PAPER:

Detección de Contaminación Fecal

utilizando Métodos Moleculares

Abstract

Este estudio explora el proceso de diseño de un método molecular para detectar la contaminación
fecal en las cuencas urbanas de Rock Island y Moline, Illinois. Se sabe que estas cuencas hidrográficas
urbanas contienen altos niveles de amoníaco y sólidos totales disueltos en base a estudios previos.
Además, existe preocupación por el envejecimiento del sistema combinado de alcantarillado y aguas
pluviales. Por lo tanto, se cree que estas cuencas hidrográficas tienen una calidad deficiente del agua,
incluida la contaminación fecal. Los métodos moleculares existentes utilizados para detectar la
contaminación fecal requieren una cantidad considerable de recursos en el laboratorio. Nuestro
objetivo fue diseñar un método molecular que requiera menos recursos y pueda continuar
utilizándose en los laboratorios de Augustana College. Describiremos el método que hemos
desarrollado y discutiremos los resultados preliminares.

Introducción

El agua es un recurso finito que es necesario para la vida, y proporciona una vía principal para el
transporte de diversos patógenos. Además, la contaminación del agua es una de las principales
causas de problemas de salud en los seres humanos (Azizullah et al 2011). En los países en desarrollo,
más de 2,2 millones de personas mueren cada año debido a la ingestión de agua sucia y al
saneamiento inadecuado (Azizullah et al 2011). Las fuentes de agua contaminadas no solo se limitan
a las naciones en desarrollo que intentan establecer una mejor infraestructura para sustentar a su
población en crecimiento. El agua de lluvia contaminada, los arroyos y otras fuentes de agua también
son comunes en los Estados Unidos como resultado de los entornos urbanos.
Factores tales como superficies impermeables, sistemas combinados de aguas residuales y aguas
pluviales, y la infraestructura obsoleta o desactualizada, como fugas de fosas sépticas y alcantarillas
contribuyen a la calidad general del agua de las cuencas hidrográficas urbanas (Young & Thackston
1999). Otro aspecto de la calidad del agua es la presencia de organismos indicadores particulares,
como la coliforme fecal. Indican la presencia de organismos patógenos potenciales, incluidos
Cryptosporidium y Giardia (Gaffield et al 2003). Algunos estudios miden la cantidad de coliformes
totales en un lugar determinado, que incluye coliformes fecales y E. coli. Sin embargo, los coliformes
fecales y los estreptococos fecales pueden ser mejores indicadores de contaminación por animales
de sangre caliente (ratas, ardillas, conejos, gatos, perros) que el grupo coliforme total, ya que se
encuentran dentro del tracto intestinal de estos animales (Geldreich et al 1968) . La presencia de
estas bacterias en aguas pluviales puede deberse a fuentes tales como poblaciones domésticas de
mascotas, vida silvestre urbana, conexiones cruzadas entre tormentas y alcantarillas sanitarias, falta
de saneamiento, habitación de roedores en alcantarillas, acumulación de sedimentos en alcantarillas
y recolección deficiente de desechos sólidos y eliminación (Marsalek y Rochfort 2004). Esto es
significativo porque los humanos expuestos o que entran en contacto con el agua contaminada
pueden sufrir graves consecuencias para la salud. La ruta más común para que las bacterias viajen
con el fin de inducir efectos graves en la salud es por vía oral, y el agua actúa como intermediario.
Algunas consecuencias para la salud que pueden resultar del contacto incluyen enfermedades
gastrointestinales agudas, erupciones en la piel, descargas en los oídos y los ojos, cáncer de vejiga,
metahemoglobinemia y defectos del tubo neural (Gaffield et al 2003).

