Revista Internacional de los Estudios de Investigación en Biociencias (IJRSB)

Volumen 3, número 9, septiembre de 2015, PP 73-80

ISSN 2349-0357 (Print) y ISSN 2.349-0.365 (en línea)
www.arcjournals.org

Un nuevo vector eficaz para el uso repetido de Pichia pastoris en

Tatsuro Shibui *, Hiroyoshi Hara, Daisuke Sakaguchi
Laboratorio de Biotecnología de los Alimentos, Facultad de Ciencias de la Alimentación, Nippon
Universidad de Veterinaria y Ciencias de la Vida, 1-7-1 Kyounamcho, Musashinoshi, Tokio 180 a
8602, Japón * tshibui@nvlu.ac.jp

Resumen: Utilizando un sistema Cre-loxP mutante, hemos desarrollado un vector para Pichia pastoris que se
puede utilizar para la incorporación repetida de genes diana. Un gen marcador de selección y un gen de
expresión Cre inducible se colocaron entre las secuencias mutante-loxP, y los genes diana pueden ser sub-
clonado en el vector para transformar P. pastoris por integración genómica. Después de que el aislamiento de
clones transformados con el vector, el marcador de selección y genes de expresión de Cre en su genoma pueden
ser extirpados por recombinación entre los sitios mutante-loxP tras la inducción del gen Cre, la preservación de
los genes diana en su genoma, y, finalmente, se convierten sensible al marcador de selección. De esta manera,
los genes diana en el mismo vector se pueden introducir repetidamente en esas cepas, ya que los transformantes
pueden ser re-seleccionable utilizando el mismo marcador, y el marcador y los genes Cre entre las secuencias
mutante-loxP se pueden eliminar de nuevo mediante la inducción de la expresión del . Con el fin de verificar la
eficacia de este vector, ponemos una proteína verde fluorescente (GFP)-expresión casete del gen en el vector, y
lo introdujo en P. pastoris varias veces. El sistema Cre-loxP mutante-funcionó bien, como se esperaba, y los
niveles de producción de GFP mide en base a la intensidad de fluorescencia aumenta junto con el número de
introducciones de vectores. Las células con cuatro introducciones mostraron un aproximadamente 4 veces
mayor intensidad que aquellos con sólo una. Los resultados sugieren que este vector podría ser notablemente
útil para la producción de grandes cantidades de proteínas diana en P. pastoris por las repetidas
incorporaciones del mismo vector de expresión. El sistema Cre-loxP mutante-funcionó bien, como se esperaba,
y los niveles de producción de GFP mide en base a la intensidad de fluorescencia aumenta junto con el número
de introducciones de vectores. Las células con cuatro introducciones mostraron un aproximadamente 4 veces
mayor intensidad que aquellos con sólo una. Los resultados sugieren que este vector podría ser notablemente
útil para la producción de grandes cantidades de proteínas diana en P. pastoris por las repetidas
incorporaciones del mismo vector de expresión. El sistema Cre-loxP mutante-funcionó bien, como se esperaba,
y los niveles de producción de GFP mide en base a la intensidad de fluorescencia aumenta junto con el número
de introducciones de vectores. Las células con cuatro introducciones mostraron un aproximadamente 4 veces
mayor intensidad que aquellos con sólo una. Los resultados sugieren que este vector podría ser notablemente
útil para la producción de grandes cantidades de proteínas diana en P. pastoris por las repetidas
incorporaciones del mismo vector de expresión.
palabras clave: Pichia pastoris; Cre-loxP; GFP; la producción de proteínas, el ADN recombinante.

