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UNIVERSITÀ DEGLI STUDI DI NAPOLI FEDERICO II

Scuola Politecnica e delle Scienze di Base

CORSO DI LAUREA MAGISTRALE IN SCIENZE CHIMICHE


CLASSE DELLE LAUREE LM-54

TESI DI LAUREA MAGISTRALE

Sintesi di rotassani a base di PEG-PCL per la realizzazione di


nanoparticelle funzionalizzate per il Drug Delivery

Relatore Candidato
Prof. Rosa Lanzetta Salvatore Simone Troise
Correlatore matr. M03/304
Dott.ssa Paola Laurienzo
Dott. Giovanni Dal Poggetto

ANNO ACCADEMICO 2018-2019


UNIVERSITY OF NAPLES FEDERICO II
Polytechnic and Basic Sciences School

MASTER DEGREE IN CHEMISTRY

MASTER THESIS

Synthesis of PEG-PCL based rotaxanes for realization of functionalized


nanoparticles for Drug Delivery

Supervisor Candidate
Prof. Rosa Lanzetta Salvatore Simone Troise
Correlator matr. M03/304
Dott.ssa Paola Laurienzo
Dott. Giovanni Dal Poggetto

ACADEMIC YEAR 2018-2019


ABSTRACT

I polimeri, sia naturali che sintetici, rappresentano una classe molto


promettente fra i materiali utilizzati in ambito biomedico. In particolare, i
polimeri biocompatibili trovano numerose applicazioni nel rilascio controllato
o mirato di farmaci. Il vantaggio di utilizzare polimeri come sistemi veicolanti
per il rilascio di farmaci risiede nel fatto che un veicolante polimerico può
contenere numerosi gruppi funzionali, di conseguenza esso può essere
progettato ‘ad hoc’.

In questo lavoro di tesi è stata messa a punto una strategia sintetica che ha
previsto l’uso di copolimeri anfifilici di-blocco PEG-PCL che in ambiente
acquoso si autoassemblano spontaneamente in strutture di tipo “core-shell” di
dimensioni nanoscopiche (nanoparticelle, NP). Il blocco idrofobico (PCL,
sintetizzato mediante “ring opening polymerization” da -caprolattone) è in
grado di intrappolare farmaci lipofili. Il blocco idrofilico (PEG),
funzionalizzato con una molecola di interesse biologico (acido folico) in grado
di riconoscere recettori specifici di cellule tumorali, è stato legato al blocco
PCL mediante Cicloaddizione di Huisgen [3+2] (“click chemistry”). Per
favorire l’esposizione dell’acido folico sulla superficie delle NP, il PEG è stato
inanellato con -Ciclodestrine, allo scopo di impartire alle catene una
conformazione più estesa. I polimeri così strutturati prendono il nome di
polirotassani. I prodotti e gli intermedi di sintesi sono stati caratterizzati
mediante spettroscopia FTIR, 1H-NMR e 2D-DOSY, analisi GPC, DSC,
diffrazione dei raggi X, TGA e microscopia ottica. Le nanoparticelle formulate
con i rotassani in miscela con mPEG-PCL sono state valutate mediante DLS e
la quantità di acido folico presente in superficie è stata determinata mediante
spettroscopia 1H-NMR.
INDICE

CAPITOLO 1

INTRODUZIONE

1 Stato dell’Arte………………………………………………………………5

1.1 Biomateriali polimerici ………………………………………………….5


1.2 Il Poli--Caprolattone (PCL)…………………………………………….7
1.3 Il Poli-(etilenglicole) (PEG).……………………………………………..9
1.4 Drug Delivery Systems…………………………………………………...9
1.5 Sistemi a matrice polimerica per il rilascio controllato………………12
1.5.1 Nanoparticelle (NP) a base di copolimeri anfifilici a blocchi……..13
1.6 Targeting passivo e attivo………………………………………………16
1.7 Obiettivo del lavoro di tesi…...…………………………………………19

CAPITOLO 2

MATERIALI E METODI

2.1 Materiali…………………………………………………………………23

2.2 Sintesi dei precursori……………………………………………………23

2.2.1 Sintesi di butinil-PCL…………………………………………………23

2.2.2 Sintesi di -tosil--ossidrile-PEG (TsO-PEG-OH)…………………24

2.2.3 Sintesi di -azido--ossidrile PEG (N3-PEG-OH)………………….24

2.2.4 Sintesi di -tosil--azido-PEG (TsO-PEG-N3)……………………..25

2.3 Sintesi di mPEG1000-PCL4000……………………………………………25

1
2.4 Sintesi del copolimero PEG-PCL funzionalizzato

con Folato (Fol-PEG-PCL) ………………………………...........................25

2.5 Preparazione dello pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-N3…..……….26

2.6 Sintesi dei rotassani Fol-PEG(CD)-PCL……………………………..27

2.6.1 Sintesi del rotassano Fol-PEG(CD)-PCL

mediante reazione di End Capping “One-Step” (R1) ……………………27

2.6.2 Sintesi del rotassano Fol-PEG(CD)-PCL

mediante reazione di End Capping “Two Steps” (R2)…………………..28

2.7 Caratterizzazione dei copolimeri………………………………………29

2.7.1 Spettroscopia FTIR…………………………………………………...29

2.7.2 Analisi GPC……………………………………………………………29

2.7.3 Spettroscopia 1H-NMR……………………………………………….29

2.7.4 Spettroscopia 2D-DOSY……………………………………………...29

2.7.5 Analisi DSC……………………………………………………………30

2.7.6 Analisi TGA…………………………………………………………...30

2.7.7 Diffrazione dei Raggi X……………………………………………….30

2.7.8 Microscopia Ottica…………………………………………………....30

2.7.9 Spettroscopia UV-Vis…………………………………………………31

2.7.10 Analisi Elementale…………………………………………………...31

2.8 Preparazione e caratterizzazione delle nanoparticelle………………..31

2
CAPITOLO 3

RISULTATI E DISCUSSIONI

3.1 Sintesi di butinil-PCL…………………………………………………...33

3.2 Sintesi di -tosil--ossidrile-PEG (TsO-PEG-OH)…………………...35

3.3 Sintesi di -azido--ossidrile PEG (N3-PEG-OH)……………………37

3.4 Sintesi di -tosil--azido-PEG (TsO-PEG-N3)………………………..39

3.5 Preparazione del complesso di inclusione TsO-PEG-N3

con CD: pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-N3 ………………………..41

3.6 Preparazione dei rotassani……………………………………………..41

3.6.1 Reazione di End Capping: TsO-PEG(CD)-N3

e butinil-PCL (reazione di “click”)………………………………………...42

3.6.2 Reazione di End Capping: sostituzione nucleofila di

TsO-PEG(CD)-PCL con Folato…………………………………………..44

3.6.3 Reazione di End Capping: approccio “One step”

e approccio “two steps”……………………………………………………...45

3.7 Analisi GPC……………………………………………………………...48

3.8 Analisi spettroscopiche 1H-NMR e 2D-DOSY………………………...48

3.9 Analisi DSC……………………………………………………………...52

3.10 Analisi di diffrazione dei Raggi X…………………………………….56

3.11 Analisi TGA……………………………………………………………58

3.12 Microscopia Ottica…………………………………………………….59

3.13 Studi di formulazione di Nanoparticelle…………………………..…60

3
CONCLUSIONI…………………………………………………………….64

BIBLIOGRAFIA……………………………………………………………66

RINGRAZIAMENTI……………………………………………………….69

4
Capitolo 1

INTRODUZIONE

1 Stato dell’arte

1.1 Biomateriali polimerici

Si definisce biomateriale “un materiale sintetico o naturale progettato per


interfacciarsi con i sistemi biologici per trattare, aumentare o sostituire
qualunque tessuto, organo o funzione del corpo”1. Un materiale
biocompatibile deve rispondere ai seguenti requisiti: non deve essere tossico
per l’ambiente fisiologico, non deve provocare reazioni infiammatorie acute e
in più deve essere in grado di stimolare una risposta biologica positiva
nell’ambiente fisiologico circostante. In questo contesto, il progresso
scientifico è stato indirizzato verso la scelta di materiali estremamente versatili
quali i polimeri, sia naturali che sintetici.

Tra i polimeri naturali, caratterizzati dalle loro proprietà di biocompatibilità e


atossicità, bisogna menzionare i polisaccaridi (alginato, chitina) e i loro
derivati (carbossimetil-cellulosa, solfato di cellulosa, chitosano ecc.) e le
proteine (collagene, cheratina ed altre).

Un settore di sviluppo molto importante, oggetto di studio da diversi decenni a


tutt’oggi sono i polimeri sintetici biocompatibili. L’interesse verso questi
materiali risiede nel fatto che è possibile modificarne le proprietà chimico-
fisiche, agendo ad esempio sulla struttura chimica o sul peso molecolare, per
ottenere un prodotto finale “ad hoc”. Caratteristica peculiare dei polimeri
sintetici infatti è la possibilità di ottenerli, in base all’applicazione a cui essi
sono destinati, con una vasta gamma di composizioni, aventi strutture e
architetture anche complesse. Grazie alle proprietà sopra elencate e alla
facilità con cui possono essere lavorati, i polimeri sintetici sono preferiti ai
materiali ceramici o metallici, molto più difficili da trattare, in ambito
1 II International Consensus Conference on Biomaterials, 1991

5
biomedicale2. I polimeri sintetici di più largo impiego nel campo biomedicale
sono elencati in Tabella 1.1.

Polimeri Area di applicazione


Polietilene a bassa densità Chirurgia ricostruttiva
Polietilene alta densità Ortopedia
Gomma al silicone Chirurgia plastica
Poliacetali Ortopedia
Polipropilene Imballaggi sterili, siringhe
Poliammidi Suture
Polietilentereftalato Cardiovascolare, Ortopedia
Fluoropolimeri Chirurgia generale, cardiovascolare
Polivinilcloruro Sacche per sangue, guanti monouso
Polilattide Suture, Ortopedica
Poliglicolide Suture
Polimeri naturali Agenti emostatici, impianti bioassorbibili, suture

Tabella 1.1: Polimeri naturali e sintetici e laro applicazioni in campo biomedicale

Un altro parametro di notevole interesse in ambito biomedicale è la


biodegradabilità, cioè la capacità del materiale di degradare in vivo per via
enzimatica o idrolitica. Tale caratteristica è richiesta, ad esempio, nel caso di
impianti temporanei. Inoltre, affinchè un polimero biodegradabile possa essere
utilizzato come biomateriale, deve rispettare parametri specifici quali ad
esempio biostabilità (cioè la capacità di non essere alterato da fluidi biologici)
e bioassorbibilità (cioè la capacità, una volta all’interno dell’organismo, di
subire una lenta ma progressiva degradazione con una velocità controllata, ed
in più presuppone il riassorbimento dei prodotti di degradazione, che non
devono essere tossici ma devono entrare in una delle vie metaboliche che
regolano le funzioni del nostro organismo), atti a determinarne il “tempo di
vita” all’interno dell’organismo in cui verranno impiantati. I polimeri
biodegradabili trovano numerose applicazioni nel settore farmaceutico

2Middleton, J.C.,Tipton A.J., “Synthetic biodegradable polymers as orthopaedic devices”, Biomaterials 21 (2000)
2335-2346

6
(realizzazione di dispositivi per il rilascio controllato o mirato di farmaci) 3.
Tra i polimeri sintetici biodegradabili e biocompatibili più utilizzati, spesso
usati in miscela o come copolimeri, vi sono il Poli--caprolattone (PCL) ed il
Poli(etilenglicole) (PEG).

