447.15080
10
0.17778 ppm 739.24622
581.22424 957.24554
C 47 H 35 O 7 N 2 = 739.24497
5 C 28 H 37 O 13 = 581.22396 C 58 H 39 O 13 N = 957.24269
116.92851 1.67897 ppm
0.47977 ppm 2.98363 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
149
GÓMEZ-CARAVACA, et al. Op. cit., p. 508.
150
84
ms2 667.2822@hcd60.00
90 [50.0000-700.0000] MS
161122_F1S_Johanna_flav
80 onoides_DDA
70
Relative Abundance
60
50
40
4.28
30
20
3.63 4.51
10 7.29
7.41
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
161122_F1S_Johanna_flavonoides_DDA #2096 RT: 4.40 AV: 1 NL: 7.62E6

173.04561
C 7 H 9 O 5 = 173.04555
0.35742 ppm
100
90
80
Relative Abundance
70
60 93.03468
C 6 H 5 O = 93.03459
50 0.93995 ppm
40
30 119.05035
C 8 H 7 O = 119.05024
20 0.90856 ppm 337.09332
543.22345
C 16 H 17 O 8 = 337.09289
10 C 29 H 35 O 10 = 543.22357
1.28167 ppm
209.04889 -0.22227 ppm 644.67230
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700
m/z
Fuente: Está investigación
Figura 33. Estructuras químicas de los compuestos 21 y 22.
Ácido 3-O-p- coumaroilquínico Ácido 4-O-p-coumaroilquínico
Fuente: SASSAKI,et al.(2011)
En la semilla también se identificó penstemide (pico 23) en un tiempo de retención de 4,73

min. Este compuesto mostró un ión pseudomolecular [M-H]- en m/z 443u (C20H28O11)
(Figura 34.). Cabe resaltar que la estructura propuesta para penstemide se basa en la
reportada por varios autores151,152,153. En el espectro MS/MS (Figura 35) se observa los
fragmentos en m/z 101 y 113 característicos para este compuesto154,155,156. Penstemide ha
sido identificado previamente en pulpa y epicarpio de aguacate Persea americana Mill157.
151
BAZYLAK, Grzegorz, ROSIAK, Andrzej y SHI, Cheng-Yang. Systematic analysis of glucoiridoids
from Penstemon serrulatus Menz. by high-performance liquid chromatography with pre-column
solid-phase extraction. En: Journal of Chromatography A, 1996. vol.725, p. 177-187.
152
ISOE, Sachihiko. Progress in the Synthesis of Iridoids and Related Natural Products. En:
RAHMAN Atta-ur (Ed.). Studies in Natural Products Chemistry. Oxford: Elseiver Inc.,1995.p. 289-
320
153
SUN, Yong, et al. Rapid characterization of chemical constituents in Radix Tetrastigma, a
functional herbal mixture, before and after metabolism and their antioxidant/antiproliferative
activities. En: Journal of Functional Foods, 2015.vol. 18, p. 300–318
154
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p.508
85
Figura 34. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 23
443.15591
C 20 H 27 O 11 = 443.15588
0.06656 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
161020_EPS_Johanna_flavonoides_dd1 10/20/16 15:14:32 EPS Johanna 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm dd
60
Relative Abundance
RT: 55
1.58 - 6.65
4.77 NL: 8.63E7
100
50
TIC F: FTMS - p ESI d Full
45 ms2 443.1559@hcd60.00
90 [50.0000-470.0000] MS
40 161020_EPS_Johanna_flav
80 onoides_dd1
35
70
30
Relative Abundance
25
60
20
50
15
40
10
239.09244 341.12402 543.08093 895.30579
689.26611
30
5 C 12 H 15 O 5 = 239.09250 C 16 H 21 O 8 = 341.12419 C 28 H 17 O 11 N = 543.08071 C 51 H 47 O 13 N 2 = 895.30836
4.88 C 44 H 37 O 6 N 2 = 689.26571
-0.24721 ppm -0.49071 ppm 0.41266 ppm -2.87776 ppm
0.58493 ppm
0
20
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
10
4.44 4.55 5.00
Fuente:
0 Esta investigación. 5.12
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6
Time (min)
Figura 35. Espectro MS/MS para el compuesto 23.

100
90 101
80
71.01395 113
Relative Abundance
70
C 3 H 3 O 2 = 71.01385
60 1.42891 ppm
119.05028
50
C 8 H 7 O = 119.05024
40 0.33179 ppm
30 281.10339
20 C 14 H 17 O 6 = 281.10306
1.18122 ppm
10
318.89764 460.81723
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
m/z
155
RODRIGUEZ-PEREZ,C.,et al. A metabolite-profiling approach allows the identification of new
compounds from Pistacia lentiscus leaves. En: Journal of Pharmaceutical &Biomedical Analysis,
2013.vol. 77,no ,p.167 .174.
156
DOMINGUEZ, Mariana,et al. Cespedes,Anti-inflammatory activity of Penstemon gentianoides
and Penstemon campanulatus.En: Pharmaceutycal Biology,2011.vol.49,no.2, p.118-124.
157
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p.508
86
Figura 36. Estructura química del compuesto 23.
Fuente: BAZYLAK, ROSIAK y SHI. (1996)
El pico 25 con tr de 5,38 min se identificó parcialmente como el ácido (1`S, 6`R) -8`-
hidroxiabscisico- β-D- glucósido por presentar un ión pseudomolecular [M-H]- a m/z 441u y
λmáx 263 nm (Figura 37), con fórmula molecular C21H30010 (Figura 40). La estructura
propuesta para este compuesto se basa en lo reportado por la literatura158,159.En el
espectro de masas (Figura 39) se observa un fragmento en m/z 330 [M-H]- reportado para
este compuesto e identificado previamente en semilla de aguacate Persea americana
Mill160.
Figura 37. Espectro UV-Vis del compuesto 25

26.487 Peak 10
223.5
1.20
1.00
0.80
AU
0.60
0.40
0.20 263.7
0.00
250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00

nm
158
TODOROKI , Yasushi; HIRAI, Nobuhiro y OHIGASHI, Hajime. Synthesis, biological activity and
metabolism of (S)-(+)-3`-Fluoroabscisic acid. En: Tetrahedron, 1995. vol.51, no. 51, p. 6911-6926.
159
PIOTROWSKA, Alicja y BAJGUZ, Andrzej. Conjugates of abscisic acid, brassinosteroids,
ethylene, gibberellins, and jasmonates. En: Phytochemistry, 2011. vol.72, p. 2097–2112.
160
GÓMEZ-CARAVACA, et al. Op. Cit., p. 508.
87
Figura 38. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 25.
441.17651
C 21 H 29 O 10 = 441.17662
-0.24162 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
161020_EPS_Johanna_flavonoides_dd1 10/20/16 15:14:32 EPS Johanna 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm dd 883.36224
C 60 H 51 O 7 = 883.36403
30 - 6.65
RT: 1.58 -2.01897 ppm
5.42 NL: 5.65E7
100
25 TIC F: FTMS - p ESI d Full
ms2 441.1770@hcd60.00
90 [50.0000-470.0000] MS
20
161020_EPS_Johanna_flav
80 onoides_dd1
15
70
Relative Abundance
10 961.37115
60 371.09824 597.18250
218.03091 808.30377 C 60 H 53 O 10 N 2 = 961.37057
5 C 16 H 19 O 10 = 371.09837 C 27 H 33 O 15 = 597.18249
50 C 7 H 8 O 7 N = 218.03062 C 53 H 44 O 8 = 808.30417 0.60933 ppm
116.92846 1.32764 ppm -0.36078 ppm 0.00289 ppm -0.48812 ppm
0
40
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 5.54 750 800 850 900 950 1000
30 m/z

20
10 5.65
5.37
4.46 5.77 5.89 6.08 6.62
0
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6
Figura 39. Espectro MS/MS para el compuesto 25. Time (min)

71.01395
C 3 H 3 O 2 = 71.01385
1.42891 ppm
100
90
80
89.02464
Relative Abundance
70
C 3 H 5 O 3 = 89.02442
60 2.44837 ppm
50
330.13211
40 119.03509 C 15 H 22 O 8 = 330.13202
C 4 H 7 O 4 = 119.03498 0.28696 ppm
30 0.88693 ppm
20 205.12369 397.18741 441.17746
C 13 H 17 O 2 = 205.12340 C 20 H 29 O 8 = 397.18679 C 21 H 29 O 10 = 441.17662
10 1.55437 ppm
1.38762 ppm 231.94135 306.42087 1.90274 ppm
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
m/z
Figura 40. Estructura química del compuesto 25
Fuente: SUN,et al.(2016)
88
4.9.1.2 Identificación de los compuestos fenólicos en F2S
Mediante la utilización de una mezcla de estándares, en esta fracción igualmente se

identificaron la mayoría de los componentes ya mencionados para el extracto EPS,
exceptuando ácido sinápico y apigenina (Tabla 24). Un componente adicional identificado
en esta fracción fue kaempferol. En la figura 24 se muestra el cromatograma de la
fracción F2S en modo negativo.
Los compuestos detectados e identificados (3,5,4,8,16) por HPLC-ESI-MS se muestran en

la tabla 24. La identidad de los picos 3 y 5 (procianidinas diméricas) con tiempos de
retención de 2,95 y 3,12 min con iones pseudomoleculares a m/z 577u [M-H]-, C30H26O12
(Figura 41) se confirmó mediante el uso de estándares y la presencia de los fragmentos
característicos a m/z 407, 289 y 245u (Figura 42). El fragmento m/z 407 es el producto de
un fraccionamiento tipo retro- Diels Alder (RDA) en el anillo C de la unidad superior, con la
pérdida consecutiva de una molécula de agua161. El ión en m/z 289 (epicatequina162) se
puede atribuir a una escisión de la metil-quinona (MQ) en el enlace interflavano163 con
posterior pérdida de CO2164 que generan el fragmento en m/z 245. Este análisis permite
identificar a estos compuestos como procianidinas dimércias tipo B1 (pico 3) y B2 (pico 5)
(Figura 43).
Este tipo de compuestos ya ha sido identificado en epicarpio de aguacate Persea

americana variedad Hass165. Adicionalmente, las procianidinas (dímeros y oligomeros)
también se han encontrado en semilla y/o epicarpio de aguacate de la variedad Hass,
Fuerte, Slimcado, Simmonds, Loretta, Choquette, Booth 7, Booth 8, Tonnage166,167,168.
161
GANGOPADHYAY, Nirupama,et al.Antioxidant-guided isolation and mass spectrometric
identification of the major polyphenols in barley (Hordeum vulgare) grain. En: Food Chemistry,
2016. vol. 210, p.212–220.
162
KOLNIAK-OSTEKY y OSZMIAǸSKI. Op. cit., p.159
163
Ibid., p.162
164
VERARDO, V., et al. Development of a CE-ESI-microTOF-MS method for a rapid identification
of phenolic compounds in buckwheat. En:Electrophoresis, 2011.vol. 32, no.6-7, p. 669-673.
165
KOSIǸSKA, et al. Op. cit., p. 4617-4617 .
166
ESTÉVES, et al. Op. Cit., p. 5628-5630
167
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p. 510-511
168
GU, BOSTIC y WANG. Op. Cit., p.1195
89
577.13531
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
100
95
0.28692 ppm
3
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
513.12311
15 C 32 H 19 O 6 N = 513.12179
2.57704 ppm
10 425.08792
C 22 H 17 O 9 = 425.08781 675.10229
289.07190 C 51 H 15 O 3 = 675.10267 865.19836
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.27249 ppm C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
-0.55211 ppm
116.92850 194.85834 0.47747 ppm 0.39273 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
T: FTMS - p ESI Full ms [100.0000-1000.0000] m/z
577.13525
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.18116 ppm
100
95
5
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
161122_F2S_Johanna_flavonoides_DDA 11/22/16 21:33:44 F2S Johanna 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm DDA
25
RT: 20
0.00 - 15.00
3.71 NL: 2.86E8
100
15
10 425.08786 ms2 577.1353@hcd60.00
90 3.08 675.10217 [50.0000-605.0000] MS
289.07169 C 22 H 17 O 9 = 425.08781 865.20007
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.12891 ppm C 36 H 21 O 13 N = 675.10184 161122_F2S_Johanna_flav
C 48 H 35 O 15 N = 865.20122
80 116.92847 -0.26152 ppm 0.49625 ppm onoides_DDA
-1.32248 ppm
0
70100 150 200 250 3.18 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
Relative Abundance
3.82 m/z
2.97
60
50

40
3.36
30 3.92
20
10 4.04
2.76 4.48
Figura 42. Espectro MS/MS para los compuestos 3 y 5.

