Química Biológica 2010

Química Biológica
TP 5 ENZIMAS ,

Introducción

Las funciones vitales de la célula no son más que una serie de reacciones químicas, que en conjunto
determinan la existencia de una verdadera maraña de procesos y vías metabólicas. Estas reacciones
son llevadas a cabo con la ayuda de catalizadores orgánicos que reciben el nombre de enzimas.
Estos catalizadores son imprescindibles para la vida, su ausencia provocaría que las reacciones se
llevasen a cabo a velocidades tan lentas que no podrían satisfacerse los requerimientos celulares,
por lo que la vida no seria posible

Químicamente se trata de moléculas en su mayoría proteínas, sin embargo existen proteínas

formadas por ARN (ribozimas). Muchas de las propiedades de la acción enzimática se hallan
directamente relacionadas con la el echo que se trata de moléculas proteicas.

Al igual que todos los catalizadores, las enzimas aceleran las velocidades de reacción Tal variación
se debe a la disminución de la energía de activación, que es la energía necesaria para convertir los
reactivos en formas moleculares inestables denominadas especies en estado de transición. Las
enzimas pueden sufrir cambios transitorios durante la reacción, pero al finalizar la misma la queda
física y químicamente inalterada, además son eficaces en pequeñas cantidades. Ambas
características son comunes a todos los catalizadores, sin embargo dada su naturaleza proteica la
acción enzimática tiene algunas características propias:

 Son termolabiles, es decir que

su funcionalidad depende de la temperatura.
 Presentan una mayor eficiencia,
es decir que transforma una mayor cantidad de sustrato por unidad de tiempo.

 Poseen una alta especificidad en

relación con la reacción catalizada y el sustrato.

 Estan sujetas a una gran variedad

de controles celulares, genéticos y alostericos.

La actividad numerosas enzimas requiere de un componente no proteico (cofactor), que puede ser
un ion o una molécula orgánica (coenzima) entre la que encontramos algunas vitaminas. El
complejo enzima-cofactor recibe el nombre de holoenzima, si se separa la coenzima, la proteína
recibe el nombre de apoenzima.
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Nomenclatura y clasificación

En la actualidad existe dos nomenclatura para las distintas enzimas. En la nomenclatura tradicional
el nombre de la enzima se obtiene agregando el sufijo “asa” al nombre del sustrato (sacarasa,
ureasa, amilasa). La nomenclatura moderna es un tanto mas compleja, la enzima recibe: un nombre
recomendado, un nombre sistemático y un numero de clasificación. Las enzimas se clasifican según
la reacción que catalizan en

1. Oxido-reductasas: catalizan reacciones de oxido-reducción, las que implican la ganancia

(reducción) o pérdida de electrones (oxidación). Las más importantes son las deshidrogenasas y
las oxidasas.

Transferasas: transfieren grupos funcionales de una molécula a otra. Ej.: quinasas; transfieren
fosfatos del ATP a otra molécula. Pueden transferir:

Hidrolasas: rompen varios tipos de enlaces introduciendo H y OH.

Liasas: adicionan grupos funcionales a los dobles enlaces.

Isomerasas: convierten los sustratos isómeros unos en otros.

Ligasas o Sintasas: forman diversos tipos de enlaces aprovechando la energía de la ruptura del
ATP. Ej: polimerasas

Parte experimental

Objetivo: identificar enzimas a partir de su actividad especifica.

Se intentara identificar algunas enzimas presente en material biológico, de forma indirecta, a partir
de su actividad especifica. Se pondrá en evidencia la naturaleza proteica de estas a partir de ensayos
con proteínas sometidas a desnaturalización y de la influencia de la temperatura en la actividad
enzimática

1. Identificación de lipasa

La lipasa es una enzima secretada por el páncreas. presente en el intestino delgado que hidroliza los
triglicéridos a ácidos grasos de cadena larga.

