Introducción

Universidad Francisco de Paula Santander Ocaña

Facultad de Ciencias Agrarias y del Ambiente
Departamento de Ciencias pecuarias
Programa Académico de Zootecnia
Asignatura Biología Molecular

Integrantes: Zharick León 710693, Gabriela Moncada 710695, Margarita Morales 710706, Juan
Sebastian Carvajalino 710660, Javier Andrés Imbrech 710611, Fabián Rodriguez 710626,
Andrés Duque 710679

Informe de laboratorio extracción de ADN a partir de sangre (Método de Salting Out

modificado para microextracción)

Resumen

Con este trabajo buscamos como objetivo preparar las diferentes soluciones necesarias para

llevar acabo el proceso de extracción de ADN. Este laboratorio fue realizado por el método de

Salting Out modificado por microextracción, donde cuantificamos las cantidades necesarias para

la preparación de las soluciones.

Introducción

La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa

de todo análisis genético. Obtener DNA relativamente puro y amplificable resulta fundamental

para los posteriores usos a los que será destinado (Riera, 2010).

Para muestras de sangre en particular, distintos protocolos han sido descriptos y

publicados, pudiendo diferenciarse básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales

difieren en la etapa de la purificación de las proteínas del extracto. Así podemos encontrar

métodos que aprovechan las propiedades desnaturalizantes que tienen ciertos solventes orgánicos

(Rojas, 2010).
 La sangre es una fuente excelente de ADN. Este está presente en los glóbulos blancos (o

leucocitos), pero no en los glóbulos rojos humanos (eritrocitos o hematíes), pues estos carecen de

núcleo.

Desde que James Watson y Francis Crick revelaron la estructura de la doble helice se ha

aceptado que las funciones del ADN son vitales para la herencia genética. La estructura única de

ADN permite que cumpla todas estas funciones (Alemañ, 2015). Las funciones biológicas del

ADN incluyen el almacenamiento de información (genes y genoma), la codificación de proteínas

(transcripción y traducción) y su auto duplicación (replicación del ADN) para asegurar la

transmisión de la información a las células hijas durante la división celular (Biología molecular ,

2017).

El objetivo de este informe es observar cada uno de los pasos necesarios para el proceso

de la extracción de ADN a partir de sangre por el método de Salting Out modificado para micro

extracción.
 Capítulo 2: Materiales y método

2.1

Reactivos

EDTA
MgCl2
Tris HCl
NaOH
Proteinasa
Agua destilada
NaCl
SDS

Materiales

Vortex
Micro centrifuga
Etanol
Baño maría
Phmetro
Agua destilada
Balanzas
Espátula
Micro pipetas
Gradilla
Tubos falcón, Eppendorf y vacutainer.
Metodología y procedimiento

