INTRODUCCIÓN.

OBJETIVOS.

 Establecer las características principales de la cromatografía de

líquidos de alta resolución y su utilidad como método analítico.
 Estudiar los parámetros que afectan la resolución de los picos de
elución en la cromatografía de líquidos.
 Conocer la cromatografía de líquidos de alta resolución de fase
inversa o reversa.
 Determinar la concentración de cafeína en algunas bebidas por
cromatografía de líquidos de alta resolución en fase reversa.
Procedimiento Experimental
Material, equipos y reactivos.

Material Equipo Reactivos

Matraz aforado de 10 ml Cromatógrafo HPLC. Metanol
Micropipeta 100-1000 µL Balanza analítica Agua
Matraz aforado de 25 ml HCl
Solución de cafeína

Preparación de la fase móvil

1. La fase móvil se realizó en una proporción 30:70 de metanol – agua,

la cual fue ajustada a pH = 3.5 con HCL 1 M. Además, se colocó en
ultrasonido para desgasificar durante quince minutos para después
filtrarla con una membrana de 0.44 µm.
Solución estándar de cafeína y curva de calibración

2. Se pesaron 25 g de cafeína y se llevaron a un aforo de 25 mL. Se realizó

una dilución de 1/10 y de esta otra más de 5/25, para obtener
finalmente una disolución estándar con una concentración de 20
ppm.
3. De acuerdo con la tabla 1 se realizaron las diluciones
correspondientes para obtener un intervalo de concentraciones de
2.0 – 10 ppm y obtener una de curva de calibración.
Preparación de la muestra problema
4. Se tomaron aproximadamente 50 mL de Pepsi kick y se llevaron a
agitación durante 20 minutos para desgasificar.
 5. Se realizaron los cálculos para obtener 10 mL de Pepsi kick con una
concentración de cafeína en el intervalo de la curva de calibración.
(Véase memoria de cálculo).
6. Finalmente se preparó la disolución aforando con la fase móvil.
Determinación de cafeína mediante HPLC

7. Se fijó el flujo del cromatógrafo en 1.5 mL/min en la longitud de onda

del detector a 272 nm. Además, se hizo fluir fase móvil por la columna
durante 15 minutos para asegurar que no haya otras sustancias en la
misma de experimentos previos.
8. Se inyectaron los estándares mencionados en el punto 3 y se realizó la
curva de calibración.
9. Finalmente se inyectó la muestra de Pepsi kick para realizar la
cuantificación por extrapolación.
10. Para finalizar se lavó la columna con una mezcla de etanol – agua
20:80.

RESULTADOS Y ANÁLISIS.

Para la fase móvil utilizada, se creó una solución 30:70 de metanol en agua,
por lo que, al ser ambos líquidos polares, se podrá percibir que la
cromatografía se llevo a cabo en reversa, además de que se dice que la
fase estacionaria por el contrario es apolar.

Dentro de esta clasificación, se dice que la cafeína es medianamente polar

por lo que su afinidad se dará para la fase estacionaria provocando un
mayor tiempo de retención o elución, la cual por su parte puede ser
modificada mediante la composición de la fase móvil, modificando su
polaridad, si esta disminuye, el tiempo de retención aumenta y por el
contrario al aumentar la polaridad el tiempo de retención disminuiría.

Además de esto, algo importante que monitorear es el pH, ya que este

puede influir en la hidrofobicidad del compuesto, por lo que en este caso se
impuso un pH acido de 3.5

Para la construcción de la curva de calibración se empleo la tabla del

manual, considerando algunas modificaciones

Tabla 1. Construcción de Curva de Calibración de Cafeína.

Sistema 1 2 3 4 5 Problema
VSTOCK (mL)
1 2 3 4 5 0
20 ppm.
VMUESTRA (mL) 0 0 0 0 0 ***
V aforo (mL) 10 10 10 10 10 10
[Cafeína] 2.02 4.04 6.06 8.08 10.1 ***

Para tratar la información de los cromatogramas obtenidos, se empleará la

siguiente tabla.