Debido a estas consecuencias para la salud, muchos investigadores han examinado diversos aspectos
ambientales de la coliformes fecales, como las fuentes potenciales, los componentes necesarios para
su supervivencia, las temporadas en las que la bacteria es más prevalente, la importancia de los
eventos de lluvia intensa, el papel del sedimento como sustrato facilitar el transporte, así como otras
implicaciones para la salud asociadas con coliformes fecales (Hathaway et al 2014). Para que la
coliforme fecal sobreviva en un ambiente, los investigadores coinciden en que hay ciertos
componentes necesarios para la supervivencia. La supervivencia de organismos indicadores y su
potencial de transferencia a aguas pluviales dependen de la exposición del suelo a la luz solar, la
temperatura y la frecuencia de las precipitaciones, la humedad del suelo, el pH del suelo, la materia
orgánica y la presencia de organismos competidores (Geldreich et al 1968).
Además, la bacteria puede inducirse a un estado latente causado por factores de estrés tales como la
exposición a los rayos UV, los cambios de temperatura y la falta de energía por carbono o energía
(Bjergbaek et al 2005). Incluso cuando está inactivo, las bacterias aún se pueden transportar
fácilmente y suponen una amenaza para la salud humana. En la bibliografía se admite ampliamente
que existen vínculos entre las tormentas y el brote de enfermedades transmitidas por el agua en
poblaciones humanas (Characklis et al 2005). Esto sugiere que los eventos de lluvia acumulan
grandes cantidades de bacterias y las transportan de manera eficiente en un rango más largo. Cuanto
más pesada es la lluvia, más extendida está la bacteria dispersa. La lluvia salpicada también puede
tener un efecto significativo en el desplazamiento de bacterias y la transferencia de patógenos a
fuentes de agua cercanas (Boyer et al 2008). Del mismo modo, la pendiente de un área puede
aumentar la probabilidad de que esto ocurra porque la pendiente aumentará la velocidad a la que
viaja el agua. Además, el sedimento tiene la capacidad de retener bacterias y las tormentas
desplazarán el sedimento y causarán una transferencia adicional de microbios. Por lo tanto, se
pueden encontrar más coliformes fecales y E. coli en áreas altamente erosivas. Coincidiendo con esta
idea de erosión, los eventos de lluvia también pueden influir en el rendimiento de los organismos
indicadores. Las concentraciones más altas de coliformes fecales a menudo ocurren durante el
invierno, y las más bajas se observan durante el verano (Hathaway et al 2014). Estos resultados están
correlacionados con la cantidad de precipitación recibida durante cada temporada.

La infraestructura de la ciudad, incluidos los sistemas de aguas pluviales y las superficies

impermeables, así como la densidad de viviendas de un área, son factores que contribuyen al estado
de la calidad del agua urbana. La infraestructura de la ciudad es un factor particularmente
importante al considerar la calidad del agua. Por ejemplo, los investigadores encontraron que el
número de conteos bacterianos indicadores en los desbordamientos combinados de aguas residuales
(la principal fuente bacteriana es el alcantarillado sanitario) era mayor que en comparación con el
agua de lluvia (Marsalek y Rochfort 2004). Por lo tanto, los sistemas combinados de alcantarillado y
aguas pluviales afectan negativamente a la calidad general del agua de los recursos hídricos urbanos
en comparación con un sistema de aguas pluviales separado. Los autores de este estudio concluyen,
además, que la contaminación del clima urbano húmedo, la descarga de aguas pluviales, las
alcantarillas o el desbordamiento es una fuente importante de deterioro de la calidad del agua en las
aguas receptoras (Marsalek y Rochfort 2004). Además, la filtración o la infraestructura defectuosa
también contribuyen a la acumulación de bacterias, como coliformes fecales, lo que pone en peligro
la calidad del agua. Además, la cantidad de personas que dependen de estas redes de agua también
puede contribuir a los niveles de contaminación del agua. Young (1999) encontró una fuerte
correlación entre la densidad de la vivienda y las densidades de bacterias fecales que implican que la
carga bacteriana está asociada con la fuga del tanque séptico, que puede ser enmascarado por otros
contaminantes en la cuenca. De manera similar, Chin (2010) concluyó que la densidad de población
es proporcional a la intensidad de carga terrestre debido a filtraciones de alcantarillas, mascotas y
fosas sépticas.