1. yoINTRODUCCIÓN
Pichia pastoris se evaluó inicialmente como una fuente potencial de proteína unicelular (SCP) debido
a su capacidad para asimilar abundante metanol hecha de gasolina y lograr cultivo continuo a altas
densidades de células sobre hace cincuenta años [1]. Por desgracia, la crisis del petróleo en ese
momento provocó un aumento en el costo de las fuentes de metanol. Por lo tanto, la producción de
SCP por P. pastoris se convirtió a partir de metanol desfavorable y se negó.
Sin embargo, ya que P. pastoris cepas son fáciles de manipular y cultivar como un organismo fúngico
eucariota, que se utilizan hoy en día como dos herramientas biológicas importantes: un eucariota
modelo utilizado en la investigación de biología celular, y un sistema de producción de proteínas
recombinantes [2]. Debido a su potencial para producir grandes cantidades de proteínas y capacidad
heterólogos para modificaciones post-traduccionales [3], cepas de P. pastoris se han convertido en
cada vez más utilizado para la investigación y la producción de proteínas recombinantes con
aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas [4, 5].
Un sistema de expresión inducible con metanol eficiente se desarrolló utilizando el AOX1-promotor
que controla la expresión de la enzima alcohol oxidasa [6]. El sistema promotor ha sido utilizado para
la producción a gran escala de muchas proteínas recombinantes. Recientemente, se identificó un
promotor constitutivo y también se utiliza para la producción de proteína recombinante [7]. En P.
pastoris sistemas de expresión, las proteínas diana o bien se pueden producir dentro de la célula o
secretada en los medios de comunicación. Especialmente para la producción secretada, el proceso de
purificación normalmente se simplifica por sus altas cantidades en los sobrenadantes: su gama de es
30-80% del total de las proteínas secretadas [2] .Además,
En general, en la producción de proteína recombinante, el número de copias de expresar genes de
proteínas diana afecta a su productividad de proteínas en células huésped. Cada vez más dispuestos
genes de expresión de proteínas diana muestran una tendencia de la promoción de sus células
hospedadoras para producir niveles más altos de proteínas, y también se han reportado tales
tendencias en P. pastoris [9]. Sin embargo, la introducción de multiplicar dispuesto
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genes en P. pastoris con la electroporación revelaron que había una limitación de tamaño de las
construcciones para la incorporación en condiciones de electroporación comúnmente usadas [10]. A
fin de superar la limitación de tamaño en la incorporación de secuencias diana se multiplican
repetidas, se describe en el presente documento la construcción de un nuevo vector reutilizable para la
introducción repetida de genes diana utilizando un sistema Cre-loxP mutante de P. pastoris, y
demuestran la validez de la incorporación repetida de una secuencia diana que utiliza este vector para
la producción de proteínas eficiente.
2. METROMATERIALES Y METROÉTODOS
2.1. Las cepas bacterianas y de levadura
Escherichia coli, JM 109, células competentes utilizados para la construcción del plásmido se
adquirieron de Toyobo Bioquímicos (Japón). Picha pastoris, GS115, para la expresión de los genes
diana era de Life Technology (EE.UU.).
2.2. Kits para la manipulación de DNA
El kit de la polimerasa KOD FX utilizado para la PCR de colonias de Pichia pastoris se adquirió de
Toyobo Bioquímicos (Japón). El kit de clonación, que utiliza las propiedades únicas de la '→ 5'
actividad exonucleasa 3 de ADN Poxvirus polimerasa [11], era de Clonetech (Infusión kit de
clonación, EE.UU.).
PCR para la construcción de plásmidos y construcciones de expresión se realizó con una ADN
polimerasa de alta fidelidad (Prime Max PCR Kit, Clontech, EE.UU.), de acuerdo con el manual del
proveedor.
kits de purificación de ADN fueron adquiridos de Nippon Genética, GBM (Japón).
2.3. Los ADN sintéticos y plásmidos
Los ADN sintéticos utilizados para la amplificación por PCR se obtuvieron de Sigma Genosis
(Japón), y se enumeran en la Tabla 1.
Plásmidos, pInt2 básica y pPICZ Cre, fueron descritas anteriormente [12].
La proteína verde fluorescente (GFP) constructo expresando, el casete de expresión G3, se describió
anteriormente [10].
2.4. PCR La clonación de E. Coli Lac operador y de DMPA terminador de la transcripción
El uso de cebadores que contienen la secuencia del operador lactosa (Tabla 1), un fragmento del gen
Cre expresión que contenía el operador lac entre el promotor AOX1 y el gen Cre se construyó con
fragmentos amplificados por PCR, y re-clonado en el vector pPICZ (Fig. 1) .
Un fragmento de ADN que contiene la región terminadora de la transcripción ompA (130 bp) se
amplificó por PCR a partir del genoma de E. coli JM109. Se utilizaron dos tipos de par de cebadores
(Tabla 1) para la clonación. La primera fue para la clonación inicial del fragmento terminador entre el
operador lac y el gen Cre, y el segundo era para la clonación repetida del fragmento terminador entre
el terminador y el gen Cre, es decir, en tándem-clonación del terminador.
2.5. Medios culturales
LB agar medio (Life Technology, EE.UU.) suplementado con ampicilina (Meiji Pharmaceuticals) a 40
mg / L (LB Amp agar) se utilizó para la construcción del plásmido. medio YPD que contiene 1% de
extracto de levadura, 2% de peptona y 0,2% de glucosa se utiliza para el cultivo de P. pastoris. medio
YPM que contiene 1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 0,5% de metanol se utilizó para
experimentos de inducción. placas de YPD y YPM contenían 1,5% de agar en medio YPD y YPM,
respectivamente.
2.6. Transformación de P. pastoris
P. pastoris las células se transformaron por electroporación según el manual proporcionado por Life
Technology. Los transformantes se seleccionaron en placas YPDSZ (PYD que contienen sorbitol 1 M,
1,5% de agar, y 100 mg zeocina / ml).
2.7. Los ensayos para GFP niveles de expresión en cada clon
Las células se pre-cultivaron a 30℃durante 24 horas en placas de YPD. Una porción de las células se
extendió sobre YPD (sin inducción) y YPM (inducción metanol) placas, y se cultivó a 30℃durante 48
horas. Entonces, los sedimentos celulares se rasparon por los bucles de platino y se suspendieron en
PBS (fosfato de sodio 10 mM, pH 7,5, y NaCl 150 mM) a una concentración de 0,1 g en húmedo de
células / mL. La actividad fluorescente relativa de GFP
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Un nuevo vector eficaz para el uso repetido de Pichia pastoris en

