Obtención de poli-b-hidroalcanoato (PHA) a partir de bacteria

Rizhobium leguminarum, como alternativa de sustitución de

plásticos

Introducción

Rizhobium es una bacteria Gram negativa, ampliamente estudiada por su capacidad

para fijar nitrógeno, al asociarse simbióticamente con plantas leguminosas; esto ha
hecho que se emplee como fertilizante (inoculante) en la industria agrícola, por su
capacidad para alterar las propiedades del flujo de agua y la posibilidad de formar
geles. Este género produce polisacáridos de diferentes tipos, que pueden
clasificarse en dos categorías: lipopolisacáridos y exopolisacáridos (carbohidratos
que son secretados al medio a través de la membrana exterior, pueden ser de
carácter acido o neutro); también producen poli-b-hidroalcanoatos (PHA) que
poseen muchas de las propiedades generales, propias de los plásticos sintéticos y
glucógeno como medio para almacenar energía. Los exopolisacáridos ácidos: son
responsables de la formación de mucosidad; están compuestos generalmente por
unidades de octasacáridos polimerizadas. Exopolisacáridos neutros: algunas
especies de Rizhobium producen heteropolisacáridos capsulares de carácter neutro
compuestos por D-glucosa, D-galactosa y D-manosa en relaciones molares 1:3:2
formando unidades repetidas de hexasacáridos con características muy similares a
las que se reportan para biopolímeros como el curdlan.
Por otro lado, la bacteria Wautersia eutropha ATCC 17699 se emplea para la
producción de PHAs ya que genera gránulos internos de este material (Pries A.
1990). En esta investigación se realizó el crecimiento de esta bacteria en medios de
cultivo a base de suero de leche para la producción de este tipo de materiales. Entre
los plásticos biodegradables más estudiados actualmente son los PHAs, y dentro
de los cuales se encuentra el polihidroxibutirato (PHB), el más común.

La Ralstonia eutropha es una de las bacterias más utilizadas en la producción de

PHA, debido a que es capaz de almacenar hasta un 96% de este material en peso
seco; con la ventaja de emplear fuentes de carbono y energía renovables como la
fructosa y la glucosa, provenientes de subproductos agroindustriales (Betancur M y
Agudelo LM ,2011).

La Azotobacter vinelandii es una especie microbiológica de bacteria Gram negativa

quimiorganotrof, posee varias copias de su cromosoma, se calcula que pueden
tener hasta 80 copias. El número de copias varía dependiendo del medio y las
condiciones de cultivo, así como de la fase de crecimiento (Peña. C, 2002). Es de
tamaño muy grande de 2x5 nm de diámetro es decir de 5 a 10 veces el volumen de
E. coli. Las capacidades metabólicas y genéticas por las que A. vinelandii ha sido y
es objeto de estudio, principalmente porque fija nitrógeno atmosférico en presencia
de oxígeno por tres sistemas diferentes de nitrogenasa, posee mecanismos de
protección, una alta capacidad respiratoria que en condiciones diazotróficas o de
fijación de nitrógeno, es hasta 10 veces más alta que la de Escherichia coli. Produce
dos polímeros de uso industrial: el polisacárido extracelular alginato y el poliéster
intracelular polihidroxibutirato, sufre un proceso de diferenciación morfológica para
formar quistes resistentes a la desecación.
Planteamiento del problema
Los Polihidroxialcanoatos (PHA) son poliésteres lineales producidos en la
naturaleza por la acción de las bacterias por fermentación del azúcar o lípidos. Las
bacterias los producen como mecanismo de almacenamiento de carbono y energía,
también son plásticos biocompatibles y biodegradables sintetizados por una amplia
variedad de microorganismos, que comparten características muy similares con los
plásticos de origen petroquímico, estos bioplásticos son un material que en las
últimas décadas ha sido utilizado para remplazar a los plásticos derivados del
petróleo, en contraste con estos se pueden producir a partir de fuentes renovables
de energía.