0
0.98 2.31
4.59
5.02 5.45 6.06 6.63 6.90 7.49 7.75 11.97 12.32 12.94
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
161122_F2S_Johanna_flavonoides_DDA #1364 RT: 2.97 AV: 1 NL: 2.15E7

125.02451
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
100
0.76701 ppm
3
90
80 407.07739
289.07230 C 22 H 15 O 8 = 407.07724
Relative Abundance
70
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.37322 ppm
83.01389
60 161.02452 1.84989 ppm
C 4 H 3 O 2 = 83.01385
0.48712 ppm C 9 H 5 O 3 = 161.02442
50
0.64291 ppm
40
245.08223
30 C 14 H 13 O 4 = 245.08193
1.21357 ppm 339.08752
20 C 19 H 15 O 6 = 339.08741
10 0.33314 ppm
391.44202 426.26675
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
90
Relative Abundanc
4.15
60
50 3.32
3.43
40 3.11
30
3.81
20
4.27
3.55
10 3.93 4.98
5.09
4.87 5.21
0
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6
Time (min)

125.02448
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
0.46189 ppm
100
90 5
80
289.07227
Relative Abundance
70
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 407.07767
60 1.74432 ppm C 22 H 15 O 8 = 407.07724
1.04792 ppm
50 83.01389
C 4 H 3 O 2 = 83.01385 161.02472
40 0.48712 ppm C 9 H 5 O 3 = 161.02442 245.08180
30 1.87479 ppm C 14 H 13 O 4 = 245.08193
-0.52971 ppm 339.08902
20 C 19 H 15 O 6 = 339.08741
4.74308 ppm
10
384.83713
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
Figura 43. a. Estructura química para procianidinas diméricas tipo B y b. Posible

mecanismo para la reacción tipo retro Diels-Alder
(a)
PC B1: R1=OH, R2=H, R3=H, R4=OH PC B5: R1=OH, R2=H, R3=OH, R4=H
PC B2: R1=OH, R2=H, R3=OH, R4=H PC B6: R1=H, R2=OH, R3=H, R4=OH
PC B3: R1=H, R2=OH, R3=H, R4=OH PC B7: R1=OH, R2=H, R3=H, R4=OH
PC B4: R1=H, R2=OH, R3=OH, R4=H PC B8: R1=H, R2=OH, R3=OH, R4=H
91
(b)
Fuente: DE FREITAS, et al. (1998)
Los picos 4 y 8 con tiempos de retención 3,39 y 4,16 min respectivamente se

identificaron como catequina y epicatequina por el ión pseudomolecular [M-H]- con m/z
289, C15H14O6 (figura 44). Esto se confirmó mediante el uso de estándares. El ión
fragmento m/z 245 [M-H-44]- en ambos espectros indica una descarboxilación de la
molécula169. La presencia de este fragmento característico170 debido a la ruptura del
enlace interflavano ya ha sido publicada para esta molécula171. Estos isómeros ya se han
encontrado en pulpa de aguacate Persea americana Mill de las variedades Hass172, Lamb
Hass y Rugoro173. La estructura química de los compuestos 4 y 8 se muestran en la figura
45.
169
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p. 510
170
SANDHU, AK y GU, L. Antioxidant capacity, phenolic content, and profiling of phenolic
compounds in the seeds, skin, and pulp of Vitis rotundifolia (Muscadine Grapes) As determined by
HPLC-DAD-ESI-MS(n). En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010.vol.58.no.8,p.4681-
4692 .
171
CALLEMIEN, D. y COLLIN, S. Use of RP-HPLC-ESI (-)-MS/MS to differentiate various
proanthocyanidin isomers in lager beer extracts. En: Journal of the American Society of Brewing
Chemists,2008. vol. 66, p.109–115.
172
KOSIǸSKA, et al. Op. cit.,p.4616.
173
CARRASCO-PANCORBO, HURTADO-FERNÁNDEZ y FERNÁNDEZ-GUTIÉRREZ , et al. Op.
cit., p.2263.
92
Figura 44. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para los compuestos 4 y 8.
289.07184
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
100
0.26633 ppm
4
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
577.13550
15 C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.60419 ppm
10
245.08180
425.08746 723.15851 865.19867
5 C 14 H 13 O 4 = 245.08193 C 22 H 17 O 9 = 425.08781 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
C 38 H 29 O 14 N = 723.15935
-0.52971 ppm -0.80438 ppm 0.74545 ppm
-1.16761 ppm 975.00006
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

289.07187
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
0.37190 ppm
100
95
90
8
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15
579.15106
10 C 30 H 27 O 12 = 579.15080
245.08188 0.45343 ppm 865.19867
401.08771 739.16669
5 C 14 H 13 O 4 = 245.08193 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
C 20 H 17 O 9 = 401.08781 C 39 H 31 O 15 = 739.16684
-0.21841 ppm 0.74545 ppm
-0.24381 ppm -0.21148 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
93
Figura 45. Estructura química de los compuestos 4 y 8.
(+)-Catequin: R1= H R2= OH

(-)- Epicatequin: R1= OH, R2= H
Fuente: HAMINIUK, et al. (2012)
Mediante el uso de estándares se identificó el pico 16 con tiempo de retención 5,51 min
como phloridzina al mostrar el ión pseudomolecular [M-H]- con m/z 435 (Figura 46) y con
formula molecular C21H24O10. La estructura propuesta se basa en lo reportado por la
literatura174,175. Este compuesto no se ha reportado en investigaciones recientes sobre
compuestos fenólicos en sub-productos de aguacate.
174
GOSCH, Christian et al. Biosynthesis of phloridzin in apple (Malus domestica Borkh.)En: Plant
Science, 2009.vol.176, p. 223–231.
175
LE GUERNEVE´, Christine, et al. New compounds obtained by enzymatic oxidation of phloridzin.
En:Tetrahedron Letters, 2004.vol.45,p.6673–6677.
94
435.12979
C 21 H 23 O 10 = 435.12967
0.27847 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45 271.06131
C 15 H 11 O 5 = 271.06120
40 0.41719 ppm
35
30
25 315.08765
C 17 H 15 O 6 = 315.08741 501.10159
20 0.74593 ppm C 34 H 15 O 4 N = 501.10066
1.86942 ppm
15 609.14618
218.03107 C 40 H 21 O 5 N 2 = 609.14560
10 C 7 H 8 O 7 N = 218.03062 0.95900 ppm
2.02748 ppm 787.26068 893.22827
5 C 42 H 43 O 15 = 787.26074 C 60 H 33 O 7 N 2 = 893.22932
116.92851 -0.07944 ppm -1.17899 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
Fuente: GOSCH, HALBWIRTH y STICH (2010)
4.9.1.3 Identificación de los compuestos fenólicos en F3S.
De igual forma utilizando estándares se identificaron en la fracción tres aislada de la

semilla (F3S), compuestos presentes en el extracto purificado de la semilla (EPS) (tabla
24). Sin embargo en esta fracción no fue posible identificar compuestos como: ácido
ferúlico I, ácido ferúlico II, ácido sinápico, apigenina y phloridzina. En la figura 24 se
muestra el cromatograma HPLC-ESI-MS de la fracción F3S en modo negativo.
95
Mediante el estudio de los fragmentos se identificaron parcialmente los compuestos 28-
34. El pico 29 (tr=2,51 min) presentó un ión pseudomolecular [M-H]- con m/z 575
C30H24O12 (Figura 48), que corresponde a una procianidina dimérica tipo A176(Figura 49).
Este compuesto se ha encontrado en epicarpio de aguacate variedad Hass177 y también
en semilla y epicarpio de aguacate Persea americana Mill178.

575.11993
C 30 H 23 O 12 = 575.11950
0.75600 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
647.58124
15 C 38 H 79 O 7 = 647.58313
116.92854 499.09598 -2.91883 ppm 863.18317
10 287.05624
C 20 H 21 O 14 N = 499.09675 719.15125 C 58 H 27 O 7 N 2 = 863.18237
C 15 H 11 O 6 = 287.05611
-1.55210 ppm C 38 H 27 O 13 N 2 = 719.15186 0.91764 ppm
5 132.86783 0.46181 ppm
-0.85781 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
Figura 49. Estructura para procianidina dimérica tipo A.
176
177
178
GÓMEZ-CARAVACA , et al. Op cit., p.511.
96
Fuente: SUN y SPRANGER (2005)
Los picos 3, 5 y 34 con tiempos de retención 3,15, 4,10 y 4,88 muestran un ión
pseudomolecular [M-H]- con m/z 577, C30H26O12 .Estos compuestos se identificaron como
procianidinas diméricas tipo B descritas previamente en F2S. Mediante el uso de
estándares los picos 3 y 5 se identificaron como procianidinas diméricas tipo B1 y B2
respectivamente. En el espectro de masas de compuestos 3, 5 y 34 (Figura 50), se
observa un ión fragmento [M-H-152]- con m/z 425 que se forma por la fisión retro Diels-
Alder (RDA) de los anillos heterocíclicos en procianidinas dímericas179. Nuevamente se
observa un ión fragmento [M-H-288]- con m/z 289 el cual se origina a partir de una
escisión del enlace interflavano180 con pérdida de una molécula de epicatequina181. Cabe
resaltar que las procianidinas diméricas tipo B se caracterizan por presentar enlaces C4-
C8 o C4-C6182, mientras que las procianidinas diméricas tipo A presentan enlaces tipo éter
adicionales C2-O-C7 o C2-O-C5183 (Figura 52). Esto genera que las procianidinas
diméricas tipo A tengan un menor número de átomos de hidrógeno en su estructura en
comparación con las procianidinas diméricas tipo B.
Figura 50. Espectros de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 3, 5 y 34

577.13544
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
100
0.49843 ppm
3
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25 865.19855
C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
20
0.60436 ppm
15
720.15839
10 C 50 H 24 O 6 = 720.15784
289.07172 425.08777 0.76304 ppm
C 22 H 17 O 9 = 425.08781 963.16547
5 116.92850 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 58 H 29 O 14 N = 963.15935
-0.15595 ppm -0.08647 ppm
204.94255 6.34744 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
179
FERNÁNDEZ DE SIMÓN, Brigida, et al. Phenolic Compounds in Cherry (Prunus avium)
Heartwood with a View to Their Use in Cooperage. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry,
2010. vol. 58,no.8,p. 4907–4914.
180
Ibid., p. 4911.
181
GU, Liwei y SANDHU, Amandeep. Antioxidant Capacity, Phenolic Content, and Profiling of
Phenolic Compounds in the Seeds, Skin, and Pulp of Vitis rotundifolia (Muscadine Grapes) As
Determined by HPLC-DAD-ESI-MS. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2010.vol.
58,no.8, p. 4681–4692.
182
SUN, B. y SPRANGER, M. Review: Quantitative extraction and analysis of grape and wine
proanthocyanidins and stilbenes. En: Ciencia e Técnica Vitivinícola, 2005. vol.20, no.2, p. 59,89.
183
HELLSTRÖM , J y MATILLA, P. HPLC Determination of Extractable and Unextractable
Proanthocyanidins in Plant Materials. En: Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2008. vol.56,
no.17, p. 7617-7624.
97
577.13531
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.28692 ppm
100
95 5
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
865.19849
20 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
0.53382 ppm
15
425.08786 720.15894
10 289.07184 C 22 H 17 O 9 = 425.08781 C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.12891 ppm -1.04351 ppm 959.87494
5 0.26633 ppm C 60 H 115 O 6 N 2 = 959.87606
116.92849
-1.17045 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

577.13568
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.92145 ppm
100
95
34
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
865.19861
C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
15
0.67491 ppm
425.08804
10 289.07190
C 22 H 17 O 9 = 425.08781 720.15881
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 960.21021
116.92855 0.55966 ppm C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
5 0.47747 ppm C 60 H 34 O 12 N = 960.20865
-1.21301 ppm
1.62096 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
El pico 32 con tiempo de retención 3,39, min muestra un ión pseudomolecular [M-H]- con
m/z 865 (Figura 51) que está de acuerdo con la formula molecular C45H38O18. Basados en
publicaciones científicas se identificó este compuesto como procianidina trimérica tipo B.
Estructuralmente se puede observar que los enlaces tipos éter adicionales presentes en
las procianidinas triméricas tipo A resultan en una disminución del número de átomos de
hidrógeno en la estructura en comparación con las procianidinas triméricas tipo B(Figura
52). En el espectro de masas se observa un ión fragmento de m/z 289 correspondiente a
98
monómeros de catequina184. Investigaciones previas indican la presencia de este tipo de
compuestos en semilla y epicarpio de ocho variedades de aguacate185.