en cada suspensión de células se midió con luz de emisión a 535 nm causado por la luz de excitación
a 485 nm usando un espectrofotómetro de fluorescencia (ARVO MX, Perkin Elmer). Todos los
espectros de fluorescencia se analizaron después de una dilución de 10 a 100 veces mayor de las
suspensiones de células con PBS, y se midió por triplicado.
Tabla 1. cebadores de ADN sintéticos para PCR utilizados en este estudio
Nombre del oligo ADN Secuencia
Para la expresión de Cre
construir:
1)
AOX15' F 5-TCATGAGATCAGATCAACATCCAAAGACGAAAGG-3'
2)
R AOX1TT 5 'GGTGTGTGGGGGATCCGCACAAACG -3'
AOX15' F TSL 5 'ATCACTAGTCGGATCAACATCCAAAGACGAAAGG-3'
AOX1TT R TSL 5 'ATCATCTAGAGGATCCGCACAAACG-3'
3)
Rv AOX15' F 5 'ACGAAGTTATGAATTCTAACATCCAAAGACGAAAGG-3'
4)
R RvAOX1TT 5 'GTACAGACGCGAATTCACTTAATCTTCTGTACTCTG-3'
5)
Op F 5 'GAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCAGATCTATTATCTGAGTGTGAAATGTCC-3'
6)
R op 5 'GAATTGTTATCCGCTCACAATTCCCCAATTAGTTGTTTTTTGATCTTCTC-3'
7)
OmpATT5' F 5 'ACAATTCCCCAGATCCGCAGGCTTAAGTTCTCGTCTGG-3'
8)
R OmpATT3' 5 'CTCAGATAATAGATCTGCTGGGTAAGGAATAACTGACG-3'
9)
OmpATT5' F Tm 5 'CTTACCCAGCAGATCCGCAGGCTTAAGTTCTCGTCTGG-3'
Para el análisis de
genómica
DNA
10)
Zeo F 5 'CGCCGTACCACTTCAAAACACC-3'
11)
R Zeo 5 'CTCCTTCCTTTTCGGTTAGAGC-3'
12)
Cre F 5 'TATTATCTGAGTGTGAAATGTCC-3'
13)
Cre I 5 'ACTAATCGCCATCTTCCAGCAGG-3'
14)
OCH1 F 5 'ATCAGACTTTGATTTGATGAGG-3'
15)
R OCH1 5 'TGCTTCTTGGTGTTTGTGTTCCG-3'

