Multiple dengue virus types harbored by individual mosquitoes 

Bennet Angel, Annette Angel, Vinod Joshi∗ 

Laboratory of Virology & Molecular Biology, Desert Medicine Research Centre, Indian Council of Medical Research, Jodhpur, 
India 
a r t i c l e i n f o 
Article history: Received 14 January 2015 Received in revised form 2 July 2015 Accepted 9 July 2015 Available online 21 July 
2015 
Keywords: Multiple dengue types Etiology DHF 
a b s t r a c t 
The  existing  knowledge  on  pathogenesis  and  aetiology  of  DHF  establishes  that  Dengue  Hemorrhagic Fever (DHF) and Dengue 
Shock  Syndrome  (DSS)  are  caused  by  two  subsequent  infections  of  two  differ-  ent  serotypes  of  dengue  affecting  a  common 
human  population  with a time gap. Present studies have been undertaken on 212 laboratory reared infected individual mosquitoes 
from  larvae  collected  from  31  dengue  endemic  towns  of  Rajasthan,  India.  Type  specific  DEN  viruses  were  detected  from 
individual  mosquitoes  employing  RT-PCR.  In  78.7%  of  212  infected  individual  mosquitoes  studied,  vertically  trans-  mitted 
multiple DENV types were observed. We report for the first time that single mosquitoes contain multiple dengue virus types. 
© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved. 
Dengue  Fever  (DF)  with  Dengue  Hemorrhagic  Fever  (DHF)  and  Dengue  Shock  Syndrome  (DSS)  is  an  emerging  public 
health  prob- lem with an estimated number of 390 million cases reported annually (Bhatt et al., 2013). The severe form of dengue 
i.e.,  DHF  or  DSS,  responsible  for  case  fatality  up  to  more than 5% (Gubler, 2011) is believed to be associated with an Antibody 
Dependent  Enhancement  (ADE)  in  the  patients  (Halstead  and  O’Rourke,  1977),  possibly  caused  by  infectious  immune 
complexes  formed  between  a  current  DENV  infection  and  non  neutralizing  antibodies  already  present  in  the  patient’s  system 
(Guzman  et  al.,  2010).  As  of today we stand with an understanding that multiple infections of more than one DENV types with a 
time  gap  is  a  pre-requisite  for  DHF.  To  understand  infection  of  different  DENV  types  in  a  population with a gap of time, more 
emphasis  has  been  given  so  far  on  isolation  of  DENV  types  (DEN-1,  2,  3  or  4)  from  the  human  patients  (Guzman,  1990). 
Although  dengue  transmission  involves  both,  horizontal  as  well  as  vertical  transmission  of  virus  (World  Health  Organization, 
2009),  latter  has  not  been  given  adequate  importance.  Mosquitoes,  in addition to transmit virus from man to man, may also con- 
tribute  extrinsic  or  unchallenged  viral  stock passaged by its own system by virtue of transovarial transmission of virus (Khin and 
Than,  1983;  Rosen  and  Gubler,  1974;  Joshi  etal.,  2002).  We  hypoth-  esized  that  studies  to  comprehend  the  DENV  types 
contained  by  single  mosquito  in  a  setting  could  add  to  our  knowledge  on  non  human  source  of  multiple  dengue  types  in  an 
endemic area. During the course of present investigations we have undertaken molec- 
∗ 
Corresponding author at: Laboratory of virology & Molecular Biology, Desert Medicine Research Centre, Pali Road, 
Jodhpur-342 005, India. Fax: +91 2912720618. 
E-mail address: vinodjoshidmrc@gmail.com (V. Joshi). 
ular  isolation  of  dengue  virus  types  from  individual  specimens of laboratory reared Aedes aegypti from larvae collected from 31 
dis-  ease  endemic  districts  towns  of  Rajasthan  state,  India.  The  paper  reports  first  observations  on  presence  of multiple dengue 
virus types carried by individual mosquitoes and discusses the possible significance of the observations in aetiology of DHF. 
Studies  were  undertaken  in  all  33  district  headquarter  towns of north-western state Rajasthan, India. Rajasthan represents the 
arid  ecosystem  forming  western  boarder  of  India.  It  includes  33  districts  which  form  a  north-western  desert  part,  an  eastern 
semi-arid  part  and  southern  hilly  area.  Out  of  33 district headquarter towns, 28 are endemic for dengue fever (Unpublished data, 
state  health depart- ment, Government of Rajasthan, India). The areas from where larval mosquitoes were collected are 31 district 
headquarter  towns as listed at the foot note (Table 1). No breeding was seen in two dis- tricts i.e., Udaipur and Dholpur. Overall a 
total of 19,775 households were surveyed. 
