FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE TECNOLOGÍA MÉDICA

ESPECIALIDAD DE LABORATORIO CLÍNICO Y ANATOMÍA

PATOLÓGICA

PRÁCTICA Nº

DETERMINACIÓN DE SALICILATOS EN MUESTRAS BIOLÓGICAS

ASIGNATURA : TOXICOLOGÍA

SECCIÓN : LC3N1 SEMESTRE: 2015-2

GRUPO: B

ALUMNO :

Código Matrícula N° : 2014100315

FECHA DE REALIZACIÓN DE LA PRÁCTICA : 05 DE NOVIEMBRE

FECHA DE PRESENTACIÓN DEL INFORME : 12 DE NOVIEMBRE

DOCENTE :

LIMA- PERÚ

2015
 I. INTRODUCCIÓN

La ansiedad es un síntoma que puede presentarse formando parte de distintos cuadros

psiquiátricos tales como episodios depresivos, maníacos, psicóticos, etc. Sin embargo,
también puede constituir un síndrome en sí misma manifestándose como componente
emocional, cognitivo y/o comportamental (palpitaciones, sudoración, tensión muscular,
etc.) de distintos trastornos psiquiátricos como las crisis de angustia (panic attack), el
trastorno de ansiedad generalizada y el trastorno por estrés postraumático entre otros.
Desde su aparición y hasta la actualidad, las benzodiazepinas se han convertido en los
fármacos de mayor prescripción en el tratamiento psicofarmacológico de la ansiedad.
Existen también fármacos no benzodiazepínicos con perfil ansiolítico y/o sedativo como
antihistamínicos (ej. difenhidramina), buspirona y barbitúricos. Estos últimos, desde que
se dispone de benzodiazepinas, han dejado de utilizarse para el manejo de la ansiedad
dado su bajo índice terapéutico y hoy su uso ha quedado limitado para anestesia
intravenosa y como anticonvulsivantes. Los barbitúricos fueron las drogas de mayor
prescripción como ansiolíticos y sedativos durante la primera mitad del siglo XX,
sumándose hacia el año 1950 el meprobamato (no disponible en nuestro país) de
estructura similar al carisoprodol (relajante muscular con efecto sedativo). El desarrollo
de las benzodiazepinas se produjo durante la década del ´50. En 1960 se patentó la
primera de ellas, el metaminodiazepóxido, nombre genérico que luego se modificó a
clordiazepóxido. En 1963 se patentó el diazepam, fármaco de mayor potencia ansiolítica
y mayor efecto relajante muscular que el clordiazepóxido. Actualmente se encuentran
disponibles en el mercado farmacéutico varios derivados benzodiazepínicos además del
clordiazepóxido y el diazepam, como el alprazolam, clonazepam, bromazepam y
lorazepam entre otros.
II. MARCO TEÓRICO

Todas las benzodiazepinas tienen el mismo mecanismo de acción y efectos adversos

similares; sin embargo, difieren marcadamente en sus características farmacocinéticas.
Son justamente estas diferencias las que les otorgan características particulares que
definirán la elección de un fármaco sobre otro.
Conocer entonces la farmacocinética de las benzodiazepinas tiene una indiscutible
importancia clínica.

El ácido gamma-aminobutírico (GABA) es el neurotransmisor inhibitorio más importante

del sistema nervioso central (SNC). Actúa sobre receptores específicos denominados
GABA A, B y C. El GABAA, situado a nivel postsináptico, es un receptor ionotrópico
dado que contiene un canal de cloro conformado por 5 subunidades. Si bien existen
múltiples combinaciones posibles de estas subunidades, la más frecuente es 2 a- 2b-1g.
Al unirse el GABA a su sitio de acción específico se produce la apertura de dicho canal,
con la consiguiente entrada de cloro a la célula e hiperpolarización de la misma, dando
como resultado un efecto inhibitorio. El receptor GABAA es un complejo
macromolecular conformado por sitios de unión específicos para varios ligandos: su
agonista GABA, y moduladores alostéricos tales como benzodiazepinas, barbitúricos y
esteroides. Las benzodiazepinas actúan solamente sobre los receptores GABAA que
tienen presente la subunidad g. Ejercen su acción aumentando la afinidad del GABA por
su receptor y la frecuencia de apertura del canal de cloro, sin modificar la conductancia
del mismo ni el tiempo de apertura del canal (figura 1). 3 Se han reconocido 3 subtipos
de receptores para benzodiazepinas que se diferencian en su estructura, ubicación y
afinidad de ligandos:

· BZ1: tiene alta afinidad por el zolpidem y se encuentra en mayor densidad en cerebelo,
corteza cerebral, hipocampo y células cromafines de la glándula suprarrenal.