1) y 2): Las letras en negrita son las secuencias del vector pPICZ requeridos para la clonación del
fragmento de ADN de expresión Cre amplificado por PCR en pPICZ por el sistema de clonación utilizando
ADN polimerasa Poxvirus 5' → actividad 3'exonuclease. 3) y 4): Las letras en negrita son las secuencias del
vector pInt2 básicos requeridos para la clonación del fragmento de ADN de expresión Cre amplificado por
PCR en pInt2 básica por el sistema de clonación. 5) y 6): El ATG subrayado es el codón de inicio del gen Cre.
Las secuencias en cursiva son la lactosa de E. coli operón secuencias del operador. 7), 8) y 9): Las letras en
negrita son secuencias entre el operador lac y el gen Cre requerido para la clonación del terminador de E. coli
ompA por el sistema de clonación. 10) y 11): secuencias localizadas en el gen de resistencia a zeocina 5' y 3'
regiones en pInt2 Cre Basic, respectivamente. 12) y 13): Secuencias localizadas en el gen Cre 5' y 3' regiones
en pInt2 Cre Basic, respectivamente. 14) y 15): secuencias localizadas en la región OCH1 en el P. pastoris,
GS115, genoma.
3. RRESULTADOS Y reISCUSION
3.1. PCR-Construcción Los genes de creación de expresión con el operador lac de E. coli y el terminador de
la transcripción Ompa y Construcción de Vector reutilizable, Pint2 Cre básico
Como se describe en un informe anterior [12], el gen de expresión AOX1 Cre no podría ser sub clonó
en el vector pInt2 Basic. El sistema Cre-loxP fue algo inducido, y los plásmidos resultantes mostraron
genes entre R- y las secuencias de L-loxP eliminado.
 Figura 1. Introducción de una secuencia de lac operador antes del gen Cre por PCR
En la primera PCR paso: (A): el promotor AOX1 y la región no traducida del gen Cre se amplificaron
mediante cebadores, AOX15' F y Op R, de pPICZ Cre [11], y (B): el gen y AOX1 terminador Cre fueron
amplificados por cebadores, Op F y AOX1TTR de pPICZ Cre [11].
En la segunda etapa de PCR: AOX1 fragmento de ADN Pro Op Cre se construyó y se amplificó a partir de (A)
y (B) por PCR usando cebadores, AOX15'F y AOX1TTR.
El lado izquierdo: el esquema de construcción. El lado derecho: fotos de los patrones de electroforesis en gel
de agarosa de los fragmentos amplificados en la primera y segunda PCR.
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Tatsuro Shibui et al.

Este fenómeno se considera que ocurre con la lectura a través de la transcripción de aguas arriba en
alguna parte del gen Cre en E. coli. Por lo tanto, con el fin de terminar este transcripcional lectura a
través de aguas arriba del gen Cre, que en primer lugar Examinamos la colocación de un operador de
la lactosa de secuencia aguas arriba del gen Cre. El uso de cebadores que contienen la secuencia del
operador lactosa (Tabla 1), un fragmento del gen de expresión Cre (Op-Cre) que contenía el operador
lac entre el promotor AOX1 y el gen Cre se construyó mediante PCR y se clonó en el vector pPICZ
(Fig.1) . Entonces, el fragmento de Op-Cre se amplificó por PCR a partir del vector-utilizando
cebadores, Rv AOX15' F y RvAOX1TT R, y sub-clonaron en un sitio EcoRI en pInt2 básica (Fig. 2
a)). Sin embargo, los plásmidos resultantes se recombinan entre las secuencias de L y R-loxP, como
fue el caso sin que el operador lac (Fig. 2 b)). q gen para la sobreproducción del represor lac.
En el siguiente paso, se examinó el efecto de la secuencia de terminación de la transcripción ompA en
este transcripcional lectura sin embargo. Un fragmento de ADN que contenía la región terminadora de
la transcripción ompA (130 bp) fue amplificado por PCR a partir de la E. coli, JM09, genoma. Se
utilizaron dos tipos de conjunto de cebadores (Tabla 1) para la clonación. El primero, OmpATT 5' F y
OmpATT 3' R, era para la clonación del terminador en un sitio Bgl II entre el operador lac y el gen
Cre, y el segundo, OmpATT5' F y OmpATT3' R Tm, fue para repetido clonación del terminador en un
sitio Bgl II entre el terminador y el gen Cre, es decir, en tándem-clonación del terminador. Uno a tres
secuencias de terminación repetidas se introdujeron entre el operador lac y el gen Cre en el vector
pPICZ. Entonces, estos fragmentos de genes de expresión Cre que contienen los terminadores se
amplificaron mediante PCR a partir del vector utilizando cebadores, Rv AOX15' F y RvAOX1TT R, y
sub-clonaron en un sitio EcoRI en pInt2 Basic. El sub-clonación de los genes de expresión Cre se
comprobó mediante digestión EcoRI (Fig. 2 b)). En el caso de Cre genes de expresión con
repeticiones en tiempo 3 2- y terminadora, tamaños precisos de fragmentos de ADN EcoRI (2,63 kpb
para 2- y 2,75 kpb para 3 repeticiones) se observaron en la electroforesis en gel de agarosa, y se
confirmó que las los genes de expresión Cre fueron sub-clonado con éxito en pInt2 básico.

una) si) M1 23 4 5

ampicilina
L-loxP
O yo
pInt2 Cre
zeocina
AOX1 P CRE AOX1 TT K pb
10.0
R-loxP 8.0
6.0
Op: op 5.0
Op + Plazo op 4.0 UNA
T1:
3.0
si
Op + Plazo op Térmi
T2: no

