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Quito, 2019
DERECHOS DE AUTOR
Yo, Débora Samantha Ortiz Tapia en calidad de autora y titular de los derechos
morales y patrimoniales del trabajo de titulación “Aislamiento y caracterización de
Yersinia enterocolitica patogénica de cerdos en la Empresa Pública Metropolitana
de Rastro Quito”, modalidad presencial, de conformidad con el Art.114 del Código
Orgánico de la Economía Social de los Conocimientos, Creatividad e Innovación,
concedo a favor de la Universidad Central del Ecuador una licencia, gratuita,
intransferible y no exclusiva para el uso no comercial de la obra, con fines
estrictamente académicos. Conservo a mi favor todos los derechos de autor sobre
la obra, establecidos en la normativa citada.
Así mismo, autorizo a la Universidad Central del Ecuador para que realice la
digitalización y publicación de este trabajo de titulación en el repositorio virtual, de
conformidad a lo dispuesto en el Art. 144 de la Ley Orgánica de Educación Superior.
Firma:
Cd. N° 1716567902
ii
APROBACIÓN DEL TUTOR
Docente – Tutor
C.C. 1713266227
iii
APROBACIÓN DE LA PRESENTACIÓN ORAL/TRIBUNAL
iv
Dedicatoria
A Jesús gracias por ponerme en el lugar y tiempo adecuado, por la familia que me
has dado. Esto es para ti mami y papi ustedes han sido el pilar base para luchar sin
rendirme, instruyéndome en amor, paciencia y perseverancia.
Hermana me has servido de ejemplo de fortaleza en una mujer, por ser luz en mis
dudas, por tus consejos estamos hoy aquí.
A mi novio por amarme como soy, motivarme tanto personal como espiritualmente,
ayudarme ampliar el panorama, gracias por apoyarme en mis fracasos,
frustraciones, mis logros y alegrías. Por darme de tu tiempo, a veces tu hombro y
siempre tu mano para levantarnos juntos.
A cada una de las personas que aportaron, sumaron en mi vida con palabras de
ánimo, sonrisas, con bajones y a veces llantos esto es para ustedes.
v
INDICE GENERAL
CAPITULO I ............................................................................................................ 1
INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1
CAPITULO II ........................................................................................................... 2
CAPITULO IV ........................................................................................................ 12
vi
4.8.1 Preparación de la Master Mix ................................................................ 15
4.9 Identificación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica ......................... 16
4.9.1 Preparación de la Master mix ................................................................ 16
4.9.3 PCR ....................................................................................................... 17
4.10. Electroforesis ......................................................................................... 17
CAPITULO V ......................................................................................................... 18
CAPITULO VI ........................................................................................................ 25
6. Conclusiones.................................................................................................. 25
5. BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................. 26
ANEXOS ............................................................................................................ 33
Anexo 1........................................................................................................... 33
2.1 Materiales de Laboratorio para toma de muestras ................................ 33
Anexo 2........................................................................................................... 34
2.8 Materiales para determinación de Genes de Virulencia ........................ 34
Anexo 3........................................................................................................... 35
2.9 Materiales para identificación de serotipos O:3 y O:9............................ 35
Anexo 4........................................................................................................... 36
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para
determinar genes de virulencia.................................................................... 36
Anexo 5........................................................................................................... 37
Reactivos y cantidades necesarias para una reacción de PCR para
determinar serotipos de Y. enterocolitica..................................................... 37
Anexo 6........................................................................................................... 38
Flujograma de Hisopado de Amígdalas ....................................................... 38
Anexo 7........................................................................................................... 39
vi
i
Flujograma de Contenido Cecal .................................................................. 39
Anexo 8........................................................................................................... 40
Índice de Tablas
Tabla 1. Clasificación de Cepas patógenas y no patógenas del Género Yersinia
spp .......................................................................................................................... 4
Tabla 2 Relación entre biotipos, serotipos, patogenicidad y virulencia de Y.