· BZ2: tiene alta afinidad por benzodiazepinas y se localiza principalmente en médula

espinal, corteza cerebral, hipocampo y células cromafines de la glándula suprarrenal.

· BZ3: tiene alta afinidad por benzodiazepinas y no se encuentra asociado al receptor

GABAA. Se localiza en hígado, riñón, testículo y suprarrenal. A nivel del SNC se
encuentra en las membranas mitocondriales y se cree que estaría involucrado en el efecto
hipnótico y sedante de esteroides neuroactivos.

III. METODOLOGÍA
Materiales, Métodos y procedimiento de la práctica (según guía de práctica).

Materiales y equipos: - Gabinete II TLC Spray

- Rayador de placas cromatográficas
- Balanza analítica - Recubridor de placas cromatográficas
- Baño María - Refrigeradora
- Campana extractora de gases - Atomizadores con bombilla, 125 mL
- Cámara Cromatográfica, 20 x 20 cm - Bagueta
- Esterilizadora - Embudos
- Gabinete II UV - Frascos viales
- Fiola 100 mL - Papel filtro
- Laminas de vidrio, 20x20 cm - Regla para Cromatografía en Capa
- Pipetas graduadas, 5mL fina.
- Probetas graduadas,10 mL, 50mL
- Peras de separación, 100 mL Reactivos:
- Tubos capilares sin heparina. - Acido sulfúrico al 10%.
- Vasos de precipitación, 50 mL. - Agua destilada
- Cloroformo p.a.
- Cintas indicadoras de pH
- Hidróxido de amonio al 10%.
- Frascos de vidrio de boca ancha con
- Metanol p.a.
tapa.
- Parafina
- Gradillas
- Silicagel G
- Guantes descartables.
- Solución reactivo de Swikker
- Pizeta - Solución reactivo de Dragendorff

Procedimiento:

a) Toma de muestras biológicas para la determinación de benzodiacepinas y

barbitúricos
- Para los análisis toxicológicos la toma de muestras de orina; se recepcionarán en frascos
de vidrio de boca ancha y tapa tipo rosca, limpios y secos en volumen de 80 mL
aproximadamente.
- Las muestras de orina recolectadas se rotularán y luego serán llevados al Laboratorio de
Toxicología, donde se guardarán en refrigeración, para finalmente en cada una de las
muestras biológicas se investigará la presencia y/o ausencia de benzodiacepinas y
barbitúricos.

b) Análisis Toxicológico
Para el análisis toxicológico de las muestras de orina, se realizará con la técnica de la
Cromatografía en capa delgada.
Se utilizarán placas cromatográficas de 20 x 20 cm con silicagel G. Se dejarán secar y se
activarán a 100°C por 30 minutos. Las fracciones clorofórmica y etérea se sembrarán por
20 a 30 veces frente a los estándares de benzodiacepinas y barbitúricos que se aplicarán
3-5 gotas.

c) Extracción y concentración de las muestras.

Se obtendrá un extracto clorofórmico en medio alcalino para extraer de la orina las
posibles metabolitos de benzodiacepinas, y un extracto etéreo en medio ácido para extraer
los barbitúricos.

A. Extracto clorofórmico:

a. Se adicionará 30 mL de orina en una pera de separación.

b. Se ajustará el pH a 9 con solución de hidróxido de amonio al 10%.
c. Luego se añadirá 15 mL de cloroformo q.p. Agitando por tres veces, dejando en reposo
de 8 a 10 minutos.

d. Después se reunirá los extractos y se concentrará a Baño maría sin llegar a sequedad.
e. Los residuos obtenidos se disolverán con 5 gotas de cloroformo y se guardarán en
frascos viales herméticamente cerrados para su posterior análisis.