1.2 Il Poli--Caprolattone (PCL)

Il PCL, la cui unità ripetitiva è mostrata in Figura 1.1, è stato ampiamente


studiato come materiale biocompatibile e biodegradabile poichè si degrada per
idrolisi dei legami esterei ed è riassorbito nei tessuti senza rilascio di prodotti
tossici4.

Figura 1.1: Poli--Caprolattone

Il PCL generalmente viene polimerizzato per apertura del ciclo dell’ε-


Caprolattone, mediante una procedura sintetica definita “ring opening
polymerization” (ROP), che utilizza un alcool (o un’ammina) mono-, di-,
multi-funzionale come iniziatore in presenza di un centro di coordinazione
metallico (Sn, Zn, Al), fra cui il più utilizzato è Sn(etilesanoato)2 (Sn(oct)2)
(come mostrato in Figura 1.2).

3
Ratner, B. Hoffmann A.S., Schoen F.J., Lemons, J.E., “Biomaterials Science. An introduction to materials in
medicine”. Academic Press. San Diego (1996)
4
Hajiali F, Tajbakhsh S, Shojaei A (28 June 2017). "Fabrication and Properties of Polycaprolactone Composites
Containing Calcium Phosphate-Based Ceramics and Bioactive Glasses in Bone Tissue Engineering: A
Review". Polymer Reviews. 58 (1): 164–207.

7
Figura 1.2: Schema riassuntivo della ROP dell’-caprolattone

Il PCL è un poliestere semicristallino con una temperatura di fusione di 60°C e


con bassa temperatura di transizione vetrosa, Tg= -60°C; quindi la
componente amorfa a temperatura ambiente si trova nello stato gommoso.
Questa proprietà è insolita fra i più comuni poliesteri alifatici e contribuisce
alla notevole permeabilità del PCL a molti principi attivi. Per queste sue
caratteristiche esso è molto usato nella progettazione di dispositivi per il
rilascio controllato di farmaci. Altre importanti proprietà sono la sua
propensione a formare miscele compatibili con molti altri polimeri e la
possibilità di ottenere copolimeri con proprietà anche notevolmente diverse
dall’omopolimero. È possibile infatti realizzare copolimeri a blocchi con altri
poliesteri caratterizzati da una velocità di degradazione più elevata o con
polieteri, in particolare con poli(etilenglicole), al fine di aumentarne la
versatilità ed ampliarne il campo di applicazione.

8
1.3 Il Poli-(etilenglicole) (PEG)

Il poli-(etilenglicole) è un polietere lineare derivante dall’ossido di etilene


(Figura 1.3).

Figura 1.3: Poli-(etilenglicole)

Il PEG è un polimero neutro, idrosolubile, biocompatibile e non


immunogenico, ed è facilmente reperibile in un vasto intervallo di pesi
molecolari. Per queste proprietà questo biopolimero (già ampiamente
utilizzato per la realizzazione di bioconiugati con proteine, peptidi e farmaci5)
ha trovato largo impiego in ambito biomedicale per la realizzazione di
dispositivi per il rilascio controllato che seguano i principi del Drug Delivery.

1.4 Drug Delivery Systems

La ricerca di nuovi farmaci da sola è insufficiente ad assicurare un progresso


nello sviluppo di terapie più efficienti.

Le cause maggiori dell’inefficacia terapeutica includono:

 Una concentrazione insufficiente del farmaco, dovuta allo scarso


assorbimento e conseguente eliminazione dell’eccesso non assorbito;
 Un’ampia oscillazione dei livelli plasmatici;

5
S Zalipsky - Advanced Drug Delivery Reviews, 1995

9
 Una scarsa solubilità del farmaco, solitamente di natura lipofila, che
porta all’esclusione della somministrazione endovenosa di soluzioni
acquose;

Affinché un farmaco possa essere correttamente formulato e quindi


somministrato, devono essere tenuti in considerazione alcuni parametri:

1. Il sito di azione, cioè la zona che deve necessariamente raggiungere il


formulato farmaceutico.
2. Un’adeguata stabilità chimica che ne garantisca lo stoccaggio e la scelta
del metodo di somministrazione, ad esempio iniezione o aereosol, in
funzione del sito che si vuole raggiungere e delle condizioni che
può/deve sopportare il formulato farmaceutico.
3. La quantità di tempo per la quale il farmaco deve rimanere ad una
concentrazione terapeutica.
4. La concentrazione con cui deve essere preparato il farmaco affinché
esso abbia risultati terapeutici.

Risulta quindi evidente che il “farmaco” non è formato solamente dal


principio attivo, anzi quest’ultimo potrebbe addirittura risultare dannoso, se
non somministrato correttamente.

Bisogna tenere a mente che per le sostanze che mostrano effetti farmacologici,
si individuano tre principali zone che spaziano nel dominio delle
concentrazioni (Figura 1.4).

A bassa concentrazione, il principio attivo risulta al di sotto del livello minimo


efficace, aumentando la concentrazione si entra nell’intervallo terapeutico, un
incremento ulteriore della concentrazione che supera il livello massimo
desiderato potrebbe renderlo tossico. Un generico profilo farmacocinetico è
mostrato in Figura 1.4a, in cui si evince che sono necessarie più
somministrazioni per avere una concentrazione che rientri nell’efficacia
terapeutica. Nel caso ideale invece, in cui il farmaco è rilasciato in maniera

10
controllata nel tempo, la concentrazione del principio attivo raggiunge livelli
efficaci ma non tossici ed è mantenuta costante per il tempo desiderato con
una sola somministrazione (Figura 1.4b).

Figura 1.4: Profilo delle concentrazioni del farmaco vs tempo; (a) dose standard somministrata più volte, (b)
dose rilasciata a velocità controllata ideale

In letteratura6 è stata ampiamente descritta l’efficacia dei polimeri sintetici


nella formulazione di adatti sistemi (carrier) per l’incapsulamento e il rilascio
di principi attivi, i cosiddetti Drug Delivery Systems. Questi sistemi
permettono di ridurre la frequenza delle somministrazioni del farmaco,
migliorando così la tollerabilità del paziente, ma anche la dose necessaria per
raggiungere la concentrazione minima efficace. Inoltre, è possibile, in linea di
principio, orientare il rilascio verso un sito specifico (organo bersaglio),
riducendo di conseguenza gli effetti collaterali associati al farmaco stesso. Il
principale vantaggio di un veicolante polimerico consiste nel poter essere
progettato ad hoc mediante introduzione di unità solubilizzanti, unità attive, e
gruppi orientanti che rendono possibile la veicolazione dei principi attivi
direttamente al sito target (cellula/tessuto), allo scopo di migliorare la stabilità,

6 A.Kumari, S.K.Yadav, S.C.Yadav - Colloids and surfaces B: Biointerfaces, 2010

11
l’assorbimento e la concentrazione terapeutica del principio attivo nel tessuto
bersaglio, quindi la sua biodisponibilità.

1.5 Sistemi a matrice polimerica per il rilascio controllato

Tra i diversi sistemi di trasporto di farmaci elaborati nel corso degli anni (nei
quali possono essere annoverati i liposomi, i dendrimeri e i sistemi con matrici
a gel)7 particolare attenzione è stata volta verso i sistemi costituiti da matrici
polimeriche (Figura 1.5).

Attualmente molti farmaci, vitamine, macromolecole come proteine e acidi


nucleici8, vengono somministrati sotto forma di sistemi a matrice polimerica.

Figura 1.5: (a)Coniugato polimero-farmaco; (b) Coniugato polimero-proteina; (c) Coniugato polimero-DNA;
(d) Micella caricato con farmaco; (d) Dendrimero caricato con farmaco9

L’incapsulamento del farmaco all’interno di matrici polimeriche, oltre a


mascherare odori e sapori sgradevoli, permette anche di garantire il
mantenimento dell’attività farmacologica di principi attivi facilmente
degradabili. I vantaggi mostrati da un veicolante polimerico sono la capacità di

7PCouvreur, C Vauthier - Pharmaceutical research, 2006


8PerezC, Sanchez A, Putnam D, Ting D, Langer R, Alonso MJ. Poly (lactic acid)-poly (ethylene glycol)
nanoparticles as new carriers for the delivery of plasmid DNA. J Control Release 2001; 75(1-2): 211-22
9
J.H.Park, Progress Polymer Science,33,113(2008)

12
garantire un rilascio controllato del farmaco nel duplice aspetto di rilascio
graduale e ritardato nel tempo, oltre alla capacità di orientarsi verso un organo
bersaglio se opportunamente funzionalizzato. I principali meccanismi che
regolano il rilascio del farmaco incorporato sono due: erosione della superficie
particellare e/o diffusione del farmaco attraverso la matrice polimerica.

I polimeri sintetici biodegradabili più utilizzati per la realizzazione di sistemi a


rilascio controllato sono i poliesteri biodegradabili, come la poli (D,L)-lattide
(PLA), poli(glicolide) (PLG) Poli--caprolattone (PCL), spesso
copolimerizzati con il Poli(etilenglicole) (PEG). I Carriers polimerici possono
essere realizzati anche con polisaccaridi come il chitosano e i destrani10.

1.5.1 Nanoparticelle (NP) a base di copolimeri anfifilici a blocchi.

In questo lavoro di tesi l’attenzione si è concentrata su nanoparticelle


polimeriche (NP) costituite da copolimeri anfifilici a blocchi PEG-PCL che, in
definite condizioni di concentrazione e temperatura, sono in grado di
autoassemblarsi in soluzione acquosa in strutture ordinate del tipo “core-shell”
(micelle) di dimensioni nanometriche (60-100 nm) e, prevalentemente, di
forma sferica (Figura 1.6). Le NP così costituite possono essere variamente
funzionalizzate ed utilizzate come “drug carriers”, principalmente per
somministrazione endovenosa. Queste NP infatti, hanno la peculiarità di poter
intrappolare fisicamente nel “core”, costituito da PCL, degli agenti terapeutici
idrofobici. Al contempo, lo “shell” costituito da PEG, possiede il duplice
compito di proteggere il core e di favorire la solubilità delle NP in ambiente
fisiologico, permettendo quindi il trasporto del farmaco11.

