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Universidade Federal de Santa Catarina

Departamento de Ciências Farmacêuticas – CCS

Análise de Fármacos e
Medicamentos

Profa. Dra. Christiane Meyre S. Bittencourt


Profa. Dra. Lílian S. C. Bernardes
Profa. Dra. Miriam de B. Falkenberg
Profa. Tania Beatriz Creczynski Pasa
AULA  7.  CROMATOGRAFIA  
A cromatografia é um método físico-químico de
separação dos componentes de uma mistura, realizada
através da distribuição destes componentes entre duas
fases, que estão em contato íntimo.
FINALIDADES  DA    
CROMATOGRAFIA  
-­‐   Separação/purificação   de   componentes   em   uma   mistura  
(cromatografia  prepara@va,  em  coluna  ou  placa);  
-­‐  Iden@ficação  de  amostras  através  da  comparação  com  padrões;  
-­‐  Avaliação  da  pureza  de  uma  amostra;  
  Farmacopéia
-­‐Quan@ficação  de  componentes  individuais  (Cromatografia  Líquida  de  
Alta  Eficiência)  
F
A
R
M
A
C
O
P
É
I
A  
 
B
R
A
S
I
L
E
I
R
A  
1906  –  Mikhael  S.  TsweZ:  
 
Extrato  de  folhas  foi  separado  com  
diferentes    solventes  por  uma  coluna  
recheada    com  carbonato  de  cálcio  e  
alumina    

Chrom (cor) e Graphe (escrever)

“Escrita por Cores”


 
Método   `sico-­‐químico   que   permite   separar   os  
componentes   presentes   numa   mistura   que   se   distribuem  
entre  duas  fases:  
 •  FASE  ESTACIONÁRIA  –  Camada  de  alta  área  superficial  
•  FASE   MÓVEL   –   Passa   através,   sobre   ou   ao   longo   da   fase  
estacionária.          
METODOLOGIA   PROPRIEDADES  
Gel  filtração   Tamanho  
 
Cromatografia  de  troca-­‐iônica   Carga  
 
Cromatografia  de  fase  reversa/  fase  normal   Hidrofobicidade  
 
Cromatografia  de  afinidade   Reconhecimento  específico  
 
Cromatografia  de  afinidade  com  metal  imobilizado   Interação  com  metais  
 
Cromatografia  de  exclusão   Tamanho  moléculas  
A  fase  móvel  passa  pela  fase  estacionária  (FE)  que  pode  estar  dentro  
de  uma  coluna  (CC)  ou  sobre  uma  placa  (Cplanar)  e  os  componentes  
da  mistura  são  separados  pela  diferença  de  afinidade  pelas  duas  fases  
Transporte  dos  componentes  de  uma  amostra  por  FM  através  da  FE:  
ESTADO  FÍSICO  DA  FASE  MÓVEL  
o   CROMATOGRAFIA  LÍQUIDA:      FM  é  um  líquido  
o   CROMATOGRAFIA  GASOSA:    FM  é  um  gás  
o   CROMATOGRAFIA  SUPERCRÍTICA:    FM  é  um  vapor  pressurizado  

ESTADO  FÍSICO  DA  FASE  ESTACIONÁRIA  


LÍQUIDO:   O   líquido   pode   estar   simplesmente   espalhado   sobre   um  
suporte  sólido  ou  imobilizado  sobre  este  (FASE  LIGADA).  
 
SÓLIDO:  Sólido  finamente  dividido  de  grande  área  superficial  
   
FASE  NORMAL:  F.  Estacionária  mais  polar  que  F.  Móvel  
   
FASE  REVERSA:  F.  Estacionária  menos  polar  que  F.  Móvel  
CLASSIFICAÇÃO  DOS  MÉTODOS  
CROMATOGRÁFICOS  