865.20020
100
C 48 H 35 O 15 N = 865.20122
-1.18139 ppm 32
95
90
85 289.07187
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
80 0.37190 ppm
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
720.15936
25 C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
-0.45024 ppm
20 576.12714
C 30 H 24 O 12 = 576.12732
15 -0.32647 ppm
10
245.08188 500.10406 768.16669
386.97037 960.21155
5 116.92850 C 14 H 13 O 4 = 245.08193 C 12 H 5 O 14 N = 386.97155 C 20 H 22 O 14 N = 500.10458 C 50 H 26 O 8 N = 768.16639 C 60 H 34 O 12 N = 960.20865
-0.21841 ppm -3.06101 ppm -1.02482 ppm 0.38668 ppm 3.01937 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
184
KOLNIAK-OSTEK, Joanna; OSZMIAŃSKI , Jan y BIERNAT, Agata. The Content of Phenolic
Compounds in Leaf Tissues of Aesculus glabra and Aesculus parviflora Walt. En : Molecules,
2015. vol. 20, no. 2, p. 2176-2189.
185
GU, BOSTIC y WANG. Op. Cit., p. 1196-1197
99
Figura 52. Estructura para procianidinas triméricas (PC) tipo B (a) y procianidinas
triméricas (PC) tipo A(b)
(a) (b)
PC C1: R1= OH ,R2= H, R3= OH,R4= H, R5=OH, R6= H
PC C2: R1= OH ,R2= H, R3= OH,R4= H, R5=OH, R6= H
Fuente: SANTOS-BUELGA , KOLODZIEIJ y TREUTTER (1995)
El pico 33 (tr=3,71 min) presentó un ión pseudomolecular [M-H]- con m/z 863. Este
compuesto se identificó como procianidina trimérica tipo A186. El espectro de masas
MS/MS de este compuesto (Figura 53) indica la presencia de iones fragmento con m/z
289 , m/z 245 descritos previamente para los compuestos tipo procianidinas identificadas
en F2S. La estructura se representa en la figura 57 b. Se ha reportado la identificación de
procianidinas triméricas tipo A en semilla y epicarpio de ocho variedades de aguacate
Persea americana187. Estudios indican que la presencia de este tipo de compuestos
previene la aparición de infecciones en el tracto urinario188.
186
KOSIǸSKA, et al. Op. cit.,p. 4617.
187
GU, BOSTIC y WANG. Op. Cit.,p. 1195-1196.
188
HOWELL, A.B., et al .A-type cranberry proanthocyanidins and uropathogenic bacterial anti-
adhesion activity.En: Phytochemistry,2005. vol. 66, no.18,p.2281 .2291.
100
ms2 863.1837@hcd60.00
90 [60.0000-900.0000] MS
161020_EPS_Johanna_flav
80 onoides_dd1
70 3.85
Relative Abundance
60
50
40
30
3.96
20
10 4.32
4.08 4.43 4.55 4.77 4.89
1.69 1.80 1.92 2.23 2.34 2.55 2.67 2.79 3.09 3.36 3.50 3.62 5.11 6.11 6.38 6.56
0
1.6 1.8 2.0 2.2 2.4 2.6 2.8 3.0 3.2 3.4 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 5.8 6.0 6.2 6.4 6.6

411.07217
289.07230 C 21 H 15 O 9 = 411.07216
125.02454 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.04579 ppm
100 1.84989 ppm
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
90 1.01110 ppm
80
Relative Abundance
70 161.02454
60 C 9 H 5 O 3 = 161.02442
0.73767 ppm
50
245.08224
40 C 14 H 13 O 4 = 245.08193
1.27583 ppm
30
20 447.07214
C 24 H 15 O 9 = 447.07216
10 -0.02616 ppm 567.09515 712.35834
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
m/z
4.9.2 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN EPICARPIO.
El análisis de los compuestos fenólicos se realizó por HPLC-ESI-MS en modo negativo.

Mediante el uso de una mezcla de estándares de compuestos fenólicos fue posible
identificar algunos compuestos del extracto purificado de epicarpio (EPE) y sus fracciones
F1E, F2E y F3E. La mínima diferencia de los valores m/z obtenidos para los estándares y
los compuestos fenólicos identificados permitió corroborar la presencia de estos en los
diferentes extractos y fracciones. En la figura 54 se presenta el cromatograma del EPE y
en la tabla 25 se registran las masas y los tiempos de retención (tR) de los diferentes
compuestos.
101
Figura 54. Cromatograma (HPLC-ESI-MS) del extracto purificado de epicarpio (EPE) y
fracciones F1E, F2E y F3E.
RT: 0.00 - 15.01

100
3.34
5 NL:
5.22E9
95
3.37
EPE TIC MS
161122_E
PE_Johann
90 a_flavonoid
es_FS
85
80
75
3.43
70
65
60
Relative Abundance
55
3.46
17
50
45 5.20
40
4 16
3.50 5.38 5.84
35 3.10
3.06 3.54 7 5.62
30 3.71 9
15
25
12 4.17
5.87
4.72 5.12 13.21
20 2.96
8 11
4.45 13
5.97 6.34
6.42 19 9.50 9.91
9.96 10.30
10.47
8.46 9.20
6.50 8.11 10.67
15
0.38 6.67 7.76 10.74
7.50 7.73 10.94
10 1 1.23 1.29
1.34
2.71
11.27
0.48 2 1.39 11.48 13.33
2.53 11.78 12.64
5 1.51 2.34 13.52
0.63 13.83
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
RT: 0.00 - 15.01

100
3.72 22 NL:
4.97E9
95
F1E TIC MS
161122_F1
3.70 E_Johanna
90 _flavonoide
s_FS
85
3.79
80
75
70
65
60
26 28
3.83
Relative Abundance
6.26
55
25 5.53
29
50 23
4.45
5.31
27 6.35
5.12 5.68
3.91
45
24
5.00
40 5.83
35
3.95 4.95 6.42 32
8.47
30
6.51
30 31 13.22
7.81 8.10
7.04 10.47
25 9.71 9.74 10.57
7.49 9.03
0.40 3.64 10.62
20
0.47 10.85
15 3.40 3.42 10.96
11.04
11.35
10 3.01
2.54 11.49
11.80
0.63 1.36 1.40 2.46 12.49
5 13.49
13.79 14.75
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
102
RT: 0.00 - 15.00 5
100 3.30
3.36
3.38 F2E NL:
8.12E9
3.44 TIC MS
95 161122_F2
3.46 E_Johanna
90 _flavonoide
3.26 s_FS
85
80
75 3.52
70
65
9
4.15
60
Relative Abundance
55
50 3.62
4.18
45
40 3.66
165.3835
3.68 5.60 36
35 34
5.21
5.86
30 4.26 17
3.02
3.08
33 5.89
25 4.72
20
72.93 5.95
13.21
6.00
1.34 9.22 9.49 9.74 10.49 10.55
15 1.31 6.05 6.65
1.35 8.89 10.66
10
1.22
0.47 0.49
1.45
42.77 6.69 8.06 8.43
7.59 10.97 13.25
1.53 11.26 13.29
5 1.67 2.69 11.52 12.73 13.35
0.90 13.67 14.20
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
RT: 0.00 - 15.00

9.93 NL:
100
95 9.55
10.07
F3E 13.22
1.23E9
TIC MS
40 10.10 161122_F3
E_Johanna
9.44 10.12
90
4
3.14 9.31 10.30
_flavonoide
s_FS
85 9.20
9.13 10.60
80 7
4.09
9.00
75 38
3.35 4.11
8.62 8.87
10.77
8.56
70
8.54
65 8.42
3.39 4.13
8.05 10.87
60
10.93
37
Relative Abundance
55 8.01
2.67 2.69 7.75
3.43
50 10.95
7.69
2.65 7.52
45 11.05
6.68 7.34
7.31
40 3.79 6.66
0.47 4.22 7.18 11.09
6.52
35 39 4.24 6.44 11.20
5.44
30 4.28 6.41
4.86 6.20 11.32
6.06 13.35
25 4.90 11.42
11.50
20 11.72 13.41
11.95 12.67
15 2.36 13.53
0.64 1.27 13.66
1.95
10 13.79
14.61
5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
Time (min)
103
Tabla 25. Compuestos fenólicos identificados por HPLC-MS en EPE y las fracciones
aisladas F1E, F2E y F3E.
Nº Compuesto tR λmáx Fórmula m/z medido
pico
EPE
1 Ácido quínico 0,48 _ C7H12O6 191.05624
2 Ácido cítrico 0,66 _ C6H8O7 191.0199
3 Ácido protocatéquico 1,94 _ C7H6O4 153,01938
4 Procianidina dimérica tipo B1 3,11 _ C30H26O12 577,13525
5 Catequina 3,36 _ C15H14O6 289,0719
6 Ácido clorogénico(ácido 5-O-cafeoilquínico) 3,68 _ C16H18O9 353,08795
8 Ácido cafeico 3,82 _ C9H8O4 179.035
10 Ácido siringico 4,18 _ C9H10O5 197,0455
11 Vainillina 4,42 _ C8H8O3 151,04005
12 Acido p-cumárico 4,6 _ C9H8O3 163,04018
13 Ácido ferulico1 mayor 4,94 _ C10H10O4 193,0506
14 Ácido sinápico 5,01 _ C11H12O5 223,06128
15 Ácido ferulico2 minor 5,13 _ C10H10O4 193,05061
16 Quercetina-3-O-Glucósido 5,37 _ C21H20O12 463,08862
17 Rutina 5,77 _ C27H30O16 609,14685
18 Phloridzina 5,79 _ C21H24O10 435,12967
19 Quercetina 6,44 _ C15H10O7 301,03568
20 Kaempferol 7,03 _ C15H10O6 285,04071
21 Apigenina 7,09 _ C15H10O5 269,04578
F1E
22 Aducto dímero ácido cafeoilquínico 3,73 _ ________ 707,18378
25 Ácido (1`S, 6`R) -8`- hidroxiabscisico- β-D- glucósido 5,31 273 C21H30O10 441,12271
27 No identificado 5,66 _ _____ 439,10703
28 Cafeoil-O- hexósido 6,26 325 C20H22O5 341,13950
104
31 Ácido vanilico hexósido I 8,12 _ C18H34O5 329,23355
32 Ácido vanilico hexósido II 8,48 _ C18H34O5 329,23361
F2E
5 Catequina 3,36 _ C15H14O6 289,07190
33 Diglucósido de quercetina 4,74 _ C27O17H30 625,14148
34 Quercetina 3-O- arabinosil-glucósido 5,21 _ 595,13080
16 Quercetina 3 –O- glucosido 5,38 _ C21H20O12 463,08856
35 Quercetina 3-O-arabinosido 5,62 _ C20H18O11 433,07770
17 Quercetina 3-O- rutinosido(Rutina) 5,75 _ C27H30O16 609,14642
36 Quercetina 3-O-ramnosido 5,85 _ C21H20O11 447,09341
F3E
38 Procianidina trimérica tipo B 3,35 _ C45H38O18 865,20032
40 Procianidina trimérica tipo B 3,83 _ C45H38O18 865,20026
4.9.2.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1E.
La mayoría de los compuestos fenólicos en F1E coinciden con los identificados en el

extracto purificado del epicarpio (EPE), sin embargo en F1E no se identificó apigenina,
kaempferol, procianidina B2 y quercetina. En la figura 54 se muestra el cromatograma de
la fracción F1E en modo negativo.
Mediante el análisis de los patrones de fragmentación del espectro de masas, se

caracterizaron parcialmente diferentes compuestos fenólicos del epicarpio de aguacate. El
pico 22 con tr=3,73 min muestra un ión pseudomolecular [M-H]- con m/z 707. Este
compuesto se identificó como un aducto dímerico del ácido cafeoilquínico189,190 el cual se
189
BRAVO, Laura; GOYA, Luis y LECUMBERRI, Elena. LC/MS characterization of phenolic
constituents of mate (Ilex paraguariensis ,St.Hil.)and its antioxidant activity compared to commonly
consumed beverages. En: Food Research International, 2007. vol. 40,no.3,p. 393 –405.
105
origina por la condensación de dos unidades del ácido clorogénico. Este proceso ha sido
descrito por Cliford et al191 solo para ácido cafeico en extractos de mate. En el espectro de
masas de este compuesto (Figura 55) se observan los iones fragmento con m/z 353 y 191
correspondientes al ácido clorogénico y el ácido quínico respectivamente.
Figura 55. Espectros de masas HPLCS-ESI-MS del compuesto 22.