enterocolitica ........................................................................................................... 5
Tabla 3. Biotipos de Yersinia enterocolitica ........................................................... 14
Tabla 4 Primers para PCR de identificación de genes de virulencia de Yersinia
enterocolitica ......................................................................................................... 15
Tabla 5 Programa del Termociclador para los genes ail,virF y Yst........................ 16
Tabla 6 Primers para la diferenciación de serotipos O:3 y O:9 de Y. enterocolitica
mediante PCR. ...................................................................................................... 16
Tabla 7 Programa del Termociclador para los genes rfbC y per. .......................... 17
Tabla 8 Resultados de la biotipificación de los aislados de Yersinia spp. originados
en cerdos positivos. ............................................................................................... 18
Índice de Figuras
vi
ii
TITULO: Aislamiento y caracterización de Yersinia enterocolitica patogénica
de cerdos en la empresa pública metropolitana de rastro Quito.
Resumen
El objetivo de este estudio fue, determinar la presencia de Yersinia enterocolitica
en hisopado de amígdalas y contenido cecal de cerdos que ingresan a la Empresa
Pública Metropolitana de Rastro Quito. Analizando mediante PCR la existencia de
genes de virulencia ail, virF, y yst, en cepas positivas a Yersinia enterocolitica.
Analizando 116 cerdos tomando 2 muestras por animal. Obteniendo 7 cerdos
positivos a Yersinia spp, de los que 4 fueron identificados como Y. enterocolitica.
Estas muestras positivas se analizaron mediante PCR, los resultados demostraron
ser negativos a todos genes de virulencia.
ix
TITTLE: Isolation and characterization of pathogenic Yersinia enterocolitica of
pigs in the Empresa Metropolitana De Rastro Quito.
ABSTRACT
The objetive of this estudy was to determine the presence of Yersinia
enterocolitic in tonsil swabs and secum content of pigs that enter to the Empresa
Metropolitana De Rastro Quito. Analizyng through PCR the existence of
virulence genes ail, virF, and virF, and yst, in positive strains of Yersinia
enterocolitic. Materials and metodology : An analysis of 116 pigs was carried out
taking 2 samples per animal. Seven pigs were found to be positive for Yersinia
spp, of wich 4 were identified as Y. enterocolitica. These positive samples were
analyzed by PCR, the results proved to be negative to virulence genes.
x
CAPITULO I
INTRODUCCIÓN
Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETAs) son causadas por diversos
organismos patógenos que pueden ser ingeridos a través de agua o alimentos
contaminados (Olea et al., 2012). Según la OMS, (2017) 1 de cada 10 personas
enferma por ETAs.
En 2017 la Unión Europea reportó 1,77 casos de Yersiniosis en humanos por cada
100,000 habitantes (EFSA, 2018). En el Ecuador se reportan brotes de ETAs
causadas por varios agentes. En 2019, el Ministerio de Salud Pública reportó un
33.91% semanal de transgresiones alimentarias causada por agentes que no fueron
identificados como Salmonella spp., E. coli o Shigella spp. (MSP, 2019).
Debido al riesgo que ésta bacteria puede presentar y la poca información que se
tiene de la misma, se considera a la presencia de Yersinia spp en cerdos de
consumo en el Ecuador como una enfermedad transmitida por los alimentos de
importancia en la Salud Pública.
1
CAPITULO II
Objetivo General
Objetivos Específicos
2
CAPITULO III
3. Marco Teórico
3.1 Historia
En sus inicios el Género Yersinia fue descrito como, una bacteria Gram negativa,
cocobacilar, e integrada como parte de la familia Pasteurellaceae (Bottone, E.,
1977). Yersinia pseudotuberculosis y Yersinia pestis fueron las primeras especies
de importancia veterinaria declarada, al causar enfermedades epizoóticas
especialmente en roedores. En 1953 varios brotes asociados a Y.
pseudotuberculosis fueron reportados en Estados Unidos (Bottone, E., 1977).
Además, patógenos denominados por entonces como “aislados tipo Yersinia”
fueron encontrados en personas, confirmando su importancia en medicina humana
(Bottone, E., 1977)
Van Loghem propone la creación del Género Yersinia en 1894, esto en honor a E.
