CERTIFICATION  

   
  ® SM  
AOAC  Performance Tested  
 
  Certificate No.  
   
121601  
 
The AOAC Research Institute hereby certifies that the performance of the test kit known as:
     
ROSA TRIO Test 
     
  manufactured by  
  Charm Sciences, Inc.   
659 Andover St. 
Lawrence, MA 01843 
USA 
 
This method has been evaluated in the AOAC® Performance Tested MethodsSM Program, and found to perform as stated by the manufacturer contingent to the comments 
contained in the manuscript.  This certificate means that an AOAC® Certification Mark License Agreement has been executed which authorizes the manufacturer to display the 
AOAC Performance Tested SM certification mark along with the statement ‐ "THIS METHOD'S PERFORMANCE WAS REVIEWED BY AOAC RESEARCH INSTITUTE AND WAS FOUND 
TO PERFORM TO THE MANUFACTURER'S SPECIFICATIONS" ‐ on the above mentioned method for a period of one calendar year from the date of this certificate (December 09, 
2016 – December 31, 2017).  Renewal may be granted at the end of one year under the rules stated in the licensing agreement.  

Deborah McKenzie December 09, 2016 

                                                        Deborah McKenzie, Senior Director Date  
Signature for AOAC Research Institute
2275 Research Blvd., Ste. 300, Rockville, Maryland, USA   Telephone:  +1‐301‐924‐7077   Fax:  +1‐301‐924‐7089 
Internet e‐mail:  aoacri@aoac.org * World Wide Web Site:  http://www.aoac.org 
 

ETHOD AUTHORS   SUBMITTING COMPANY         

ORIIGNAL VALIDATION:  Robert S. Salter, David Douglas,  Charm Sciences, Inc. 
Carla McPhee, Lindsey McRobbie, and Janine Schwartz  659 Andover St. 
Lawrence, MA 01843
     
KIT NAME(S)  CATALOG NUMBERS
ROSA TRIO Test  LF‐TRIO‐20K; LF‐TRIO‐100K; LF‐TRIO‐500K 
     
INDEPENDENT LABORATORY   AOAC EXPERTS AND PEER REVIEWERS
1 2 3
Eurofins‐DQCI  Joe Boison , Philip Kijak , Jim Agin   
1 
5205 Quincy Street  Canadian Food Inspection Agency, Saskatchewan, CANADA  
2
Mounds View, MN 55112   US FDA Center for Veterinary Medicine, Laurel, MD, USA 
3 
USA  Cincinnati, OH, USA 
     
APPLICABILITY OF METHOD   REFERENCE METHOD
Target organism – ß‐lactams, sulfonamides, and tetracycline drugs   
Matrices – raw commingled milk 
Performance claims ‐ The data generated indicate that the TRIO 
method is appropriate for testing trucks and farm tanks of 
commingled raw milk for the presence of β‐lactams, sulfonamides, 
and tetracyclines at or lower than the Canadian MRLs. 
     
 
ORIGINAL CERTIFICATION DATE  CERTIFICATION RENEWAL RECORD
December 09, 2016  New Approval 
 
METHOD MODIFICATION RECORD  SUMMARY OF MODIFICATION 
NONE  NONE 
 
SM SM
Under this AOAC® Performance Tested  License Number, 121601 this  Under this AOAC® Performance Tested  License Number, 121601 this 
method is distributed by:  method is distributed as: 
 
NONE  NONE 
 
PRINCIPLE OF THE METHOD (1)   
The TRIO test consists of a flow strip encased in a plastic outer container device. The flow strip consists of receptor and antibody binding agents attached to colloidal 
gold, a control line, and three detection lines, one for each drug class. The test lines are immobilized forms of the drug family where the BL line presents a β‐lactam 
ring, the S Line a sulfonamide structure, and the TE line a tetracycline structure.  Milk is added to the sample compartment of the flow device placed in a 56°C 
incubator. As milk flows through the device, it hydrates the binding agents and any antibiotic in the milk sample will attach to the agents. As the binding agents flow 
across the detection lines, any unbound binding agent will attach and form a reddish BL, S or TE line. Any antibiotic‐bound binding agent will then be captured on the 
control (C) line. After 3 minutes the test lines are compared to the control line using a reader, model Charm‐EZ or Charm‐EZ lite. If the test lines are the same or 
darker than the control line, then the sample is negative below the method’s level of detection. If any detection line is lighter than the control line, the sample is 
positive for a drug in the drug class of that binding line, BL (for β‐lactam), S (for Sulfonamide), or TE (for Tetracycline). The reader has the option to tell which line is 
positive, BL, S, or TE or their combination if multiple lines are lighter than the control line. Any combination of multiple 
positive lines is possible, BL, S, TE, BLS, BLTE, STE, BLSTE as shown in Figure 1. Alternatively the reader option can be turned off and only a positive will be delivered 
without drug line information.  
 