Técnica:

Tomar 1 gr de pancreatina y suspenderlo en 10 ml de agua destilada, luego preparar tres tubos de la

siguiente manera:
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Tubo 1: colocar 10 ml de leche, 1ml dela suspensión de pancreatina y 10 gotas de rojo fenol, llevar
a ph neutro.

Tubo 2: colocar 10 ml de leche, 1ml dela suspensión de pancreatina previamente hervida durante 5
minutos y 10 gotas de rojo fenol, llevar a ph neutro.

Tubo 3: colocar 10 ml de leche, 1ml dela suspensión de pancreatina y 10 gotas de rojo fenol, llevar
a ph neutro.

Incubar los tubos 1 y 2 a 37° C y observar el cambio de color debido a la disminución del ph.

2. Identificación de sacarasa

En el metabolismo de las levaduras, la sacarosa es convertida en glucosa y fructuosa. Esta

transformación ocurre por medio de una enzima llamada sacarasa. Dado que la sacarosa es un
azúcar no reductor podemos identificar la acción de esta enzimas por la presencia de azucares
reductores.

Técnica:

Suspender 1 gr de levadura en 20 ml de acetona fría, la acetona destruye las células sin atacar la
enzima. Dejar reposar la suspensión 20 minutos, luego recuperar el precipitado y colocarlo en un
papel de filtro para secarlo. Suspender el precipitado en 3 ml de solución buffer de fosfato de
potasio 0.5M pH 4.5.

Agitar 5 minutos y centrifugar 5 minutos a 3000 rpm, luego recuperar el sobrenadante y resuspenda
en 5 ml de agua destilada. A continuación preparar tres tubos:

Tubo 1: 1 ml de agua destilada y 1ml de la solución que contiene la enzima.

Tubo 2: 1ml de agua destilada y 1 ml de solución de sacarosa al 1 %

Tubo 3: 1 ml de solución de sacarosa y 1 ml de la solución que contiene la enzima

Incubar los tubos 30 minutos a 37° C, y luego realizar el ensayo de Fehling.

3. Identificación de catalasa
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El peroxido de hidrógeno se descompone en agua y oxigeno por la acción de la enzima catalasa.

Colocar en un tubo 1 gr de hígado fresco y agregar 5 ml de peroxido de hidrógeno, observar el
burbujeo que evidencia la liberación de oxigeno.

4. Inhibición enzimática

Se evaluara la acción inhibitoria de la azida de sodio sobre la enzima glucosa oxidasa presente en el
metabolismo de las levaduras. Esta enzima cataliza el paso la oxidación de glucosa dando ácido
glucuronico.

Técnica:

Suspender 1 gr. de levadura en 50 ml de buffer fosfato de sodio 0.01 M NaCl 0.1 M pH 7.2, luego
agregar 5 ml de glucosa 10 mM. El reactivo de trabajo contiene glucosa oxidasa (GOD), peroxidasa
(POD), fenol y 4 aminofenazona. Preparar dos tubos:

Tubo 1: colocar 0.1 ml de la suspensión de levaduras, agregar 0.1 ml de agua destilada.

Tubo 2: colocar 0.1 ml de la suspensión de levaduras, agregar 0.1 ml de agua destilada, y 0.1 ml de
azida de sodio 2 % p/v

Incubar 20 minutos. Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo de trabajo e incubar ambos tubos 20
minutos. Si en el tubo aun queda glucosa debiese ocurrir la siguiente reaccion:

GLUCOSA + O2 + H2O -----(GOD) Acido glucuronico + H2O2

H2O2 + 4 aminofenazona + fenol ------- (POD) quinona coloreada + H2O

Actividades complementarias:

1. Definir: sitio activo, coenzima y holoenzima.

2. Diferencia enzimas nativas e inducibles.

3. Indica las enzimas que participan en el metabolismo extracelular de las proteínas

4. Indica ejemplos de enzimas:

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a. Hidrolasas

b. Liasas

c. Oxidoreductasas

5. Diferencia inhibición competitiva y no competitiva

6. Indica brevemente el efecto del ph y la temperatura sobre la actividad enzimática.