161122_F1E_Johanna_flavonoides_FS #835 RT: 3.73 AV: 1 NL: 9.54E8
707.18378
C 45 H 27 O 7 N 2 = 707.18237
1.98314 ppm
100
95
90
85 353.08783
C 16 H 17 O 9 = 353.08781
80 0.06876 ppm
75
70
191.05606
65 C 7 H 11 O 6 = 191.05611
-0.26452 ppm
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15
760.09332
10
453.01285 C 54 H 16 O 6 = 760.09524
641.15082 929.21313
C 24 H 7 O 9 N = 453.01263 -2.51775 ppm
5 C 44 H 21 O 4 N 2 = 641.15068 C 59 H 33 O 10 N 2 = 929.21407
0.48319 ppm
278.72601 0.21437 ppm -1.00475 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
El pico 25 con tr de 5,31min se identificó como el ácido (1`S, 6`R) -8`- hidroxiabscisico- β-
D- glucosido por presentar un ión pseudomolecular [M-H]- a m/z 441u y λmáx
273nm192(Figura 56), con fórmula molecular C21H30010 (Figura 57). Este compuesto fue
identificado previamente en la fracción F1S. La impureza del pico cromatográfico genera
diferentes señales en el espectro de masas del compuesto (Figura 57) y su espectro UV-
vis.
190
CHUL, Sung , et al. Determination of polyphenol components of Lonicera japonica Thunb. using
liquid chromatography- tandem mass spectrometry: Contribution to the overall antioxidant activity.
En: Food Chemistry, 2012. vol. 134, no. , p. 572 .577
191
THABTI, Inés et al. Identification and quantification of phenolic acids and flavonol glycosides in
Tunisian Morus species by HPLC-DAD and HPLC–MS. En: Journal of Functional Foods, 2012.vol
4,no.1, p. 367- 374.
192
GÓMEZ-CARAVACA, et al. Op. Cit., p. 508.
106
Figura 56. Espectro UV-Vis del compuesto 25.
30.141 Peak 3
223.5
0.25
0.20
0.15
AU
0.10
243.6 273.2
0.05
0.00
250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00

nm

441.12271
C 26 H 19 O 6 N = 441.12179
2.09831 ppm
100
95
90
85 393.17688
C 17 H 29 O 10 = 393.17662
80
0.66030 ppm
75
70
65
60 263.12891
Relative Abundance
C 15 H 19 O 4 = 263.12888 505.20810
55 0.09075 ppm C 26 H 33 O 10 = 505.20792
0.35426 ppm
50
45
40
35
30
25
219.13902
C 14 H 19 O 2 = 219.13905
20 567.20837
-0.13846 ppm C 27 H 35 O 13 = 567.20831
15 305.13956 0.10538 ppm
151.07639 C 17 H 21 O 5 = 305.13945 867.31171
10 C 9 H 11 O 2 = 151.07645 685.27124
0.36001 ppm C 47 H 49 O 15 N = 867.31077
-0.44634 ppm C 45 H 37 O 5 N 2 = 685.27080
1.08228 ppm
5 0.64898 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
107
El pico 28 mostró un tR de 6,26min, λmáx en 325 nm (Figura 58) y un ión pseudomolecular
en m/z 341 [M-H]-,C20H22O5 (Figura 59). A partir de estas señales se identificó
parcialmente este compuesto como el ácido hidroxicinámico cafeoil-O-
hexósido193,194,195,196,197. La estructura del compuesto 28 se muestra en la figura 60.
Figura 58. Espectro UV-Vis del compuesto 28 medida a 280nm.
16.777 Peak 1
228.3
3.00
2.50
2.00
325.7
AU
1.50
1.00
0.50
0.00
250.00 300.00 350.00 400.00 450.00 500.00 550.00

nm
193
MENA, Pedro, et al. (Poly)phenolic fingerprint and chemometric analysis of white (Morus alba L.)
and black (Mmostróorus nigra L.) mulberry leaves by using a non-targeted UHPLC–MS approach.
En: Food Chemistry, 2016.vol. 212, p. 250-255.
194
SEGURA-CARRETERO, Antonio, et al. Profiling of phenolic and other polar constituents from
hydro-methanolic extract of watermelon (Citrullus lanatus) by means of accurate-mass spectrometry
(HPLC-ESI-QTOF-MS). En: Food Research International, 2013. vol. 51,no.1,p.354- 362.
195
SASSAKI, Guilherme, et al.UPLC-PDA –MS evaluation of bioactive compounds from leaves of
Ilex paraguariensis with different growth conditions,treatments and ageing. En: Food Chemistry,
2011. vol. 129,no.4,p. 1453 –1461.
196
CHUL SHIN, Sung, et al. Op.Cit., p. 572-577
197
LAMUELA-RAVENTOS, Rosa, et al. A comprehensive characterisation of beer polyphenols by
high resolution mass spectrometry (LC .ESI-LTQ-Orbitrap-MS). En: Food Chemistry, 2015. vol.169,
p.336 –343.
108
341.13950
C 20 H 21 O 5 = 341.13945
0.14311 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50 505.20856
C 26 H 33 O 10 = 505.20792
45 1.26035 ppm
551.21387
40 C 27 H 35 O 12 = 551.21340
0.84820 ppm
35
30
25
20
15 243.12375
C 12 H 19 O 5 = 243.12380 439.10675
10 -0.19821 ppm C 26 H 17 O 6 N = 439.10614 615.24487
C 32 H 39 O 12 = 615.24470 835.43372
1.40052 ppm
5 0.28164 ppm C 53 H 59 O 7 N 2 = 835.43278
1.12570 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
R= hexósido
Fuente: CHUL, et al. (2012)
Los picos 31 y 32 con tiempos de retención 8,12 y 8,48min respectivamente se

identificaron como isómeros del ácido vanílico-hexósido198,199 .El espectro de masas de
ambos compuestos muestra un ión pseudomolecular en m/z 329 [M-H]-, C18H34O5 (Figura
61). La estructura general de los compuestos 31 y 32 se muestran en la figura 62 los
cuales poseen diferencias estructurales debido a la posición del grupo metoxilo, el cual
puede estar en posición meta o para. Este compuesto se ha identificado previamente en
semilla de aguacate Persea americana Mill200.
198
SEGURA-CARRETERO, et al., Op. cit,. p.357
199
SEGURA-CARRETERO, Antonio,et al. Identification and quantification of phenolic and other
polar compounds in the edible part of Annona cherimola and its by-products by HPLC-DAD-ESI-
QTOF-MS. En: Food Research International, 2015. vol.78, p.246- 257.
200
GÓMEZ CARAVACA, et al. Op. cit., p. 508.
109
Figura 61. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 31 y 32.
329.23355
C 18 H 33 O 5 = 329.23335
0.61851 ppm
100
95 31
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
218.03114
35 C 7 H 8 O 7 N = 218.03062
2.37741 ppm
30
25
20
15 159.00848 397.22079
C 9 H 3 O 3 = 159.00877 C 16 H 33 O 9 N 2 = 397.21915 543.28125
10 -1.78232 ppm 4.13092 ppm C 27 H 43 O 11 = 543.28109 709.36597
0.30318 ppm 861.52148
5 116.92854 C 46 H 49 O 5 N 2 = 709.36470 C 57 H 69 O 5 N 2 = 861.52120
1.79164 ppm 0.33418 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
329.23361
C 18 H 33 O 5 = 329.23335
0.80390 ppm
100
95
32
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
218.03116
20 C 7 H 8 O 7 N = 218.03062
2.44739 ppm
15
397.22073
159.00851 C 16 H 33 O 9 N 2 = 397.21915
10
C 9 H 3 O 3 = 159.00877 3.97727 ppm 547.31250 681.45618
-1.59039 ppm 877.55219
5 C 27 H 47 O 11 = 547.31239 C 48 H 59 O 2 N = 681.45513
116.92856 C 58 H 73 O 5 N 2 = 877.55250
0.20937 ppm 1.53845 ppm -0.35500 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
Figura 62. Estructura química general para los compuestos 31 y 32.
R= hexósido
110
Mediante la utilización de una mezcla de estándares, en esta fracción igualmente se

identificaron la mayoría de los componentes ya mencionados para el extracto EPE,
161122_EPE_Johanna_flavonoides_DDA 11/22/16 20:26:53 EPE Johanna 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm DDA
exceptuando ácido sinápico, el ácido siríngico y la vainillina (Tabla 25). En la figura 54 se
RT: 0.56 - 9.53
muestra el cromatograma de la fracción F2E en modo negativo.

100
3.11 NL: 2.27E8
ms2 577.1354@hcd60.00
90 [50.0000-605.0000] MS
161122_EPE_Johanna_flav
80 onoides_DDA
Los compuestos detectados e identificados (4, 7, 5, 9, 33, 34,16,35,17 y 36) por HPLC-
70
Relative Abundance
ESI-MS se muestran en la tabla 25. Mediante el uso de estándares los picos 4 y 7 con
60
50
tiempos de retención 2,77 y 2,94 min con iones pseudomoleculares a m/z 577 [M-H]- ,
2.99
40 4.11
3.21
C30H26O12 (Anexo G) se identificaron como procianidinas diméricas tipo B1 (Pico 4) y tipo
30
20
B2 (Pico 7).Los espectros MS/MS se muestran en la figura 63.
10
3.32
3.43
3.77 4.23
4.34 4.91
3.88 5.02 5.38 6.78 6.93 7.77 8.10
0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
Figura 63. Espectros MS/ MS para los picos 4 y 7.
161122_EPE_Johanna_flavonoides_DDA 11/22/16 20:26:53 EPE
Time Johanna
(min) 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm DDA
161122_EPE_Johanna_flavonoides_DDA
RT: 0.56 - 9.53 #1382 RT: 2.99 AV: 1 NL: 1.44E7
F: FTMS - p ESI d Full ms2 577.1354@hcd60.00 [50.0000-605.0000]3.11 NL: 2.27E8
100 125.02445
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
ms2 577.1354@hcd60.00
90 0.27882 ppm [50.0000-605.0000] MS
100
8090 onoides_DDA
7080 289.07227 407.07724

Relative Abundance
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 22 H 15 O 8 = 407.07724
Relative Abundance
6070 1.74432 ppm -0.00162 ppm

60
50
161.02469 2.99
50 C 9 H 5 O 3 = 161.02442
40 4.11
83.01402 1.68527 ppm
40 3.21 245.08226
C 4 H 3 O 2 = 83.01385
30 C 14 H 13 O 4 = 245.08193
30 1.95759 ppm
1.33809 ppm 339.08713
2020 3.32 C 19 H 15 O 6 = 339.08741 462.31873
3.77 4.23
1010 -0.83685 ppm C 24 H 46 O 8 = 462.31982
3.43 4.34 4.91
3.88 5.02 5.38 -2.35983 ppm
6.78 6.93 7.77 8.10
00
50 1.0 100
1.5 2.0 150
2.5 3.0 200 3.5 4.0 250 4.5 5.0300 5.5 350
6.0 6.5 400
7.0 7.5 450 8.0 8.5 500 9.0 9.5550 600
Time (min) m/z
161122_EPE_Johanna_flavonoides_DDA #1904 RT: 4.11 AV: 1 NL: 1.41E7