En los últimos años, el concepto de plástico ha evolucionado hacia aquellos

materiales cuyo origen es distinto al petróleo y que puedan convertirse en
compuestos con características similares. Los biopolímeros basados en recursos
renovables y/o biodegradables están generando un creciente interés no solo en la
industria de los plásticos sino en la sociedad en general. Por ende, el término
biodegradación en el campo de los polímeros hace referencia al ataque de
microorganismos a estos materiales, proceso a través del cual se obtiene la
desintegración del polímero en pequeños fragmentos debido a la ruptura de enlaces
en su cadena principal.

La biodegradación de plásticos generalmente es un proceso complejo debido al

tamaño molecular de los polímeros y a su falta de solubilidad en agua, los
microorganismos no son capaces de transportar el material polimérico a sus células
donde la mayoría de procesos bioquímicos tienen lugar, por lo que inicialmente
excretan enzimas extracelulares que depolimerizan el material fuera de las células.
En cambio, los biopolímeros tienen un origen en materias orgánicas, en principios
renovables, que hacen que puedan biodegradarse por la acción de los
microorganismos a corto plazo.
Justificación

La obtención de bioplásticos a partir de polihidroxialcanoatos tiene gran potencial a

futuro debido a su aporte ecológico y aprovechamiento de recursos naturales en vez
de derivados del petróleo. La posibilidad de obtener compuestos químicos de
manera biológica ha llevado a los investigadores a experimentar nuevas alternativas
para su producción y ha sido entonces cuando los procesos biotecnológicos han
empezado a ocupar un lugar de privilegio en la industria mundial. Dentro de este
grupo de compuestos se encuentran los biopolímeros, una diversa y muy versátil
clase de nuevos materiales con potenciales aplicaciones en muchos de los sectores
de la economía. Estos van desde polisacáridos como Dextranos, Alginatos y
Xantanos hasta poliésteres como los Polihidroxialcanoatos (PHA´s). En este
proyecto se busca hacer posible, eliminar la mayoría de los plásticos que se utilizan
día a día no solo en el país, sino en el mundo entero y que a su exceso de
producción contaminan poco a poco al medio ambiente. La explotación del petróleo
recurso natural que es utilizado para la elaboración de materia prima como lo es el
plástico, este conduce inevitablemente al deterioro gradual del ambiente que afecta
en forma directa al suelo, agua, aire, la flora y la fauna; Debido a esta problemática
nos hemos propuesto crear plásticos que puedan desintegrarse fácilmente al
ecosistema en el que vivimos, esta a su vez tiene cualidades similares al plástico
común que es derivado del petróleo como su resistencia, eficacia entre otras, a partir
de aquí surge la necesidad de la creación de bioplásticos los cuales tienden a ser
una mejor solución ya que por su contenido de materiales orgánicos, son más
próximos a degradarse y afectan con menos posibilidad al medio ambiente, la
degradación resultada de la acción de microrganismos que se encuentran en la
naturaleza tales como bacterias, hongos y actinomicetos; plásticos
fotodegradables, en los que la degradación resulta de la acción de la luz solar y
plásticos degradables por hidrólisis, en los que la degradación, como su nombre lo
dice resulta de la hidrólisis, el término de biodegradación menciona que es el
proceso en el cual material polimérico es desintegrado o reducido a pequeñas
partículas o moléculas por organismos o sus enzimas, de tal manera que el carbón
contenido en el material finalmente retome a la biosfera.
Objetivo general

Obtener muestras de bioplásticos a partir de polímeros naturales que puedan ser

elaborados y utilizados en la vida cotidiana, reduciendo así la producción de este
tipo de residuos al medio ambiente.

Objetivos específicos.

● Aislar y propagar cepas.

● Obtención de PHA por vía fermentativa de estructura metabolica, utilizando
las bacterias (Ralstonia eutropha, Azotobacter vinelandii, Rizhobium
leguminarum).
● Realizar comparación de niveles de producción de las cepas estudiadas.