B. Extracto etéreo:

a. A la orina que se encuentra en la pera de separación del paso anterior.

b. Se ajustará el pH a 3,5 con ácido sulfúrico al 10%.
c. Luego se añadirá 15 mL de éter etílico q.p. Agitando por tres veces, dejando en reposo
de 8 a 10 minutos.
d. Después se reunirá los extractos y se concentrará a Baño maría sin llegar a sequedad.
e. Los residuos obtenidos se disolverán con 5 gotas de éter y se guardarán en frascos
viales herméticamente cerrados para su posterior análisis.

d) Identificación por Cromatografía en capa fina de benzodiacepinas y barbitúricos.

Fundamento:
La cromatografía en capa fina, es procedimiento físico-químico que permite la separación
de los componentes de una mezcla de sustancia que se encuentra sobre una placa de
vidrio, cubierta por un soporte (fase estacionaria) mediante el pasaje de un sistema de
solvente (fase móvil), provocando la migración diferencial de los componentes de la
mezcla.

A. Barbitúricos.
- Fase estacionaria : Silicagel G
- Fase Móvil-A : Cloroformo 80 mL

Acetona 20mL
- Fase Móvil-B : Acetato de etilo 85 mL

Metanol 10 mL
Hidróxido de amonio 5 mL

Visualización: Las placas deben secarse antes de proceder al examen visual. El secado
puede efectuarse a la temperatura ambiente o, para mayor rapidez, mediante el empleo de
aire caliente. En este último caso, hay que tener cuidado de que ningún componente de
interés esté descompuesto. Para la visualización de los metabolitos de barbitúricos, se
pulveriza la cromatoplaca con el reactivo de Swikker.

B. Benzodiacepinas
-Fase estacionaria : Silicagel G
-Fase Móvil-A : Cloroformo 80 mL

Metanol 20 mL
-Fase Móvil-B : Cloroformo 90 mL

Metanol 10 mL
-Visualización: Las placas deben secarse antes de proceder a la visualización. El secado
puede efectuarse a la temperatura ambiente o para mayor rapidez, mediante el empleo de
aire caliente. En este último caso, hay que procurar que ningún componente de interés sea
térmicamente lábil, Para que el color pueda revelarse debidamente, es importante eliminar
de la placa todo vestigio de amoniaco o de otras bases.

-Métodos de visualización:

Luz ultravioleta a 254 nm.

-Pulverizar la cromatoplaca con el Reactivo de Dragendorff (Munier)

IV. RESULTADOS
Cálculos matemáticos sobre dosis, cuadros, gráficos, imágenes de los efectos
farmacológicos en animales de experimentación.

Dividir en áreas la Insertar en el frasco coplin

placa cromatografía

Utilizar el atomizador RESULTADOS

V. DISCUSIÓN
La muestra biológica (orina) es válida para la identificación de posibles metabolitos
tóxicos. El método Screening para determinación de BZD es válido, sin embargo el
resultado obtenido en la práctica fue negativo esto se debe a diversos factores como:
 La muestra estuvo contaminada.
 Error del operador por mala manipulación de la muestra.

Los materiales utilizados estuvieron contaminado con otras sustancias La CCF es una
técnica analítica y tiene como objetivo el análisis de una mezcla de componentes, se
desarrolla rápidamente debido a su simplicidad y velocidad, para el análisis cualitativo de
los productos de una reacción, puesto que permite conocer de manera rápida y sencilla
los componentes que hay en una mezcla. El Rf se puede determinar para cada una de las
manchas el valor de Rf (factor de retención), o la distancia que cada compuesto se
desplaza en la placa.

Cada compuesto tiene un Rf característico que depende del disolvente empleado y del
tipo de placa de CCF utilizada, pero es independiente del recorrido del disolvente. De esta
manera se puede ayudar a identificar un compuesto en una mezcla al comparar su Rf con
el de un compuesto conocido (preferiblemente cuando se hacen eluir en la misma placa
de CCF).

VI.CONCLUSIONES
 Se obtuvo el extracto seco por el método Screening.
 Se preparado el revelador de Dragendorff.
 Se preparó el medio para el recorrido de la placa.
 Se preparó el diluyente.
 Se realizó la investigación de metabolitos tóxicos en cromatografía en capa fina,
el resultado fue negativo, no se observó la presencia de BZD en la muestra de
orina.
 Se analizó una muestra de orina tanto drogas de carácter ácido como básico, por
lo tanto se procedió a realizar una extracción en medio ácido, y de la fase acuosa
que resultó de esta extracción, se procedió a alcalinizar y realizándose otra
extracción para obtener la fracción básica.