125.02453
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
0.88905 ppm
100
90
80
Relative Abundance
70
60 289.07205
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
50 161.02452 1.00533 ppm 407.07834
83.01388 C 22 H 15 O 8 = 407.07724
40 C 9 H 5 O 3 = 161.02442
C 4 H 3 O 2 = 83.01385 2.69720 ppm
0.64291 ppm
0.30331 ppm
30 245.08136
C 14 H 13 O 4 = 245.08193
20 -2.33525 ppm 339.08609
C 19 H 15 O 6 = 339.08741
10
-3.89683 ppm
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
De igual forma mediante el uso de estándares se identificaron los picos 5 y 9 con tiempos
de retención 3,36 y 4,16 min respectivamente como catequina (Pico 5) y epicatequina
(Pico 9) al mostrar el ión pseudomolecular [M-H]- con m/z 289, C15H13O6. El espectro de
masas para los pico 5 y 9 se muestra en el anexo H.
Los espectros de masas MS/MS de los picos 33, 34,16,35,17 y 36 tienen en común un ión
fragmento en m/z 300 con una abundancia relativa más alta que el ión fragmento en m/z
301(correspondiente a la molécula de quercetina) característico de compuestos
glicosidados en la posición 3-O201. El análisis de las rutas de fragmentación de estos
201
VAN CAMP,John, et al. Ultra(high)-pressure liquid chromatography-electrospray ionization-time-
of-.ight-ion mobility-high definition mass spectrometry for the rapid identification and structural
characterization of flavonoid glycosides from cauliflower waste. En: Journal of Chromatography A,
2014. vol. 1323, p. 39 – 48.
111
compuestos inicia con la escisión de los enlaces glicosídicos y la eliminación de las
moléculas de azúcares presentes202.
El pico 33 con tiempo de retención 4,74 min muestra un ión pseudomolecular en m/z 625
[M-H]- , C27O17H30 (Figura 64). En el espectro MS/MS se observa un fragmento en m/z 301
[M-H-324]- debido a la perdida de dos unidades de glucosa. El fragmento en m/z 271 [M-
H-324-CH2O]- (fragmento neutro formaldehído), se forma por pérdida de un grupo
carbonilo en el carbono de la posición 3203 (Figura 65). Teniendo en cuenta que los
compuestos tipos flavonoide se caracterizan por la pérdida de moléculas neutras
pequeñas como CO, CO2 y C2H2O204 se puede inferir que el fragmento en m/z 243 [M-H-
324-CH2O-CO]- se genera por la pérdida de una molécula neutra de CO y el fragmento en
m/z 199 [M-H-324-CH2O-CO-CO2]- se genera por la pérdida de una molécula de CO2.
Finalmente el ión fragmento [M-H-324-193]- a m/z 107 se origina por la pérdida del anillo
B205. Así este compuesto se identificó parcialmente como diglucósido de quercetina206
(Figura 65). Kosinska et al207, reportan la presencia de la quercetina 3,4`-diglucosido en
epicarpio de aguacate variedad Hass con lo que se podría inferir que las glucosas están
en posiciones 3 y 4` del anillo C y B respectivamente.

625.14148
C 40 H 21 O 6 N 2 = 625.14051
1.55143 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
289.07202
20
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
15 0.89976 ppm
10 163.04008
C 9 H 7 O 3 = 163.04007 693.12830 863.18311
435.09302
5 0.10690 ppm C 33 H 11 N 2 = 435.09277 C 55 H 17 O = 693.12849 C 58 H 27 O 7 N 2 = 863.18237
116.92851 0.56505 ppm -0.27789 ppm 0.84693 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
202
STOBIECKI, Maciej. Op.Cit.,p.237-256.
203
YE, Min; YAN, Yuning y GUO,D.A.. Characterization of phenolic compounds in the Chinese
herbal drug Tu-Si-Zi by liquid chromatography coupled to electrospray ionization mass
spectrometry. En: Rapid Communication in Mass Spectrometry , 2005. vol. 19,no. 11, p.1469–1484.
204
CUYCKENS y CLAEYS. Op. Cit.,p. 6
205
LIANG, Xin-miao , et al. Systematic screening and characterization of flavonoid glycosides in
Carthamus tinctorius L. by liquid chromatography/UV diode-array detection/electrospray ionization
tandem mass spectrometry.En: Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2008. vol.
46,no.3, p. 418–430.
206
207
112
RT: 1.84 - 7.87
4.72 NL: 1.96E8
100
TIC F: FTMS - p ESI d Full ms2
625.1414@hcd60.00
90 [50.0000-655.0000] MS
161122_F2E_Johanna_flavonoi
80 des_DDA_161123101849
70
Relative Abundance
60 4.83
50
40
30
4.94
20
10 5.04
5.15 5.37 5.60 5.71 5.83
2.01 2.25 2.49 2.61 2.84 3.23 3.65 4.61
0
2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5
161122_F2E_Johanna_flavonoides_DDA_161123101849 #2175 RT: 4.72 AV: 1 NL: 5.48E7

300.02786
C 15 H 8 O 7 = 300.02755
1.03893 ppm
100
90
80 271.02512
C 14 H 7 O 6 = 271.02481
Relative Abundance
70
1.12446 ppm
60
50
40 243.02995
C 13 H 7 O 5 = 243.02990
30 0.23204 ppm
107.01393 199.04012
20
C 6 H 3 O 2 = 107.01385 C 12 H 7 O 3 = 199.04007 325.03604 445.07907 544.97437
10 0.24089 ppm C 17 H 9 O 7 = 325.03538 C 21 H 17 O 11 = 445.07763 C 29 H 5 O 12 = 544.97865
0.73434 ppm 625.14294
2.04713 ppm 3.22759 ppm -7.86003 ppm
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650
m/z
Fuente: PhytoChemical Interactions Data Base (PCIDB)
El pico 34 con tr 5,21 min se identificó parcialmente como quercetina-3-O-arabinosil-

glucósido208.El espectro de masas muestra un ión pseudomolecular en m/z 595 [M-H]-
(Figura 67).
208
KOSIǸSKA, et al. Op. cit., p. 4617
113
595.13080
C 39 H 19 O 5 N 2 = 595.12994
1.43392 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
RT: 25
0.56 - 9.53
5.31 NL: 1.22E8
100
20 TIC F: FTMS - p ESI d Full
ms2 595.1309@hcd60.00
90 [50.0000-625.0000] MS
15
289.07196 5.19 161122_EPE_Johanna_flav
80 onoides_DDA
10 C 15 H 13 O 6 = 289.07176
0.68861 ppm 451.10352 709.14240
70 877.19934
C 24 H 19 O 9 = 451.10346
Relative Abundance
5 C 37 H 27 O 14 N = 709.14370 C 59 H 29 O 7 N 2 = 877.19802
60 0.13357 ppm -1.84390 ppm
116.92851 1.50063 ppm
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550
5.53 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
40 m/z
30
20
10
5.65
4.17 5.08 5.76 6.11 6.27 6.38 6.50
4.27 8.34
0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5

300.02798
C 15 H 8 O 7 = 300.02755
1.44580 ppm
100
90
271.02515
80
C 14 H 7 O 6 = 271.02481
Relative Abundance
70 1.23706 ppm
60
50
243.02994
40 C 13 H 7 O 5 = 243.02990
30 0.16926 ppm
199.04037
20 107.01398
C 12 H 7 O 3 = 199.04007 355.04633 415.06659 507.22205
C 6 H 3 O 2 = 107.01385
10 1.54414 ppm C 18 H 11 O 8 = 355.04594 C 20 H 15 O 10 = 415.06707 C 26 H 35 O 10 = 507.22357 595.13080
1.16210 ppm
1.08480 ppm -1.15763 ppm -3.00569 ppm
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
114
Mediante el uso de estándares el pico 16 con tiempo de retención 5,38 min se identificó
como quecetina 3-O-glucósido por el ión pseudomolecular en m/z 463 [M-H]-C21H20O12
(Figura 70), señal correspondiente a una molécula de quercetina enlazada a un hexosa.
Este glicósido de flavonol muestra el ión fragmento en m/z 301 [M-H-162]- (Figura 71), la
cual indica una perdida neutra de una unidad de hexosa que puede ser glucosa o
galactosa, generando al final la respectiva aglícona del flavonol209 (quercetina). La
estructura del compuesto 16 se muestra en la figura 72.
209
JERZ, Gerold; GUTZEIT, Derek y WINTERHALTER, Peter. Application of preparative high-
speed counter-current chromatography/electrospray ionization mass spectrometry for a fast
screening and fractionation of polyphenols.En:Journal of Chromatography A, 2007. vol. 1172, no.1,
p.40–46.
115
Figura 70. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para el compuesto 16.
463.08856
C 21 H 19 O 12 = 463.08820
0.78353 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
595.13116
40 C 39 H 19 O 5 N 2 = 595.12994
2.04926 ppm
35
30
161122_F2E_Johanna_flavonoides_DDA_16... 11/23/16 10:20:33 F2E Johanna 1ml MeOH 10% 0.1%FA microfiltrada Nylon 0.2um 13mm DDA
25
RT: 0.00 - 15.00 927.18463
5.43 C 55 H NL: 1.46E8
100 31 O 13 N 2 = 927.18316
20 TIC F: FTMS - p ESI d Full ms2
1.58460 ppm
463.0879@hcd60.00
90 879.21466 [50.0000-490.0000] MS
15
289.07196 C 59 H 31 O 7 N 2 = 879.21367
161122_F2E_Johanna_flavonoi
80 C 15 H 13 O 6 = 289.07176
10 1.12159 ppmdes_DDA_161123101849
0.68861 ppm
70 663.11853 805.16309
Relative Abundance
5 C 54 H 15 = 663.11792 C 52 H 25 O 8 N 2 = 805.16164
60 116.92853 0.91450 ppm 1.79714 ppm
0
50100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
40
m/z
5.55
30
20
10
5.65
6.41 6.51 6.62
5.09 5.18 7.06
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
161122_F2E_Johanna_flavonoides_DDA_161123101849 #2504 RT: 5.43 AV: 1 NL: 3.76E7

300.02783
C 15 H 8 O 7 = 300.02755
0.93722 ppm
100
90
80 271.02502
C 14 H 7 O 6 = 271.02481
Relative Abundance
70 0.78666 ppm
60
50 243.03008
C 13 H 7 O 5 = 243.02990
40
0.73433 ppm
30
151.00415 199.04018 463.09213
20 108.02218
C 7 H 3 O 4 = 151.00368 C 12 H 7 O 3 = 199.04007 373.29700 C 21 H 19 O 12 = 463.08820
C 6 H 4 O 2 = 108.02168
10 3.10257 ppm 0.54754 ppm C 21 H 41 O 5 = 373.29595 8.49377 ppm
4.63729 ppm
2.81127 ppm
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480
m/z
116
Fuente: CHEN, SONG y LI (2007)
El pico 35 con tiempo de retención 5,62 min se identificó como quercetina-3-O-

arabinosido, el espectro de masas muestra un ión pseudomolecular en m/z 433 [M-H]-
,C20H18O11(Figura 73), que según reportes en la literatura corresponde a una molécula de
quercetina enlazada a una pentosa210,211.Dentro de los estudios previos en sub productos
de aguacate se ha reportado la presencia de este compuesto en epicarpio de aguacate
Persea americana en las variedad Shepard212.
Figura 73. Espectro de masas HPLC-ESI-MS del compuesto 35