Tabla 2. Resultados de los sistemas de la curva de calibración y muestra

problema
Sistema [Cafeína] tR (min) W1/2 Área Altura
ppm (s) (min) (u )
2 (u)
1 2.02 4.587 8.1 0.135 56777 7436
2 4.04 4.544 8.1 0.135 130759 14395
3 6.06 4.540 8 0.1333 205514 22640
4 8.08 4.482 7.8 0.13 285508 32475
5 10.1 4.489 8 0.1333 33214 36962
problema 4.79 4.490 7.6 0.126 78479 9190

Mediante la tabla anterior, se puede percibir que el tiempo de retención

tiene intervalos demasiado pequeños entre los sistemas, ya que dicho factor
en realidad no es dependiente de la concentración de los sistemas.

En este caso lo que en realidad es de vital importancia es tanto el área como

la altura de los picos formados, por lo que se decidió construir la curva de
calibración con los valores obtenidos del área puesto que mantienen
proporción el área y la concentración, por otro lado ya que el ancho de los
picos no es constante y su forma varía achatándose las puntas, a menos de
que se tomen ciertas partes donde el cambio seria mínimo, es una opción
mucho menos viables.
Si nos enfocamos en este caso, el ancho a la mitad del pico presenta ligeras
variaciones en los últimos sistemas de alrededor de 0.2 s, lo cual puede ser
algo muy bajo, pero al tratarse de concentraciones bajas, esto puede
representar un gran error.
Lo antes mencionado se puede verificar al llevar a cabo la regresión lineal
con los datos de altura, obtenemos un coeficiente de correlación de 0.9906,
que es menor que el obtenido para la regresión lineal con las áreas (0.99937).

Grafico no. 1: Curva de calibración.

400000
350000 y = 34932x - 9532.5
R² = 0.9937
300000
250000
Area (U2)

200000
150000
100000
50000
0
0 2 4 6 8 10 12
[Cafeina] ppm

Utilizando la ecuación de regresión lineal se puede obtener la

concentración en ppm de la solución del refresco seleccionado.
𝑦 = 34932𝑥 − 9532.5
Dicha ecuación se puede comparar con la del modelo
𝐴 = 𝐾𝐶

Donde
𝐴=𝑌
𝑋 = 𝐶𝑜𝑛𝑐𝑒𝑛𝑡𝑟𝑎𝑐𝑖𝑜𝑛
78479 = 34932𝑥 − 9532.5 → 𝑋 = 𝐶 = 2.5195 𝑝𝑝𝑚

Por lo que mediante los cálculos necesarios, se obtuvo la siguiente tabla

donde se muestra la concentración teórica y experimental en la muestra de
refresco.
 Tabla 3. Información de la muestra problema (Obtenido de
la etiqueta).
Porcentaje en
Marca masa/volumen de
cafeína
Coca cola con
20 mg/ 250 ml
café

Tabla 4. Comparación de las concentraciones teóricas y y experimentales

𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆𝒊𝒏𝒂 𝒈 𝒄𝒂𝒇𝒆𝒊𝒏𝒂
𝑪𝒕𝒆𝒐 [𝟐𝟓𝟎 𝒓𝒆𝒇𝒓𝒆𝒔𝒄𝒐] % error
𝑪𝒆𝒙𝒑 [ ]
𝟐𝟓𝟎 𝒓𝒆𝒇𝒓𝒆𝒔𝒄𝒐
80 ppm 41.99 47.51

La comparación de datos muestra que la concentración experimental de

cafeína es menor que la que esta reportada en la etiqueta del producto, la
variación de estos valores fue del 47.51 %, la cual es demasiado grande, ya
que casi es lo equivalente a la mitad de lo reportado. Una de las razones
que contribuyeron a este error es que los productos comerciales tienden a
tener un rango de concentración o cantidad que debe tener la sustancia
de interés en este caso la cafeína además de que pudo deberse a diversos
factores que pudieron afectar tanto en la lectura de las concentraciones en
el cromatógrafo tanto de las disoluciones patrón como la de la muestra
problema.