La importancia de estos hallazgos anteriores es relevante porque la presencia de coliformes fecales

en las fuentes de agua urbanas puede causar importantes efectos en la salud en lo que respecta a la
salud pública. Como se mencionó anteriormente, hay una serie de problemas de salud asociados con
la exposición a fuentes de agua contaminadas. Las enfermedades transmitidas por el agua consisten
en diarrea, náuseas, gastroenteritis, tifus y disentería (Azizullah et al 2011). Estas enfermedades no
se informan en gran parte porque son difíciles de identificar (Gaffield et al 2003). Gaffield (2003)
identificó las principales fuentes de estos impactos sobre la salud y estimó que los costos de abordar
estos impactos oscilaban entre 2.1 y 13.800 millones de dólares. Esto incluye mejorar el tratamiento
del agua potable por 33 mil millones de dólares y mejorar el manejo de aguas pluviales a un costo de
9.3 mil millones de dólares (Gaffield et al 2003). En general, la literatura académica sobre la
coliformes fecales dentro de los recursos hídricos de un entorno urbano confirma que la
transferencia de bacterias depende de la cantidad de precipitación y, por lo tanto, puede variar
según las estaciones. Asimismo, la infraestructura de la ciudad, como los sistemas de aguas pluviales,
la cantidad de superficies impermeables y la densidad de viviendas de un área, son factores que
contribuyen a la calidad del agua urbana. La presencia de coliformes fecales en las fuentes de agua
urbanas se relaciona con la salud humana pública porque puede causar efectos significativos en la
salud.

Las ciudades de Rock Island y Moline, Illinois, consisten en más de 13 cuencas hidrográficas urbanas
que drenan directamente en los ríos Rock o Mississippi, que son fuentes de agua potable para ambas
ciudades. A partir de 2013, el Augustana College Upper Mississippi Center (UMC) se asoció con las
dos ciudades para evaluar la salud general de estas cuencas hidrográficas por primera vez. Durante
los últimos dos años, estas cuencas hidrográficas se han muestreado midiendo los niveles de nitrato,
amoníaco, fósforo, sólidos disueltos totales, sólidos suspendidos totales y oxígeno, pero las cuencas
hidrográficas no se han evaluado para coliformes fecales. Además, las aguas pluviales y los sistemas
de alcantarillado de las ciudades están envejeciendo y deteriorándose. Esta infraestructura
envejecida podría ser una fuente de contaminación de aguas residuales a las cuencas hidrográficas
circundantes. En este estudio, tratamos de examinar la presencia de coliformes fecales en las
cuencas urbanas de Rock Island y Moline, Illinois. El método utilizado para responder esta pregunta
se estructuró de manera similar a la propuesta por Field (2003), que consiste en utilizar PCR (reacción
en cadena de la polimerasa) para amplificar genes específicos de especie en coliformes fecales
(2003). Exploramos si el método de extracción de membranas de filtro para el análisis de PCR es una
técnica efectiva para determinar la presencia de contaminación fecal.

Métodos

Sitios de muestra: Se tomaron muestras de agua de siete cuencas urbanas dentro de Rock Island y
Moline. Tres de las cuencas hidrográficas drenan en el río Mississippi, y las otras cuatro desembocan
en el río Rock. Hubo tres sitios de recolección para cada cuenca en función de la ubicación de los
sitios de confluencia, barranco y cabecera establecidos por Augustana College Upper Mississippi
Center. Se recolectó una réplica para una cuenca hidrográfica para ser utilizada para el control
positivo. Las muestras de agua se recolectaron en tres períodos diferentes durante el verano: 8-9 de
julio, 4-5 de agosto y 25 de julio, que representaron un evento de lluvia (precipitación significativa
dentro de las 24 horas del evento de muestreo). Las muestras de agua se recogieron en botellas de
Nalgene esterilizadas en autoclave de 250 ml y se colocaron inmediatamente en hielo.