Yersin quien fue el primero en aislar Bacillus pestis (ahora denominada Yersinia
Pestis). En 1954 utilizando análisis computarizado se determinó relaciones
cercanas, lo que le permitió integrarse a la familia de las Enterobacteriaceae
(Bottone, E., 1977).
3
3.2 Generalidades
El género Yersinia spp. según el CDC (Centers for Disease Control and Prevention)
es responsable de gran parte de los trastornos intestinales en humanos (CDC,
2016). Además es una importante infección alimentaria según la Unión Europea en
2015 (EFSA, 2007; Morka et al., 2018).
Las bacterias del género Yersinia son Gram negativas, de forma cocobacilar, no
formadora de esporas, anaerobias facultativas, oxidasa negativa y catalasa
positivas (Chlebicz & Slizewska, 2018; Van Damme, 2013). Son psicrófilas pudiendo
crecer entre 0°C a 45 °C, con una temperatura óptima de 22°C a 30°C donde son
móviles (Van Damme, 2013).
4
enterocolitica subespecie enterocolitica que comprende cepas altamente patógenas
del biotipo 1B y Y. enterocolitica subespecie paleartica que comprende cepas poco
patógenas o apatógenas, dando lugar a 6 grupos filogenéticos (Fredriksson-
Ahomaa et al., 2018; Hall et al., 2015).
5
5 O:2,3 Baja a + -
moderada
a pYV: Plásmido de Virulencia para Yersinia, b HPI: Isla de alta patogenicidad.
(Adaptada de Van Dame 2013 y 2010)
Este patógeno posee una resistencia natural a las penicilinas por su actividad de la
B-lactamasa (Fredriksson-Ahomaa, 2017). Es ampliamente tolerante a tratamientos
alcalinos, en especial con hidróxido de potasio el cual es usado para reducir
bacterias contaminantes en los aislamientos de Y. enterocolitica (Iso, 2017).
6
codificados en el plásmido son virF y YadA, estos se encuentran en el pYV
(plásmido de Virulencia de Yersinia). Los genes de virulencia cromosómica más
importantes son yst, inv, ail (Fredriksson-ahomaa et al., 2006; Mazzette et al., 2015;
Zadernowska et al., 2013).
El gen yst codifica una enterotoxina estable al calor, factor que es asociado a
cuadros de diarrea durante la infección (Harnett et al., 1996; Mazzette et al., 2015).
El gen inv codifica a proteínas de membrana, que se une a receptores de las células
epiteliales en las células M del intestino, permitiendo la absorción de las bacterias
en la etapa primaria de la infección (Petsios et al., 2016; Van Damme, 2013). El gen
ail codifica a proteínas que se relaciona con la unión e invasión en la célula huésped,
permite la propagación bacteriana a la linfa mesentérica y es característica de cepas
patógenas, también defiende a las bacterias del sistema inmunitario del hospedador
(Petsios et al., 2016; Zadernowska, A., et al. 2013).
7
jóvenes o que han sido sometidos a situaciones de estrés (Fredriksson-Ahomaa,
2017).
Algunos estudios señalan que animales que han adquirido Y. enterocolitica son
asintomáticos (Bottone, E., 2015; Fredriksson-Ahomaa, 2017). Esta bacteria ha sido
aislada en tonsilas, así como en el intestino y heces de cerdos saludables. Estudios
en cerdos de matadero demostraron una relación de 6 veces a 1 de los aislamientos
obtenidos de tonsilas frente a los aislados de heces y contenido intestinal de Y.
enterocolitica patógena (Nesbakken et al., 2006). Estos hechos resaltan la
importancia para la recuperación de este patógeno tomando las muestras en
tonsilas de cerdos (Nesbakken et al., 2006).