Diseño experimental

Variable dependiente Variable independiente

Determinación de biomasa (Pha) • pH

• Crecimiento de microorganismo

• Determinación de sustrato
(sacarosa)

• Lectura de espectrofotometría
infrarroja

• Tiempo

• Temperatura

Tabla 1 Diseño experimental

Marco teórico
La producción de PHAs fue descrita por primera vez en 1962 por Lemoigne, quien
aisló y caracterizó químicamente 3-hidroxibutirato a partir de observaciones por
microscopía de inclusiones citoplasmáticas en Bacillus megateriu. En años
posteriores a su descubrimiento, las investigaciones relacionadas con la producción
de PHAs estuvieron dirigidas a conocer su importancia metabólica en los
microorganismos y su papel en mecanismos celulares tales como la esporulación y
su función como fuente de energía (Slock y Stahly, 1974; Nakata 1966; Kominek y
Halvorson, 1965). No fue hasta finales de la década de los 70s cuando comenzaron
a estudiarse las enzimas involucradas en la de producción de PHAs, así como sus
características y composición química con potencial para uso en biotecnología
(Oeding y Schlegel, 1973; Senior y Dawes, 1973).

Los PHA son polímeros de ácidos hidroxialcanoicos que algunas bacterias, arqueas
y microalgas acumulan intracelularmente como material de reserva, para usarlo
posteriormente como fuente de carbono y energía. La polimerización de los ácidos
hidroxialcanoicos, por acción de enzimas intracelulares, tiene lugar mediante
condensación del grupo carboxilo de un monómero (ácido hidroxialcanoico), con el
grupo hidroxilo del siguiente, formándose un enlace éster de allí que también se les
conozca como biopoliésteres (Khanna y Srivastava 2005). Se acumulan como
polímeros líquidos, móviles y amorfos en forma de gránulos que se alojan en el
citoplasma microbiano rodeados de una monocapa de fosfolípidos que contiene
enzimas polimerasas y despolimerasas. Las investigaciones sobre el proceso de
acumulación de PHA indican que el número de gránulos por célula se define en las
primeras etapas de acumulación y que la producción del polímero cesa cuando su
contenido alcanza cerca del 80 % del peso celular en base seca. Este fenómeno ha
llevado a la conclusión de que existen restricciones físicas que impiden a la célula
acumular más polímero, a pesar de la disponibilidad de sustrato y actividad de la
enzima PHA polimerasa (Wang y Lee 1997).

Los PHA tienen características físicas similares a las de los plásticos derivados del
petróleo, como el polipropileno y polietileno, pero tienen la ventaja de que pueden
ser sintetizados a partir de fuentes de carbono renovables, son biodegradables
(pueden ser asimilados por muchos microorganismos ya sea de suelos, mares,
lagos o aguas residuales) y son biocompatibles (no causan efectos tóxicos). En la
naturaleza, los microorganismos son capaces de degradarlos hasta CO2 y agua, en
condiciones aerobias, y hasta metano, en condiciones anaerobias, por acción de las
enzimas PHA despolimerasas y PHA hidrolasas (Barbosa et al., 2005). Otra ventaja
de estos biopolímeros está asociada con los sustratos utilizados para su síntesis:
mientras para la producción de plásticos sintéticos se requiere materia prima de
origen petroquímico, los PHAs se pueden obtener a partir de diferentes desechos
agroindustriales, que constituyen materiales orgánicos de bajo costo
(Vishnuvardhan et al., 2009; Thirumala et al., 2010).

Estas propiedades les confieren una gran importancia como sustitutos de los
plásticos convencionales (Anderson y Dawes 1990).

En relación con las condiciones bajo las cuales ocurre la síntesis de los PHA, en la
mayoría de los casos tiene lugar en respuesta a una limitación de N, P, S, Mg u
oxígeno (Reddy et al. 2003), aunado a la presencia de un exceso de fuente de
carbono en el medio de cultivo.

A la fecha, se han identificado diversos géneros bacterianos con capacidad de

producir PHAs; aunque muchos de ellos han sido identificados como productores
de PHAs, en la mayoría de los casos no existen datos de crecimiento, rendimiento
y tipo de polímero producido (Lee, 1996).