10
Liu Z, Jiao Y, Wang Y, Zhou C, Zhang Z. Polysaccharides-based nanoparticles as drug delivery systems. Adv
Drug Deliv Rev. 2008; 60(15): 1650-166
11
Gohy, J. F, Creutz S. Garcia M, Aggregates formed by amphoteric diblock copolymers in water.
Macromolecules, 2000, 33(17): 6378-6387

13
Figura 1.6: Autoassemblaggio di copolimeri anfifilici a blocchi in Nanoparticelle a valori di CMC e CMT
adeguati

La formazione delle micelle e la loro stabilità dipendono da due parametri


specifici: la Concentrazione Micellare Critica (CMC) e la Temperatura
Micellare Critica (CMT). Parametro fondamentale delle NP è la CMC, che
per definizione è il valore minimo di concentrazione alla quale si osserva
l’aggregazione delle singole macromolecole in strutture micellari. A
concentrazioni superiori alla CMC, i copolimeri si autoassemblano in NP
orientando il blocco idrofilico verso l’esterno, a contatto con il solvente
acquoso, e il blocco idrofobico verso l’interno; a concentrazioni inferiori alla
CMC esse si disgregano. Le micelle polimeriche presentano CMC molto basse
(10-6-10-7 M), e quindi possono essere diluite nel flusso sanguigno senza
disgregarsi12. Anche la temperatura ha un ruolo importante: a una determinata
concentrazione, la transizione unimero-micella avviene aumentando la
temperatura. Una volta assemblata la nanoparticella, le interazioni fra i blocchi
idrofobici ne impediscono la disgregazione. Le micelle polimeriche sono
particolarmente stabili: il tempo di residenza di un copolimero nella micella è
dell’ordine delle ore, mentre quello di sostanze anfifiliche a basso PM è
dell’ordine dei millisecondi. Ciò rende le micelle polimeriche utilizzabili come

12
Kwon, G. S.; Naito, M; Yokoyama, M; Sakurai Y.; Kataoka, K. Langmuir, 1993, 9, 945

14
carriers per il trasporto di farmaci. Un ulteriore vantaggio dell’utilizzo di NP di
dimensioni <100 nm è la possibilità di raggiungere anche i vasi sanguigni di
ridotte dimensioni13.

L’utilizzo del PEG, come costituente dello shell nelle NP, ha suscitato
notevole interesse in ambito farmaceutico perché è in grado di impedire
fenomeni di aggregazione tra le NP ed il sistema immunitario degli organismi
in modo da mimetizzare le NP, rendendole invisibili ai fagociti 14. Questo
permette un prolungamento del tempo di permanenza delle NP nel circolo
sanguigno. I sistemi con queste caratteristiche sono stati definiti Stealth.

Un ulteriore parametro da tenere in considerazione per la realizzazione di NP,


utilizzabili per il Drug Delivery, è lo spessore dello shell idrofilico. Come
riportato in letteratura, lo shell deve essere sufficientemente spesso affinché si
possa avere una adeguata stabilizzazione del carrier ed un adeguato
ricoprimento di tutto il core idrofobico15. A basse concentrazioni di PEG sulla
superficie, le catene polimeriche assumono la cosiddetta forma a fungo o
“mushroom shape”, la superficie è poco mascherata e le catene di PEG hanno
più spazio per muoversi (in media si dispongono più vicine alla superficie
della particella). Si possono formare delle lacune nello strato protettivo del
PEG, quando il grado di rivestimento è molto basso, permettendo ai sistemi di
protezione biologici di legarsi liberamente alla superficie della NP, che
verranno così eliminate dal circolo sanguigno. Se invece la concentrazione di
PEG in superficie è elevata, le catene iniziano ad interagire fra di loro
assumendo una conformazione più estesa, fenomeno definito transizione da
“mushrooms” a “brush”, cioè a “spazzola”16. In questo modo la superficie è
completamente coperta, diminuisce la mobilità delle catene del PEG e quindi

13Soo-Hong Lee, Soo Hyun Kim, Yang-Kyoo Han, Ha Kim, J. Polym. Chem., 40, 2545-2555, 2002
14Owens III Donald E, Peppas Nicholas A. Opsonization, biodistribution, and pharmacokinetics of polymeric
Nanoparticles. Int. J. of Pharm. 2006; 307: 93-102
15Gref R, Minamitake Y, Peracchia MT, Trubetskoy V, Torchilin V, Langer R. Biodegradable longcirculating

polymeric nanospheres. Science 1994; 263: 1600–160


16
Hansen PL, Cohen JA, Podgomik R, Parsegian VA. Osmotic properties of poly (ethylene glycols): quantitative
features of brush and bulk scaling laws. Biophys J. 2003; 84: 350-355

15
aumentano le proprietà di ingombro sterico dello strato di PEG verso i sistemi
di difesa dell’organismo (Figura 1.7)

Figura 1.7: Conformazioni assunte dalle catene di PEG sulla superficie di una particella

Dati di letteratura dimostrano che una forma intermedia tra quella


“mushroom” e “brush”, è la migliore conformazione per rivestire la superficie
delle NP17. Questo perché la maggior parte delle catene sono in una
conformazione leggermente costretta, ma ad una densità abbastanza alta tale
da garantire la mancanza di spazi e lacune. Questa conformazione intermedia
riesce a garantire la giusta repulsione verso i sistemi di difesa dell’organismo,
permettendo alle NP di circolare liberamente in ambiente fisiologico.

1.6 Targeting passivo e attivo

Come già accennato in precedenza, una delle cause della tossicità dei farmaci
è la loro scarsa selettività per le cellule malate. Ad esempio, gli agenti
antitumorali agendo indistintamente anche sulle cellule sane, causano diversi
effetti collaterali, anche gravi, quali tossicità a livello epatico o cardiaco18. Per
questo motivo la sfida terapeutica a cui tutti ricercatori mirano è ottenere un
sistema terapeuticamente selettivo attraverso strategie di targeting passivo e/o
attivo (Figura 1.8).

17
Storm G, Belliot SO, Daemen T, Lasic DD. Surface modification of nanoparticles to oppose uptake by the
mononuclear phagocyte system. Adv. Drug Deliv. Rev. 1995; 17: 31-48
18Iver L, Ratain MJ. Pharmacogenetics and cancer chemotherapy. Eur. J. Cancer 1998; 34(10): 14931499

16
Figura 1.8: Illustrazione di Targeting passivo e Targeting attivo

Il Targeting passivo si basa sull’effetto di incremento di permeabilità e


ritenzione (EPR: enhanced permeability and retention effect) ed è attribuibile a
due principali fattori: da un lato, la vascolarizzazione tumorale spesso mostra
un endotelio discontinuo, cioè con permeabilità alterata, che permette il
passaggio di particelle di dimensioni <100 nm, le quali invece attraversano
con difficoltà o non attraversano affatto le pareti di vasi normali. D’altro lato,
si osserva nel tumore una mancanza di drenaggio efficace da parte del sistema
linfatico, che conduce a un accumulo locale delle NP penetrate.19 Quindi,
grazie all’effetto EPR, NP di dimensioni adeguate possono penetrare e
accumularsi nei tessuti tumorali. Tuttavia, un sistema di Drug Delivery basato
solo sul targeting passivo è spesso limitato dalla mancanza di specificità del
sito di destinazione e, inoltre, i vasi tumorali permeabili sono molto eterogenei
e non ci sono grandi differenze nell’effetto EPR tra diversi tipi di tumore.
19Maeda H, Matsumara Y. Tumoritropic and lymphotropic principles of macromolecular drugs, CRC Crit. Rev.
Ther. Drug Carrier Sys. 6(3) 1989: 193-210

17
Il Targeting attivo, invece, si basa sulla modifica della superficie del carrier
con un opportuno ligando in grado di riconoscere uno specifico recettore
presente sulle cellule tumorali e di orientarlo verso il sito di azione riducendo
l’assorbimento del farmaco a livello delle cellule sane20.

Tra i vari tipi di ligandi utilizzati nel targeting attivo, è stato scelto per questo
lavoro di tesi il Folato (Fol) (Figura 1.9).

Figura 1.9: Acido Folico

Questo è un ligando ampiamente usato perché riconosce il recettore della


vitamina acido folico, comunemente sovra espresso nella maggioranza dei
tumori solidi21. Tuttavia, una delle complicazioni durante la progettazione di
sistemi per il Targeting attivo è la conformazione che assumono le catene di
PEG localizzate sulla superficie. In alcuni casi è possibile che il PEG,
ripiegandosi, mascheri i ligandi ancorati all’estremità di catena, riducendo in
tal modo l’esposizione in superficie del ligando e quindi la possibilità di una
associazione o una interazione con le cellule bersaglio. Questo porta
inevitabilmente ad una diminuzione dell’efficienza di rilascio mirato
intracellulare delle NP modificate22.

20Gu F, Zhang L, Teply BA, Mann N, Wang A, Radovic-Moreno AF, Langer R, Farokhzad OC. Precise
engineering of targeted nanoparticles by using self-assembled biointegrated block copolymers. Proc Natl Acad
Sci U S A. 2008; 105: 2586-2591
21Sun C, Sze R, Zhang M. Folic acid-PEG conjugated superparamagnetic nanoparticles for targeted cellular

uptake and detection by MRI. J. Biomed. Mater. Res. 2006; 78: 550–557
22van Vlerken LE, Vyas TK, Amiji MM. Poly(ethylene glycol)-modified nanocarriers for tumortargeted and

intracellular delivery. Pharm Res. 2007; 24(8): 1405-1414

18
1.7 Obiettivo del lavoro di tesi

L’obiettivo di questo lavoro di tesi è quello di sintetizzare e caratterizzare


opportuni copolimeri anfifilici a blocchi al fine di realizzare nanoparticelle
decorate con acido folico per il targeting attivo caratterizzate da una migliore
esposizione del ligando sulla superficie. Precedenti studi23 hanno mostrato
come NPs ottenute da una miscela di copolimeri PEG-PCL con PEG Mw 1000
Da e Fol-PEG-PCL con PEG 1500 Da mostrano un maggiore uptake da parte
di cellule tumorali che sovra-esprimono il recettore Fol rispetto a NP in cui i
copolimeri hanno la stessa lunghezza dei blocchi PEG. La maggiore lunghezza
del PEG che lega il folato ne determina una migliore esposizione in superficie.
Allo scopo di migliorare ulteriormente l’esposizione del Fol, in questo lavoro
di tesi, in collaborazione con l’Istituto per i Polimeri, Compositi e Biomateriali
(IPCB) del CNR di Pozzuoli (NA), è stata messa a punto una strategia
sintetica che prevede l’utilizzo di Polirotassani. Il Polirotassano è uno strand
polimerico “inanellato” con macrocicli (es., ciclodestrine) mediante legami
non covalenti. I costituenti della struttura sono bloccati da molecole
stericamente ingombranti (definite End Caps o stoppers) poste alle estremità
della catena, che impediscono il disanellamento (Figura 1.10). In assenza di
end-caps, il polimero inanellato viene definito pseudo-polirotassano. La
nomenclatura specifica si basa sul numero di macrocicli per catena polimerica
che, se noto, viene riportato in parentesi quadra (es.: 3rotassano indica 2
macrocicli su 1 catena). Quando il numero di macrocicli per singola catena
non è noto o è superiore a 5 si parla genericamente di polirotassani.

23
F. Quaglia, L. Ostacolo, G. De Rosa, M. La Rotonda, G. Nese, G.Maglio, R. Palumbo, International
Journal of Pharmaceutics, 324, 56-66,2006

19
Figura 1.10: Steps di formazione del Polirotassano

In linea di principio, una struttura così formata dovrebbe assumere una


conformazione delle catene polimeriche più estesa dell’analogo non
inanellato. Quindi, se utilizzato come molecola End-Cap, è possibile che
l’acido folico rimanga esposto sulla superficie e non venga mascherato
all’interno dello shell idrofilico (Figura 1.11).

