UNIVERSIDAD CATÓLICA DE SANTA MARÍA

FACULTAD DE MEDICINA HUMANA IV SEMESTRE

CURSO DE INMUNOLOGÍA BÁSICA

INFORME

PRACTICA N°4: AISLAMIENTO Y CULTIVO DE LINFOCITOS Y NEUTROFILOS HUMANOS

PRESENTADO POR: LUCERO BEATRIZ MACHACA FLORES

I. INTRODUCCIÓN:

La técnica de Ficoll hypaque es una técnica de centrifugación por gradiente de

densidad para separar Células Mononucleares de Sangre Periférica (CMSP) de
otras células de la sangre. Durante la centrifugación se van formando varias capas,
el sedimento que esta formado principalmente por granulocitos y eritrocitos ha
migrado a través de la gradiente de densidad que es mayor al del ficoll hypaque,
encima estaría otra capa que seria el ficoll hypaque que es menos denso, y encima
estaría otra capa fina opalescente que serian las CMSP, finalmente sobre esa capa
estaría las plaquetas y el plasma que con futuros lavados se estarían removiendo
para tratar de obtener solo los linfocitos.

Es necesario para realizar los estudios funcionales de células mononucleares de

sangre periférica, el aislamiento de éstos a partir de muestras de sangre, órganos
linfoides u otros tejidos. Este aislamiento se puede realizar por varios métodos pero
en esta ocasión vamos a hacer referencia a la “Separación por gradiente de
densidad”, utilizaremos la centrifugación sobre una solución de densidad definida
como es el Ficoll-Hypaque. El Ficoll es un polímero de carbohidrato y metrizamida
(compuesto denso que contiene yodo) y que permite que se hundan los eritrocitos y
los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y que floten las células
mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugación nos será
fácil obtener las células mononucleares de sangre periférica.

II. DESARROLLO DE LA PRÁCTICA:

Se extrajo la sangre en tubos de vidrio y se mezcló con anticoagulante, se añadió

2.5 ml de dextrano al 10%, se dejó sedimentar por 40 minutos y se recuperó el
sobrenadante y se colocó sobre ficoll-hypaque en relación de 1-2.
 En un tubo falcon se colocó 5 ml de ficoll-hypaque y se agregó cuidadosamente 10
ml de la solución anterior evitando la mezcla de ambas. Se centrifugó por 20 minutos.
Después se recolectó la capa de leucocitos formada entre el ficoll-hypaque y el
plasma, y se recolectó en un nuevo tubo falcon al igual que con el precipitado debajo
del ficoll-hypaque. Se agregó 10 ml de PBS.

Se centrifugó nuevamente y se añadió 2 ml de medio de cultivo completo,

estreptomicina y suero humano al precipitado. Se procedió con el conteo.

III. RESULTADOS:

1. Esquematice el procedimiento de aislamiento y cultivo de linfocitos y neutrófilos

humanos.
(Imágenes)
 2. Determinar la viabilidad y el número de linfocitos y neutrófilos humanos
obtenidos por mililitro.

Conteo Celular:
G1 = 508 X 10⁴ -> 5.08 X 10⁷
G2 = 499 X 10⁴ -> 4.99 X 10⁷

Viabilidad:
𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑣𝑖𝑎𝑏𝑙𝑒𝑠 2058
G1 = x 100 = x 100 = 93%
𝑛 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠 𝑡𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 2206

1827
G2 = x 100 = 96%
1898

IV. CUESTIONARIO

1. Indique el fundamento del aislamiento de linfocitos y neutrófilos humanos con

ficoll-hypaque
Ficoll-hypaque es un polímero de carbohidrato y metrizamida la cual es una
sustancia que ayuda a que las células se separen de acuerdo a sus densidades,
es por eso que los eritrocitos que tienen mayor densidad se van hasta el fondo,
luego sigue el ficoll-hypaque, las células mononucleares y finalmente el plasma.

2. ¿Qué características físicas de las células de la sangre permiten la distribución

de las células de la sangre en distintas capas?
Las distintas densidades que posee cada tipo de célula

3. ¿Qué es una gradiente de densidad?

Columna de líquido de densidad concreta que se utiliza en la separación de
diferentes tipos de células por centrifugación. Las células van progresando por
el gradiente hasta que alcanzan el nivel en que su gravedad específica, es la
misma que la del medio. De este modo, los diferentes tipos celulares presentes
en la muestra dan lugar a diferentes bandas en función de su densidad.

4. Indique los tipos de linfocitos que se encuentran en la sangre

Linfocitos B
Linfocitos T

5. ¿Qué es una centrifugación isopicnica?

La centrifugación isopicnica es igual que una centrifugación convencional, solo
que a la sustancia que vamos a centrifugar se le agrega ficoll-hypaque el que
hace que las células que van a ser separadas tiendan a igualar sus densidades
y así puedan separarse.

6. Indique que otros medios de densidad se puede utilizar para la separación de

linfocitos
Centrifugación en colchones de densidad constante. Se recolectó 1 mL de
sangre, tipo O Rh+, por punción venosa, utilizando CPD-A3, (15 mM ácido
cítrico, 90 mM citrato de sodio, 16 mM fosfato de sodio monobásico, 250 mM
dextrosa, 4 mM adenina, pH 5,9), como anticoagulante. La sangre fresca se
centrifugó a 200 x g (Centrífuga International, modelo HN, rotor 215), a
temperatura ambiente, durante 10 minutos para eliminar el plasma, y mediante
un conteo en cámara de Neubauer, se determinó el contenido de células blancas
 totales. Las células rojas sedimentadas se resuspendieron vlv en HBS (160 mM
NaCI, 20 mM HEPES ácido. pH 7,4) y se adicionaron suavemente por las
paredes de un tubo de 2 mL, sobre un colchón de 1 mL de ficoll (Pharmacia) (4)
o de dextrán (Sigma) (3); se ensayó, además, un lavado consecutivo con ficoll-
dextrán en las mismas condiciones mencionadas anteriormente. Después de
descartar el sobrenadante que contenía las células blancas, se lavaron las
células rojas dos veces con HBS. Finalmente, se calculó el porcentaje de
remoción por conteo de células en cámara de Neubauer.

7. Indique cual es la composición del medio de cultivo RPMI-1640 e indique la

importancia de sus componentes

RPMI es un medio enriquecido, con múltiples aplicaciones para diversas líneas

celulares de mamíferos e hibridomas, incluyendo:
 Mieloma humano
 Hibridoma de ratón
 Leucocitos humanos
 Linfocitos B y T

8. ¿Por qué se utiliza CO2 en el cultivo de células animales o humanas? ¿Cuál es

su función? ¿Qué buffer se puede emplear en vez del CO2?
El mantenimiento de la temperatura en una atmósfera con una tensión controlada
de CO2 y adicionalmente de humedad elevada es el objetivo del incubador de
CO2.
El nivel de CO2 se establece para mantener el equilibrio carbonato-bicarbonato
en el medio de cultivo, habitualmente al 5%.