Biopolímeros

Los biopolímeros, sustancias poliméricas producidas por organismos vivos han

recibido atención reciente en la investigación debido a sus características
únicas. Los biopolímeros son moléculas en forma de cadena formadas por bloques
químicos repetitivos producidos a partir de recursos renovables que podrían
degradarse en el medio ambiente. Propiedades únicas de no toxicidad
y biodegradabilidad de los biopolímeros. Impulsar sus aplicaciones en electrónica,
dispositivos médicos, energía, envasado de alimentos, etc. La incorporación de
refuerzo nanométrico en los biopolímeros o la composición de biopolímeros puede
mejorar las propiedades de los biopolímeros, por lo tanto, mejorar las aplicaciones
prácticas. Teniendo en cuenta la idoneidad, compatibilidad y sostenibilidad de la
interacción de nuevos materiales en biopolímeros, se pueden obtener nuevos
materiales con una excelente calidad eléctrica, mecánica, térmica y óptica. La
energía solar ofrece un gran potencial como fuente renovable de energía
eléctrica; sin embargo, las tecnologías actuales siguen siendo demasiado caras
para reemplazar las fuentes de energía no renovables.

El compuesto para tecnologías de energía renovable está obteniendo un interés

considerable debido a la combinación de ventajas de los polímeros con
bio/nanomateriales complejos. Por otro lado, los fotodetectores ligeros, flexibles,
económicos y de temperatura cercana a la temperatura ambiente basados
en biopolímeros compuestos también se hicieron populares en los últimos
años. Esta revisión se centra en la aplicación de fotodetección fotovoltaica y
ultravioleta (UV) de biopolímero compuesto / nanocompuesto. El proceso
de fabricación, las características y la influencia del biocompuesto en la eficiencia
de conversión de energía se explican brevemente. (Alfred Rudin, 2013)

Biopolímeros PHA producidos por microorganismos.

Los polihidroxialcanoatos (PHAs) son biopolímeros que algunos microorganismos

acumulan como reserva de carbono y energía, son producidos cuando hay
limitaciones nutricionales en el medio. El sistema genético asociado con la
producción de PHAs codifica para diversas proteínas formadoras de gránulos
citoplasmáticos. Estos biopolímeros han cobrado gran importancia debido a que
pueden ser utilizados reemplazando materiales como el plástico, que actualmente
genera gran acumulación y que se ha convertido en un alto foco de contaminación
ambiental debido a su lenta degradabilidad. La principal ventaja de los
polihidroxialcanoatos frente a los plásticos derivado del petróleo es que al ser
producidos por microorganismos son biodegradables por lo tanto no hay una
acumulación; los PHAs tienen diversas aplicaciones entre las que se encuentran:
empaques de larga y corta duración, injertos utilizados en medicina, productos de
higiene y biocombustibles. (Riaño, 2010).

Se resumen (ilustración 1) las rutas metabólicas hacia la síntesis de los diversos

precursores de polímeros. Las líneas continuas indican vinculación de rutas
metabólicas primarias con intermedios de biosíntesis de polímeros o catalizados por
enzimas directas conversiones hacia el precursor polimérico inmediato. Las líneas
discontinuas indican múltiples pasos enzimáticos. Polisacáridos se muestran en
cajas de color verde claro, los poliésteres se muestran en cajas de color rosa, las
poliamidas se muestran en cajas azules y las inorgánicas el polianhídrido se
muestra en un cuadro morado. FAB, biosíntesis de ácido graso de novo; FAD,
oxidación β de ácidos grasos; KDPG, el Vía 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato; NDP,
nucleósido 5ʹ-difosfato; P, fosfato; IGP, fosfoglucoisomerasa; PGM,
fosfoglucomutasa; Pha, enzima de síntesis de polihidroxialcanoato; PHAscl, PHAs
de cadena corta; PHAmcl, PHA de longitud de cadena media; Ciclo TCA, ciclo del
ácido tricarboxílico. (Rehm, 2016)

Las bacterias del genero Rhizobium son un grupo de microorganismos genéticamente

diversos y fisiológicamente heterogéneos, que están en una misma clasificación en virtud
de su capacidad para nodular plantas del grupo Leguminosae.