Posteriormente en la siguiente tabla se muestran los valores que definen la

eficiencia en el proceso de separación para la columna utilizada.

Tabla 5. Número de platos teóricos y altura equivalente de plato teórico

Sistema [Cafeína] tR (min) W1/2 N AEPT
ppm (s) (min) (mm)
1 2.02 4.587 8.1 0.135 6401.6436 0.01562
2 4.04 4.544 8.1 0.135 6282.1840 0.01591
3 6.06 4.540 8 0.1333 6432.1025 0.01554
4 8.08 4.482 7.8 0.13 6591.1098 0.01517
5 10.1 4.489 8 0.1333 6288.4043 0.015902
Promedio 6399.0888 0.01562

En la tabla anterior se observa que las variaciones en N y AEPT son pequeñas,

esto debido a los ligeros cambios en el tiempo de retención y el ancho a la
mitad del pico. Normalmente estas desviaciones se deben a factores en la
interacción de la cafeína con la columna, las cuales varían ligeramente.

Por lo tanto, en este caso sería más conveniente hablar de valores promedio
para N y AEPT ya que se trata del mismo compuesto para todos los sistemas,
el cual se presenta al final de la tabla. Además, de que, aunque las
variaciones no son significativas de forma ideal se esperaba fueran las
mismas.

Finalmente, es importante mencionar que existen distintos métodos para el

análisis de cafeína, la determinación de esta se suele llevar a cabo
mediante técnicas de separación como HPLC (Cromatografía líquida de
alta eficiencia), CE (Electroforesis capilar), TLC (Cromatografía de capa fina)
o GC (Cromatografía de gases). Estos métodos realizan la detección
mediante técnicas electroquímicas (potenciométricas, conductimétricas,
amperométricas, etc.), ópticas (espectrofotométricas, fluorimétricas, etc.) y
otras (termoquímicas). La elección de una u otra técnica depende del
problema a resolver, del volumen de muestra y de su concentración.
CONCLUSIONES

En primera estancia se logro obtener cafeina a traves de una cromatografia

liquida de alta eficiencia a traves de una muestra de Coca Cola con café,
mostrando asi que este tipo de técnica se aplica al sistema estudiado, pues
este posee una fase movil liquida. Asimismo se tomo en cuenta las variables
que afectan la eficiencia de la tecnica, tal es asi que se detecto cierta
cantidad de cafeina en la muestra, 41.99 ppm, esto demuestra que
realmente hay una mayor cantidad de azúcares que de cafeína dentro de
una Coca Cola con café, sin embargo es una cantidad considerable para
el consumo humano.

Cabe destacar que se logro identificar las diferencias entre una fase normal
y una fase reversa, identifiacando que una de las principales caracteristicas
residen en la polaridad de la fase estacionaria y la fase movil de una
columna, es decir, para la fase normal, la fase estacionaria es polar y la fase
movil es no polar, mientras que para la fase reversa, la FE es no polar y la
fase movil posee cierta polaridad.

Finalmente como la muestra contenia compuestos no volatiles es como se

pudo obtener la concetracion de cafeina con base en la tecnica de HPLC,
mostrando asi, que este metodo es valido para la muestra problema.
MEMORIA DE CALCULO
 Preparación solución Stock
 Preparación de curva de calibración de cafeína
 Preparación muestra problema
 Cuantificación de cafeína en el refresco
 Número de platos teóricos y altura equivalente de plato teórico

Bibliografía
Calvo, J. R. (2010). Manual de Prácticas de Química Analítica II. Ciudad de
México: Universidad Autonóma Metropolitana.

Consejo Superior de Investigaciones Científicas. (2009). Cromatografía

Líquida de Alta Eficacia. España: Museo Nacional de Ciencias
Naturales.

García, A. (2011). HPLC Instrumental. España: Universitat Politécnica de

Valencia.