Figura 1.11: Rappresentazione schematica della conformazione delle catene di PEG rotassano nella shell

In questo contesto, nei laboratori dell’IPCB, è stato possibile sintetizzare


copolimeri anfifilici che andranno a formare le nanoparticelle (con opportuni
metodi di formulazione) con questa struttura:

 Blocco idrofilico: PEG con peso molecolare 1500 Da inanellato con -


ciclodestrine bloccato ad un’estremità dall’acido folico

20
 Blocco idrofobico: PCL con peso molecolare 4000 Da, che ha la
duplice funzione di blocco idrofobico ed End-Cap per il blocco PEG
rotassano

Il polirotassano finale quindi è costituito da un copolimero Fol-PEG-PCL in


cui il PEG è inanellato con -Ciclodestrine e funzionalizzato all’estremità con
Folato. Il copolimero è stato preparato secondo lo schema di reazione mostrato
in Figura 1.12.

Figura 1.12: Steps di sintesi per la realizzazione del copolimero Fol-PEG-PCL

Questa procedura sintetica rappresenta un’innovazione poiché in letteratura


sono riportati diversi esempi di polirotassani basati su PEG e ciclodestrine con
End Caps identici, mentre non sono riportati, a tutt’oggi, esempi di

21
polirotassani con due diversi End Caps24,25,26 Sono state successivamente
realizzate e caratterizzate NP, a partire da questi polirotassani in miscela con
un copolimero mPEG1000/PCL4000 secondo protocolli di formulazione
precedentemente messi a punto presso i laboratori Drug Delivery del
Dipartimento di Farmacia dell’Università di Napoli Federico II (prof. Fabiana
Quaglia).

24A. Harada, J. Li, Kamachi, Preparation and Properties of Inclusion Complexes of Poly (ethylene glycol) with a-
Cyclodextrin. Macromolecules, 1993, 26; 5698-5703
25J. Araki, K. Ito, Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their applications

to soft materials. Soft Matter. 2007;3, 1456-1473


26T. Ooya, N. Yui, Synthesis and characterization of biodegradable polyrotaxane as a novel supramolecular-

structured drug carrier. J. Biomater. Sci. Polymer Edn., 1997; 6, 437-455

22
Capitolo 2

Materiali e Metodi

2.1 Materiali

Il monometossi-poli(etilenglicole), CH3O-PEG-OH, Mw=1000 Da (mPEG1k,


Nanocs Inc., New York, USA) è stato disidratato mediante distillazione
azeotropica con Toluene anidro utilizzando una trappola Dean-Stark. L’-
ciclodestrina (CD), il poli(etilenglicole), HO-PEG-OH, Mw=1500 Da
(PEG1.5k) e tutti gli altri reagenti elencati in seguito sono stati acquistati da
Sigma-Aldrich (Milano, Italia). -caprolattone (CL) è stato distillato su CaH2
sotto vuoto. Ossido d’argento (Ag2O), stagno-(2-etilesanoato)2 (Sn(oct)2),
cloruro di tosile (TsCl), 3,5-dimetil-fenolo (Fen), acido folico (Fol), ioduro di
potassio (KI), idruro di sodio (NaH), trietilammina (NEt3), sodio azide (NaN3)
e solfato di sodio anidro (Na2SO4) sono stati usati senza nessuna purificazione
preliminare. 3-butin-1-olo è stato anidrificato per passaggio su gel di silice. Il
rame in fili (Carlo Erba, Milano, Italia) è stato trattato con H2SO4 per 3 minuti
prima della reazione, successivamente sono stati eseguiti 3 lavaggi con acqua
distillata seguiti da altrettanti in metanolo. Dopo i lavaggi il rame è stato
seccato sotto vuoto in stufa a 60°C per 30 minuti.

2.2 Sintesi dei precursori

2.2.1 Sintesi di butinil-PCL

Il butinil-PCL è stato preparato mediante “Ring-Opening Polymerization”


(ROP). In un pallone sono stati aggiunti 4,87g (42.7 mmol) di CL, 124.7mg
(1.78mmol) di 3-butin-1-olo come iniziatore e 197.7mg (0.356mmol) di
Sn(oct)2 come catalizzatore (20% in moli) la reazione è stata condotta a 120°C
per 24h in atmosfera controllata di Ar. Il rapporto molare tra iniziatore e CL è
35. Resa della reazione 99.6%. 1H-NMR (CDCD3, δ in ppm), 1.38-1.64 (m);

23
2.30-2.52(t); 3.64(t); 4.06-4.18 (t). Mn determinato mediante 1H-NMR= 4168
Da.

2.2.2 Sintesi di -tosil--ossidrile-PEG (TsO-PEG-OH)

In un pallone, contenente 190 mL di toluene anidro, sotto flusso di argon, sono


stati sciolti 15g (10mmol) di HO-PEG-OH. In seguito sono stati aggiunti alla
soluzione in sequenza: 3.48g (15mmol) di ossido d’argento (Ag2O), 0.428g
(2mmol) di ioduro di potassio (KI) e dopo circa 5 minuti sono stati aggiunti
2.002g (10.5mmol) di cloruro di tosile (TsCl). La reazione è posta sotto
vigorosa agitazione per tutta la notte a 25°C sotto atmosfera controllata di Ar.
La soluzione così ottenuta è stata filtrata su una colonna a filtro sinterizzato
con celite. Dopo filtrazione, il solvente è stato allontanato al rotovapor. Il
grezzo di reazione è stato quindi sciolto nella minima quantità di cloroformio
(CHCl3) e precipitato in n-esano freddo. Il prodotto è stato filtrato e posto ad
essiccare sotto vuoto per tutta la notte. Resa della reazione 95.5%. 1H-NMR
(d6-DMSO, δ in ppm), 2.4(s); 3.48(m); 4.1(t); 4.55(t) 7.5-7.55(d).

2.2.3 Sintesi di -azido--ossidrile PEG (N3-PEG-OH)

In un pallone, contenente 30 mL di DMF anidra, sotto flusso di argon, sono


stati sciolti 2.0g (1.25mmol) di TsO-PEG-OH. In seguito sono stati aggiunti
alla soluzione 0.405g (6.23 mmol) di sodio azide (NaN3). La reazione è stata
condotta a 90°C, sotto vigorosa agitazione, per tutta la notte in atmosfera
controllata di Ar. Al termine della reazione il solvente è stato allontanato al
rotovapor e il grezzo di reazione così ottenuto è stato sciolto in diclorometano
(DCM). È stata quindi eseguita un’estrazione liquido-liquido tre volte con
brine (soluzione acquosa sovrasatura di NaCl) e successivamente altrettante
con H2O (milliQ). La fase organica è stata quindi anidrificata su solfato di
sodio anidro (Na2SO4) e concentrata al rotovapor. Il prodotto è stato
precipitato in n-esano freddo, filtrato e posto ad essiccare sotto vuoto per tutta
la notte. Resa della reazione 65.5%. 1H NMR (d6-DMSO, δ in ppm), 4.56 (t)

24
3.2 (t) 3.5 (s), 3.4 (t). Banda diagnostica FTIR 2105 cm-1 relativa allo
stretching del gruppo azide.

2.2.4 Sintesi di -tosil--azido-PEG (TsO-PEG-N3)

In un pallone, contenente 15mL di THF anidro, sotto flusso di argon, sono


stati sciolti 1,2g (0.8mmol) di N3-PEG-OH. In seguito sono stati aggiunti alla
soluzione in sequenza: 274 µL (2.0 mmol) di trietilammina (NEt3) e 375 mg
(2.0 mmol) di TsCl. La reazione è stata condotta a 25°C, sotto vigorosa
agitazione, per 24h in atmosfera controllata di Ar. La soluzione così ottenuta è
stata prima filtrata su carta, concentrata al rotovapor e in seguito precipitata in
n-esano freddo. Dopo l’allontanamento dell’esano, il prodotto è stato essiccato
sotto vuoto per tutta la notte. Resa della reazione 87.5%. 1H NMR (d6-DMSO,
δ in ppm), 3.1-3.48 (m); 4.1-4.2 (t); 5.5-7.8(t).

2.3 Sintesi di mPEG1000-PCL4000

Il copolimero lineare diblocco è stato preparato mediante Ring-Opening


polymerization (ROP). In un pallone sono stati aggiunti 4,87g (42.7 mmol) di
CL, 952mg (1,22mmol) di CH3-PEG-OH come iniziatore e 98.8mg (0.244
mmol) di Sn(Oct)2 come catalizzatore (20% in moli). Il rapporto molare tra
iniziatore e CL è 36. Resa della reazione 99.6%. 1H-NMR (CDCD3, δ in ppm),
blocco PCL: 1.4-1.65(m), 2.35(t), 4.05(m); blocco PEG: 3.35(t), 3.65(s). Mn
determinato mediante 1H-NMR = 5160 Da

2.4 Sintesi del copolimero PEG-PCL funzionalizzato con Folato (Fol-


PEG-PCL)

L’acido folico è stato previamente trattato con NaH. 244mg (0.66 mmol) di
Fol sono stati disciolti in un pallone contenente 3mL di DMSO, sono stati
aggiunti 20mg (0.92mmol) di NaH sotto flusso di Ar a 45°C. La reazione è
stata condotta fino alla completa evoluzione di H2.

25
In un secondo pallone, contenente 3mL di DMSO, sono stati disciolti 100mg
di copolimero TsO-PEG-PCL sotto flusso di Ar a 45°C. Dopo completa
dissoluzione, la soluzione di Folato è stata aggiunta, goccia a goccia, al
pallone contenente il copolimero. La reazione è condotta a 45°C sotto vigorosa
agitazione (600 rpm) per 24h in atmosfera controllata di Ar. La soluzione è
stata trasferita in una membrana di dialisi (cut-off della membrana: 2000 Da),
ed immersa per 2 settimane in un becker contenente DMSO a temperatura
ambiente. Il DMSO è stato sostituito con solvente fresco ogni due giorni.
Dopo due settimane la soluzione è stata recuperata dalla membrana, il solvente
è stato allontanato sotto flusso di N2 ed il prodotto recuperato è stato in fine
essiccato sotto vuoto per tutta la notte. Resa della reazione 91%. Grado di
funzionalizzazione del Folato 90% valutato tramite UV. 1H-NMR (CDCl3, δ
in ppm): 3.6 (2H, t), 3.5 (127H, s, blocco PEG), 3.4 (2H, t), 1.29–1.78 (139H,
m blocco PCL); 2.19–2.43 (82H, m), 3.92–4.21 (82H, t), 4.31 (2H, t); Analisi
elementare Teorica: C% 59.99; H% 8.55; (O+N) % 31.44. Sperimentale: C%
56.8; H% 8.8; (O+N) % 34.4.

