LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

GUÍA No 3.- Desnaturalización de proteínas y reconocimiento de aminoácidos

I. EL PROBLEMA.

Identificar los diferentes factores que afectan la estabilidad de las proteínas y reconocer algunas de
las pruebas más comunes en la identificación de aminoácidos.

II. FUNDAMENTO TEÓRICO

REACCIONES DE RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS

Reacción con acetato de plomo alcalino

Los aminoácidos azufrados como la cisteína se reconocen por la formación de precipitados de

sulfuro de plomo de color gris oscuro o negro que se forman cuando reacciona con acetato de plomo
en medio alcalino.

Reacción Xantoproteica

Los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos reaccionan con ácido nítrico concentrado
formando nitroderivados de color anaranjado por lo cual esta reacción permite reconocer la
presencia de tirosina y triptófano.

DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

La desnaturalización consiste en el desdoblamiento total o parcial de la conformación nativa de

una cadena polipeptídica o una proteína. Consiste en romper las fuerzas que estabilizan la
estructura secundaria, es decir, los puentes de hidrógeno entre enlaces peptídicos y/o terciaria o
cuaternaria, como las fuerzas esquematizadas en la figura 1.

1) Puentes disulfuro. 3) Puente de hidrógeno.

2) Puente salino o interacción 4) Interacción hidrofóbica.
electrostática.

Las proteínas tal como se encuentran dentro de las células o en los fluidos corporales, tienen una
conformación nativa y se encuentran solubilizadas en soluciones coloidales o suspensiones
coloidales, si se producen ciertas alteraciones en las condiciones del medio acuoso las proteínas se
desdoblan pierden solubilidad y precipitan o coagulan.

Diversos agentes desnaturalizantes pueden inducir estas alteraciones como la agitación, el cambio
de temperatura, la adición de sustancias ácidas o básicas, sales, metales pesados, reactivos con
grupos tiol, solventes orgánicos, etc.

III. MATERIALES Y REACTIVOS.

Material por grupo

20 Tubos de ensayo
2 Pipetas graduadas de 5mL
2 Probetas de 10 mL
2 Gradillas
1 Propipeta
1 Pinza para tubo de ensayo
1 Espátula
5 Goteros plásticos

Material y reactivos generales.(volúmenes calculados para diez grupos de laboratorio)

- Acido tricloroacético (ATA) al 20% (200mL)

- Isopropanol al 96% (100mL)
- Hidróxido de sodio 20% (300 mL)
- Solución de acetato de plomo 0,1 M (100mL) (en gotero)
- Acido nítrico concentrado (100mL)
- Hidróxido de sodio 40% (100 mL) (en gotero)
- Hielo

Posibles muestras: (volúmenes calculados para un grupo de laboratorio)

- BSA al 3% en NaCl al 0,9% (200mL)

- Gelatina sin sabor en NaCl al 0,9% (200mL)
- Peptona al 3% en NaCl al 0,9% (200mL)
- Clara de huevo 1: 3 en NaCl al 0,9%( 200mL)
- Yema de huevo 1:1 en NaCl al 0,9%( 200mL)
- Leche cruda (200mL)
- Suplemento dietario: Protizyme banana creme (metabolic nutrition) al 5% en NaCl al 0,9%
(200mL)
- Caseína en NaOH al 1% (200mL)
- Solución de lactosuero: se lleva 150 mL de agua a 38°C, se añade 50 mL de leche
descremada calentada a la misma temperatura, luego se añade gota a gota y agitando ácido
acético 2M hasta la máxima precipitación (7 mL de ácido aprox.). Se deja enfriar y decantar,
separando la fase líquida (lactosuero) y se descarta la fase sólida (caseína).
- Solución de aminoácidos (1 g/L): cisteína y fenilalanina.

NOTA: el profesor escogerá una muestra para cada una de las pruebas e informará a los
estudiantes con anterioridad el nombre para elaborar el preinforme.
IV. PROCEDIMIENTO

PROCEDIMIENTOS DE DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS

1. Desnaturalización térmica:

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de la solución de la muestra, calentar al baño maría y observar si

se presenta algún cambio.

2. Desnaturalización por pH extremo:

Colocar en un tubo de ensayo 3 mL de solución de la muestra, adicionar 0.5 mL de ácido

tricloroacético (ATA) y observar.

3. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos:

Coloque en un tubo de ensayo 5 mL de la solución de la muestra, adicione 5 mL de isopropanol agite

y deje en reposo. Observe.

4. Desnaturalización por metales pesados:

En un tubo de ensayo coloque 3 mL de la solución de la muestra, adicione gota a gota (hasta 10

gotas) la solución de acetato de plomo 0.1M, agite y déjelo en reposo. Observe.

PROCEDIMIENTOS PARA RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS.

5. Reacción con acetato de plomo alcalino

En un tubo de ensayo coloque 3 mL de la solución de la muestra y en otro 3 mL de cisteína, adicione

2 mL de solución de NaOH al 20% a cada uno, y también 20 gotas de solución de acetato de plomo
0.1 M. Caliente ambos tubos al baño maría y observe.