433.07770
C 20 H 17 O 11 = 433.07763
0.14603 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
579.13593
25 C 26 H 27 O 15 = 579.13554 867.16345
0.65975 ppm C 53 H 27 O 11 N 2 = 867.16203
20
1.63676 ppm
15
289.07196 501.06555
10 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 33 H 11 O 5 N = 501.06427
0.68861 ppm 2.55661 ppm 937.16669
687.22925 819.27362
5 C 56 H 29 O 13 N 2 = 937.16751
C 34 H 39 O 15 = 687.22944 C 57 H 39 O 6 = 819.27521 -0.88038 ppm
116.92851 -0.28451 ppm -1.94265 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
210
SASSAKI, et al. Op. cit., p.1458.
211
HOFMANN, Tamas; NEBEHAJ, Esztella y ALBERT, Levente. Antioxidant properties and
detailed polyphenol profiling of European hornbeam (Carpinus betulus L.)leaves by multiple
antioxidant capacity assays and high-performance liquid chromatography/multistage electrospray
mass spectrometry.En: Industrial Crops and Products, 2016. vol. 87, p.340 –349
212
KOSIǸSKA, et al. Op.cit.,p.4617.
117
Fuente: Adaptado de CUYCKENS,et al. (2005)
Mediante el uso de estándares el pico 17 con tiempo de retención 5,75 min se identificó
como un derivado de quercetina conocido como quercetin-3-O-rutinosido (rutina)213 por el
ión pseudomolecular en m/z 609 [M-H]-, C27H30O16 (Figura 75).La presencia del fragmento
en m/z 300 y 301 [M-H-146-162]- (Figura 76) indica la pérdida de los dos azúcares
ramnosa y glucosa respectivamente214 y la existencia de un enlace interglicosídico entre
los carbonos C1-C6 de los dos monosacáridos215, que para este caso corresponde a una
pentosa y una hexosa. Este compuesto ha sido identificado previamente en epicarpio de
aguacate Persea americana Mill216.
213
KOSIǸSKA, et al. Op.cit.,p.4617.
214
VAN CAMP, et al. Op.Cit., p.42.
215
LI, Shao-Hua, et al. Analysis of flavonoids from lotus (Nelumbo nucifera ) leaves using high
performance liquid chromatography/photodiode array detector tandem electrospray ionization mass
spectrometry and an extraction method optimized by orthogonal design. En: Journal of
Chromatography A, 2012. vol. 1227, p.145 – 153.
216
118
609.14642
C 40 H 21 O 5 N 2 = 609.14560
1.35979 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
RT: 0.56
30 - 9.53
5.74 NL: 7.49E7
100
25 433.07770 TIC F: FTMS - p ESI d Full
C 20 H 17 O 11 = 433.07763 ms2 609.1465@hcd60.00
90
20 [50.0000-640.0000] MS
0.14603 ppm
80
15 onoides_DDA
289.07187
70
10 C 15 H 13 O 6 = 289.07176
Relative Abundance
545.09369 723.15765 867.16278

0.37190 ppm C 25 H 21 O 14 = 545.09368 C 48 H 23 O 6 N 2 = 723.15616
5
60 C 53 H 27 O 11 N 2 = 867.16203
0.01933 ppm 2.06610 ppm 0.86253 ppm
116.92849
0
50
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 5.85 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
40 m/z
5.88
30
5.96
20
10 4.97 5.07 6.08
5.19 5.40 6.19 6.41 6.82
2.30 2.58 3.07 3.19 6.94
0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
Figura 76. Espectro MS/MS para el compuesto 17 Time (min)

300.02808
C 15 H 8 O 7 = 300.02755
1.75094 ppm
100
90
80
271.02521
Relative Abundance
70
C 14 H 7 O 6 = 271.02481
60 1.46226 ppm
50
40
30
199.04062
20 107.01413 C 12 H 7 O 3 = 199.04007
C 6 H 3 O 2 = 107.01385 387.06714 609.14661
2.77072 ppm C 26 H 11 O 4 = 387.06628
10 2.58796 ppm
2.21290 ppm 620.02948
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
119
Fuente: CHEN, SONG y LI (2007)
El pico 36 con tiempo de retención 5,85 min muestra un ión pseudomolecular en m/z 447
[M-H]-, C21H20O11(Figura 78). En el espectro MS/MS (Figura 79) del compuesto se
muestran diferentes iones fragmento a m/z 300, 271, 255 y 151 los cuales han sido
reportados previamente para el compuesto quercetina-3-O-ramnosido217. En el espectro
de masas el fragmento en m/z 301 [M-H-146]- corresponde a la pérdida de una unidad de
ramnosa. El fragmento [M-H-146- H2O-CO]- a m/z 255 se genera por la pérdida sucesiva
de una molécula de H2O y una molécula de CO218. Finalmente se observa un fragmento
[M-H-147-H2O-2CO]- con m/z 227 la cual se genera por la pérdida consecutiva de una
molécula de agua y dos moléculas de CO219. La estructura del compuesto 36 se muestra
en la figura 80.
217
HOFMANN, NEBEHAJ, ALBERT. Op, Cit., p.345.
218
MARCH, Raymond E., et al. A comparison of flavonoid glycosides by electrospray tandem mass
spectrometry. En:International Journal of Mass Spectrometry, 2006. vol. 248,no.1-2 p. 61–85.
219
CUYCKENS y CLAEYS. Op. Cit., p.8.
120
Figura 78. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para el compuesto 36.
447.09341
C 21 H 19 O 11 = 447.09328
0.29018 ppm
100
95
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35 609.14673
895.19495
C 40 H 21 O 5 N 2 = 609.14560
C 55 H 31 O 11 N 2 = 895.19333
30 1.86078 ppm
1.80224 ppm
25
20 389.12408
RT: 0.56 - 9.53 C 20 H 21 O 8 = 389.12419
15 -0.27333 ppm 5.84 NL: 1.09E8
100
289.07190 TIC F: FTMS - p ESI d Full
10 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 515.08051 ms2 447.0727@hcd60.00
90 [50.0000-475.0000] MS
C 34 H 13 O 5 N = 515.07992
0.47747 ppm 677.13373 161122_EPE_Johanna_flav
5
80 1.13493 ppm C 55 H 17 = 677.13357 onoides_DDA
116.92851 0.22760 ppm
70
0
Relative Abundance
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
60
m/z
50
40
5.95
30
20
6.06
10 6.18 6.50 6.74
5.73 6.81 6.93
Figura 79. Espectro MS/MS para el compuesto 36.
0
3.32 3.79 4.37 4.48 7.14 7.35
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
Time (min)

300.02802
C 15 H 8 O 7 = 300.02755
1.54751 ppm
100
90 271.02518
C 14 H 7 O 6 = 271.02481
80 1.34966 ppm
Relative Abundance
70
60
255.03024
50 C 14 H 7 O 5 = 255.02990
1.35792 ppm
40
30 151.00381 227.03523
107.01396 C 7 H 3 O 4 = 151.00368 C 13 H 7 O 4 = 227.03498
20 C 6 H 3 O 2 = 107.01385 447.09344
0.87950 ppm 1.10350 ppm
1.01951 ppm 335.12097 C 21 H 19 O 11 = 447.09328
10 C 10 H 23 O 12 = 335.11950 0.35844 ppm
4.39361 ppm
0
60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460
m/z
121
Fuente: Adaptado de VALLABHANENI, et al. (2012)
De igual forma utilizando estándares se identificaron, en la fracción tres aislada del

epicarpio (F3E), compuestos presentes en el extracto purificado del epicarpio (EPE) (tabla
25). Sin embargo en esta fracción no fue posible identificar compuestos como: ácido
ferúlico I, ácido ferúlico II, ácido sinápico, ácido siríngico y vainillina. En la figura 54 se
muestra el cromatograma HPLC-ESI-MS de la fracción F3E en modo negativo.
RT: 0.56 - 9.53
Mediante el estudio de los fragmentos se identificaron parcialmente los compuestos 4, 38,

100
3.11 NL: 2.27E8
ms2 577.1354@hcd60.00
90
40 y 7. Los picos 4 y 7 con tiempos de retención 3,14 y 4,09 min se identificaron mediante
80
[50.0000-605.0000] MS
onoides_DDA
el uso de estándares como procianidinas diméricas tipo B1 (Pico 4) y tipo B2 (Pico 7),
70
Relative Abundance
mostrando un ión pseudomolecular a m/z 577 [M-H]-, C30H26O12.Estos compuestos se

60
50 2.99
encontraron en la fracción F2S aislada de la semilla y en la fracción F2E aislada del
40 4.11
3.21
epicarpio. En la figura 81 se muestran los respectivos espectros MS/MS de los
30
20
compuestos 4 y 7. Los espectros de masas se muestran en el anexo I.
10
3.32
3.43
3.77
3.88
4.23
4.34 4.91
5.02 5.38 6.78 6.93 7.77 8.10
0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
Figura 81. Espectros MS-MS de los compuestos 4 y 7. Time (min)

125.02445
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
0.27882 ppm
100
90
407.07724
80 289.07227
C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 22 H 15 O 8 = 407.07724 4
Relative Abundance
70 1.74432 ppm -0.00162 ppm

60
161.02469
50
`
C 9 H 5 O 3 = 161.02442
83.01402 1.68527 ppm
40 245.08226
C 4 H 3 O 2 = 83.01385
30 1.95759 ppm C 14 H 13 O 4 = 245.08193
1.33809 ppm 339.08713
20
C 19 H 15 O 6 = 339.08741 462.31873
10 -0.83685 ppm C 24 H 46 O 8 = 462.31982
-2.35983 ppm
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
122
Relative Abundanc
60
50 2.99
40 4.11
3.21
30
20 3.32
3.77 4.23
10 3.43 4.34 4.91
3.88 5.02 5.38 6.78 6.93 7.77 8.10
0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9.0 9.5
Time (min)

125.02453
C 6 H 5 O 3 = 125.02442
0.88905 ppm
100
7
90
80
Relative Abundance
70
60 289.07205
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
50 161.02452 1.00533 ppm 407.07834
83.01388 C 22 H 15 O 8 = 407.07724
40 C 9 H 5 O 3 = 161.02442
C 4 H 3 O 2 = 83.01385 2.69720 ppm
0.64291 ppm
0.30331 ppm
30 245.08136
C 14 H 13 O 4 = 245.08193
20 -2.33525 ppm 339.08609
C 19 H 15 O 6 = 339.08741
10
-3.89683 ppm
0
50 100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600
m/z
Los picos 38 y 40 con tiempos de retención 3,35 y 3,83 min se identificaron como
procianidinas triméricas tipo B. El espectro de masas muestra un ión pseudomolecular en
m/z 865 [M-H]-,C45H38O18(Figura 82). Estos compuestos se encontraron previamente en la
fracción F3S aislada de la semilla.

865.20032
C 48 H 35 O 15 N = 865.20122
-1.04030 ppm
100
95
90 38
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
720.15979
C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
40
0.14302 ppm
35
30
25
20
15
577.13477
10 C 43 H 17 O N 2 = 577.13464
289.07172 439.06726 767.83411 960.21069
0.22372 ppm
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 22 H 15 O 10 = 439.06707 C 55 H 107 = 767.83783 C 60 H 34 O 12 N = 960.20865
116.92851
-0.15595 ppm 0.43477 ppm 701.87421 -4.84501 ppm 2.12947 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
123
865.20026
C 48 H 35 O 15 N = 865.20122
-1.11084 ppm
100
95
90 40
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15 720.15881
151.03999 576.12677 C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
10 C 8 H 7 O 3 = 151.04007 C 43 H 16 O N 2 = 576.12681 -1.21301 ppm
289.07184 432.09537 -0.07196 ppm 960.54376
-0.49076 ppm
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 35 H 12 = 432.09445 C 55 H 78 O 13 N = 960.54786
0.26633 ppm 2.12609 ppm -4.27084 ppm
546.77008 671.81244
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
124
CONCLUSIONES
- Mediante el diseño experimental se pudo establecer que los solventes empleados

(acetona 70% y metanol 80%) para la extracción de fenoles y polifenoles de
semilla y epicarpio del aguacate, no influyen significativamente (p<0,05, nivel de
confianza 95%) sobre el CFT y TEAC.
- Las técnicas de HPLC-ESI-MS y MS/MS permitieron la identificación en la semilla

de diferentes ácidos fenólicos (ácido protocatéquico, quínico, cafeico,
cafeoilquínico, p-cumárico cumaroilquínico, ferúlico, sinápico, y cítrico), un
aldehído (vainillina) y diversos compuestos fenólicos (catequina, epicatequina,
rutina, quercetina-3-O-glucósido, quercetina, apigenina, kaempferol, phloridzina,
procianidinas diméricas tipo B1 y B2 y procianidinas triméricas tipo A y B. En el
epicarpio se identificaron glicósidos de flavonoides como quercetina-3-O-
glucósido, rutina, quercetina-3-O-arabinosido, quercetina-3-O-ramnosido entre
otros y procianidinas diméricas y trímericas tipo A y B. En las fracciones más
pesadas (F3S y F3E) aisladas por cromatografía de exclusión por tamaño se
identificaron principalmente procianidinas dimérricas y triméricas.
- Se identificaron por primera vez en subproductos de aguacate los compuestos:

ácido 4-p-O-cumaroilquínico, kaempferol, apigenina, phloridzina, un aducto
dimérico del ácido cafeoilquínico y el ácido cafeoil-O- hexósido.
- El análisis de los datos mediante el procedimiento de diferencia mínima

significativa (LSD) de Fisher y la prueba de múltiples rangos permitió establecer
que existen diferencias estadísticamente significativas (p<0.05, nivel de confianza
95%) cuando se comparan los valores del CFT y TEAC de todas las muestras
(extractos purificados y fracciones). Los extractos crudos de semilla y epicarpio
(ECS y ECE) mostraron valores relativamente bajos en el CFT y TEAC con
respecto a los extractos purificados (EPS y EPE), se encontró que estos valores
son mayores para EPE y EPS. El mayor CFT y TEAC lo presentaron las fracciones
con peso molecular intermedio de la semilla y epicarpio (F2E y F2S) y las más
pesadas (F3E y F3S), siendo las fracciones F2E y F2S quienes presentan los
mayores valores.
- Se observó un comportamiento diferente para el caso de la actividad antioxidante

evaluada por el método DPPH, en donde no se obtuvo una correlación entre los
valores DPPH y CFT; sin embargo las fracciones más pesadas (F3S y F3E) fueron
las más antioxidantes (menor FRS50).
- Se comprobó que los subproductos de la fruta estudiada son una fuente
promisoria de compuestos bioactivos que podrían ser de importancia en la
industria alimentaria y farmacéutica, siendo más interesantes las fracciones con
mayor peso molecular.
125
- La RED RIFRUTBIO continuará con las investigaciones en este campo, para las
fracciones más activas (F2S, F2E, F3S y F3E) se evaluará el potencial efecto
sobre la bacteria H. pylori asociada con el desarrollo de cáncer gástrico, una
enfermedad con alta ocurrencia en el Departamento de Nariño.
126
RECOMENDACIONES
Se recomienda la realización de la cuantificación mediante estándares de los compuestos

mayoritarios de las fracciones más activas encontradas en los residuos de aguacate.
Se sugiere realizar un nuevo proceso de separación por cromatografía en columna a las

fracciones más pesadas recolectadas en el proceso de fraccionamiento, y de esta forma
simplificar en mayor medida este tipo de extractos facilitando el proceso de identificación
de los compuestos poliméricos.
Por las características bioactivas encontradas en este trabajo para los residuos de
aguacate, se recomienda seguir las investigaciones en este campo con el fin de evaluar
alternativas de uso en el sector alimenticio o farmacéutico.
127
PRODUCTOS DE LA INVESTIGACIÓN
PONENCIAS TIPO PÓSTER
WARPA: 5th WORKSHOP IN RECENT ADVANCES ON SAMPLE PREPARATION,

realizada desde 7 al 10 de Septiembre del 2015, Universidad de Caldas, Manizales-
Colombia.
 Resultado preliminares en la extracción y caracterización de principios activos

polifenólicos con actividad antioxidante a partir de residuos de aguacate (Persea
americana): semilla y epicarpio.
V Congreso Iberoamericano de Productos Naturales, realizado desde 25 al 29 de

Abril del 2016, Hotel Tequendama, Bogotá- Colombia.
 Extracción, contenido fenólico y actividad antioxidante de los polifenoles aislados

de residuos de aguacate, semilla y epicarpio (Persea americana).
I Simposio de Ciencias Exactas y Naturales y III Jornada de actualización Científica

en Química, realizado desde 24 al 27 de Octubre del 2016 , Universidad de Nariño ,
San Juan de Pasto-Colombia.
 Extracción, contenido fenólico y actividad antioxidante de los polifenoles aislados

de la semilla y epicarpio de aguacate (Persea americana).
ARTÍCULO EN REDACCIÓN
 Rosero, C.J., Hurtado, N. H., Cruz S., Osorio C. Chemical study and antioxidant
activity of polyphenols isolated from avocado by - products (Persea americana Mill)
grown in Colombia. Food Chemistry.
128
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Food Analytical Methods, 2010.vol.3, p. 90-97
140
ANEXOS.
Anexo A. Datos para la construcción de curvas de calibración.
Tabla1. Datos obtenidos para la construcción de la recta de calibrado en la determinación

de flavonoides totales empleando como patrón catequina.
Concentración de Absorbancia± desviación

a
catequina(mg/L) estándar
10 0,052± 0,002
30 0,107± 0,004
60 0,201± 0,004
100 0,341± 0,012
150 0,519±0,012
200 0,768± 0,005
a
DS de tres réplicas
Tabla 2. Datos para la curva de calibración con DPPH.
Concentración de DPPH Absorbancia± desviación estándar

(mM)
0,0025 0,033±0,003
0,005 0,058±0,001
0,0075 0,087±0,003
0,01 0,117±0,002
0,02 0,249±0,004
0,03 0,357±0,007
0,04 0,514±0,009
0,05 0,598±0,003
Tabla 3. Datos para la curva de calibración con patrón de ácido gálico
Concentración de ácido gálico a %DPPH Remanente

30 53,8295512
40 31,1734202
60 15,8404831
70 14,9822963
141
Anexo B. Prueba de múltiples rangos para las metodologías TEAC, DPPH y FT.
Tabla 1. Pruebas de Múltiple Rangos para valores CFT por fracciones y extractos
purificados.
Contraste Sig. Diferencia +/-

Límites
EPS - F1S * 10,8041 1,33083

EPS - F2S * 5,79845 1,33083
EPS - F3S * 6,35032 1,33083
EPS – EPE * 6,28036 1,33083
EPS - F1E * 13,61 1,33083
EPS - F2E * 4,65586 1,33083
EPS - F3E * 6,43582 1,33083
F1S - F2S * -5,00564 1,33083
F1S - F3S * -4,45377 1,33083
F1S – EPE * -4,52373 1,33083
F1S - F1E * 2,80595 1,33083
F1S - F2E * -6,14823 1,33083
F1S - F3E * -4,36827 1,33083
F2S - F3S 0,551864 1,33083
F2S – EPE 0,481909 1,33083
F2S - F1E * 7,81159 1,33083
F2S - F2E -1,14259 1,33083
F2S - F3E 0,637363 1,33083
F3S – EPE -0,0699545 1,33083
F3S - F1E * 7,25973 1,33083
F3S - F2E * -1,69445 1,33083
F3S - F3E 0,0855 1,33083
EPE - F1E * 7,32968 1,33083
EPE - F2E * -1,6245 1,33083
EPE - F3E 0,155455 1,33083
F1E - F2E * -8,95418 1,33083
F1E - F3E * -7,17423 1,33083
F2E - F3E * 1,77995 1,33083
Tabla 2. Pruebas de Múltiple Rangos para valores DPPH por fracciones y extractos
purificados.

Límites
EPS - F1S -100,951 132,451

EPS - F2S -14,1843 132,451
EPS - F3S 3,82 132,451
EPS - EPE 7,5312 132,451
EPS - F1E * -283,407 132,451
EPS - F2E 5,4075 132,451
142
EPS - F3E 10,3339 132,451
F1S - F2S 86,767 132,451
F1S - F3S 104,771 132,451
F1S - EPE 108,483 132,451
F1S - F1E * -182,456 132,451
F1S - F2E 106,359 132,451
F1S - F3E 111,285 132,451
F2S - F3S 18,0043 132,451
F2S - EPE 21,7155 132,451
F2S - F1E * -269,223 132,451
F2S - F2E 19,5918 132,451
F2S - F3E 24,5182 132,451
F3S - EPE 3,7112 132,451
F3S - F1E * -287,227 132,451
F3S - F2E 1,5875 132,451
F3S - F3E 6,5139 132,451
EPE - F1E * -290,938 132,451
EPE - F2E -2,1237 132,451
EPE - F3E 2,8027 132,451
F1E - F2E * 288,815 132,451
F1E - F3E * 293,741 132,451
F2E - F3E 4,9264 132,451
Tabla 3. Pruebas de Múltiple Rangos para valores FT por fracciones y extractos

purificados.

Límites
EPS - F1S * 406,306 32,0466

EPS - F2S * 65,3153 32,0466
EPS - F3S * 65,7658 32,0466
EPS – EPE * -75,2252 32,0466
EPS - F1E * 446,847 32,0466
EPS - F2E * -117,568 32,0466
EPS - F3E * 33,7838 32,0466
F1S - F2S * -340,991 32,0466
F1S - F3S * -340,541 32,0466
F1S - EPE * -481,532 32,0466
F1S - F1E * 40,5405 32,0466
F1S - F2E * -523,874 32,0466
F1S - F3E * -372,523 32,0466
F2S - F3S 0,45045 32,0466
F2S - EPE * -140,541 32,0466
F2S - F1E * 381,532 32,0466
F2S - F2E * -182,883 32,0466
F2S - F3E -31,5315 32,0466
F3S - EPE * -140,991 32,0466
F3S - F1E * 381,081 32,0466
143
F3S - F2E * -183,333 32,0466
F3S - F3E -31,982 32,0466
EPE - F1E * 522,072 32,0466
EPE - F2E * -42,3423 32,0466
EPE - F3E * 109,009 32,0466
F1E - F2E * -564,414 32,0466
F1E - F3E * -413,063 32,0466
F2E - F3E * 151,351 32,0466
Anexo C. Gráficas de comparación de medias de extractos purificados y fracciones de

epicarpio y semilla obtenidos en las metodologías de CFT, TEAC, DPPH y FT.
Figura 1. Gráfica de medias para los valores de CFT en extractos purificados y fracciones
Medias y 95,0% de Fisher LSD
CFT mg ácido gálico/ g extracto seco
1330
1130
930
730
530
330
EPS F1S F2S F3S EPE F1E F2E F3E
Figura 2. Gráfica de medias para los valores TEAC en extractos purificados y fracciones
TEAC mM Trolox/ g extracto seco
20
16
12
0
Figura 3. Gráfica de medias para los valores de FT en extractos purificados y fracciones

800
FT mg catequina/ g extracto seco
600
400
200
0
144
Figura 4. Gráfica de medias para los valores DPPH en extractos purificados y fracciones
500
EC50 g antioxidante/ kg DPPH

400
300
200
100
0
ANEXO D. Análisis de varianza y gráficas de correlaciones
Tabla 1. Análisis de varianza de valores CFT y TEAC en fracciones y extractos

purificados de epicarpio.
Figura 1. Correlación entre

Col_5 = 0,481274 TEAC y CFT para el epicarpio.
+ 0,0118039*Col_4
Y= 0,481274+ 0,0118039* X r= 0,984621
14,7
12,7
10,7
8,7
6,7
4,7
360 560 760 960 1160
CFT mg ácido gálico/ g extracto
Tabla 2. Análisis de varianza de valores CFT y FT en fracciones y extractos purificados

de semilla.
145
Tabla 3. Análisis de varianza de valores CFT y FT en fracciones y extractos purificados
de epicarpio.
Figura 2. Correlación entre CFT y FT para la semilla (a) y epicarpio (b).