2.5 Preparazione dello pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-N3

In un pallone, contenenti 80mL di H2O (MilliQ), sono stati sciolti, sotto


vigorosa agitazione magnetica (600 rpm), 10.2g (10.5mmol) di CD a
temperatura ambiente in atmosfera di argon per 20 minuti. La soluzione così
ottenuta di CD è stata versata in un secondo pallone contenente una
soluzione di 1.0g (0. 55 mmol) di TsO-PEG(CD)-N3 in 40mL di H20
(MilliQ) (concentrazione di CD nella soluzione finale: 8% in peso) Dopo 30
minuti si osserva la formazione di un precipitato bianco (complesso di
inclusione tra CD e PEG). La soluzione è stata lasciata sotto agitazione per
tutta la notte a temperatura ambiente. Il solvente è quindi stato allontanato
sotto flusso di N2 a 40°C per circa 4h. Il prodotto così ottenuto è stato messo
in stufa a 40°C sotto vuoto per eliminare l’acqua residua

26
2.6 Sintesi dei rotassani Fol-PEG(CD)-PCL

2.6.1 Sintesi del rotassano Fol-PEG(CD)-PCL mediante reazione di


End Capping “One-Step” (R1)

L’acido folico è stato previamente attivato per trattamento con NaH come
descritto nel parag. 2.2.5. In un secondo pallone, contenente 3mL di DMSO,
sono stati disciolti 100mg di pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-N3 sotto
flusso di Ar a 45°C. Sono stati di seguito aggiunti sotto agitazione 230mg di
Cu e 304mg (0.08 mmol) di butinil-PCL. I calcoli stechiometrici sono stati
eseguiti ipotizzando un grado di ricoprimento del 100% (CD/PEG 17/1 in
mol). Dopo completa dissoluzione, l’acido folico attivato è stato aggiunto,
goccia a goccia, al pallone contenente lo pseudo-rotassano. La reazione è stata
condotta a 45°C sotto vigorosa agitazione per 48h. Dopo l’allontanamento
manuale del Cu, la soluzione è stata trasferita in una membrana di dialisi (cut-
off della membrane: 2000 Da), la membrana è stata quindi immersa per 2
settimane in un becker contenente DMSO a temperatura ambiente. Il DMSO è
stato sostituito con solvente fresco ogni due giorni. Dopo due settimane la
soluzione è stata recuperata dalla membrana, il solvente è stato evaporato sotto
flusso di N2 ed il prodotto recuperato è stato in fine essiccato sotto vuoto per
tutta la notte. Resa della reazione 58.3%. Grado di funzionalizzazione del
Folato 94%. Analisi Elementare: Teorica (calcolata in base al numero di CD
per catena di PEG determinato mediante NMR): C% 61.99; H% 8.79; (O+N)
% 29.21. Sperimentale: C% 60.7; H% 8.7; (O+N) % 30.06. 1H-NMR (d6-
DMSO, T 40°C, δ in ppm); blocco PCL: 1.3-1.5(t), 2.2(t), 4.1(t); blocco PEG:
3.25(s) 3.51(s); CD: 5.5(d), 5.35(s), 5.1(s), 4.6(m), 3.8(m), 3.65(m), 3.55(m),
3.39(m)

27
2.6.2 Sintesi del rotassano Fol-PEG(CD)-PCL mediante reazione di End
Capping “Two Steps” (R2)

In un pallone contenente 5mL di DMSO sono sciolti 100 mg di pseudo-


rotassano TsO-PEG(CD)-N3 a 45°C in atmosfera di Ar. Sono stati quindi
aggiunti 230mg di Cu e 304mg (0.07mmol) di butinil-PCL. La reazione è stata
condotta per 48h. La soluzione è stata concentrata al rotovapor e quindi il
prodotto essiccato sotto vuoto per tutta la notte. Prima di proseguire con lo
step successivo, l’esito della reazione di “click” è stato verificato mediante
FTIR. In un pallone, contenente 3mL di DMSO, è stato sciolto il TsO-
PEG(CD)-PCL a 45°C sotto atmosfera di Ar. Sono stati quindi aggiunti,
goccia a goccia, 5mL di soluzione di DMSO contenente 244mg (0.55mmol) di
Fol (preventivamente attivati con 20mg (0.87mmol) di NaH come descritto nel
par. 2.4.1). La reazione è stata condotta per altre 48h a 45°C. Il rotassano
finale è stato purificato mediante dialisi seguendo la stessa procedura seguita
per R1 descritta nel parag. 2.4.1. Resa della reazione 57.3%. Grado di
funzionalizzazione del Folato 19%. Analisi Elementare: Teorica (calcolata in
base al numero di CD per catena di PEG determinato mediante NMR): C%
62.02; H% 8.80%; (O+N)% 29.18; Sperimentale: C% 62.9: H% 9.1; (O+N)%
28.0. 1H-NMR (d6-DMSO, δ in ppm): blocco PCL 1.29(t), 1.58(t), 2.24(m),
3.98(t); blocco PEG 2.49(s) 3.23(s) 3.51(m); CD: 5.5(d), 5.35(s), 5.1(s),
4.6(m), 3.8(m), 3.65(m), 3.55(m), 3.39(m)

28
2.7 Caratterizzazione dei copolimeri

2.7.1 Spettroscopia FTIR

L'analisi FTIR (Infrarossi a Trasformata di Fourier) è stata eseguita con uno


spettrometro Perkin-Elmer (Paragon 500) dotato di un accessorio di cristallo a
riflettanza totale attenuato (ATR) ZnSe. I campioni sono stati posti a diretto
contatto con il cristallo ATR e pressati con una pinza a pressione posizionata
sopra l'area del cristallo/campione per consentire un contatto intimo tra il
materiale e il cristallo. Gli spettri sono stati acquisiti nell'intervallo 4000-400
cm-1, con una risoluzione di 2 cm-1 (media di 20 scansioni).

2.7.2 Analisi GPC

Le analisi di cromatografia a permeazione di gel (GPC) sono state eseguite in


THF a 35°C e una velocità di flusso di 0,8 ml/min con un array di rivelatori a
quadruplo GPC MAX/TDA 305 di Malvern-Viscotek, utilizzando una
precolonna e due colonne Phenogel (Phenomenex, USA) con limiti di
esclusione rispetivamente 106 e 103. I Campioni (100μl) sono stati filtrati
attraverso un filtro a membrana in PTFE da 0,22 μm prima dell'iniezione. La
calibrazione in punto triplo è stata basata su uno standard di polistirene con
peso molecolare di 104.959 Da.

2.7.3 Spettroscopia 1H-NMR

Gli spettri 1H-NMR sono stati ottenuti su uno spettrometro Bruker DRX-400
utilizzando tubi da 5 mm. Le concentrazioni del campione erano circa dello
0,7% (peso/volume). Tutti gli spettri sono stati misurati con 16 accumuli e un
ritardo di riciclo di 10s.

2.7.4 Spettroscopia 2D-DOSY

L’effettivo successo della reazione di sintesi dei rotassani è stata determinata


utilizzando la spettroscopia NMR basata sulla Diffusione (DOSY). Gli
esperimenti DOSY sono stati condotti a 25°C per R2 e a 40°C per R1 su uno

29
spettrometro Bruker DRX-600 equipaggiato con un cryo-probe. Tutti gli
esperimenti sono stati eseguiti utilizzando un D1 tenuto fisso a 10s. 2mg di
ciascun rotassano sono stati disciolti in 600 L di d6-DMSO. La sequenza di
impulsi della libreria Bruker, che incorpora la coppia di impulsi del gradiente
bipolare e 1 gradiente di scarto, con un ritardo del campo elettrico
longitudinale, è stata eseguita con gradiente lineare (5,35 G cm1) a gradini tra
2,0% e 95,0%, incrementati in 32 steps. La durata del gradiente () è stata
mantenuta costante a 2 ms e il ritardo di eco () a 200 ms.

2.7.5 Analisi DSC

L'analisi di Calorimetria a Scansione Differenziale (DSC) è stata eseguita su


un calorimetro Mettler 30 sotto flusso di azoto con una velocità di scansione di
2°C/min. Il campione (circa 4 mg) sigillato in un crogiolo di alluminio è stato
riscaldato da -20 a 90°C, raffreddato a -20°C e infine riscaldato nuovamente a
90°C.

2.7.6 Analisi TGA

L'analisi termogravimetrica (TGA) è stata eseguita su un apparecchio Perkin-


Elmer Pyris Diamond TG-DTA da 25 a 500°C sotto flusso di azoto (50
ml/min) a velocità di riscaldamento di 10°C/min.

2.7.7 Diffrazione dei RaggiX

I profili di diffrazione dei raggiX da polveri sono stati ottenuti a temperatura


ambiente con la radiazione di CuKa filtrata da Ni utilizzando un diffrattometro
automatico X-Pert di Panalytical.

2.7.8 Microscopia Ottica

La microscopia ottica in luce polarizzata è stata eseguita con un microscopio


Axioscop-Zeiss dotato di fornetto THMS 600 e di un programmatore di
temperatura Linkam TMS 91.

30
2.7.9 Spettroscopia UV-Vis

Il grado di funzionalizzazione del Fol è stato determinato mediante


spettroscopia UV-Vis su soluzioni di copolimero in DMSO (0,2-2 mg/ml),
utilizzando soluzioni standard di Fol in DMSO per la costruzione delle curve
di calibrazione. L'assorbanza del campione è stata valutata a 360 nm su uno
spettrofotometro Shimadzu 1800.

2.7.10 Analisi Elementare

La composizione dei rotassani sintetizzati è stata valutata mediante analisi


elementare con un analizzatore LECO ITALY Modello 840. Il campione
solido (circa 20-30 mg) è inserito in dei vessel in ceramica e attraverso un
braccio robotizzato è inserito in un forno a 950°C alimentato da ossigeno. In
seguito a combustione della sostanza organica si forma:
 anidride carbonica che viene rilevata e quantificata da un rivelatore
NDIR, in modo da valutare la quantità di carbonio totale (TC);
 acqua e ossidi di azoto che vengono convogliati su un catalizzatore a
base di rame, alla temperatura di 650°C dove vengono convertiti in
idrogeno e azoto elementare che vengono rilevati e quantificati da un
detector TCD.

2.8 Preparazione e caratterizzazione delle nanoparticelle

Le NP non funzionalizzate sono state preparate con mPEG-PCL mentre le NP


funzionalizzate con Folato (Fol-NP) sono state preparate con una miscela di
mPEG-PCL con R1 (10 e 20% in peso, rispettivamente Fol-NP10 e Fol-
NP20).

Le NP e Fol-NP sono state preparate con la tecnica della nanoprecipitazione.


Nel caso delle NP, il copolimero è stato sciolto in una fase organica (10 mg di
copolimero in 1 mL di acetone) successivamente aggiunta goccia a goccia in
acqua (milliQ, 4 mL) sotto agitazione magnetica (300 rpm).

31
Nel caso di Fol-NP, è stata utilizzata una soluzione THF/DMSO 1/1 v/v come
fase organica aggiunta goccia a goccia in acqua (milliQ), mantenendo lo stesso
rapporto copolimero totale/solvente organico/acqua.

Dopo l’allontanamento del solvente organico (acetone o THF) per


evaporazione all’aria sotto agitazione, le NP sono state filtrate attraverso filtri
Phenex® da 0,45 μm (Phenomenex, USA), mentre le Fol-NP sono state
dializzate contro acqua prima della filtrazione per rimuovere il DMSO. Le NP
sono state congelate in N2 liquido e liofilizzate (Christ Alpha 2-4 LSCplus,
Germania) dopo l'aggiunta di 2-idrossipropil--ciclodestrina (HPβCD) come
crioprotettore (il rapporto polimero:HPβCD è 1:10 in peso). Le Fol-NP
possono essere liofilizzate senza l'ausilio di alcun crioprotettore. Le
nanoparticelle recuperate sono state conservate a 4°C. La resa di recupero è
stata valutata pesando il residuo solido dopo la liofilizzazione in assenza di
crioprotettore ed è risultata maggiore del 99% per le 3 formulazioni.