DISCUSSION OF THE VALIDATION STUDY (1) 
The Charm ROSA TRIO test demonstrated suitability as a screening test for raw commingled milk with a low negative error rate and low positive error rate. The Charm 
ROSA TRIO test negative error rate was less than 0.6% of with 2 negative observations, one at 100 ppb tetracycline and one at 10 ppb sulfadimethoxine, of 330 
positive samples at MRL. There was a positive error rate of less than 0.3% with two positive samples of 690 negative samples in the sensitivity study and these were 
potentially explained by operator error. Considering the other replicate negative and positive samples of the other experiments the positive error rate and negative 
error rates are likely considerably lower than the estimates from the sensitivity studies. 
Because the TRIO test is a multiplex assay detecting three drug families on one test strip, there were four instances when a true positive result for one drug family 
caused an erroneous identification of a second positive drug family. This erroneous‐positive‐family‐cross‐reaction occurred 2 times in the bacterial interference study 
with oxytetracycline causing a BLTE positive interpretation and occurred 2 other times in the sensitivity study of the tetracycline drugs with a BLSTE and STE 
interpretation.  These multiple positive results were also observed in the chemical interference study with low level positives of multiple drugs in one sample. 
It is manufacturer instruction, and common regulatory practice, to retest initial positive results in duplicate with positive and negative controls to verify a sample as 
presumptive positive. In cases where there may be operator error causing milk over test lines that is causing a positive result, or an erroneous family‐positive 
interpretation, the retested samples would likely produce a correct result. In the event of a presumptive double or triple positive family interpretation, and to avoid 
potential error in a positive drug family identification, it is manufacturer recommended to use family specific assays to confirm each positive family identified. For 
example a BLSTE presumptive positive sample should be confirmed with three tests specific to each family, i.e. β‐lactams, sulfonamides and tetracyclines. In this 
manner potential erroneous family positive results would be identified and corrected. 
The β‐lactam incurred study results indicate the TRIO test sensitivity with incurred samples is similar to that determined with fortified milk samples. This 
demonstrates that β‐lactam drugs after administration to cows are detected at Canadian MRL. This also meets the performance criteria to accept the TRIO method as 
a PMO approved β‐lactam bulk tank/tanker truck screening test (2, 5). Still to be performed with the independent laboratory are incurred samples studies with the 
tetracycline and sulfonamide drugs. FDA‐CVM indicated that consideration of a method for screening test approval could progress without incurred study results as 
the generated data would only impact potential precautionary statements that would appear on the manufacturer operators manual rather than the test approval 
status.  
  2275 Research Blvd., Ste. 300, Rockville, Maryland, USA   Telephone:  +1‐301‐924‐7077   Fax:  +1‐301‐924‐7089 
Internet e‐mail:  aoacri@aoac.org * World Wide Web Site:  http://www.aoac.org 
 ®
Charm Sciences, Inc., ROSA TRIO Test AOAC  Certification Number 121601 

 
Table 1: Sensitivity Determination by an independent laboratory compared to manufacturer calculations (1) 
  Concentration  Number Positive  Cumulative  Manufacturer 
Independent  Lab 
  Studied  (N=30)    Probability  of  Claim 90/95 
  90/95  detection 
except  zero (N=60)  of N=10 from  each  Detection  detection  level 
  1
lot except  N=20 for  (POD)  level  [ppb ]  and 
Drug  (Canadian 
0  expressed  as  2  1 
(CC‐β level) ppb
% positive  MRL/Target  testing 
[#pos/#tested] 
level) 

Lot  Lot  Lot 

006  009  010 

  0  0  0  0  0%   
     
     
  1  1  1  2  13%     
    4.7 
sulfadimethoxine  2  3 2 6 37% 7.6  (10)  (5.0) [40/40] 