Larvae  of  A.  aegypti  were  collected  from  the  domestic  and  peri-  domestic  water  collections  from  different  localities  in  the 
urban  settings  of  31  dengue  endemic  districts  of  state  of Rajasthan, India from May, 2012 till May 2014 using random sampling 
design.  Ran-  dom  numbers  were  assigned  to  selected  houses  in  study  towns. Depending upon the size of town, every 6th, 8th or 
10th  house  was  chosen.  All  the  breeding  containers  available  in  a sampled house were examined for larval collection. A total of 
1,30,525  containers  were  surveyed.  The  larvae  were  brought  and  reared  in  laboratory  into  adult  mosquitoes  at  ambient 
temperature  of  about  25  ◦C.  Lar-  val food of dog biscuit and yeast powder was provided. Adult A. aegypti emerged were kept in 
Barraud  cages  maintained  individ-  ually  for each locality in each district for about 5–6 days at about 25 ◦C and relative humidity 
of 65%. 
http://dx.doi.org/10.1016/j.actatropica.2015.07.007 0001-706X/© 2015 Elsevier B.V. All rights reserved. 
jo ur nal home p age: www.elsevier.com/locate/actatropica 
Acta Tropica 150 (2015) 107–110 
Contents lists available at ScienceDirect 

Acta Tropica 
 
Table 1 Details of multiple Dengue virus types (D-1, 2, 3 & 4) in individual mosquitoes of the 31 disease endemic settings of 
Rajasthan, India employing RT-PCR assay. 
District codes Number of individual infected 
mosquitoes processed of each district 
Total number of mosquitoes identified with multiple strains infectivity 
Mosq. 1 Mosq. 2 Mosq. 3 Mosq. 4 Mosq. 5 Mosq. 6 Mosq. 7 Mosq. 8 Mosq. 9 Mosq. 10 
1  7  D-2,  3  D-2,  3 D-3, 4 D-2, 4 D-3, 4 D-2,3, 4 D-1,2, 3 ■ ■ ■ 7 2 6 D-2, 3 D-3 D-2, 3, 4 D-3 D-1 D-1 ■ ■ ■ ■ 2 3 7 D-1, 
2,  3  D-2,  3  D-2,  3  D-2,  3  D-1,  2, 3 D-2, 3 D-3 ■ ■ ■ 6 4 7 D-3, 4 D-1, 2, 3 D-2, 3 D-3, 4 D-2, 3, 4 D-1, 2, 3, 4 D-1, 2, 3, 4 ■ 
■  ■  7  5 7 D-1, 2, 3, 4 D-3, 4 D-1, 2 D-2, 4 D-3 D-1, 2, 3, 4 D-1, 2, 3 ■ ■ ■ 6 6 10 D-3, 4 D-3, 4 D-3, 4 D-1, 2, 3, 4 D-3 D-1, 
2,  3,  4 D-3, 4 D-2, 4 D-1, 2 D-1, 2, 4 9 7 10 D-2, 3, 4 D-3, 4 D-1, 3, 4 D-1, 3, 4 D-3 D-3, 4 D-3, 4 D-1, 2, 3,4 D-1, 2 D-1, 2, 4 9 8 
7  D-4  D-2,  3,  4  D-2,  3,  4  D-4 D-2, 3, 4 D-2, 3,4 D-2, 3, 4 ■ ■ ■ 5 9 7 D-2, 3 D-2, 3, 4 D-2, 3, 4 D-2 D-2, 3, 4 D-2, 3,4 D-3, 4 
■  ■ ■ 6 10 6 D-2, 3, 4 D-1, 2 D-1, 3, 4 D-2, 3, 4 D-2, 4 D-1, 2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 6 11 7 D-2 D-2, 4 D-1, 2, 3, 4 D-1, 2, 3, 4 D-4 
D-1,2,4  D-2,  3,4  ■  ■  ■  5  12  6 D-1, 2, 3, 4 D-2, 3 D-2, 3, 4 D-1, 2, 3, 4 D-3, 4 D-2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 6 13 7 D-1, 2, 3, 4 D-3, 4 