Il diametro idrodinamico (DH), l'indice di polidispersività (PdI) e il potenziale


zeta (ξ) delle nanoparticelle a base PEG-PCL sono stati determinati su
Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments Ltd). Temperatura di acquisizione
dati 25° C. La percentuale di PEG superficiale sulle NP e la percentuale di
PEG e CD in superficie sulle Fol-NP è stata calcolata mediante spettroscopia
1
H-NMR. Per il calcolo della percentuale di PEG esposto sulla superficie delle
NP, l’integrale del picco dell’unità ripetitiva (-CH2-CH2-) del PEG a 3.6 ppm
delle NP formulate in D2O è stato rapportato all’integrale del picco
corrispettivo in CDCl3 a 3.5ppm. Per calcolare la percentuale di CD invece,
l’integrale del picco del protone anomerico (H1) delle CD a 4.9 ppm in D2O
è stato rapportato all’integrale del picco omologo in CDCl3 a 5.0 ppm.

32
Capitolo 3

Risultati e discussioni

3.1 Sintesi di butinil-PCL

Come ampiamente riportato in letteratura27, il metodo di sintesi più comune


utilizzato per ottenere il PCL è la polimerizzazione in massa mediante Ring
Opening Polymerization (ROP) dell’-Caprolattone (CL) ad opera di un
gruppo alcolico catalizzata da Sn(oct)2. Il peso molecolare del PCL dipende
dalla quantità di monomero introdotto rispetto all’iniziatore. Studi recenti
concordano nel ritenere che lo Sn(oct)2 non sia l’effettivo catalizzatore, ma
che tale funzione sia espletata da uno stagno(alcossido) che si forma mediante
reazione di interscambio tra i gruppi etilesanoato e i gruppi –OH dell’alcol. La
polimerizzazione avviene per inserzione di molecole di CL nel legame
metallo-ossigeno e presenta le tipiche caratteristiche di una polimerizzazione
vivente28,29. Per questo lavoro di tesi è stato scelto come iniziatore il 3-butin-1-
olo che in seguito all’aggiunta del catalizzatore darà inizio alla crescita del
segmento PCL, allo scopo di introdurre un gruppo alchino per la successiva
reazione di click (Figura 3.1).

Figura 3.1: Polimerizzazione del -CL, partendo da 3-butin-1-olo come iniziatore, mediante ROP

27Quaglia F., Vignola M.C., De Rosa G., La Rotonda M.I., Maglio G., Palumbo R. Journal Of Controlled
Release. vol. 83 pp. 263-71
28A. Kowalski, A. Duda, S. Penczek, Macromol., 33, 7359-7370, 2000
29K. Wegrzyn, T. Stephan, R. Low, R. B. Grubbs, J. Polym. Sci, 43, 2977, 2005.

33
Lo spettro 1H-NMR ha consentito di valutare l’effettivo successo della
reazione poiché presenta i picchi caratteristici del PCL e sono ben visibili i
picchi relativi ai protoni del terminale alchino (1.38-1.64 (m); 2.30-2.52(t);
3.64(t); 4.06-4.18 (t)) (Figura 3.2). Dallo spettro è stato inoltre possibile
calcolare il valore di Mn del polimero che risulta essere 4168 Da. Il peso del
polimero è stato ottenuto calcolando il rapporto tra l’integrale del tripletto a
3.64ppm del CH2 in posizione f con quello del tripletto a 4.06-4.18 ppm del
CH2 in posizione e dell’unità ripetitiva del PCL.

Figura 3.2: Spettro 1H-NMR di butinil-PCL4k

34
3.2 Sintesi di -tosil--ossidrile-PEG (TsO-PEG-OH)

Per realizzare il copolimero Fol-PEG-PCL si è partiti da un PEG con estremità


etero-funzionalizzate. Per ottenere tale prodotto è stata utilizzata una strategia
sintetica riportata in letteratura30 che prevede la modifica selettiva dei gruppi
terminali del PEG diolo commerciale (HO-PEG-OH) rispettivamente in –OTs
(tosile) e -N3 (azido). Il primo step sintetico riguarda la sintesi di PEG
monotosile (TsO-PEG-OH). Il gruppo tosilato è noto come buon substrato per
le reazioni di sostituzione nucleofila. La sua proprietà di buon gruppo uscente
consente la conversione delle estremità tosilate in diversi gruppi funzionali.
Quindi, funzionalizzare una delle estremità delle catene di PEG con un
tosilato, ha permesso la preparazione di una serie di derivati PEG
eterofunzionali utilizzando come precursore PEG α-tosil-ω-ossidrile.

Come riportato in letteratura31, la modifica selettiva di un solo –OH terminale


è possibile utilizzando ossido di argento e una quantità catalitica di ioduro di
potassio. La sintesi è stata eseguita secondo lo schema riportato in Figura 3.3
partendo da PEG diolo (Mn 1500 Da) preventivamente anidrificato mediante
distillazione azeotropica in Toluene usando una trappola Dean-Stark. Il
PEG1500 è stato inoltre scelto in quanto dati di letteratura riportano il miglior
grado di ricoprimento con -ciclodestrine32.

Figura 3.3: Schema di sintesi di -tosil--ossidrile-PEG

30Wu, Y.; Ahlberg, P. Preparation of 4,4-dimethoxybutyl iodide from 1,4-butanediol via the corresponding
tosylate. J. Org. Chem. 1994, 59, 5076–5077.
31Bouzide, A.; Sauvé, G. Silver (I) oxide mediated highly selective monotosylation of symmetrical diols.

Application to the synthesis of polysubstituted cyclic ethers. Org. Lett. 2002, 4, 2329–2332.
32A. Harada, J. Li, Kamachi, Preparation and Properties of Inclusion Complexes of Poly(ethylene glycol) with a-

Cyclodextrin. Macromolecules, 1993, 26; 5698-5703

35
La funzionalizzazione selettiva, che porta all'α-tosil-ω-idrossil-PEG è stata
valutata mediante 1H-NMR in dimetilsolfossido deuterato (d6-DMSO). Lo
spettro (Figura 3.4) mostra un tripletto a 4.55 ppm corrispondente ai protoni
ossidrilici, che non si sposta o si amplia con la variazione della
concentrazione, ben separato dal picco dello scheletro del PEG, il cui integrale
corrisponde al rapporto teorico sia con gli integrali dei protoni aromatici (7.7-
7.5 ppm) sia con il CH3 del tosile (2.4 ppm) e con il CH2 in alfa al tosile (4.1
ppm).

Il grado di funzionalizzazione è risultato essere quasi identico al teorico


previsto (≈99%).

Figura 3.4: Spettro 1H-NMR di TsO-PEG-OH con ingrandimenti sul tripletto relativo al gruppo ossidrile a
chemical shift 4,55ppm e sui tripletti aromatici del tosile

Confrontando i cromatogrammi GPC del PEG diolo e del prodotto ottenuto


(Figura 3.5), è evidente che i due picchi hanno tempi di ritenzione simili,
come previsto.

36
Figura 3.5: Picchi cromatografici sovrapposti; linea tratteggiata: PEG diolo; linea continua:PEG monotosile

3.3 Sintesi di -azido--ossidrile PEG (N3-PEG-OH)

La sintesi di -azido--ossidrile PEG ha previsto la trasformazione del


terminale Tosile del TsO-PEG-OH (descritto nel paragrafo precedente) in
terminale azidico -N3 per reazione con un eccesso di sodio azide (NaN3) in
dimetilformammide (DMF). In questo modo si è introdotta la funzione azidica
mediante sostituzione nucleofila, la cui driving force è la natura di buon
gruppo uscente del gruppo Tosilato. Lo schema di sintesi è riportato in Figura
3.6.

Figura 3.6: Schema di sintesi del HO-PEG-N3

I PEG funzionalizzati con azide hanno riscontrato una considerevole


attenzione nel campo biomedicale, in particolare per la reazione di
cicloaddizione 1,3-dipolare azido-alchino catalizzata da rame (I) ("click
chemistry"). A causa della sua specificità, del rendimento quantitativo e della
buona tolleranza del gruppo funzionale, questo tipo di chimica è risultata

37
essere un ottimo approccio per la pegilazione in condizioni blande di
nanoparticelle33,34. L'introduzione della funzione azidica è stata confermata
mediante FTIR (Figura 3.7).

Figura 3.7: Spettri IR in sovrapposizione: HO-PEG-N3 (verde) e HO-PEG-OH (rosso;) è evidenziata la


banda di assorbimento dell’Azide a 2105cm-1

Nello spettro IR è evidenziata la banda di assorbimento caratteristica del


gruppo azidico a 2105cm-1 chiaramente assente nello spettro di assorbimento
di un PEG-diolo usato come riferimento.

33Codelli,J.A.; Baskin, J.M.; Agard, N.J.; Bertozzi, C.R. Second-generation difluorinated cyclo octynes for
copper-free click chemistry. J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 11486–11493.
34Chen, X.; Thomas, J.; Gangopadhyay, P.; Norwood, R.A.; Peyghambarian, N.; McGrath, B.V. Modification of
symmetrically substituted phthalocyanines using click chemistry: Phthalocyanine nanostructures by nanoimprint
lithography. J. Am. Chem. Soc. 2009, 131, 13840–13843

38
La conversione quantitativa del gruppo tosile è stata valutata tramite 1H-NMR
(Figura 3.8). Dallo spettro infatti, è possibile notare la scomparsa dei protoni
aromatici del gruppo tosile (sia libero che legato), sinonimo inoltre, di una
buona purificazione del prodotto.

Figura 3.8: spettro 1H-NMR di HO-PEG-N3

3.4 Sintesi di -tosil--azido-PEG (TsO-PEG-N3)

La sintesi di -tosil--azido-PEG (TsO-PEG-N3), rappresenta l’ultimo step di


preparazione per la sintesi dei copolimeri anfifilici a blocchi che andranno a
far parte delle NP per il Drug Delivery. Esso infatti, mediante opportune
modifiche, sarà trasformato dapprima in pseudo-rotassano, per reazione di
inanellamento con -Ciclodestrine, e di conseguenza trasformato in rotassano
tramite l’utilizzo di butinil-PCL e Acido Folico come opportuni End Cap alle
estremità etero-funzionalizzate del PEG, consentendo l’utilizzo di queste NP a
base PEG-PCL per il targeting attivo.

39
La sintesi del TsO-PEG-N3 è descritta in Figura 3.9.

Figura 3.9: schema di sintesi di TsO-PEG-N3

Per reazione di HO-PEG-N3 con Cloruro di Tosile (TsCl) in presenza di trietil


ammina (NEt3), si ottiene il PEG etero-difunzionale. Per questa reazione,
l’utilizzo di una base è necessario per migliorarne la resa, inoltre è possibile
osservare nel corso della sintesi la graduale formazione di un precipitato
bianco, un sale di ammonio insolubile in THF e facilmente separabile dal
1
prodotto. Mediante analisi dello spettro H-NMR in d6-DMSO è stata
confermata la presenza del gruppo tosilato legato al substrato e la completa
assenza di sottoprodotti, a conferma della corretta purificazione del prodotto
(Figura 3.10).