4  7  7  10  80% 

6  10  9  9  93% 

10  10  9  10  97% 

 
 
 
  0  0  0  0  0%   
     
     
  2  1  0  0  3%     
    7.7 
sulfamethazine  4  0 1 4 17% 9.2  (10)  (7.7) [59/60] 

6  6  8  7  70% 

8  10  7  10  90% 

10  10  10  10  100% 

  3  
0  0  1^   0  1.6% 
     
     
  5  0  0  0  0%     
    21 
tetracycline  10  0 2 1 10% (21) [19/20] 
42  (100) 

15  4^  4  10  60% 

20  9  10  7  87% 

100  10  □  10  97% 

9

  0  0  0  0  0%   
     
     
  20  0 0 0 0%    
     
 ®
Charm Sciences, Inc., ROSA TRIO Test AOAC  Certification Number 121601 

  30  3  7  8  60% 
oxytetracycline  66 
53 (100)  (66) [40/40] 
40  3  9  8  67% 

◊
60  10   10  10  100% 

80  10  10  10  100% 

100  10  10  10  100% 

  0  0 0 0 0%  
     
     
  10  2  0  1  10%    54 
chlortetracycline  34  (100)  (54) [40/40] 
20  9  6  5  67% 

40  10  10  10  100% 

60  10  10  10  100% 

 
 
 
  100  10  10  10  100%   

  3  
0  0  1*   0  1.6% 
     
     
  1.25  3 1 0 13%    
    2.2 
Penicillin G  (2.2) [20/20] 
1.5  8  4  4  53%  2.0 (6) 

2  9  10  10  97% 

2.5  10  10  10  100% 

5  10  10  10  100% 

  0  0  0  0  0%   
     
     
  40  4 3 3 33%    
Ceftiofur  (incurred    φ
53  
Total  Metabolites) 
45  8  5  8  70%  50.0 (100)  (53) [40/40] 

50  10  10  10  100% 

60  10  10  10  100% 

100  10  10  10  100% 

  0  0 0 0 0%  
     
     
  2  0  0  0  0%     
   
7.4 
cloxacillin  4  3  0  0  10%  8.5 (10)  (7.4) [40/40] 
 ®
Charm Sciences, Inc., ROSA TRIO Test AOAC  Certification Number 121601 

6  6  5  7  60% 

8  9  9  10  93% 

10  10  10  10  100% 

  0  0 0 0 0%  
     
     
  1.5  2  2  3  23%    3.1 
amoxicillin  3.5 (10)  (3.1) [20/20] 
2  6  5  6  57% 

2.5  8  6  5  63% 

3  10  10  10  100% 

 
 
 
  10  10  10  10  100%   

  0  0  0  0  0%   
     
     
  2  0 0 0 0%    
    7.7 
4  0  0  10  3%  (7.7) [55/60] 
ampicillin  8.8 (10) 
(9.7) [60/60] 

6  0  4  8  37% 

8  8  10  10  93% 

10  10  10  10  100% 

  0  0  0  0  0%   
     
     
  4  0 0 0 0%    
   
14 
cephapirin  8  0  1  1  7%  14.5 (20)  (14) [38/40] 

12  7  8  8  77% 

16  10  10  10  100% 

20  10  10  10  100% 

1 
  ppb is part per billion and is equivalent to mg/kg concentration 
2 
CC‐ß is the minimal concentration in which number of negative results is less than 5% of the total number of tests performed.  Shown in parentheses is    
  the CC‐ß concentration studies and shown in brackets is [# positive/#tested} at the CC‐ß concentration.  
3
 There were 2 positives of 690 negative samples tested <0.3% positive. 
^ A positive‐BL observed was likely caused by milk over BL test line. 
*Likely a double test of penicillin G 2.0 ppb sample preceding the zero sample. 
# Invalid developed strip inserted into reader. 
◊ One positive was positive‐STE 
□ One positive was positive‐BLSTE likely caused by milk over BL and S lines 
Φ Prior claim level was ppb based on synthetic metabolite. This new level is based on incurred residue. Parent detection level is about 25 ppb of ½ of the
metabolite level.
 