D-2,3,  4  D-3,  4  D-2, 3, 4 D-2,3, 4 D-1, 3, 4 ■ ■ ■ 7 14 6 D-1, 2, 3 D-1, 4 D-1, 2, 3, 4 D-3, 4 D-2, 3, 4 D-2, 3 ■ ■ ■ ■ 6 15 
3  D-2,  3,  4  D-1,  2,  3,  4  D-1,  2,  3 ■ ■ ■ ■ ■ ■ ■ 3 16 6 D-2 D-4 D-2 D-4 D-2, 3 D-2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 2 17 7 D-2,3 D-2,3 
D-2,3  D-3,4  D-2,  3,4  D-1,4  D-2,  3  ■  ■  ■  7  18  7  D-1,  2,  3,4  D-3,  4  D-1,  2,  4  D-2,  4  D-2,  3 D-4 D-2, 3 ■ ■ ■ 6 19 7 D-1 
D-2,  3  D-2,-3,  4  D-1,  2,  3,  4  D-2  D-3,  4  D-1,  2,  3,  4  ■  ■  ■  5  20  8 D-2, 3,4 D-2, 3 D-2, 4 D-2, 3 D-2, 3, 4 D-2,3, 4 D-2, 3, 4 
D-2,  3  ■  ■  8  21  7  D-2,  3,  4  D-2,  3,  4  D-1,  3,  4 D-2, 4 D-2, 3 D-3, 4 D-2, 3 ■ ■ ■ 7 22 7 D-2, 3, 4 D-2 D-2,3 D-2, 3, 4 D-2 
D-2,  3  D-3,  4  ■  ■  ■  5  23  6  D-2  D-2, 3 D-2 D-2, 3, 4 D-2 D-1, 2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 3 24 7 D-2, 3,4 D-2 D-2, 3, 4 D-4 D-2 D-4 
D-2,  3,  4  ■  ■  ■  3  25  7  D-2,  3  D-2  D-2,  3,  4  D-4  D-4  D-2  D-2,  3,  4  ■  ■  ■  3  26  7  D-2 D-1, 2,3,4 D-2, 3, 4 D-2, 3, 4 D-2 
D-2,3,  4  D-2,  3,  4 ■ ■ ■ 5 27 6 D-2, 3, 4 D-2 D-2, 3, 4 D-2, 3, 4 D-2 D-2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 4 28 7 D-2, 3,4 D-1, 2, 3, 4 D-2, 3, 
4  D-2  D-2,  3  D-2  D-2  ■  ■  ■  4  29  7  D-2,  3,  4  D-2  D-2,  3,  4  D-2,  3,  4  D-2  D-2  D-2 ■ ■ ■ 3 30 6 D-1, 2, 3, 4 D-1, 2, 3, 4 
D-1,  2,  3  D-2,  3, 4 D-2, 3 D-2, 3, 4 ■ ■ ■ ■ 6 31 7 D-2, 3, 4 D-2 D-1, 2, 3, 4 D-2, 3 D-1, 2, 3 D-1,2,3, 4 D-1, 2, 3, 4 ■ ■ ■ 
6 Total 212 167 (78.7%) 
■ = No mosquito processed; D = Dengue strain. 
Dengue virus types (D-1, 2, 3 & 4) observed in individual mosquitoes (Mosq) as expressed in agarose gel 
 
B. Angel et al. / Acta Tropica 150 (2015) 107–110 109 
Individual  Aedes  adults  were  homogenized  in  200  l  PBS  and  centrifuged  at  5000  rpm  for  10  min  at  4  ◦C.  The  supernatant 
were  transferred to clean eppendorfs, labelled district wise and stored at −80 ◦C. For screening the presence or absence of dengue 
virus  antigen  within  them,  5  l  of  this  supernatant  (before  storing)  was  subjected  to  Indirect  Fluorescence  Antibody  test  (IFAT) 
and a green fluorescence observed was recorded as IFAT positive result. 
Thus  a  total  number  of  5136  laboratory  reared  mosquitoes  were  screened  employing  Indirect  Fluorescence  Antibody  Test 
(IFAT),  of  which  1263  (24.59%)  were  found  positive  by  dengue  virus.  Of  these  1263  vertically  infected  mosquitoes,  212 
specimens were selected (6–10 mosquitoes from each setting) and subjected to DENV type virus detection employing RT-PCR. 