A.Col_5 = -134,022 + 0,764851*A.Col_4

Y= -134,022 + 0,764851 X r= 0,990898
Y = 42,7833 + 0,464482*X r= 0,780676
800
680
FT mg catequina/ g extracto
FT mg catequina/ g extracto
580 600
480
400
380
200
280 (a) (b)
180 0
580 780 980 1180 1380 360 560 760 960 1160
CFT mg ácido gálico/ g extracto CFT mg ácido gálico/ g extracto
Tabla 4. Análisis de varianza de valores CFT y DPPH en fracciones y extractos

purificados de semilla.
Tabla 5. Análisis de varianza de valores CFT y DPPH en fracciones y extractos

146
Figura 4. Correlación entre CFT y DPPH para la semilla (a) y el epicarpio (b).
Col_5 = 213,076 - 0,105731*Col_4

Y= 213,076 - 0,105731* X r= - 0,659938
Y = 527,036 - 0,432941*X r= - 0,99
200
EC50 g antioxidante / kg DPPH
EC50 g antioxidante/ kg de DPPH

400
180
300
160
140 200
120
100
100 (a) (b)
80 0
580 780 980 1180 1380 360 560 760 960 1160
CFT mg ácido gálico/ g extracto CFT mg ácido gálico/ g extracto
Tabla 6. Análisis de varianza de valores TEAC y DPPH en fracciones y extractos

Tabla 7. Análisis de varianza de valores TEAC y DPPH en fracciones y extractos

Figura 6. Correlación entre TEAC y DPPH para la semilla (a) y el epicarpio (b).
Col_5 = 533,656 - 35,639*Col_4
Gráfica del Modelo Ajustado Gráfica del Modelo Ajustado

Y = 227,768 - 8,68757*X r= - 0,780215 Y= 533,656 - 35,639* X r= - 0,976988
200 400
180
300
160
140 200
120
100
100 (a) (b)
80 0
7 9 11 13 15 17 19 4,7 6,7 8,7 10,7 12,7 14,7
TEAC mM Trolox/ g extracto TEAC mM Trolox/ g extracto
147
Tabla 8. Análisis de varianza de valores FT y TEAC en fracciones y extractos purificados
de semilla.
Tabla 9. Análisis de varianza de valores FT y TEAC en fracciones y extractos purificados

de epicarpio.
Figura 8. Correlación entre FT yCol_5TEAC

= 2,60001 + 0,0153367*Col_4
para la semilla(a) y el epicarpio(b).
Y = 3,04252 + 0,0208375*X r= 0,861648 Y= 2,60001 + 0,0153367* X r= 0,987465
19 14,7
17 TEAC mM Trolox/ g extracto

12,7
15
10,7
13
8,7
11
9 6,7
(a) (b)
7 4,7
180 280 380 480 580 680 0 200 400 600 800
FT mg catequina/ g extracto FT mg catequina/ g extracto
Tabla 10. Análisis de varianza de valores FT y DPPH en fracciones y extractos
Tabla 11. Análisis de varianza de valores FT y DPPH en fracciones y extractos

148
Figura 10. Correlación entre FT y DPPH para la semilla y epicarpio.
Col_5 = 441,215 - 0,547006*Col_4

Y = 239,737 - 0,26435*X r= -0,981704 Y= 441,215 - 0,547006* X r= - 0,965498
200 400

180
300
160
140 200
120
100
100
80
(a) 0 (b)
180 280 380 480 580 680 0 200 400 600 800
FT mg catequina/ g extracto FT mg catequina/ g extracto
ANEXO E. Concentraciones y % DPPH remanente para extractos purificados y

fracciones de semilla y epicarpio.
a
C extracto % [DPPH ∙]
Extracto Remanente
90 48,43645035
EPS 120 33,91150678
140 18,57962191
160 15,51324493
90 82,37464068
F1S 120 63,8568581
140 55,43461361
170 45,8410636
200
70 72,3481796
F2S 90 57,8309739
120 39,9725066
140 27,7596193
170 19,8097209
90 48,85206791
F3S 120 27,39739841
140 14,92508387
160 14,06689709
a
C patrón % [DPPH ∙]
Extracto Remanente
70 61,63263363
EPE 90 48,39449874
120 25,44839827
140 9,841333986
120 86,9532316
F1E 140 82,8044684
160 80,9484427
180 75,5987218
200 71,6137256
70 62,73236
F2E 90 49,8922488
105 36,2170083
149
120 26,8740005
140 13,7207158
70 68,2284763
F3E 90 41,4735089
105 30,5578538
120 17,5519669
140 10,6774267
a
g antioxidante/L
ANEXO F. Gráficas para calcular FRS50 para ácido gálico extractos purificados de semilla
y epicarpio de aguacate y sus respectivas fracciones.
EPS F3S
r=-0,996111 r= -0,993167

%DPPH Remanente = 99,009 - 0,568242*Concentración antioxidante F3S
%DPPH remanente = 99,1554 - 0,545766*Concentración antioxidante ERP S
100
100
80
%DPPH Remanente 80
%DPPH remanente
60 60
50% 50%
40 40
20 20
EC50= 90,07±45,36 EC50= 86,25± 61,08

0 0
0 40 80 120 160 0 40 80 120 160
g EPS/ kg DPPH g F3S/ kg DPPH
F2S F1S
r=-0,992985 r=-0,991877
100
105
80
%DPPH Remanente
95
%DPPH Remanente
85
60
50%
75
40
65
20
55
50%
EC50= 104,3± 48,46 EC50= 191,02 ±90,54
0 45
0 30 60 90 120 150 180 0 40 80 120 160 200
g F2S/ kg DPPH g F1S/ kg DPPH
150
EPE F3E
r= -0,995579 r= -0,983403
%DPPH Remanente = 102,854 - 0,640374*Concentración antioxidante EPE %DPPH Remanente = 103,922 - 0,676282*Concentración antioxidante F3 E
100 100
80
%DPPH Remanente
80
%DPPH Remanente
60 60
50% 50%
40 40
20 20
EC50= 82,54±41,75 EC50= 79,73±63,07

0 0
0 30 60 90 120 150 0 30 60 90 120 150
g EPE/ kg DPPH g F3E/ kg DPPH
F2E F1E
r=-0,996106 r=-0,984375
%DPPH Remanente = 102,497 - 0,620102*Concentración antioxidante F2E %DPPH Remanente = 109,892 - 0,189424*Concentración antioxidante F1 E
100 87
80
%DPPH Remanente
83
g F2E/ kg DPPH
60
50%
79
40
75
20
EC50= 84,66±29,41
0 71
0 30 60 90 120 150 110 130 150 170 190 210
Concentración antioxidante F2E Concentración antioxidante F1 E
151
ANEXO G. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 presentes en F2E.
577.13550
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
100
95
0.60419 ppm
4
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
513.12000
15
C 29 H 21 O 9 = 513.11911 865.19891
10 1.73388 ppm C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
455.09836 720.15900 1.02763 ppm
289.07184
C 23 H 19 O 10 = 455.09837 C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176
116.92853 -0.02596 ppm -0.95876 ppm
0.26633 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

577.13538
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.39267 ppm
100
95 7
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
504.09805
C 19 H 22 O 15 N = 504.09949
15
-2.85477 ppm
10 425.08789 865.19867
675.10223 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
305.06674 C 22 H 17 O 9 = 425.08781
C 36 H 21 O 13 N = 675.10184 0.74545 ppm
5 C 15 H 13 O 7 = 305.06668 0.20070 ppm
0.58666 ppm
116.92850 212.07501 0.21619 ppm 536.78290
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
ANEXO H. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para los compuestos 5 y 9 presentes en

F2E
289.07190
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
0.47747 ppm
100
95
90
5
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15
579.15125
10 C 30 H 27 O 12 = 579.15080
245.08186 865.19873
C 14 H 13 O 4 = 245.08193 425.08740 0.76959 ppm 725.11725
5 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
C 22 H 17 O 9 = 425.08781 C 40 H 23 O 13 N = 725.11749
-0.28067 ppm 0.81600 ppm
-0.94796 ppm -0.33009 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
152
289.07196
C 15 H 13 O 6 = 289.07176
0.68861 ppm
100
95
90
9
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15
579.15118
10 C 30 H 27 O 12 = 579.15080
245.08188 403.08163 865.19879
0.66420 ppm 739.16681
5 C 14 H 13 O 4 = 245.08193 C 23 H 15 O 7 = 403.08233 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
C 39 H 31 O 15 = 739.16684
-0.21841 ppm -1.71560 ppm 0.88654 ppm
-0.04633 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
Fuente: Está investigación
Anexo I. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 presentes en F3E.

577.13538
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.39267 ppm
100
95 4
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20 865.19763
C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
15 -0.45381 ppm
720.15912
10 C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
425.08792
289.07184 959.53796
C 22 H 17 O 9 = 425.08781 -0.78925 ppm
5 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 C 55 H 77 O 13 N = 959.54004
116.92851 0.27249 ppm
0.26633 ppm -2.16317 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z

577.13544
C 30 H 25 O 12 = 577.13515
0.49843 ppm
100
95
7
90
85
80
75
70
65
60
Relative Abundance
55
50
45
40
35
30
25
20
15 865.19861
425.08798 C 58 H 29 O 7 N 2 = 865.19802
10 151.04001 289.07184 C 22 H 17 O 9 = 425.08781 720.15900 0.67491 ppm
C 8 H 7 O 3 = 151.04007 C 15 H 13 O 6 = 289.07176 0.41607 ppm C 38 H 28 O 13 N 2 = 720.15969
5 0.26633 ppm
-0.38973 ppm -0.95876 ppm
0
100 150 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000
m/z
153

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EXTRACCIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE LOS PRINCIPIOS ACTIVOS FENÓLICOS

CON ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE A PARTIR DE RESIDUOS DE AGUACATE:

JOHANNA CATALINA ROSERO ROSERO

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

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JOHANNA CATALINA ROSERO ROSERO

Trabajo de grado para optar al título de Químico

Ph.D. en Ciencias Químicas

SILVIA CRUZ SÁNCHEZ.

Ph.D. en Ciencias Químicas

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES

SAN JUAN DE PASTO

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A Dios por ser el pilar de mi vida, ser la luz de mis días.

A mi madre por ser mi mayor ejemplo de amor incondicional, esfuerzo, sacrificio y

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3.4.1 Determinación del contenido de fenoles totales 49

3.4.2 Método ABTS (ácido 2,2`-azinobis- (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonato)): 49

3.5 PURIFICACIÓN Y SEPARACIÓN DE LOS COMPUESTOS 50

3.5.1 Fraccionamiento de los extractos purificados 50

3.6 DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE POR EL 53

3.7 DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES. 53

3.8 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC –ANALÍTICA Y 54

3.8.1 Análisis de compuestos fenólicos por HPLC-MS 54

4.1 CLASIFICACIÓN DEL FRUTO. 55

4.2 AISLAMIENTO DE LOS EXTRACTOS CRUDOS Y DETERMINACIÓN 55

4.2.1 Determinación de la actividad antioxidante 55

4.2.2 Determinación del contenido fenólico total (CFT) 57

4.3 Estudio de la variación de la actividad antioxidante bajo las diferentes 58

4.5 CONTENIDO FENÓLICO TOTAL DE FRACCIONES Y EXTRACTOS 62

4.6 ESTUDIO COMPARATIVO DE LA TEAC DE LOS DIFERENTES 66

4.7 Actividad antioxidante (Método DPPH) 69

4.8 FLAVONOIDES TOTALES (FT) 73

4.9 IDENTIFICACIÓN DE COMPUESTOS FENÓLICOS POR HPLC-ESI-MS 75

4.9.1 Identificación de compuestos fenólicos por HPLC-ESI-MS en semilla 75

4.9.1.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1S 81

4.9.1.2 Identificación de los compuestos fenólicos en F2S 89

4.9.1.3 Identificación de los compuestos fenólicos en F3S 95

4.9.2 ANÁLISIS DE COMPUESTOS FENÓLICOS EN EPICARPIO 101

4.9.2.1 Identificación de los compuestos fenólicos en F1E 105

4.9.2.2 Identificación de los compuestos fenólicos en F2E. 111

4.9.2.3 Identificación de los compuestos fenólicos en F3E 1222

PRODUCTOS DE LA INVESTIGACIÓN 128

Tabla 1. Metabolitos secundarios fenólicos encontrados en extractos 27

Anexo A. Datos para la construcción de curvas de calibración. 141

Anexo B. Prueba de múltiples rangos para las metodologías 142

Anexo C. Gráficas de comparación de medias de extractos purificados 144

Anexo E. Concentraciones y % DPPH remanente para extractos 149

Anexo G. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 152

Anexo H. Espectro de masas HPLC-ESI-MS para los compuestos 152

Anexo I. Espectro de masas HPLC-ESI-MS de los compuestos 4 y 7 153

ABTS Ácido 2,2` -azinobis- (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato)

AGLÍCONA: compuesto orgánico combinado con la porción azúcar de un glucósido y que

ANTIOXIDANTE: moléculas presentes de forma natural en muchos alimentos que tienen

BIOPROSPECCIÓN: búsqueda sistemática, clasificación e investigación de nuevas

CROMATOGRAFÍA LÌQUIDA DE ALTA EFICIENCIA (HPLC): técnica utilizada para

DISEÑO EXPERIMENTAL: técnica estadística que permite identificar y cuantificar las