Op + Plazo op Térmi Términ 2.5

T3: no o

2.0
2,4 a 2,75 kpb
EcoRhode Island EcoRhode Island 1.5

Figura 2. Los mapas de plásmidos Cre / loxP y sus estabilidades en E. coli

a) Mapas de Cre / loxP plásmidos construidos en este
estudio Las abreviaturas en mapas.
L-loxP y R-loxP: secuencias de loxP mutadas. Zeocin: Zeocin gen de resistencia de pPICZA. La ampicilina y
ori: Ampicilina resistancegene y el origen de replicación del plásmido de pUC18. AOX1 P y AOX1TT: AOX1
promotor y squences terminadoras de la transcripción. CRE: gen de la recombinasa Cre. Op: secuencia del
operador lactosa
(30 pb). Plazo: secuencia terminadora transcripcional ompA (103 pb).
b) Estabilidades de plásmidos que contienen un constructo de expresión de Cre con varias secuencias de
control de la transcripción en E. coli.
Carril M: marcadores de peso molecular. Carril 1: un plásmido que contiene sólo el gen Cre. Carril 2: un
plásmido
que contiene el gen Cre con una secuencia de operador de la lactosa (Op). Carril 3: un plásmido que contiene el gen
Cre con
un operador de la lactosa y secuencias terminadoras de la transcripción ompA (Op + T1). Carril 4: un
plásmido que contiene el gen Cre con un operador de la lactosa y dos ompA terminador transcripcional
secuencias (Op + T2). Carril 3: un plásmido que contiene el gen Cre con un operador de la lactosa y tres ompA
terminador transcripcional secuencias (Op + T3). Flecha A indica la posición de los EcoRI Op + T3 Cre
fragmentos de expresión (2,75 kpb). Flecha B indica la posición de los EcoRI Op + T2 Cre fragmentos de
expresión (2,62 kpb).

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Un nuevo vector eficaz para el uso repetido de Pichia pastoris en

3.2. Construcción de GFP vector de expresión que podría ser utilizado para la incorporación
múltiple de GFP de la Expresión Génica
Un casete de expresión de GFP, el casete de expresión G3, fue sub-clonado en pInt2 Cre básico con el
sistema de clonación utilizando ADN polimerasa Poxvirus 3' → 5'exonuclease actividad, como se
describe anteriormente [13], para construir pInt2 G3 CRE. El vector de expresión GFP se linealizó en
primer lugar con la digestión NruI. El fragmento de la expresión de GFP linealizado, que contiene
secuencias parciales del promotor AOX1 en ambos extremos, se reemplazó el interior de la región del
promotor AOX1 por doble recombinación homóloga. Se aisló un clon de zeocina resistentes que
expresan GFP, y nombrado G3x1 ZeoR. entonces G3x1 ZeoR se incubó en YPM durante 6 horas a
30℃ para expresar Cre recombinasa, y la propagación sobre placas de YPM para aislamiento de
colonias individuales. La sensibilidad a zeocina de esas colonias se comprobó en placas YPDZ.
Noventa y seis de cada cien clones fueron recogidos zeocina sensible. Uno de los clones sensibles fue
elegido y nombrado G3x1 ZEOS. Esto sugiere que el E. coli omp A terminador transcripcional no
tenía ningún efecto claro sobre Cre transcripción de genes a partir del promotor AOX1 en P. pastoris.

Fig. 3. Mapas de pInt2 Op + T3 Cre básico y el casete de expresión de GFP

Abreviaturas: AOX1 P (49-291) y (292-527): el promotor AOX1 49-291 y 291-527 secuencias de la región en
el vector pPICZ. TSLR BL: una secuencia requerida para la clonación de genes diana. PTEF: promotor TEF1.
zeocina:
gen de resistencia a zeocina. Cic TT: terminación de la transcripción CYC1. AOX1 TT: AOX1 terminación de la
transcripción.
Del cre: gen Op + T3 Cre. AOX1 Pro: promotor AOX1. La ampicilina y ori: ampicilina gen de resistencia y
origen de replicación de pUC18. GFP: gen de la proteína fluorescente verde.
3.3. Los clones Análisis genómico de Zeocin resistente y con sensibilidad
La eliminación de la secuencia entre las secuencias de L y R-loxP sobre Cre inducción de genes se
comprobó por genómicos de PCR usando cebadores: Zeo F y Zeo R para el gen de resistencia a
zeocina, Cre F y Cre I para el gen Cre, y OCH1 F y OCH1 R para el gen OCH1 como control
positivo. Como se muestra en la Fig. 3, el gen de resistencia a zeocina y el gen Cre no se detectaron
en G3x1 Zeos. Esto indica que la secuencia entre los sitios de L y R- loxP, es decir, la resistencia a
zeocina y genes de expresión de Cre, debe ser escindido eficazmente por la recombinasa Cre, y el
clon aislado podría ser utilizado para repetidas incorporaciones de la misma clase de vectores.