Viral  RNA was extracted using the QIAmp Viral RNA kit (m/s Qia- gen Inc., Valencia, CA). Gene specific primers (Lanciotti 
et  al.,  1992)  were  used  for  detecting  the  four  types  of  DEN  virus  in  the  individ-  ual  samples.  These  primers  used  were 
commercially  synthesized  from  m/s  Eurofins,  Bangalore,  India.  Thus  for  each  sample  a  total  of  4  reaction  was  run,  one 
representing  a  single  type.  The  Super-  script  III  RT/Taq  Polymerase  One-Step  RT-PCR  kit  (manufactured  by  m/s  Invitrogen, 
USA)  was  used  for  the  assay  following  the  manufac-  turer’s  protocol.  The  temperature conditions were also as suggested in the 
protocol. After the amplification, 10 l of PCR product (four for each sample) was run on a 2% Agarose gel (m/s Invitrogen, USA) 
and  then  viewed  in  the  Gel  Documentation  System  (manufactured  by  m/s  Bio-Rad,  USA).  This  was  done  for  a  total  of  212 
individual  mosquitoes.  The  types  that  appeared  as  bands  were  noted  for  each  sample.  Of  these,  eight  mosquitoes were selected 
for sequencing. 
Besides  these 8 mosquitoes, viral suspensions of 6 infected mosquitoes were inoculated in Cell lines of C6/36 (Aedes albopic- 
tus)  procured  commercially  from  National  Centre  for  Cell  Sciences (NCCS), Pune, India. 420 l of this suspension was subjected 
to  RNA  extraction  and  RT-PCR  amplification  as  mentioned  above.  The  primers  used  were  as  that  referred  in  Lanciotti  et  al., 
(1992).  These  cell-line  inoculated  mosquito  samples  were  also  reacted  with  another  set  of  type-specific  primers  (Seah  et  al., 
1995).  After  detect-  ing  the  type-specific  bands  for  each sample in the Agarose gel, the remaining sample was purified using the 
PCR  purification  kit  (manufactured  by  m/s  Qiagen,  Valencia,  CA,  USA)  following  the  manufacturer’s  protocol.  The  final 
purified  product  was  eluted  in  10  l  of  Elution  buffer  provided  in  the  kit.  Thus  a  total  of  14  sam-  ples  of  infected  mosquitoes 
showing  multiple  DEN-V  types  were  subjected  to  sequencing.  1–2  l  of  this  PCR  purified  product  was  subjected  to  cycle 
sequencing  using  the  Big  Dye  Terminator  cycle  sequencing  kit v3.1 (manufactured by m/s Invitrogen, USA). This was followed 
by  purification  of  the  cycle  sequenced  product using the Dye-Ex 2.0 spin kit (manufactured by m/s Qiagen, Valencia, CA, USA) 
according  to  the  manufacturer’s  protocol.  The  purified  product  was  then  loaded  in  the  16-capillary  based  3130XL  Genetic 
Analyzer (m/s ABI, USA). 
Data  generated  from  the  sequencer  were  then  analyzed  using  the  ‘Sequence  Analysis’  software.  The  quality  check  and 
trimming  of  the  sequences  generated  was  done  using  the  ‘Seqscape  2.6’  soft-  ware  (m/s  Applied  Biosystems,  USA)  and  then 
attempted  for  their  assembly  with  the  available  dengue  virus  type-specific  reference  genomes.  After  trimming,  BLAST  was 
carried  out.  Further,  multiple  alignment  was  also  performed  using  the  ‘Clustal-W’  for  the  sam-  ples  by  placing  them  in  four 
categories according to their types identified (Den-1, 2, 3 or 4). 