Ilustración 1 Vías de biosíntesis de polímeros bacterianos a partir de intermedios del metabolismo central
Rhizobium leguminosarum es una bacteria reconocida por su habilidad para fijar nitrógeno
en plantas leguminosas, así como por su capacidad para producir polisacáridos de tipo
extracelular y capsular (adheridos a la pared celular) por fermentación de azúcares como
lactosa o sacarosa, son microorganismos microaeróbicos, quimiorganotróficos, que se
pueden agrupar en cepas de crecimiento lento, cuyos tiempos de generación están entre 8
y 12 horas, y en cepas de crecimiento rápido con tiempos de generación entre 3 y 4 horas;
los requerimientos nutricionales varían según esta clasificación. Además, ha sido utilizada
como biofertilizante en la industria agrícola por su capacidad para fijar nitrógeno atmosférico
en plantas leguminosas, es además un microorganismo capaz de producir tres
biopolímeros diferentes, que hasta el momento no han sido muy estudiados; dos de ellos
son polisacáridos extracelulares, que se encuentran en el medio de cultivo y un tercero
que está adherido a la pared celular como polisacárido capsular.

Metodología
Se utilizó la bacteria Rhizobium Leguminosarum cepa 32 suministrada por la
Corporación del Instituto Colombiano Agropecuario, CORPOICA.

Preparación del inoculo

 Suspender 50g de polvo en 1 litro de agua destilada.

 Calentar y agitar hasta hervir.
 Esterilizar por 15 minutos a 121 ºC y 15 psi.

1. Medio de cultivo liquido enriquecido (previamente esterilizado por 15 minutos).

2. El volumen del inóculo fue de 10ml, volumen correspondiente al 10% del volumen a
inocular (100ml).
3. Se inoculó con la cepa conservada en caja Petri, tomando una asada de biomasa
hasta alcanzar una turbidez establecida según escala de McFarlan.
ESCALA MCFARLAN
Los estándares de turbidez de Mcfarlan se usan como referencia en suspensiones
bacteriológicas para saber que el número de bacterias por mililitro, o más bien en UFC
según una escala que va de 0.5 a 10. Estos estándares son creados al mezclar soluciones
de cloruro de bario al 1% en volúmenes específicos, para asegurar la densidad correcta se
puede controlar usando espectrofotómetros.
Los estándares pueden ser visualmente comparados con suspensiones de bacterias en
salina estéril o en caldos. Si la suspensión es demasiado turbia, puede añadirse diluyente,
y si no es lo suficiente turbia, se puede agregar más bacterias. La ventaja es que no es
necesario incubar ni usar equipo especial para estimar el número de bacterias. La
desventaja de este método es que no discrimina a las bacterias vivas de las muertas en la
solución, por lo que se puede sobreestimar la población de bacterias.
Casos específicos en los que se usa es en el de antibiogramas o pruebas de sensibilidad,
donde es necesario para estandarizar el método y se eviten falsos positivos o negativos.
4. se incubó a 30ºC durante 45 horas.
 Tiempo correspondiente a más o menos la mitad de la fase exponencial del crecimiento
de la célula.

Ensayos de fermentación
1. Las fermentaciones se realizaron en Erlenmeyer de 500ml (con tapón de gasa y
100ml de medio de cultivo estéril).
2. durante 72 horas, a una temperatura de 32ºC y una velocidad de agitación de 100
rpm.
3. La composición del medio de cultivo:
Sacarosa 20 g
Estracto de levadura 0.2 g
Nitrato de calcio 0.2 g
NaCl 0.6 g
MgSO4*7H2O 0.2 g
K2HPO4 0.5 g
Tabla 2 Composicion del medio de cultivo MacConkey

Todo disuelto en 100 mL de agua destilada.

Cinéticas de biomasa, sustrato y producto.

Se realizaron ensayos en Erlenmeyer de 100ml con 50ml de medio de cultivo y un inóculo

del 10% durante las 72 horas de reacción. Para cada mediada se tomaba un Erlenmeyer
diferente y a la muestra se le determinó biomasa, consumo de sustrato y la cantidad de
polisacárido producido. Además se midió el pH al comienzo y final de la fermentación.

Separación y determinación de la cantidad de biopolímero.