8
3.6 Epidemiología
Según la EFSA (2018) la Unión Europea en 2017 reportó para humanos 6.823 casos
de Yersiniosis, lo que significa 1.77 casos por cada 100.000 habitantes. En 529
muestras de cerdos se encontró 4.4% casos positivos. La EFSA reporta también
una disminución de casos de Yersiniosis en humanos comparada con el 2016, de
2.8%, sin embargo esta enfermedad sigue siendo de constante reporte de la Unión
Europea en casos humanos (EFSA, 2018).
9
Ecuador no posee estudios específicos de Y. enterocolitica, los datos que se pueden
obtener son a través de la gaceta Nacional Epidemiológica y el Ministerio de Salud
Pública reportado como brotes ETA, en el 2019 se presentaron en un 33.91% en
3.235 casos (MSP, 2019).
Dentro de las ventajas que proporcionada el agar CIN tenemos: mayor recuperación
de cepas clínicas, mejor visualización de la morfología de las colonias, en relación
a otros medios de cultivo como Salmonella-Shigella Modificado (SSDC) y
MacConkey (MAC), propiedades que le permiten diferenciar Y. enterocolitica de
otras bacterias Gram negativas (Fredriksson-Ahomaa, 2017; Petsios et al., 2016).
Esta bacteria forma colonias características menores a 2mm, con centro rojo
profundo por la fermentación del manitol, con un borde translucido denominado
como “ojo de buey” (Iso, 2017; Zadernowska et al., 2013). La apariencia de la
colonia varía con el serotipo, puede ser irregular o con un centro rojo elevado como
10
“huevo frito” cuando son observadas a través de un estereosmicroscopio. Se
recomienda una incubación a 30°C para evitar la pérdida de plásmidos de virulencia
(Van Damme, 2013; Zadernowska et al., 2013)
11
CAPITULO IV
4. Materiales Y Métodos
12
boca. La torunda fue colocada en un frasco estéril, previamente rotulado y
almacenado para su transportación en refrigeración.
En el frasco con la torunda se colocó 5 ml de agua estéril, más 15 ml de PBS
para su enriquecimiento.
13
Colonias características en CIN se sometieron a cinco pruebas bioquímicas
divididas en dos fases. La primera fase las muestras se sembraron en agar
Kliger, caldo urea a 30°C por 24h siendo positivas cuando se obtiene un
resultado negativo a fermentación de lactosa, positivo a fermentación de
glucosa, (K/A) y urea positiva. En la segunda fase de identificación, las
muestras fueron biotipificadas mediante las pruebas bioquímicas de esculina,
xilosa e indol. La interpretación de estos resultados se realizó con los criterios
que se muestran en la Tabla 3.
15
Tabla 5 Programa del Termociclador para los genes ail,virF y Yst.
16
Tabla 7 Programa del Termociclador para los genes rfbC y per.
17
CAPITULO V
5. Resultados Y Discusión
18
De los 7 cerdos positivos 4 fueron identificados como Y. enterocolitica. Los aislados
de los otros 3 cerdos no pudieron ser identificados con las pruebas bioquímicas
utilizadas en este estudio (Tabla 3).
En el análisis de PCR realizado la muestra U2133c amplicó para el gen ail, pero
para ser considerada una cepa patógena, debe ser positiva a dos de los tres genes
19
analizados (Van Damme, 2013). Por lo tanto no se obtuvieron muestras positivas a
genes de virulencia (ail, virF y yst) analizados en este estudio (Figura 1).
20
5.3 Discusión
En Europa, esta bacteria ocupa el tercer lugar entre los patógenos entéricos
causantes de ETAs en humanos (Mazzette et al., 2015). Además, se ha asociado
al cerdo como el principal reservorio de cepas patógenas (Bottone, 2015;
Nesbakken et al.2003; Van Damme et al., 2013). Estudios realizados en Europa
reportaron prevalencias de Y. enterocolitica entre el 37.4% y 58% en cerdos de
consumo (EFSA, 2007; Van Damme et al., 2015). Por su lado Estados Unidos
presentó prevalencias del 5% y 25% (Bowman et al., 2007; Funk et al.,1998).