Figura 3.10: Spettro 1H-NMR di Ts-PEG-N3

40
3.5 Preparazione del complesso di inclusione TsO-PEG-N3 con CD:
pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-N3

Il complesso di inclusione di TsO-PEG-N3 con CD è formato


spontaneamente dalla semplice miscelazione in acqua distillata dei due
componenti dando così il cosiddetto pseudo-rotassano (Figura 3.11).

Figura 3.11: Formazione del complesso di inclusione PEG/CD (pseudo-rotassano)

In questa fase di sintesi, non è stato possibile eseguire nessuna verifica


sperimentale che confermasse la presenza del complesso di inclusione poiché
disciogliere il prodotto, in qualsiasi solvente, avrebbe portato alla separazione
delle CD dallo strand polimerico di PEG come confermato da dati di
letteratura35. Il prodotto è stato recuperato per semplice allontanamento del
solvente.

3.6 Preparazione dei rotassani

I rotassani sono stati preparati dai rispettivi pseudo-rotassani eseguendo una


procedura in due steps (“two pot”). Il TsO-PEG(CD)-N3 è stato infatti prima
isolato mediante evaporazione dell’acqua, e successivamente ridisciolto in
DMSO per le reazioni successive di End-Capping. In tutti i lavori scientifici
viene usato un PEG pseudo-polirotassano --omo-difunzionale come
precursore. Quindi, molecole o gruppi voluminosi identici, che agiscono da
stopper fisici, sono legati alle estremità del PEG-rotassano attraverso una
pletora di reazioni (come ad esempio reazioni di sostituzione nucleofila o

35
Tiejun Zhao and Haskell W. Beckham. Direct Synthesis of Cyclodextrin-Rotaxanated Poly(ethylene glycol)s
and Their Self-Diffusion Behavior in Dilute Solution. Macromolecules 2003, 36, 9859-9865

41
reazioni di condensazione)36. In questo lavoro di tesi è stato realizzato per la
prima volta un PEG-rotassano con due stopper diversi alle estremità, a partire
dal PEG etero-difunzionale descritto in precedenza (par. 3.4).

3.6.1 Reazione di End Capping: TsO-PEG(CD)-N3 e butinil-PCL


(reazione di “click”)

La prima reazione di End Capping eseguita sullo pseudo-rotassano ha previsto


l’accoppiamento del butinil-PCL al gruppo terminale -azido del
PEG(Figura3.12).

Figura 3.12: Reazione di click tra blocco PEG e blocco PCL

L’accoppiamento dei due residui polimerici è stato eseguito mediante la


reazione di cicloaddizione di Huisgen[3+2] catalizzata da rame(I). Questa è
una cicloaddizione 1,3-dipolare tra un azide e un alchino terminale, o interno,
per formare un 1,2,3-triazolo, come mostrato in Figura 3.12, e si colloca, per
la sua importanza pionieristica, come capostipite delle reazioni di “click
chemistry”37. Sono diversi i riferimenti in letteratura che prevedono l’uso di
questa reazione come soluzione ideale e versatile per il problema
dell’efficiente chiusura dei polirotassani a base di CD38,39.

361.Araki,J. & Ito, K. Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their
applications to soft materials. Soft Matter 3, 1456 (2007).
37
R.Huisgen, W.Mack, E. Anneser 1.3-Dipolar Additionen der Nitriloxyde an Cs-Doppelbindungen, Angewandte
Chemie,73 issue 19 (1961)
38A. Harada and M. Kamachi, Macromolecules, 1995, 28, 8406.
39N. Kihara, K. Hinoue and T. Takata, Macromolecules, 2005, 38, 223.

42
Potrebbe essere previsto un possibile coinvolgimento del PCL nella
formazione di complessi di inclusione durante questa reazione dato che la
catena PCL è abbastanza sottile da adattarsi all’interno delle CD. Tuttavia, è
stato riportato che il PCL forma complessi di inclusione solo per pesi
molecolari inferiori a 3000 Da in condizioni di preparazione simili a quelle
utilizzate per questo lavoro40. Inoltre, per polimeri estremamente idrofobici
come il PCL, la cinetica di inserzione delle CD nel filamento PCL è lenta a tal
punto da rendere improbabile la complessazione. Quindi ne consegue che il
PCL con Mn di 4168 Da, utilizzato per questo lavoro, risulta essere uno
stopper efficiente, inoltre il metodo di purificazione utilizzato, la dialisi in
membrana con un opportuno cut-off per tempi molto lunghi, ha proprio lo
scopo di eliminare dal rotassano tutto ciò che non è “legato”.

E’ stata eseguita un analisi FTIR per verificare l’effettiva riuscita della


reazione di “click”. Dagli spettri ottenuti da polveri di TsO-PEG(CD)-PCL,
confrontati con spettri precedentemente ottenuti di TsO-PEG-N3, si evidenzia
la completa scomparsa del picco caratteristico della funzione azidica a 2105
cm-1, segno che la reazione è effettivamente avvenuta (Figura 3.13).

Figura 3.13: Spettri IR in sovrapposizione: TsO-PEG-N3(rosso) e TsO-PEG(CD)-PCL (viola); è evidenziata


la banda di assorbimento dell'Azide a 2105cm-1

40
L.Huang,E.allen,AE Tonelli, Study of the Inclusion Compounds Formed between a-Cyclodextrin and High
Molecular Weight Poly (ethylene oxide) and Poly (e-caprolactone), Polymer,1998,39, 4857-4865

43
3.6.2 Reazione di End Capping: sostituzione nucleofila di TsO-PEG(CD)-
PCL con Folato.

Il Folato è già descritto in letteratura come un efficiente stopper per prevenire


la fuoriuscita delle CD dalle catene di PEG41. In questo lavoro di tesi è stato
scelto di trattare la soluzione di Folato in DMSO con idruro di sodio (NaH) in
modo da rendere il gruppo amminico maggiormente nucleofilo e quindi
favorire il legame con PEG (Figura 3.14). La scelta di questa via operativa
risiede nell’escludere la possibilità di incorrere in reazioni che potrebbero
coinvolgere il gruppo carbossilico in  del Folato, responsabile del
riconoscimento da parte del recettore specifico presente sulle cellule tumorali,
influenzando negativamente l’endocitosi delle NPs.

Figura 3.14: Gruppo funzionale del Folato attivato da NaH.

Il Folato così attivato è stato di conseguenza messo a reagire con la soluzione


contenente lo pseudo-rotassano TsO-PEG(CD)-PCL. La reazione di
sostituzione nucleofila ha permesso, dopo 48 ore, di ottenere il rotassano
desiderato (la cosiddetta “site-selective complexation”)42 (Figura 3.15).

41L.R.Garcia,F.J.O.Espinar,A.L.Alvarez,J.B.Mendez, Cyclodextrin Based Rotaxanes, Polyrotaxanes and


Polypseudorotaxanes and their Biomedical Application, Current Topics in Medical Chemistry, 14,4,2014,478-
493
42
Gerhard Wenz, Bao-Hang Han, and Axel Muller. Cyclodextrin Rotaxanes and Polyrotaxanes. Chem. Rev. 106,
782817 (2006)

44
Figura 3.15: Sostituzione nucleofila del Tosile con Folato

La complessazione selettiva dei copolimeri a blocchi con CD si basa


solitamente su un’affinità diversa dei due blocchi verso la dimensione
dell’anello. Nel caso di copolimeri triblocco di PCL e PEG, è stato riscontrato,
in lavori precedenti, che sia il PCL che il PEG sono stati complessati da CD
perché non vi è alcuna preferenza per uno dei due blocchi43. Al contrario, la
strategia qui descritta consente una complessazione selettiva del blocco PEG
in copolimeri PEG-PCL non ottenibile altrimenti.

3.6.3 Reazione di End Capping: approccio “One step” e approccio “two


steps”

Sono inoltre stati perseguiti e confrontati due percorsi leggermente diversi per
le reazioni di End Capping. La differenza tra i due risiede sostanzialmente
nella scelta della sequenza delle reazioni.

Nell’approccio “One step” le reazioni di End Capping sono state eseguite


simultaneamente su entrambe le estremità del PEG (Rotassano R1),

43
L.Huang,E.allen,AE Tonelli, Study of the Inclusion Compounds Formed between a-Cyclodextrin and High
Molecular Weight Poly (ethylene oxide) and Poly (e-caprolactone), Polymer,1998,39, 4857-4865

45
aggiungendo contemporaneamente alla soluzione di TsO-PEG(CD)-N3 il
folato e il butinil-PCL/Cu.

Nell’approccio “Two steps” invece, le reazioni di End Capping sono state


eseguite in successione come descritte nei paragrafi precedenti (Rotassano
R2).

Particolarmente degna di nota è la buona resa riscontrata in entrambi i casi che


si attesta essere maggiore del 50%, significativamente più elevata rispetto a
quanto riportato in letteratura per la maggior parte dei polirotassani a base di
PEG, che risulta essere minore del 10%44.

L’analisi FTIR di entrambi i rotassani, R1 e R2, ottenuti nelle due metodologie


sopra descritte, ha evidenziato la completa scomparsa del picco a 2105 cm-1,
corrispondente alla vibrazione specifica del gruppo azidico, suggerendo che
tutti i gruppi -N3 hanno reagito completamente (Figura 3.16). I picchi
attribuibili alle CD (3350 e 1640 cm-1) sono visibili negli spettri FTIR, anche
se la loro intensità suggerisce un basso grado di complessazione.

Figura 3.16: sovrapposizione spettri IR: R1(rosso) e R2 celeste); sono evidenziate le bande relative alle
ciclodestrine (3350 e 1640 )cm-1; la banda a 2105cm-1 relativa all'assorbimento dell'azide è assente

44
J. Araki, K. Ito, Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their applications
to soft materials. Soft Matter. 2007;3, 1456-1473

46
Il grado di funzionalizzazione del Folato, determinato mediante spettroscopia
UV-Vis, è risultato essere molto diverso tra R1 e R2 (rispettivamente 94 e
19%). La differenza può essere imputata alla diversa reattività del gruppo
tosile sull’estremità del PEG nelle due sintesi. Quando le reazioni di End
Capping sono eseguite in sequenza (metodo “Two steps”), la sostituzione
nucleofila del tosile con il Folato può risultare poco efficace, probabilmente
perché il gruppo tosile del TsO-PEG(CD)-PCL è meno accessibile. Al
contrario, con il metodo “One step”, è stato ottenuto un alto grado di
funzionalizzazione poiché la sostituzione del gruppo tosile con il Folato
riguarda principalmente TsO-PEG(CD)-N3 libero.

La percentuale di funzionalizzazione con Folato di R1 e R2 ha un grande


impatto sulle proprietà di solubilità dei rotassani in diversi solventi organici
(Tabella 3.1).

Campioni Piridina Acetone N-metil THF Cloroformio DMSO THF:


Pirrolidone DMSO
1:1 v:v

R1 ✔ - - - - - ✔
R2 ✔ ✔ ✔ - ✔ ✔ ✔
Tabella 3.1: Solubilità dei rotassani R1 e R2 in diversi solventi organici a Tamb

I dati di solubilità sono stati raccolti anche a T= 40 °C; la solubilità dei due
rotassani rimane invariata in tutti i casi tranne che in DMSO, in cui R1 diviene
solubile. Come si può notare, al contrario di R1, il rotassano R2 conserva la
buona solubilità del copolimero precursore in diversi solventi. Questo fattore
influenza in grande misura la possibilità di acquisizione dei dati chimico-fisici.