Fig4. Una ilustración esquemática de rescate de resistencia a zeocina por el sistema Cre-loxP mutante en el
genoma de la vector integradas en P. pastoris y análisis de PCR de las construcciones de ADN integrado en el
genoma r

a) elr esquema A de Cre escisión

s
de resistencia a zeocina (Zeo) y genes de recombinasa Cre-catalizada.
Zeo: zeocina-resistente. Zeo: zeocina sensible. Cre: Cre recombinasa.
Zeo F y Zeo R: cebadores de PCR para gen de resistencia a zeocina. Cre R y Cre F: cebadores de PCR para la
recombinasa Cre gen. Las secuencias de cebadores se enumeran en la Tabla 1.
b) Una agarosa análisis en gel de ADN genómicos con la PCR de colonias.
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Tatsuro Shibui et al.

Carril M: marcadores de peso molecular. Los carriles 1 y 3: clon Zeor. Carriles 2 y 3: Zeos clon.
Las reacciones de PCR se realizaron con cebadores, OCH1 F y R (como un control interno), Zeo F y Zeo R para
los carriles 1 y 2, y Cre F y Cre R para los carriles 3 y 4.
Las flechas A, B, y C indican las posiciones de los fragmentos de ADN del gen OCH1, Cre, y Zeo,
respectivamente.
3.4. introducción múltiple de pInt2 G3 Cre en P. pastoris, GS115
En el siguiente paso, el plásmido de expresión G3 se linealizó por digestión con BamHI, y se introdujo
en G3x1 ZEOS por electroporación para crear clones que expresan GFP de nivel superior. El vector
linealizado se puede integrar por recombinación homóloga en la secuencia en el sitio BamHI en el
fragmento NruI de pInt2 G3 Cre que ya estaba integrado en el genoma G3x1 ZEOS (ver el mapa en la
Figura 3). Una de las colonias que aparecieron en las placas YPDSZ fue seleccionado, y fue nombrado
G3x2 ZeoR. Entonces, G3x2 ZeoR se incubó en medio YPM en 30℃ durante 6 horas para la expresión
del gen Cre, y las células se extendieron sobre placas de YPM. Su sensibilidad a zeocina se comprobó
de manera similar como en el paso anterior. Uno de los clones sensibles fue seleccionado y nombrado
G3x2 ZeoR. El mismo plásmido de expresión de GFP BamHI-linealizado se re-introduce en G3x2
Zeos, y las colonias resistentes a zeocina se seleccionaron en YPDSZ. Uno de ellos se seleccionó y se
denominó G3x3 ZeoR. G3x3 ZeoR se incubó de nuevo en YPM en 30℃durante 6 horas para la
expresión del gen Cre, las células se extendieron sobre placas de YPD, y se aislaron clones zeocina-
sensibles. Uno de ellos fue seleccionado y nombrado G3x3 ZEOS. Del mismo modo, G3x4 ZeoR se
construyó a partir G3x3 ZEOS por la re-introducción del mismo plásmido linealizado con BamHI, y
G3x4 ZEOS era de G3x4 ZeoR.
El casete de expresión de GFP usado en nuestro experimento contenía tres genes de expresión GFP
para obtener claramente expresando clones, ya que se ha informado de que sólo la expresión génica
uno GFP no podía producir suficientes niveles de expresión de GFP para la detección de [10]. En este
informe, un total de doce copias del gen de la expresión de GFP se introdujeron con éxito en P.
pastoris. Haciendo genes en tándem in vitro utilizando enzimas de restricción y la ligasa y sus efectos
sobre la expresión del gen diana también se informó
[14]. Sin embargo, en nuestros anteriores experimento usando tándem genes GFP-expresión
construido in vitro [10], se consideraron cinco tándem de repeticiones de la construcción de expresión
(= 12,2 kpb) para ser el tamaño máximo de DNA para la electroporación en P. pastroris en las
condiciones comúnmente utilizado para la electroporación. Por lo tanto, especialmente en casos de
grandes construcciones de expresión, los multímeros de ellos para una mayor expresión serían no
siempre tengan éxito, a pesar de que es posible construir genes altamente polimerizados in vitro. La
construcción in vivo de cepas multiplican integradas de genes diana utilizando G418 u otros genes
marcadores de resistencia También se informó de [14, 15]. Sin embargo, estos métodos no siempre
tienen éxito tampoco, y es necesario que la pantalla muchos clones resistentes marcadores para
identificar un clon multiplican integrado, o productor de nivel superior. Usando el sistema de vectores
en el presente informe, podríamos aumentar estratégicamente número de copias de los genes diana en
las células mediante re-introducir el mismo vector de expresión tantas veces como se desee sin
limitación. Por lo tanto, este sistema de vector proporciona un método más fiable para establecer
cepas de P. pastoris con copias múltiples de los genes diana que otros sistemas hacen simplemente la
construcción de multímeros en vectores plasmídicos o cribado de más clones de marcador resistente
para identificar cepas multiplican integrados.
3.5. La expresión de GFP en clones que Expresión Multiplicar Incorporated cassette
Clones aislados en la sección anterior se cultivaron con o sin inducción con metanol, y sus niveles de
expresión de GFP se midieron como se describe en Materiales y Métodos. Cuando inducida por
metanol, sus intensidades fluorescentes aumentaron junto con los números de veces que se introdujo
el plásmido de expresión de GFP (Fig. 5).
 Fig5. expresiones GFP de clones aislados construidas a partir de introducción repetida de pInt2 G3 Cre
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Un nuevo vector eficaz para el uso repetido de Pichia pastoris en