Extracción de filtro: Las muestras de agua se filtraron usando filtros de nitrocelulosa desechables de
250 ml con un tamaño de poro de 0,45 μm. Cada muestra de agua se vertió en un filtro separado con
vasos de precipitados de 250 ml colocados debajo de cada filtro para recoger el sobrenadante. Una
vez que toda el agua había goteado a través del filtro, la membrana del filtro se cortó usando un
bisturí quirúrgico torácico con una cuchilla desechable (tamaño de pluma 24). Para evitar la
contaminación, la cuchilla se esterilizó usando 90% de etanol y un mechero Bunsen entre filtros.

Periódicamente, algunos de los filtros se obstruirían y el agua no filtrada restante se eliminó con una
pipeta estéril. Después de separar el perímetro de la membrana, se usaron pinzas estériles para
doblar la membrana y transferirla a un tubo cónico de 250 ml. Una vez que se recogieron todos los
filtros para cada sitio de muestreo, se colocaron en un congelador a -80 ° C hasta la extracción del
ADN. Para preparar las botellas de muestreo para la siguiente colección, las botellas se enjuagaron
con agua del grifo y luego se llenaron con agua desionizada. Una vez seco, las botellas fueron
esterilizadas en autoclave.
Purificación y extracción de ADN: Se retiró una membrana de filtro del tubo cónico con pinzas
estériles y se colocó en una placa de Petri estéril. Luego se cortó por la mitad con tijeras estériles y se
colocó en un tubo cónico nuevo con perlas de vidrio (se usaron perlas de vidrio de 0,1 mm de
diámetro). Se añadieron 15 ml de tampón TBS a cada tubo y las muestras se incubaron luego con
agitación durante la noche a temperatura ambiente. Al día siguiente, el líquido se transfirió a un tubo
cónico de 15 ml y se centrifugó durante 1 hora a 6000 rpm. El sobrenadante se vertió y el sedimento
se resuspendió (que se extendió por el lado del tubo) en 600 µl de solución de lisis de núcleos del kit
de purificación de ADN genómico Wizard (Promega Cat. # A1120). Usando una micropipeta P1000, la
solución se pipeteó suavemente hasta que las células se resuspendieron. Las muestras se incubaron a
80 ° C durante 5 minutos para lisar las células, y luego se enfriaron a temperatura ambiente. Se
añadieron 3 μl de solución de RNasa y el tubo se invirtió 2-5 veces para mezclar el lisado celular. La
solución se incubó a 37 ° C durante 60 minutos y luego se enfrió a temperatura ambiente. Se
añadieron 200 µl de Solución de Precipitación de Proteína y la solución se agitó vorticialmente
vigorosamente a alta velocidad durante 20 segundos. La solución se incubó en hielo durante 5
minutos. Después de la incubación, la muestra se centrifugó a 13,000 x g durante 3 minutos. El
sobrenadante que contenía el ADN se transfirió a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml limpio y se
añadieron 600 µl de isopropanol a temperatura ambiente. La solución se mezcló por inversión.
Después de la inversión, la muestra se centrifugó a 13,000 x g durante 3 minutos. Una vez
centrifugado, el sobrenadante se vertió y el tubo se drenó sobre un papel absorbente limpio. Luego
se añadieron 600 µl de etanol al 70% a temperatura ambiente y el tubo se invirtió varias veces para
lavar el sedimento de ADN. La muestra se centrifugó luego a 13,000 x g durante 2 minutos y el etanol
se pipeteó cuidadosamente para no romper el sedimento. Después de eliminar el etanol, el tubo se
drenó sobre un papel absorbente limpio y el pellet se secó al aire durante 15 minutos. El sedimento
se resuspendió en 50 µl de agua libre de DNasa y luego se incubó a 65ºC durante 1 hora.
Ocasionalmente, la solución se mezcló tocando el tubo. La solución se almacenó luego a 8 ° C
durante la noche para la PCR. Antes de establecer la reacción de PCR, se usó un espectrofotómetro
para obtener la concentración del ADN rehidratado.