CP:  cromatografia  em  papel  


CSC:  Cromatografia  supercrí4ca  
CGAR:  Cromatografia  gasosa  de  alta  resolução  
Componentes de um
sistema cromatográfico:
TERMOS  TÉCNICOS  NA  CROMATOGRAFIA  

o  Fator de retenção (Rf): razão entre distância percorrida pelos componentes


e FM;
o  Tempo de retenção (tR): tempo gasto desde a injeção até a saída do ponto
máximo do pico;
o  Resolução: separação entre os componentes;
o  Eficiência: Número de pratos teóricos
(equilíbrio entre as duas fases)
o  Simetria dos picos: sem distorções frontais ou
Posteriores (caudas)
MECANISMOS  DE  SEPARAÇÃO  
Cromatografia  de  adsorção  
 
o  Interação  é  devida  a  forças  eletrostá@cas,  envolvendo  processos  de  sorção-­‐
dessorção.      
o  Quando  a  FE  é  um  sólido,  a  adsorção  do  soluto  vai  ocorrer  na  interfase  entre  o  
sólido  e  a  FM,    devido  a  presença  de  grupos  a@vos  nas  suas  super`cies.    
o  A  dessorção  do  soluto  implica  na  volta  deste  a  FM.    
 

Fase  estacionária:  sílica,  alumina  


Encontrada  na  C.C.D.  e  C.G.S  e  CLS  
Cromatografia  de  parGção  
 
o  Interação   é   devida   a   equilíbrio   de   par@ção   (solubilidade)   entre   duas   fases  
líquidas.    
o  Quando   a   FE   é   um   líquido   espalhado   na   super`cie   de   um   suporte   sólido   e  
inerte,  ou  nas  paredes  de  um  tubo  cromatográfico.    
o  Processo   é   intrafacial   ocorrendo   por   absorção   ou   par@ção   que   se   baseia   nas  
diferentes  solubilidades  dos  componentes  da  amostra  na  FE.    
o  A   volta   dos   componentes   a   fase   móvel   depende   de   sua   vola@lidade   (FM  
gasosa)  ou  de  sua  solubilidade  nesta  fase  (FM  líquida).  
 
Cromatografia  de  troca  iônica  
 
o  A   FE   é   cons@tuída   por   uma   matriz   onde   são   adicionados   grupos   funcionais  
ionizáveis.  Assim  tem-­‐se  trocadores  aniônicos  que  tem  sí@os  a@vos  carregados  
posi@vamente,   retendo   ânions,   e   trocadores   ca@ônicos,   carregados  
nega@vamente,  retendo  cá@ons.  
o  A  FM  geralmente  é  uma  solução  iônica  com  propriedades  tamponantes.  
 

• fortemente catiônica (sulfônico)


• fortemente aniônica (amina quater.)
• fracamente catiónicas (carboxílico)
• fracamente aniônicas (amina prim.)
Cromatografia  de  exclusão  
 
o  Puramente  mecânico.    
o  A  FE  é  uma  matriz  inerte  com  parnculas  de  forma,  tamanho  e  porosidade  
uniforme.  As  moléculas  são  separadas  porque  as  menores  são  capazes  de  
penetrar  nos  poros  da  FE,  enquanto  que  as  maiores  são  excluídas  

Cromatografia  por  bioafinidade  


 
Grupos  com  especificidade  biológica,  quimicamente  ligados  a  matrizes.  Ex.  
Enzimas   re@ram   da   FM   somente   os   seus   componentes   complementares  
proteínas,  deixando  passar  outras  espécies.  
CLASSIFICAÇÃO  DOS  MÉTODOS  
CROMATOGRÁFICOS  
Métodos  cromatográficos:    
Cromatografia em coluna (CC): Eluente  
 
Papel  filtro  
o  Silica  gel  
Amostra  
 
(pasGlha)  
POR  ADSORÇÃO    (LÍQUIDO  –  SÓLIDO)   Papel  filtro  
Coluna  recheada  com  um  sólido  (FE)  e    
uma  fase  móvel  líquida.  
Adsorvente  
Cromatografia Flash:
 
o  sílica  gel  ou  cartuchos  de  fase  reversa   Lã  de  vidro  
Ou  algodão  

S@ll,  C.  W.  et  al.,  J.Org.Chem.  