VII. RECOMENDACIONES

Es importante tener en cuenta que para realizar un análisis de metabolitos

benzodiacepinicos en muestras de orina, se debe conocer la solubilidad, el metabolismo
de cada BZD y contar con los materiales y equipos necesarios, así como también de
sustancias de referencia de metabolitos con el fin de obtener resultados precisos y
confiables. La extracción liquido-liquido es una técnica muy utilizada por lo que uno de
los factores a tener en cuenta para este tipo de extracción es la reelección del solvente
adecuado es la densidad, la polaridad, selectividad y la solubilidad de la droga.
 VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Gómez. Intoxicación por Benzodiacepinas. Departamento de toxicología de la

Universidad de Antioquina. Capitulo VIII. 1275-1277. 2.

Camargo F. Screening toxicológico de sustancias psicoactivas en muestras biológicas.

Instituto Medido Forense. Argentina. 2010. 3.

Fiorenza G. Manual De Procedimientos Analíticos Toxicológicos Para Laboratorios De

Baja Complejidad. Argentina. 2007 4.

Villalobos M. implementación de un método de análisis por cromatografía de metabolitos

de BZD en muestras de orina. Universidad Industrial de Santander. Colombia. 2004. 5.

http://www.ub.edu/oblq/oblq%20castellano/cromatografia_tipus.html

IX. ANEXOS
Flujogramas, imágenes…Cuestionario

Cuestionario

1. Explique el fundamento del Método realizado en la práctica al identificar

Benzodiacepinas en orina con el reactivo de Dragendorff.

La cromatografía en capa fina (en inglés thin layer chromatography o TLC) es una
técnica analítica rápida y sencilla, muy utilizada en un laboratorio de Química Orgánica.
Entre otras cosas permite:

Determinar el grado de pureza de un compuesto. Se puede determinar así, por ejemplo,

la efectividad de una etapa de purificación.
Comparar muestras. Si dos muestras corren igual en placa podrían ser idénticas. Si, por
el contrario, corren distinto entonces no son la misma sustancia.
Realizar el seguimiento de una reacción. Es posible estudiar cómo desaparecen los
reactivos y cómo aparecen los productos finales o, lo que es lo mismo, saber cuándo la
reacción ha acabado.
La muestra a analizar se deposita cerca de un extremo de una lámina de plástico o
aluminio que previamente ha sido recubierta de una fina capa de adsorbente (fase
estacionaria). Entonces, la lámina se coloca en una cubeta cerrada que contiene uno o
varios disolventes mezclados (eluyente o fase móvil). A medida que la mezcla de
disolventes asciende por capilaridad a través del adsorbente, se produce un reparto
diferencial de los productos presentes en la muestra entre el disolvente y el adsorbente.
2. Explique el fundamento del Método realizado en la práctica al identificar
Barbitúricos en orina con el reactivo de Swikker.

LOS BARBITURICOS en presencia de sales de cobre

forman complejos coloreados piridincupricos muy poco
solubles en piridina agua y francamente solubles en solventes
orgánicos, en esta acción el barbitúrico actúa como reductor
del cobre transformandolo de cúprico a cuproso. En el caso
de los tiobarbituricos es el azufre del C2, el agente reductor
del O2, dando en ambos casos como resultado una coloración
que depende del tipo de barbitúrico presente en el caso de los
oxibarbituricos será violeta – rosado y para los tiobarbituricos
será verde. De esta manera dicha reacción e s usada para
diferenciar los oxibarbituricos de los tiobarbituricos.

3. Realice la reacción química al identificar barbitúricos con el Reactivo Zwikker.

4. ¿Porqué tanto las benzodiacepinas y metabolitos de la cocaína se identifican con el

Reactivo Dragendorff?.

5. Con que finalidad Ud., utiliza hidróxido de sodio al 10% y acido sulfúrico al 10% en la
marcha analítica para identificar Benzodiacepinas y barbitúricos.