Los clones se nombran después del número de incorporaciones de pInt2 G3 Cre, y fenotipos zeocina-resistentes.
G3x1 ZeoR: Un clon transformado con linealizado con NruI pInt2 G3 Cre.
Zeos G3x1: Un clon con la resistencia a zeocina y genes de expresión Cre retirado de G3x1 ZeoR por Cre
recombinasa.
G3x2 ZeoR: Un clon transformado por incorporación de linealizado con BamHI pInt2 G3 Cre en G3x1 Zeos.
Zeos G3x2: Un clon con la resistencia a zeocina y genes de expresión Cre retirado de G3x2 ZeoR por Cre
recombinasa.
G3x3 ZeoR: Un clon construido con la re-introducción de linealizado con BamHI pInt2 G3 Cre en G3x2 Zeos.
Zeos G3x3: Un clon con la resistencia a zeocina y genes de expresión Cre retirado de G3x3 ZeoR por Cre
recombinasa.
G3x4 ZeoR: Un clon construido con la re-introducción de linealizado con BamHI pInt2 G3 Cre en G3x3 Zeos.
Zeos G3x4: Un clon con la resistencia a zeocina y genes de expresión Cre retirado de G3x4 ZeoR por Cre
recombinasa.
-: células sin inducción con metanol. +: Células con la inducción con metanol.
ZeoR: A colne zeocina-resistente. ZEOS: Un clon zeocina-sensible.
G3x4 ZeoR y G3x4 Zeos con cuatro introducciones mostró un aproximadamente 4 veces mayor
intensidad en comparación con los clones con sólo una. Los niveles de expresión de GFP se
incrementaron ligeramente en los clones zeocina-sensible. Desde También se expresó la recombinasa
Cre durante la inducción de metanol de GFP expresión genes en los clones zeocina-resistente, la
eliminación de la resistencia a zeocina y genes de expresión Cre durante la expresión también se
produjo en ellos, y este evento podría haber afectado a los niveles de expresión de GFP. Estos
resultados sugieren que el marcador de selección y genes de expresión de Cre no son necesarios para
la expresión estable, y su eliminación es más preferible para las expresiones de genes objetivo. Bajo la
condición de no-metanol-inducción, las intensidades de fluorescencia fueron casi los mismos que en
el fondo en todos los clones construidos,
4. CCONCLUSIONES

Usando el sistema Cre-loxP mutante, un vector para el uso repetido en P. pastoris fue desarrollado
por la inserción de la E coli ompA transcripcional terminadores entre el promotor AOX1 y el gen
Cre para terminar la transcripción de lectura a través de aguas arriba del gen Cre.

El uso de este vector, el casete de expresión de GFP se introdujo repetidamente cuatro veces en P.
pastoris.

Los niveles de expresión aumentaron junto con los tiempos de incorporación del vector, y se
observó un aumento de aproximadamente 4 veces en clones 4-tiempo-incorporada como en
comparación con los clones con sólo un único incorporación.

Los clones zeocina sensible expresan de forma estable GFP, y mostraron niveles ligeramente elevados GFP-
expresión en comparación con sus clones zeocina resistente parentales.

Como el casete de expresión de GPF contiene tres copias del gen de la expresión de GFP, un total
de 12 copias del gen de la expresión de GFP se introdujeron con éxito en P. pastoris para alcanzar
niveles más altos de producción GFP.