 4:  (11),  2913-­‐2925,  1978.  
Cromatografia de Partição Centrífiga (CPC):

o  Separação de uma amostra entre duas fases líquidas não miscíveis;


o  Fase estacionária é mantida na célula pela força centrífuga e a partição ocorre
pela fase móvel tomar forma de gotículas que passam através da fase
estacionária
ü  Vantagens: baixo consumo de solvente (cromatografia verde), baixo risco de
degradação da amostra, alta recuperação da amostra, maior capacidade de
escalonamento sem perda da resolução cromatográfica
Cromatotron:
o  Cromatografia  por  Força  Centrifuga  
o  Sistema  de  placa  circular  de  CCD  inclinada,  o  que  permite  a  maior  eficácia  no  
escoamento  e  coleta  dos  compostos.  
o    Tem   o   poder   de   purificar   compostos   com   Rf   (fator   de   retenção)   muito  
próximos,  baixo  consumo  de  solventes      
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE):

o  Emprega  pequenas  colunas,  recheadas  de  materiais  especialmente  


 preparados  e  uma  fase  móvel  que  é  eluída  sob  altas  pressões.  
 
Componentes:

Fonte: Merck
o  U@lização   de   uma   placa   de   vidro   ou   outro   material   rígido   inerte  
recoberta   com   uma   camada   de   adsorvente   que   pode   ser   a   Fase  
Estacionária   (sólida)   ou   um   suporte   para   Fase   Estacionária  
(líquida).  
 
Grau  de  adsorção  depende  de  vários  fatores:  
 
² Quan@dade   de   água   presente   na   fase   sólida   (mais   rea@vo  
quanto  mais  seca  es@ver)  
²  Estrutura   da   substância   adsorvida   (presença   de   grupos  
funcionais   polares,   capacidade   de   formar   ligações   de  
hidrogênio)  
² Ocupação   dos   sí@os   a@vos   da   fase   sólida   pelo   solvente   e   da  
força  atra@va  entre  soluto  e  solvente    
UTILIZAÇÃO  DA  CCD  

o  Monitorar  o  andamento  de  uma  reação  química;    

o  Determinar  a  pureza  de  substâncias  orgânicas;    


 
o  U@lizada  como  método  de  iden@ficação  e  pureza.    
Interferência  dos  grupos  funcionais  
Os  grupos  funcionais  que  afetam  em  ordem  crescente  o  grau  de  intera@vidade  num  
composto   orgânico   são:   alcanos;   haletos   de   alquila,   alcenos;   dienos;   hidrocarbonetos  
aromá@cos;   haletos   de   arila;   éteres;   ésteres;   cetonas;   aldeídos,   aminas;   álcoois;  
fenóis;  ácidos  carboxílicos;  ácidos  sulfônicos.  
 
Carboxila:   grupamento   funcional   que   confere   aos   compostos   orgânicos   alta  
intera@vidade.  
Hidrocarbonetos:   sem   grupamento   funcional   representa   uma   molécula   de   baixa  
intera@vidade.    
Etapas  na  CCD....  
Ativação da Placa e aplicação da Amostra
Em  algumas  separações,  deve-­‐se  a@var  as  Placas,  para  se  re@rar  
substancias  aderidas  ao  adsorvente.    
 
Sílica:  105°C-­‐110°C  por  30  min.  
Alumina:  105°C  por  10  min.  

o  Soluções,  em  solventes  bem  voláteis.    


o  Em  geral,  de  0,1%  a  1,0%.  Grandes  quan@dades  de  amostras  geram  manchas  
muito  grandes,  o  que  não  é  desejado.  

Forma incorreta de aplicação Forma correta de aplicação


Exemplo  de  aplicações  com  diversos  solventes:  
SELEÇÃO  DA  FASE  MÓVEL  
o  Papel  fundamental  na  separação  dos  componentes.    
o  Existe  uma  compe@ção  entre  as  moléculas  da  amostra  e  da  fase  móvel,  pela  
super`cie  adsorvente,  portanto  considera-­‐se  a  natureza  química  da  amostra  
e  a  polaridade  da  fase  móvel.  
DESENVOLVIMENTO  
Fonte: http://pharmaxchange.info/press/wp-content/uploads/2012/11/tlc_screen.jpg
REVELAÇÃO  
Revelação do Cromatograma
Procedimentos   químicos,   `sicos,   ou   biológicos   aplicados   ao  
cromatograma   para   tornar   visível   as   manchas   das   substâncias  
separadas  por  cromatografia.  
 