Cálculo para la preparación de soluciones

STOCKS Vol: 100 ml

EDTA 0.5M Ph 8.0 gr: [ ] . PM . Vol donde

Tris HCl 2M Ph 7.5 [ ]: concentración molar

MgCl2 1M PM: peso molecular

NaCl 5M Vol: volumen a utilizar

EDTA
0,5 𝑚𝑜𝑙 372.24 𝑔
gr: 𝑥 𝑥 100 𝑚𝑙
1000 𝑚𝑙 𝑚𝑜𝑙

gr: 18.612 = 9.306

Tris HCl
2 𝑚𝑜𝑙 121,1 𝑔
gr: 𝑥 𝑥 100 𝑚𝑙
1000 𝑚𝑙 𝑚𝑜𝑙

gr: 24,22 = 12,11

MgCl2
1 𝑚𝑜𝑙 95,22 𝑔
gr: 1000 𝑚𝑙
𝑥 𝑚𝑜𝑙
𝑥 100 𝑚𝑙

gr: 9,522 = 4,761

NaCl
5 𝑚𝑜𝑙 58,4 𝑔
gr: 1000 𝑚𝑙
𝑥 𝑚𝑜𝑙
𝑥 100 𝑚𝑙

gr: 29,2 = 14,6

Solución lisis I Vol: 150ml

0.32M sacarosa

10mM Tris HCl Ph=7.5  0,01 M

5mM MgCl2  0,05 M

1% Triton X-100
MgCl2

M: 0,05 Mol/L

PM: 95,21 g/mol

V: 0,15 L

gr: M . V . PM

0,05 𝑚𝑜𝑙 95,21 𝑔

gr: 𝐿
𝑥 𝑚𝑜𝑙
𝑥 0,15 𝐿

gr: 0,714

Sacarosa

M: 0,32 Mol/L

PM: 342,29 g/mol

V: 0,15 L

0,32 𝑚𝑜𝑙 342,29 𝑔

gr: 𝑥 𝑥 0,15 𝐿
𝐿 𝑚𝑜𝑙

gr: 16,43

Tris HCl

M: 0,01 Mol/L

PM: 121,14 g/mol

V: 0,15 L

0,01 𝑚𝑜𝑙 121,14 𝑔

gr: 𝐿
𝑥 𝑚𝑜𝑙
𝑥 0,15 𝐿

gr: 0,181
Solución lisis II

10mM Tris HCl Ph= 7.5

10Mm de EDTA Ph= 8.0
50Mm de NaCl
0,2 % SDS

Se pesó 4,761 g de cloruro de magnesio (MgCl2 ) este se disolvió en 30 ml de agua

destilada en un vaso de precipitado y en un tubo falcón se agregó 50 ml de la mezcla anterior.

Se pesó 9.306 g de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) que se colocó en un frasco de

vidrio de 100 ml, se adicionó 30 ml de agua destilada que fue mezclado en el vortex y llevado al

peachímetro

El peachímetro fue esterilizado con agua destilada con el fin de que no alterará el valor de

la muestra. Ésta marco un Ph ácido de 1.66 el cual fue muy bajo ya que el ideal era de 8,0. Para

lograr el Ph ideal se agregó 11 pastillas de hidróxido de sodio (NaOH) y se obtuvo un Ph de

9.45. Este se sobrepasó, por ende agregamos 27 gotas de ácido clorhídrico (HCl) al 37% para

lograr bajarlo. El peachimetro utilizado no estaba calibrado por lo cual optamos por usar otro,

obteniendo el Ph ideal al final.

Se pesó 16,43 g de sacarosa (C12H22O11) en un vaso de precipitado, le adicionamos 50 ml

de agua destilada y se revolvió en el vortex hasta disolverse completamente. Con la micropipeta

se tomaron 750 µl de MgCl2 y se añadió a esta solución. Seguidamente se agregó 1,5 ml de

tritón, 80 ml de agua destilada se mezcló, se le añadió 750 µl de tris y se aforo hasta 150 ml.
 Se tomó cuatro muestras de sangre diferentes agregando 0,3 ml de cada una en 3 tubos

Eppendorf junto con 0,5 ml de lisis I. Se mezcló en el vortex y se colocaron en la micro

centrífuga por 14 minutos a 12,700 rpm.

Al salir de la micro centrífuga se voltearon los tubos sobre una servilleta limpia con el fin de

descartar el sobrenadante (Figura 7). Luego, se le adicionó 1 ml de lisis I se mezcló nuevamente

por inversión y se colocó en el vortex hasta desbaratar el pellet (Figura 8). Se introdujo en la

micro centrífuga por 3 minutos a 12,700 rpm. Al sacar los tubos se observó que el pellet es más

visible (Figura 9) y se colocaron en el refrigerador por 24 h.

Al retirar los tubos Eppendorf del refrigerador se calentaron suavemente con las manos. Se

agregó 0,3 ml de cloruro de sodio (NaCl) 5M donde se mezcló suavemente por inversión. Se

introdujo a la micro centrífuga por 14 minutos a 12,700 rpm.

 Discusión

GABRIELA ESTA ES LA DISCUSIÓN DE MYRICAR TE GUIAS POR ELLA POR FA

La extracción de ADN es de suma importancia por lo que con esto se estudian los genes, su
evolución, la forma en que se expresan y las funciones que tienen en la formación de genomas de los
diferentes organismos, pero requiere de un proceso secuencial en el que se debe tener mucha
precaución para que no altere los resultados.

Los reactivos que se utilizan para este procedimiento cumplen un papel muy importante, ya que
cada uno tiene diversas funciones que en conjunto hacen posible la extracción del ADN.

Anexos
 Bibliografía

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1851-75872010000200001

http://www.biologia.arizona.edu/human/problem_sets/DNA_forensics_2/06t.html

http://www.scielo.org.ar/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S1851-75872010000200001

http://www.ehowenespanol.com/importante-extraccion-adn-lista_143344/