1. Centrifugar el caldo de fermentación a 5000rpm durante 30 minutos.
2. Al sobrenadante se le agrega etanol al 92% en relación volumen 3:1.
3. Dejar reposar entre 24 y 48 horas.
4. Cuidadosamente retirar el polímero que flota en el etanol y depositarlo en frascos
previamente tarados y pesados.
5. Retirar el etanol y cuidadosamente con ayuda de un agitador de vidrio retirar el polímero
que se encuentra adherido en el fondo del recipiente en forma de gel y depositarlo en
frascos previamente pesados.
6. Llevar los frascos a estufa a 40ºC y secar hasta peso constante (entre 2 y 3 días).
7. Determinar la cantidad de polisacáridos por diferencia de pesos.

Caracterización del polímero.

 Ensayos de disoluciones y ebulloscopia.

 1. Preparar diluciones (concentración de polisacáridos), utilizar como solvente
el agua.
2. Observar el comportamiento de la disolución.
3. Medir temperaturas de ebullición de las soluciones con el fin de establecer
si estas aumentaban con la concentración.
4. Si presenta una tendencia lineal se permite tratar de encontrar el peso
molecular de los polímeros por el método de ebulloscopia.
5. Las concentraciones trabajadas fueron 2, 3, 4, 5, 6 y 7 g/l tanto para P1 como
para P2.
6. Graficar los datos obtenidos de delta de temperatura de ebullición sobre
concentración contra la concentración.

Determinación de biomasa
Para la determinación de la concentración total de células en el medio de cultivo se tiene el
siguiente
Procedimiento:
1. Tomar la muestra del medio de cultivo, centrifugar a 4000rpm durante 30 min.
2. Filtrar en embudo, con papel filtro previamente pesado.
3. Secar en estufa a 70 ºC hasta peso constante.
4. Dejar enfriar en el desecador y pesar.

Determinación de sustrato
Para la determinación de la concentración de sacarosa por refractometría se tiene el
siguiente procedimiento:
1. Tomar la muestra del caldo de cultivo, centrifugar.
2. Filtrar el sobrenadante.
3. Previamente se ha ajustado el equipo de tal manera que a 20 ºC y con agua
destilada, marque un valor de índice de refracción de 1.333 o 0% de sacarosa y se
ha realizar una curva de calibración de diferentes concentraciones de sacarosa.
4. Leer el valor del índice de refracción de la muestra manteniendo la temperatura
constante y observando la lectura en la escala derecha del refractómetro.
5. Si la solución es muy oscura, para efectuar una lectura directa, se puede diluir con
solución concentrada de sacarosa.

Microscopia Electrónica de Barrido en Ambiente (ESEM)

  Microscopio electrónico Philips ESEM XL 30 TMP.
 Dadas las características eléctricas de las muestras analizadas se operó el
microscopio en modo ambiental, de manera que no es necesaria la metalización.

Espectrofotometría infrarroja con transformada de Fourier FTIR.

La toma de los espectros se realizó de la siguiente forma:

 Toma de un espectro background para corregir el medio en el rango de 3200 a

450cm-1, número de barridos 25, resolución 4cm-1.
 Toma del espectro de la muestra en el rango de 3200 a 450cm-1, número de
barridos 25, resolución 4cm-1.

El espectrofotómetro de Infrarrojo por Transformada de Fourier (FT-IR) con que cuenta el

laboratorio de física del plasma de la Universidad Nacional de Colombia sede Manizales,
es un Perkin Elmer Spectrum BX., con accesorios para analizar muestras sólidas y liquidas.
Para muestras sólidas se utiliza el modo de transmitancia para el cual las muestras deben
ser preparadas así:

 Se mezcla 200mg de KBr o KCl ambos compuestos son ventanas infrarrojas (no
reaccionan al infrarrojo), con 2mg de la muestra, se maceran en el mortero y luego
se coloca este polvillo en el molde que posteriormente se prensa para formar la
pastilla, la cual se monta en el equipo.
RESULTADOS

Reconocimiento del microorganismo

Se realizó la caracterización de la bacteria por tinción Gram, dando como resultado
bacteria Gram negativa, observándose en microscopio células de color rosado con
formas de bacilos y cocobacilos con bipolaridad. Se repicó en medio sólido
MacConkey y crecieron colonias de color rosado pálido característico de cepas de
Rhizobium como se muestra en la figura 2.