 
 ®
Charm Sciences, Inc., ROSA TRIO Test AOAC  Certification Number 121601 

REFERENCES CITED 
1. Salter, R., Douglas, D., McPhee, C., McRobbie, L., and Schwartz, J., TRIO Method for Detection of ß‐ 
2. National Milk Producers. 2016. Milk and Dairy Beef Drug Residue Prevention‐ Producer Manual of Best Management Practices.  Arlington VA. 
http://www.nationaldairyfarm.com/residue‐ prevention 
3. U.S. Department of Health and Human Services (2015) Pasteurized Milk Ordinance, Appendix N, U.S. Food and Drug Administration, Public Health Service, 
Publication229 pp. 362‐379, Washington, DC 
4. Codex Alimentarius Commission. 2009. CAC/GL 71‐2009 Guidelines for the design and implementation of national regulatory food safety assurance 
programmes associated with the use of veterinary drugs in food producing animals. Joint FAO/WHO Food Standards Programme, CAC, Rome. 
https://www.google.com/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=3&ved=0ahUKEwiij‐ 
qTt6jOAhVhwYMKHVblDcAQFggrMAI&url=http%3A%2F%2Fwww.fao.org%2Finput%2Fdownload%2Fstandards%2F11252%2FCXG_071e_2014.pdf&usg=AFQj
CNEz9KJhlt78aFRD0xTB4PUb3iCG3g&bvm=bv.128987424,d.amc&cad=rja 
5. FDA. 2015. Multicriteria‐based Ranking Model for Risk Management of Animal Drug Residues in Milk and Milk Products. Food and Drug Administration, U.S. 
Department of Health and Human Services, Rockville,  MD. http://www.fda.gov/Food/FoodScienceResearch/RiskSafetyAssessment/ucm443549.htm 
6. FDA‐CVM. 2011.  FDA Center For Veterinary Medicine Data Requirements For Milk Screening Tests Labeled For Testing Milk At The Bulk Tank/Tanker Truck 
For Drug Residues Test Kits With Instrument Readers/Printers Only‐ β‐lactams 
7. FDA‐CVM. 2015. Protocol for Validation of Tetracycline tests kit submitted as part of the Appendix N Pilot Testing program approved at the 35th Meeting of 
the National Conference on Interstate Milk Shipments‐ Tetracyclines 
8. FDA‐CVM. July 22, 2016.  FDA Center For Veterinary Medicine Data Requirements For Milk Screening Tests Labeled For Testing Milk At The Bulk Tank/Tanker 
Truck For Drug Residues‐ Test Kits With Instrument Readers/Printers Milk Screening Test Evaluation Protocol, Sulfonamides: 
9. International Dairy Federation (2015) Draft V7 Procedure for the validation of qualitative screening tests for the detection of residues of veterinary drugs in 
milk. Standing Committee for Analytical Methods for Antimicrobials and Chemicals. Belgium. 
10. Anonymous. 2010. Guidelines for the validation of screening methods for residues of veterinary medicines (initial validation and transfer). Community 
Reference Laboratories Residues (CRLs). 20/01/2010: 1‐18. 
11. AOAC. March 6, 2016. Independent Laboratory Study for the Charm Sciences, Inc., TRIO Test for the simultaneous detection of beta‐lactams, sulfonamides, 
and tetracycline in raw commingled raw milk in 3 minutes. Gaithersburg, MD 
12. Salter, R.S., Conaway, D., Markovsky, R. (2008) Validation of the SL3 β‐Lactam Test for screening milk in compliance with U.S. Pasteurized Milk Ordinance: 
performance tested method 040701. J AOAC Int. v. 91:675–683. 
13. Salter, R.S., Douglas, D., McRobbie, L., Quintana, J., Legg, D., Schwartz, J., Markovsky, R.  (2011) Validation of the Charm 3 SL3 β‐Lactam Test for screening 
raw milk in compliance with the US Pasteurized Milk Ordinance. Performance tested method 071002. J AOAC Int. v.94:348–357.  
14. Chu, P., Von Bredow, J., & Carson, M. (2000) Multiresidue Detection of 5 ‐Lactam Residues in Milk by HPLC 
15. Moats, W. and Raida, H. JAOAC, 1995. pp. 49‐54 
16. Zomer et al,  JAOAC, 1995. pp. 1165‐1172 
17. Probit analysis https://www.xlstat.com/en/solutions/features/logistic‐regression‐for‐binary‐ response‐data‐and‐polytomous‐variables‐logit‐probit