PCR: El ADN de los controles de E. coli y de las muestras de agua se amplificaron utilizando cebadores
diseñados previamente que detectan la contaminación fecal (Bernhard y Field, 2000). Se usaron las
siguientes combinaciones de cebadores: CF193F y Bac708R, HF183F y Bac708R, HF134F y HF654R, y
Bac32F y Bac708R (Tabla 1 y 2). Cada 25 μl de PCR mezcla contenía 50 ng de ADN, 5 μl de 5X GoTaq®
Flexi Buffer (Promega), 1,5 μl de 25 mM MgCl2, 0,5 μl de 10 mM dNTP mezcla, 2 μl de 10 μM cebador
adelante, 2 μl de 10 cebador inverso μM y 0,2 μl de GoTaq® Flexi DNA Polymerase (Promega). Se usó
un termociclador para todas las reacciones con las siguientes condiciones: 94ºC durante 1 minuto,
seguido de 35 ciclos que consisten en 94ºC durante 30 segundos, 53ºC durante 30 segundos y 72ºC
durante 1 minuto, seguido de una extensión final de 6 minutos a 72ºC. . Los productos de PCR se
corrieron en un gel de agarosa al 1%.

Tabla 1: Cebadores utilizados en este estudio

Los emparejamientos son los siguientes: CF193F y Bac708R, HF183F y Bac708R, HF134F y HF654R, y
Bac32F y Bac708R. Las secuencias se obtuvieron de un estudio previamente citado (Bernard y Field
2000).

Tabla 2: combinaciones de cebador usadas en este estudio

Alojar marcadores genéticos específicos (Bernard y Field 2000).

La Figura 1 es un control positivo del ADN de E. coli. El carril de mezcla maestra (MM) contiene la
mezcla maestra de PCR con ausencia de ADNg y, por lo tanto, es un control negativo. Al examinar
esta línea, no hay amplificación que indique que no hay contaminación en el laboratorio. El carril 1 es
la combinación de cebadores Bac708R y CF193. E. coli está presente en este carril. El carril 2 es la
combinación de cebadores de Bac708R y HF183F. Como esta es la combinación de cebadores
específicos para humanos, E. coli no está presente en este carril. El carril 3 contiene cebadores
HF134F y HF654R. E. coli no está presente en este carril porque la combinación de estos primers es
un control negativo. El carril 4 contiene Bac32F y Bac708R. E. coli está presente en este carril.

La Figura 2 es la amplificación del ADN del filtro 13R. Como en la Figura 1, el carril MM es un control
negativo. El carril 5 contiene cebadores Bac708R y CF193F. La ausencia de un gen amplificado indica
que la contaminación fecal en el sitio del barranco de la cuenca 13 no es de una vaca. Lane 6 es la
combinación de cebadores Bac708R y HF183F. Dado que no hay amplificación genética en este carril,
la contaminación fecal en el sitio del barranco de la cuenca 13 no es humana. El carril 7 contiene los
cebadores de control negativo HF134F y HF654R. Como se esperaba, no hay amplificación presente.
Lane 8 es la combinación de Bac32F y Bac708R. La amplificación está presente en este carril, y por lo
tanto, la contaminación fecal está presente en el sitio del barranco de la cuenca 13. Además, la
contaminación fecal no se debe a humanos o vacas.

Figura 1: amplificación específica de ADN de E. coli usando cebadores de Bacteroides (Bac).

Figura 2: Amplificación específica de ADN coliforme fecal usando cebadores Bac del filtro 13R.