Ilustración 2 Colonias de Rizhobium Leguminasarum en medio MacConkey

El producto
Durante los ensayos de fermentación realizados se obtuvieron dos biopolímeros
extracelulares uno que denominaremos P1, el cual sobrenada al agregar el etanol, y
otro denominado P2, que precipita en el medio con etanol.

Ilustración 3 Biopolímeros P1 (sobrenadante) y P2 (precipitado)

 Cinéticas de biomasa
Cinética de crecimiento en las próximas 72 horas de la fermentación,

Gráfico 1 Cinética de
crecimiento celular

En el gráfico 2 muestra los datos de

concentración de sacarosa durante el
transcurso de la fermentación,
observándose que el consumo de sustrato
empieza con el crecimiento celular, así
mismo se nota que la sacarosa no es
consumida en su totalidad alcanzándose
una concentración final de 12.34 g/l, 11.95
g/l y 13.23 g/l para cada uno de los tres
ensayos, por lo que se concluye que no se
trata de una situación de sustrato limitante.

Gráfico 2 Consumo de sustrato

Se hicieron varias diluciones a diferentes concentraciones de polímero tanto para P1

como para P2,

Gráfico 3 Polímero P1
Se pueden apreciar claramente en el grafico 3 como para el caso de P1 los datos
son aleatorios y no presentan una tendencia lineal. En el grafico 4 se puede apreciar
que para P2 los datos también son muy dispersos a pesar de que si se observa.

Gráfico 4 Polímero P2

Como se mencionó en el numeral 2.6.2 se analizó la superficie de los biopolímeros

obtenidos en el microscopio electrónico de barrido con modo ambiental ESEM.
La figura () muestra en detalle los poros presentes, midiendo los más significativos entre
50 y 80 micrómetros

Ilustración 5 Detalles de los poros Ilustración 4 Detalles de los poros P2

presentes en P1
Referencias

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(Colombia) 93-101 . Obtenido de Polihidroxialcanoatos (PHA) producidos por
bacterias y su posible aplicación a nivel industrial: Dialnet-
PolihidroalcanoatosPHAs Producido por bacterias

Rojas Fernandez , E., Hoyos Concha , J. L., & Mosquera Sánchez, S. A. (09 de
Junio de 2016). Biotecnología en el sector agropecuario y agroindustrial.
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PARTIR DE Ralstonia etropha: v14n1a03.pdf

Valero Valdivieso, M. F., Ortegon, Y., & Uscategui, Y. (04 de Junio de 2013). Dyna
pp.171-180. Obtenido de Biopolímeros: avances y perspectivas:
1567680608631_v80n181a19.pdf
 CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES

AGOSTO
SEPTIEMBRE OCTUBRE NOVIEMBRE DICIEMBRE
NOMBRE DE
ACTIVIDADES
1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4

SELECCIÓN DEL TEMA DEL

PROTOCOLO

BÚSQUEDA DE INFORMACIÓN x

COMPARACIÓN DE ARTÍCULOS x x
ESTABLECIMIENTO DE
OBJETIVOS.
REALIZACIÓN DE
INTRODUCCIÓN
DEDUCCIN DEL
PLANTEAMIENTO DEL
PROBLEMA
REALIZACIÓN DEL MARCO x x x x
TEÓRICO
CORRECCIÓN DE OBJETIVOS x x

ADICIÓN DE INFORMACIÓN
DISEÑO DE METODOLOGÍA
PROPUESTAS DE
ALTERNATIVAS DE
MEJORAMIENTO DEL
PROTOCOLO
EXPOSICIÓN DEL PROTOCOLO
BUSQUEDA DE
METODOLOGIAS
ALTERNATIVAS
REORGANIZACION DE
METODOLOGÍA
EXPOSICIÓN DE
METODOLOGIA Y REVISIÓN.
CORRECCIÓN DE
METODOLOGÍA
REDACCION DEL DOCUMENTO
FINAL.
ENTREGA DE
PROYECTO FINAL