6. Reacción xantoproteíca

En un tubo de ensayo coloque 3 mL de solución de la muestra y en otro 3 mL de fenilalanina,

adicione 1 mL de HNO3 concentrado a ambos tubos y caliéntelos al baño maría. Luego enfríe en un
baño con agua–hielo y adicióneles gota a gota una solución de NaOH al 40% agitando
cuidadosamente y en frío. Observar.

V. BIBLIOGRAFÍA.

- Aspectos teóricos relacionados con el laboratorio de Bioquímica. (1991). Medellín: Politécnico

Colombiano Jaime Isaza Cadavid.
- Cheftel, J. (1989). Proteínas alimentarias. Zaragoza: Acribia.
- Plummer, D. (1981).Bioquímica Práctica. México:Mc Graw Hill Latinoamericana.
- Rendina, G. (1974 ).Técnicas de Bioquímica aplicada. México: Interamericana.
 PREINFORME / DESNATURALIZACIÓN DE PROTEÍNAS Y RECONOCIMIENTO DE
AMINOÁCIDOS

Recuerde que solo entregará por escrito el título, las fichas técnicas, diagramas de flujo, resultados
esperados y bibliografía. En su quiz de laboratorio (oral o escrito) se le evaluarán sus diagramas de
flujo y la consulta.

1. Consulta

a) Revise sobre la composición de su muestra y diseñe una tabla con la siguiente información según
corresponda:
Una sola proteína: dé el nombre de esta y muestre la concentración o el número dentro de la
estructura primaria, de cada uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
Una mezcla de péptidos: mencione cómo se obtiene esta muestra y muestre la concentración
de cada uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
Una mezcla de varias proteínas: lista de las proteínas constituyentes y muestre la
concentración de cada uno de los 20 aminoácidos en su muestra.
Varias proteínas junto con otras biomoléculas: realice una lista de las proteínas constituyentes
e indique el contenido de proteína en porcentaje y además muestre la concentración de cada
uno de los 20 aminoácidos en una tabla.

b) Mencione en general si su muestra es inestable, es decir se desdobla y precipita con todos los
agentes desnaturalizantes a usar (temperatura alta, pH extremo, metal pesado y solvente orgánico),
o si por el contrario es estable en algunos.

*Para responder esta consulta revise libros de química de alimentos que incluyan la naturaleza
química, propiedades y posibles procesos de extracción de los materiales biológicos originales.
 2. Fichas técnicas
Propiedades de los reactivos a usar en el laboratorio
Reactivo Fórmula Aspecto Peligrosidad* Disposición de residuos

Ácido
tricloroacético

Isopropanol

Acetato de
plomo
Ácido nítrico

Hidróxido de
sodio
*
Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable (F), extremadamente
inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn), irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente
(N). Pictogramas SGA

3. Bibliografía (normas APA)

4. Procedimiento

4.1 Desnaturalización térmica

Resultado esperado _______________________________________________________________

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Diagrama de flujo:
Procedimiento

4.2 Desnaturalización por pH extremo

Resultado esperado:___________________________________________________________
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_____________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo:

4.3. Desnaturalización por presencia de solventes orgánicos

Resultado esperado: ________________________________________________________

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Diagrama de flujo:
4.4. Desnaturalización por metales pesados

Resultado esperado: _____________________________________________________

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Diagrama de flujo:

4.5. Reacción de aminoácidos con acetato de plomo alcalino

Resultado esperado: _____________________________________________________

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________________________________________________________________________
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Diagrama de flujo:

4.6 Reacción de aminoácidos con xantoproteíca

Resultado esperado: _____________________________________________________
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________________________________________________________________________
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INFORME Nombre________________________________________________ / Grupo____

1. Tablas
Construya una tabla por cada reactivo de reconocimiento (evite limitarse a escribir tubo 1, tubo etc.) y
describa en forma organizada las observaciones en cada tubo y si la prueba puede considerarse
positiva o negativa.
Incluya fotos de tubos debidamente marcados

2. Discusión de resultados

Recuerde que no es simplemente un cuestionario a responder y que deben corresponder con

tablas y FOTOS.
Para cada prueba de desnaturalización explicar y no solo describir, en forma concreta:
1- ¿Si ocurrió o no la desnaturalización y cómo se confirmo?
2-Los enlaces o interacciones que se ven afectadas por al exposición al agente
desnaturalizante
3-Aclare si se altera la estructura secundaria, terciaria y/o cuaternaria.
4-La relación con el fundamento teórico, el resultado esperado y consulta (naturaleza
química, composición y estabilidad de la muestra) del preinforme.
Para cada prueba de reconocimento de aminoácidos y proteína explicar:

1- El o los grupos funcionales que reaccionaron o los responsables de la coloración positiva

del ensayo con aminoácidos o proteína, use imágenes de fórmulas estructurales.

2-La ecuación química correspondiente con el o los aminoácidos particulares que pudo
identificar.

3-Describir el fundamento químico de la prueba realizada.

4-La relación con toda la información del preinforme: consulta (tablas de composición de
aminoácidos y proteínas) y resultado esperado.
*Recuerde explicar tanto las pruebas positivas o negativas y usar citas que correspondan
con la bibliografía.

4. Redacte la bibliografía correspondiente en normas APA.