DISCUSION

Nuestros resultados preliminares indican que hay contaminación fecal en el sitio de la cuenca 13
durante el momento del muestreo, el 25 de junio. El coliforme fecal humano y de vaca estuvo
ausente en el sitio, por lo que podemos concluir que la fuente de contaminación es probable debido
a mascotas o vida silvestre . Los métodos utilizados para este estudio se desarrollaron con el fin de
proporcionar una alternativa económica y más rápida a métodos moleculares más costosos y
métodos de microbiología relativamente más lentos, en los que los investigadores están expuestos a
bacterias potencialmente dañinas. Determinamos que nuestro método molecular modificado es una
opción viable en términos de gastos. Gastamos aproximadamente $ 25 por muestra, que incluye la
recolección de muestras a través de la reacción de PCR. En cuanto a la eficiencia, esto es más difícil
de determinar debido a algunos desafíos que enfrentamos.
Uno de los principales desafíos que enfrentamos fue eliminar las bacterias del filtro para la
extracción de ADN. Esta demora se resolvió mediante el uso de un método de perlas, que luego
mejoró la eficiencia de nuestro método molecular. Un factor limitante significativo de esta técnica es
el tiempo promedio para filtrar las muestras de agua, aproximadamente 3.5 horas hasta que el filtro
gotea en seco, así como 10 minutos adicionales por muestra para pipetear filtros obstruidos. Esto se
debe parcialmente a las muestras de agua que contienen muchas partículas que se filtran a través de
una membrana con un tamaño de poro de 0,45 μm. Otro factor importante a tener en cuenta es que
muchos laboratorios grandes utilizan aspiradoras especializadas únicas para un aparato de filtración
de vidrio que ayuda a pasar el agua a través de la membrana del filtro (Field & Bernhard 2003). Dado
que modificamos el método molecular mediante el uso de filtros desechables individuales, confiamos
únicamente en la gravedad para extraer el agua a través de la membrana. Se intentó tanto una
bomba de mano como una aspiradora de agua como un medio para reducir la cantidad de tiempo
dedicado a filtrar las muestras de agua, aunque ninguna de las opciones resultó efectiva. En general,
una vez que se filtran las muestras, el protocolo restante es un procedimiento de PCR estándar y, por
lo tanto, es relativamente rápido. Por lo tanto, a pesar de estos desafíos, nuestra técnica siguió
siendo una alternativa económica a un método molecular para detectar contaminación fecal.

La presencia de contaminación fecal en la cuenca hidrográfica 13 es importante porque la coliformes

fecales es un indicador de bacterias que representan una calidad deficiente del agua. Además, la
presencia de coliformes fecales sugiere que también están presentes más patógenos dañinos,
incluidos carcinógenos humanos y microorganismos como Cryptosporidium y Giardia (Characklis et al
2005). Las enfermedades asociadas con el escurrimiento urbano debido a estos patógenos incluyen
enfermedades gastrointestinales agudas, erupciones en la piel, descargas en los oídos y los ojos,
cáncer de vejiga, metahemoglobinemia y defectos del tubo neural (Gaffield et al 2003). De acuerdo,
el filtro de la cuenca hidrográfica 13 es solo nuestros resultados preliminares, pero estas cuencas
hidrográficas locales se encuentran cerca de las escuelas, en los patios traseros de las subdivisiones y
drenan en los ríos en los que las ciudades reciben su agua potable. Debido a la presencia del
organismo indicador, es probable que exista la posibilidad de exposición a un agente patógeno más
dañino. De acuerdo, el uso de la cloración para desinfectar las aguas residuales disminuirá los
organismos indicadores fecales, pero no los oocistos de Cryptosporidium (Lalancette et al 2004). Por
lo tanto, dado que la contaminación fecal está presente en la cuenca hidrográfica 13, es posible que
haya más bacterias dañinas en estas aguas y que puedan comprometer el agua potable
independientemente de las plantas de tratamiento de agua. En general, más resultados de PCR
ayudarán a determinar el estado de la calidad del agua en Rock Island y Moline, Illinois.

En conclusión, nuestros resultados preliminares indican que hay contaminación fecal en el sitio del
barranco de la cuenca hidrográfica 13 y podemos confirmar que esta contaminación no proviene de
humanos o vacas. Para estudios futuros, recomendamos utilizar una variedad más amplia de
cebadores de PCR específicos de contaminación fecal para detectar la fuente de contaminación.
Dado que nuestros resultados preliminares indican contaminación fecal, un estudio de seguimiento
sería beneficioso para determinar la abundancia de coliformes fecales. Esto ayudaría aún más a
evaluar la calidad del agua amenazada de Rock Island y Moline, Illinois.