El vector reutilizable en este informe sería útil para producir un nivel más alto de proteínas diana en P.
pastoris mediante la introducción de genes diana como tantas veces como desee.
REFERENCIAS
[1] Braude R, Hosking ZD, Mitchell KG, Plonka S y Sambrook IE, Pruteen, una nueva fuente de
proteína para cerdos en crecimiento. experimento I. metabólico: la utilización de nitrógeno.
Ganado Prod Sci. 4, 79-78 (1977).
[2] Goodrick JC, Xu H, Finnegan R, Schilling BM, Schiavi S, Hoppe H y Wan NC, la expresión de
alto nivel y la estabilización de humano recombinante quitinasa producen en un sistema de
expresión de Pichia pastoris constitutiva continua. Biotechnol Bioeng. 74, 492-497 (2001).

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Tatsuro Shibui et al.
[3] Hamilton SR, Davidson RC, Sethuraman N, Nett JH, Jiang Y, Rios S, Bobrowicz P, Stadheim
TA, Li H, Choi BK, Hopkins D, Wischnewski H, Roser J, Mitchell T, Strawbridge RR, Hoopes J,
Wildt S y Gerngross TU, Humanización de levadura para producir complejos glicoproteínas
sialiladas terminal. Ciencias. 313, 1441-1443 (2006).
[4] Cregg JM, Cereghino JL, Shi J y Higgins DR, la expresión de proteínas recombinantes en Pichia
pastoris. Mol Biotechnol. 16, 23-52 (2000).
[5] Li T, Cheng J, Hu B, Liu Y, Quian G y Liu F, Construcción, producción y caracterización de
anticuerpos scFv recombinantes contra metamidofos expresada en Pichia pastoris. Mundial J
Microbiol Biotechnol. 24, 867-874 (2008).
[6] Cereghino JL y Cregg JM, expresión de la proteína heteróloga en la levadura metilotrófica Pichia
pastoris. FEMS Microbiol Rev. 24, 45-66 (2000).
[7] Hohenblum H, Gasser B, Maurer M, Borth N y Mattanovich D, Efectos de la dosis de genes,
promotores, y los sustratos sobre el estrés proteína desplegada de Pichia pastoris recombinante.
Biotechnol Bioeng 85 (4): 367-375. Biotechnol Bioeng. 85, 367-375 (2004).
[8] Hellwig S, Emde F, Raven NP, Henke M, van Der Logt P y Fischer R, Análisis de la producción
de anticuerpos de cadena sencilla en Pichia pastoris usando el control metanol en línea en lote
alimentado y alimentación mixta fermentaciones. Biotechnol Bioeng. 74, 344-352 (2001).
[9] Clare JJ, Rayment FB, Ballantine SP, Sreekrishna K y Romanos MA, la expresión de alto nivel
de la toxina tetánica fragmento C en Pichia pastoris cepas que contienen múltiples integraciones
en tándem del gen. Biotecnología (NY) 9, 455-460 (1991).
[10] Shibui T, Sakaguchi D y Hara H, construcción y efectos de los genes de expresión de repetición
en tándem para Pichia pastoris, y su incorporación Eficiencias y estabilidades por
electroporación. CIBTech Journal of Biotechnology. 3, 25-35 (2014).
[11] Zhu B, Cai G, Hall EO y Freeman GJ, In-fusión montaje: ingeniería sin fisuras de proteínas
multidominio de fusión, vectores modulares, y mutaciones. Biotechniques. 43, 354-359 (2007).
[12] Shibui T, Hara H y Sakaguchi D, Ingeniería un Pichia pastoris cepa capaz de incorporar repetida
constructos de ADN con el marcador de selección Same. CIBTech Journal of Biotechnology. 4,
1-11 (2015).
[13] Shibui T, Sakaguchi D y Hara H, A New Tandem génica Método de construcción que incluyen un
Sistema de Clonación Usando DNA Poxvirus polimerasa, y su aplicación a la expresión génica.
Los avances en Biociencia y Biotecnología. 5, 838-845 (2014).
[14] Takeshita S, Tezuka K, Takahashi M, Honkawa H, Matsuo A, Matsuishi T y Hashimoto-Gotoh T,
la amplificación del gen en tándem in vitro para la expresión rápida y eficaz en células animales.
Gene. 71,9-18 (1988).
[15] Taylor WH y Hagerman PJ, Un método general para la clonación de fragmentos de ADN en
múltiples copias. Gen 53, 139-144 (1987).
UNAUTOR'S siIOGRAPHY
Tatsuro Shibui, Ph.D., Profesor de la Facultad de Veterinaria y Ciencias de la Vida,
Nippon Universidad de Veterinaria y Ciencias de la Vida (Tokio, Japón). Su interés
actual es la producción de biológicos por ingeniería genética, esprcially con la
levadura, P. pastoris.

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