Los niveles de Y. enterocolitica reportados en Ecuador han sido los más bajos
dentro en el contexto latinoamericano. Así, un estudio realizado en una comunidad
rural Otón de Vélez en Yaruquí encontró 1 cerdo positivo (2.8%) de 36 animales
muestreados (Vasco et al., 2016). No obstante, los resultados que se encontraron
en el presente estudio mostraron la presencia de Yersinia spp. en aislados
originados en 7 cerdos (6%), de los cuales 4 fueron identificados como Y.
enterocolitica.
21
Los bajos porcentajes de aislamiento de Y. enterocolitica en nuestro estudio pueden
estar influenciados por el tipo de faenamiento que se realiza en Ecuador. Un estudio
de Fredriksson-Ahomaa et al., (2001) determinó que se provocaba una mayor
diseminación de este patógeno durante el faenamiento al cortar la cabeza de los
cerdos. Sin embargo, el proceso de faenamiento en el Ecuador es diferente al
europeo, manteniendo la cabeza del cerdo intacta en la línea de faenamiento. Otro
factor que hay que mencionar es la cantidad limitada de animales muestreados en
este estudio. Para futuros estudios, se sugiere aumentar el número de muestra a fin
de reducir el potencial sesgo de la estimación de esta bacteria en cerdos.
22
seguido en menor cantidad del O:3 (Bottone, 2015; Petsios et al., 2016;
Zadernowska et al., 2013). En América del Sur solo algunos países presentan
identificación de serotipos. Así, Rusak et al., (2014) determinó al serotipo O:3 en
cepas brasileñas y en México se encontraron los serotipos O:9 y O:3 (Elizalde
Castañeda et al., 2001).
23
La ausencia de datos sobre Y. enterocolitica en Latinoamérica dificulta tener una
idea epidemiológica regional sobre esta bacteria. Estudios futuros se hacen
necesarios para entender la dinámica de este patógeno en alimentos. Un mayor
número de animales analizados, muestreo en diferentes zonas geográficas y un
panel más amplio de pruebas para identificar varios serotipos podrían ser factores
que deben ser considerados.
El cerdo está entre los principales alimentos de consumo del país, por lo que se
requiere establecer procesos de investigación que profundicen los conocimientos
sobre este patógeno alimentario para ayudar a establecer políticas sanitarias
basadas en hechos científicos.
24
CAPITULO VI
6. Conclusiones
25
5. BIBLIOGRAFÍA
Bowman, A. S., Glendening, C., Wittum, T. E., Lejeune, J. T., Stich, R. W., & Funk,
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31
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1437-y
32
ANEXOS Caldo TSB
Buffer TE 1X
Anexo 1.
Equipos
2.1 Materiales de Laboratorio para
toma de muestras Mechero de bunsen o cámara
Materiales de seguridad
Estereoscopio
Frascos estériles
Incubadoras 30 ºC
Fundas estériles
Micropipeta 100 – 1000 μl
Muestra de contenido cecal
Vortex
Algodón
Lámina de bisturí
Asas plásticas de 1μl para
siembra y estriaciones
Espejo
Lámpara de luz blanca
Reloj análogo
Gradilla
Aguja de inoculación
Reactivos
Materiales Equipos
Reactivos
TE1X
Agua de grado Molecular
Buffer
Cloruro de magnesio (MgCl2)
Desoxirribonucleótidos
trifosfatados (dNTP)
Primers forward y reverse para
los genes ail, virF, yst.
Enzima ADN polimerasa (Taq)
Templado o molde de ADN
34
Anexo 3 Agarosa
Materiales Equipos
Reactivos
TE1X
Agua de grado Molecular
Buffer
Cloruro de magnesio (MgCl2)
Desoxirribonucleótidos
trifosfatados (dNTP)
Primers forward y reverse para
los genes rfbC y per
Enzima ADN polimerasa (Taq)
Templado o molde de ADN
35
Anexo 4.
36
Anexo 5.
37
Anexo 6
Flujograma de Hisopado de Amígdalas
38
Anexo 7
39
Anexo 8
40
Observación de colonias en agar CIN Colonia sospechosa
41
Colonias y tamaño específicas Siembra en agar esculina
42