Hence in all, a total number of 1, 30, 525 domestic water con- tainers from 31 district towns of Rajasthan, India were searched 
for  larval  collection  of  Aedes  mosquitoes.  Total  number  of 5136 laboratory reared mosquitoes were screened for IFAT of which 
1263  (24.59%)  were  found  positive  by  vertically  transmitted  dengue  virus. Of these, 212 (174 females and 38 males) specimens 
were selected from 31 study settings (6–10 mosquitoes from each dis- 
trict)  for  type-specific  RT-PCR.  Table  1  shows  results  of  Reverse  Transcriptase  Polymerase  Chain  Reaction  (RT-PCR)  for 
DENV  types  as observed in individual mosquitoes. It was observed that in 78.7% of total specimens studied, more than one DEN 
type  was  present.  Further  analysis  of  data  of  mixed  infections  showed  that  in  163  out  of  212  mosquitoes  (76.8%)  DEN-2  was 
observed,  in  155  (73.1%)  DEN-3  was  present,  in  132  (62.2%)  DEN-4  was  present  and  least  53  (25%)  specimens  DEN-1  was 
observed.  The  sequences  of  the  14  samples  (processed  for  sequencing),  obtained  after  trimming when assembled and annotated 
with  the  reference  genomes  of  the  four  genotypes  (NC  001477.1,  NC  001474.2,  NC 001475.2, NC 002640.1 respectively) gave 
no match. But when these sequences were matched and aligned with each other using Clustal-W software, showed good coverage 
and  identity.  The  results  of  this  multiple  sequence  alignment  showed  presence  of  multiple  DEN-V  types  in  6  of  14  mosquito 
samples  while  rest  showed  single  or  no  DEN-V  types.  Of  these,  one  mosquito  sample  showed  good  coverage  for  all  the  four 
DEN-V  types,  5  showed  good coverage for two DEN-V types and five showed coverage for single DEN-V type. The sequencing 
results  of  the  six  mosquitoes  inoculated  in  cell  lines  and  amplified  with  second  set  of  primers  (Seah  et  al.,  1995) showed good 
assem- bly and annotation with DENV-2. The sequences generated will be attempted for submission in the NCBI website. 
It  is  believed  that  primary  infection  by  any  of  the  serotypes  of  dengue  leads  to  simple  dengue  fever  (Guzman  et  al.,  2010), 
whereas  infection  by  two  different  dengue  strains  with  a  time  interval may lead to DHF/DSS (Lanciotti et al., 1992; Wichmann, 
2005;  Jelinek,  2000).  Experimental  basis  of  above  hypothesis is the DENV type specific virus isolations from human population 
cohort  exhibiting  DHF/DSS.  In  addition,  the  observations  on  experimental  infection  of  monkeys  by different DENV types with 
time  intervals  have  also  contributed  to  strengthen  above  hypothesis  (Halstead  et  al.,  1973).  However,  limitations  of  the  above 
studies  (Lanciotti  et  al.,  1992;  Wichmann,  2005;  Jelinek,  2000)  is  that  DENV  types  have been observed from serum samples of 
cohort  of  human  patients  which  represents  an  immunologically  challenged  virus  stock.  Limitations  of  the  other  studies  in 
supporting  above  hypothesis  is  that  earlier  workers  (Halstead  et  al.,  1973), have performed experiments on 118 rhesus monkeys 
but  only  one  animal  has  manifested  signs  of  DHF  viz;  thrombocytopenia  and  elevation  of  prothrombin,  when  challenged  by 
different  DENV  types  with  a  time  interval.  The  aeti-  ology and pathogenesis of DHF/DSS are still not fully understood (Gubler, 
1998).  Although  earlier  workers  (Lanciotti  et  al.,  1992;  Wichmann,  2005;  Jelinek,  2000)  have  reported  enough  serolog-  ical 
evidences  to  explain pathogenesis of DHF, however none of the studies has included study of DENV types from mosquitoes. It is 
well  known  that  dengue  viruses  undergo  transovarial  transmis-  sion  (Khin  and  Thin,  1983;  Rosen  and  Gubler,  1973). 
Experimental  studies  have  also  shown  persistence  of  transovarial  transmission  in  successive  generations of infected mosquitoes 
(Joshi  et  al.,  2002;  Halstead  et  al.,  1973;  Shroyer,  1990).  We  hypothesized  that  transo-  varial  transmission  of  dengue  virus,  in 
addition  to  serve  as  the  possible  mechanism  of  virus retention in nature (Joshi et al., 2002), may also conserve the hetero DENV 
types  in  study  settings.  Based  on  our  observations of detection of DENV types from 212 individual infected mosquitoes from 31 
disease  endemic  settings  of  Rajasthan,  India  of  which  78.7% carried more than one DENV type. We report for the first time that 
vertically infected individual mosquitoes pos- sess multiple DNV types. 
Present  observations  highlight  two  distinct  messages.  One  is  that  in  dengue  endemic  settings,  through  transovarial  route, 
multiple  DENV  types  establish  themselves  across  mosquito  gen-  erations.  Since  we  have  made  RT-PCR  virus  isolations  on 
individual  mosquitoes  and  not  on  the  pools  of  mosquitoes,  these  observations  carry  their  own  significance  to  think  whether 
repetitive bites of mosquitoes infected by multiple DENV types could serve to provide 
 
110 B. Angel et al. / Acta Tropica 150 (2015) 107–110 
source  of  hetero  DENV  types  in  endemic  settings.  Present  observa-  tions  get  supported  by  the  earlier  reports citing that among 
young  children  even  primary  infection  of dengue leads to vascular leakage and that age dependent host factors contribute to such 
manifesta- tions (Alvarez, 2006; Guzman, 2002; Gamble 2000). 