A-­‐  Procedimentos  Físicos:  Luz  ultravioleta  (aromá@cos  ou  dupla  
ligação  conjugada).  
B-­‐   Procedimentos   Químicos:   Aplicação   de   um   rea@vo   químico  
para  formar  um  derivado  colorido  ou  fluorescente.  
C-­‐   Procedimentos   Biológicos   e   Enzimá@cos:   An@bió@cos,  
Enzimas  e  Substratos.  
D-­‐Radioa@vidade:  Marcadores  radioa@vos  (13C).  
 
Reveladores  Físicos  
 
o  Uso  de  adsorvente  contendo    
substância  fluorescente  

Reveladores  Químicos  
 
o  U@liza-­‐se  agentes  cromogênicos  que,  em  contato    
com  as  substâncias  da  amostra,  tornam-­‐as  coloridas  e,    
portanto,  visíveis.    

Reveladores  Biológicos  
 
U@liza-­‐se  reações  enzimá@cas  
ou   bacterianas   para   tornar   a  
mancha  visível.  
PARÂMETROS  UTILIZADOS  NA  
CROMATOGRAFIA  PLANAR  
Define-­‐se  Rf  como  a  razão  entre  a  distância  percorrida  na  placa  pela  substância  e  
a  distância  percorrida  pelo  solvente  (medidas  no  centro  da  mancha  da  substância  
e  a  frente  do  solvente)  
 
Para  fins  de  iden@ficação:    Rf  entre  0,2  a  0,8  (amostra  autên@ca  deve  ser  aplicada  
lado   a   lado   na   mesma   placa,   para   assegurar   igualdade   de   condições  
experimentais).    
Rf      =              Distância  percorrida  pela  mancha  desde  a  origem  (Δx)  
                               Distâncias  percorrida  pelo  solvente  desde  a  origem  (Δy)  
Fatores que Afetam
Fatores   a Reprodutibilidade
que  afetam   a  reprodu@bilidade  
em Cromatografia Planar (2)
o  Envelhecimento  e  composição  da  Fase  Móvel.  
o  Viscosidade,  Miscibilidade,  Polaridade  da  F.  
Móvel.  
o  Quan@dade  da  Fase  Móvel.  
o  Quan@dade  da  amostra.  
o  Vedação  da  cuba.  
o  Dimensões  da  cuba.  
o  Impurezas  da  amostra.  
o  Temperatura  (Não  deve  variar  mais  que  5  ºC).  
o  Soluto,  Fase  Móvel,  Fase  estacionária,  Suporte.  
o  Técnica  de  aplicação.  
Procedimentos   p
Procedimentos para Aumentar aara   a umentar    
a  reprodu@bilidade:  
Reprodutibilidade
o  Saturação  da  cuba  cromatográfica.  
o  Qualidade  e  quan@dade  da  Fase  Móvel.  
o  A@vidade  da  Fase  Estacionária.  
o  Qualidade  da  Fase  Estacionária.  
o  Espessura  da  camada  delgada.  
o  Técnica  e  condição  da  Fase  móvel  (desenvolvimento,  
temperatura,  distância  percorrida  pela  Fase  Móvel,  
quan@dade  da  amostra)  
 
1)  Escolha  da  fase  móvel  e  solvente  para  preparo  da  amostra:  Clarkes;  
2)  Separação  amostra  desconhecida  e  padrão;  
3)  Saturação  da  cuba  com  a  fase  móvel;  
4)  Preparação  da  solução  amostra    e  amostra  padrão:  2  mg/mL;  
5)  Aplicação  das  amostras  na  cromatoplaca;  
6)  Avaliação  pelo  método  `sico:  fluorescência  ou  ex@nção.  
7)  Avaliação  pelo  método  químico:  câmara  de  iodo