Acknowledgements 
We  thank  Director,  Desert  Medicine  Research  Centre  (Indian  Council  of  Medical Research), Jodhpur for providing facilities 
and  support  in  conducting  above  work.  Present  work  was  supported  by  the  Indian  Council  of  Medical  Research,  Ministry  of 
Health  &  Family  Welfare,  Government  of  India,  India.  We  also  thank  Sh.  Ajay  Prakash  Joshi,  Scientist-I, Dr. Rajendra Kumar 
Baharia,  Scientist-  II  and  Smt.  Suman  Rathore,  Research  Assistant,  Desert  Medicine  Research  Centre,  Jodhpur  for  providing 
support for Bioinformatics analysis. 
References 
Alvarez, M., 2006. Dengue hemorrhagic fever caused by sequential dengue 1–3 
virus infections over a long time interval: Havana epidemic 2001–2002. Am. J. Trop. Med. Hyg. 75, 1113–1117. Bhatt, S., 
Gething, P.W., Brady, O.J., 2013. The global distribution and burden of 
dengue. Nature. Gubler, D.J., 1998. Dengue and dengue hemorrhagic fever. Clin. Microbiol. Rev. 11, 
480–496. Gamble, J., 2000. Age related changes in microvascular permeability: a significant 
factor in susceptibility of children to shock. Clin. Sci. 98, 211–216. 
Guzman, M.G., 2002. Enhanced severity of secondary dengue-2 infections. Death 
rates in 1981 and 1997 Cuban outbreaks. Rev. Panam. Salud Publica 11, 223–227. Guzman, M.G., Halstead, S.B., Artsob, H., 
Buchy, P., 2010. Dengue a continuing 
global threat. Nature, 7–16. Gubler 2011, Gubler, D.J., 2011. Dengue, urbanization and globalization: the 
unholy treaty of 21st century. Trop. Med. Health 39, 3–11. Guzman, M.G., 1990. Dengue hemorrhagic fever in Cuba, 1981: a 
retrospective seo 
epidemiologic study. Am. J. Trop. Med. Hyg. 42, 179–184. Halstead, S.B., O’Rourke, E.J., 1977. Dengue viruses and 
mononuclear phagocytes. I. 
Infection enhancement by non neutralizing antibody. J. Exp. med. 146, 201–217. Halstead, S.B., Henry, S., Jordi, C., 1973. 
Studies on the pathogenesis of dengue infection in monkeys. II. Clinical laboratory responses to heterologous infection. Infect. 
Dis. 128 (1), 15–22. Jelinek, T., 2000. Dengue fever in international travellers. Clin. Infect. Dis. 31, 
144–147. Joshi, V., Mourya, D.T., Sharma, R.C., 2002. Persistence of dengue-3 virus through transovarial transmission 
passage in successive generations of Aedes aegypti mosquitoes. Am. J. Trop. Med. Hyg. 67 (2), 158–161. Khin, M.M., Thin, 
A.T., 1983. Transovarial transmission of dengue-2 virus by Aedes 
aegypti in nature. Am. J. Trop. Med. Hyg. 32, 590–594. Lanciotti, R.S., Calisher, C.H., Gubler, D.J., Chang, G.J., Vorndam, 
V., 1992. Rapid 
detection and typing of dengue viruses from clinical samples by using reverse transcriptase-polymerase chain reaction. J. Clin. 
Microbiol. 30, 545–551. Rosen, I., Gubler, D.J., 1973. The use of mosquitoes to detect and propagate dengue 
viruses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 23, 1153–1157. Seah, C.L.K., Chow, V.T.K., Chan, Y.C., 1995. Semi nested PCR using NS3 
primers for 
the detection of dengue viruses in clinical serum specimens. Clin. Diag. virol. 4, 113–120. Shroyer, D.A., 1990. Vertical 
maintenance of dengue-1 virus in sequential 
generations of Aedes albopictus. J. Am. Mosq. Control Assoc. 6, 312–314. World Health Organization, 2009. Dengue: 
Guidelines for Diagnosis, Treatment, 
Prevention and Control, new ed. WHO, Geneva, Switzerland. Wichmann, O., 2005. Dengue antibody prevalence in German 
travellers. Emerging 
Infect. Dis. 11, 762–765.