47
3.7 Analisi GPC

L’analisi dei dati GPC ha permesso di approfondire la natura delle strutture


sintetizzate in laboratorio. Si può infatti discriminare, da un confronto dei
tempi di ritenzione del polimero e dell’CD analizzati in precedenza, se le
strutture sintetizzate siano effettivamente rotassani o pseudo-rotassani (i
secondi si disanellano in soluzione restituendo due tempi di ritenzione
diversi). I risultati ottenuti sul Fol-PEG-PCL e R2 sono riportati in Tabella
3.2. Di fatto, la scarsa solubilità di R1 ha impedito un’analisi affidabile.

Campioni a Mw (Da)b Mn (Da)c PDId

Fol-PEG-PCL 0.55 6737 5987 1.12


R2 0.66 8696 6354 1.36
Tabella 3.2: dati relativi alle analisi GPC; acostante di Mark-Howink; bpeso molecolare medio ponderale;
cpeso molecolare medio numerico; dindice di polidispersione

L’analisi dei dati GPC ha confermato che le CD formano un complesso con
il PEG in R2, poiché è stato rilevato un solo picco in corrispondenza del
copolimero. Inoltre l’aumento della costante Mark-Howink , è indicativo di
una conformazione semirigida delle catene di PEG nel complesso di
inclusione45. E’ stato riscontrato un aumento di Mw, in linea con la presenza
di CD su PEG. Tuttavia si deve ricordare che, secondo dati di letteratura, il
peso molecolare dei polirotassani non può essere correttamente determinato
dalla GPC poiché essi si comportano diversamente dagli standard
comunemente utilizzati in GPC a causa della loro morfologia rigid-rod.

3.8 Analisi spettroscopiche 1H-NMR e 2D-DOSY

La spettroscopia 1H-NMR è stata utilizzata per determinare il rapporto


PEG/CD in R1 e R2, sebbene non sia in grado di stabilire se il PEG sia
incluso o meno nel macrociclo. I segnali relativi al copolimero e alle CD

45M.A.Masuelli, Mark-Houwink Parameters for Aqueous-Soluble Polymers and Biopolymers at Various


Temperatures, Journal of Polymer and Biopolymer Physics Chemistry, 2014,vol.2,No.2,37-43

48
sono chiaramente visibili in entrambi gli spettri R1 e R2; l’assegnazione dei
picchi dei protoni CD in R1 è mostrata in Figura 3.17.

Figura 3.17: assegnazioni picchi relativi alle aCD nel rotassano R1

Sono stati rilevati dei lievi shifts nei picchi dell’CD nel complesso di
inclusione rispetto agli spettri di CD libera, in linea con quanto riportato in
letteratura46. Dal rapporto tra gli integrali del segnale dei protoni dell’unità -
CH2 della catena di PEG a 3.4 ppm e il segnale del protone anomerico H1 di
CD a 5.1 ppm, è stato calcolato il numero di CD (N) complessato per
catena di PEG secondo la formula:

N= [4DPPEG xA5.1(H1) /6xA3.4(H del PEG)]

dove DP è il grado di polimerizzazione del PEG.

46Z.Yan,A.Guo,L.Ye,A.Zhang,Z.Feng, The synthesis and characterization of a processable polyrotaxane-based


triblock copolymer via “two steps” strategy, RSC Advances,2016,6,33221

49
I dati ottenuti sono riportati in Tabella 3.3

CD/catena di CD/catena di % ricoprimentoc


PEG (mol/mol) a PEG (mol/mol) b

R1 17/1 1.6/1 11
R2 17/1 1.9/1 --
Tabella 3.3: rapporti CD/PEG nei rotassani R1 e R2; aRapporto nella soluzione iniziale (PEG è nella forma
TsO-PEG-N3); bRapporto nel rotassano determinato tramite 1H-NMR; cCalcolato assumendo un ricoprimento
del 100% corrispondente a 2 unità ripetitive per singola CD

La percentuale di ricoprimento è stata stimata assumendo che la


complessazione del 100% corrisponda al rapporto CD/unità di PEG = 1/2,
come riportato in letteratura47. Pertanto, il rapporto CD/PEG nella soluzione
di origine è esattamente lo stesso richiesto per un ricoprimento del 100% (17/1
CD/catena di PEG per Mw 1500 corrisponde a 1/2 CD/ unità di PEG). E’
stato calcolato un indice di ricoprimento di solo 11% in R1, molto al di sotto
di quello riportato con gli stopper tradizionali, come il 3,5-dimetilfenolo (c.ca
70%)48. Per quanto riguarda R2 invece il grado di ricoprimento non viene
riportato in quanto, come verrà evidenziato dal DOSY, le CD non sono
inanellate sulla catena di PEG.

Il livello di inanellamento in un polirotassano è limitato dalla competizione tra


la reazione di End Capping e la disgregazione del complesso di inclusione. In
effetti, la formazione del complesso di inclusione è generalmente un processo
reversibile. Poiché il DMSO è un buon solvente per il complesso di inclusione
CD/PEG e anche per le CD libere, si presume che possa avvenire una
fuoriuscita dei macrocicli dal PEG prima del completamento della reazione di
End Capping, ciò spiegherebbe il basso grado di ricoprimento ottenuto. Di
fatto, la formazione dei rotassani in soluzione di DMSO è abbastanza difficile
47Araki, J. & Ito, K. Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their
applications to soft materials. Soft Matter 3, 1456 (2007).
48Harada, A. Preparation and structures of supramolecules between cyclodextrins and polymers. Coord. Chem.

Rev. (1996) 0010-8545(95)01157-9

50
da ottenere. In alcuni lavori di letteratura infatti sono riportati valori del
rapporto CD/PEG in complessi di inclusione ottenuti in DMSO addirittura
inferiori o nulli49. Un grado di ricoprimento basso o nullo viene inoltre spesso
riportato in caso di peso molecolare del polimero superiore a 1000 Da, poiché
i segmenti inanellati di polimero si aggregano e precipitano prima che sia stato
raggiunto il ricoprimento desiderato.

Il DOSY è un metodo di analisi molto sensibile che riesce a discriminare tra i


complessi di inclusione e i polimeri separati dai macrocicli 50. Tramite
spettroscopia bidimensionale di diffusione è stato chiaramente osservato che
in R1 il coefficiente di diffusione del PEG coincideva con quello degli anelli
di CD, fornendo quindi una forte evidenza della presenza del complesso di
inclusione (Figura 3.18).

Figura 3.18: Spettro 2D-DOSY del rotassano R1; i segnali di CD, PEG e PCL sono su una sola riga, indice
della formazione del complesso di inclusione

49
Z.Yan,A.Guo,L.Ye,A.Zhang,Z.Feng, The synthesis and characterization of a processable polyrotaxane-based
triblock copolymer via “two steps” strategy, Royal Society of Chemistry,2016,6,33221
50
Araki, J. & Ito, K. Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their
applications to soft materials. Soft Matter 3, 1456 (2007).

51
Al contrario, nello spettro R2 (Figura 3.19), sono visibili due linee orizzontali
attribuite ai coefficienti di diffusione del PEG e di CD separati, indicando
che in soluzione di DMSO il complesso di inclusione si è disgregato.

Figura 3.19: Spettro 2D-DOSY del rotassano R2; sono presenti due set di segnali, segno che il complesso di
inclusione non si è formato

Questo risultato è apparentemente in contrasto con l’analisi GPC. Una


possibile interpretazione è che il processo di disgregazione di R2 avviene in
maniera veloce in seguito a dissoluzione in DMSO. Questa conclusione è
supportata dal basso grado di funzionalizzazione con Folato (19%). D’altro
canto, la scarsa solubilità delle CD libere in THF potrebbe essere
responsabile della tendenza dell’CD a essere trattenuta sulla catena PEG,
dando origine a un singolo picco nel cromatogramma GPC.

3.9 Analisi DSC

L'analisi DSC è stata eseguita al fine di studiare l'influenza del complesso di


inclusione sulla cristallinità dei blocchi PEG e PCL. Poiché PEG e PCL hanno
temperature di fusione vicine, è stata scelta una bassa velocità di scansione per
favorire la separazione dei picchi eso/endotermici tra i due diversi blocchi. Le

52
proprietà termiche del copolimero Fol-PEG-PCL, dei rotassani e dei precursori
(butinil-PCL, PEG diolo e N3-PEG-PCL) sono riportate in Tabella 3.4.

Campioni Tm1 Hm1 Tm1 Hm1 Tm2 Hm2 Tm2 Hm2


PEG PEG PCL PCL PEG PEG PCL PCL
Fol-PEG1.5k-PCL4k - - 54.4 121.5 - - 51.6 103.3
R1 - - 57.7 196.1 - - 53.1 135.3
R2 - - 59.3 227.5 - - 56.5 160.4
butinil-PCL4k 53.2 118.1 50.7 82.9
PEG1.5k diol 43.8 201.4 42.7 181.0
N3-PEG1.5k-PCL4k 30.1 109.2 52.3 51.8 32.1 126.3 49.1 39.9
Tabella 3.4: Dati relativi all'analisi DSC dei copolimeri sintetizzati; T espressa in °C, H espresso in J/g. I
Hm si riferiscono alla reale frazione in peso di PEG e PCL nel copolimero

I picchi di fusione di PEG e PCL sono ben distinti nel copolimero N3-PEG-
PCL, indicando una segregazione dei blocchi (Figura 3.20).

Figura 3.20: termogrammi di prima fusione, cristallizzazione e seconda fusione relativi ai copolimeri Fol-PEG-
PCL (linea verde), N3-PEG-PCL (linea rossa) e al rotassano R1 (linea nera)

Poiché il blocco PEG è più corto del blocco PCL, la cristallizzazione del PCL
è dominante, portando alla cristallizzazione imperfetta del PEG51. In effetti, i
valori di Tm e Hm del PEG diminuiscono significativamente nel copolimero
rispetto al PEG libero. Il picco di fusione relativo al PEG nell’intervallo 30-

51
B. Bogdanov a, A. Vidts a, A. Van Den Bulcke a, R. Verbeeck b and E. Schacht a'Synthesis and thermal
properties of poly(ethylene glycol)- poly( -caprolactone) copolymers *PolymerVol. 39 Nos. 8-9, pp. 1631-1636,

53
40°C, invece, è completamente assente nel termogramma di Fol-PEG-PCL.
Questo risultato può essere imputato alla presenza del gruppo Folato
terminale, che influenza significativamente la cristallinità e la temperatura di
fusione del PEG52. Analogamente al Fol-PEG-PCL, anche i rotassani non
mostrano un picco di fusione del PEG separato; pertanto, l'influenza delle
CD sulla cristallinità del PEG non può essere dedotta dall'analisi DSC. La
presenza del picco di fusione del PCL intorno a 55°C, in R1 e R2, conferma
che le catene di PCL non sono coinvolte nella formazione dei complessi di
inclusione. È interessante notare l'alto valore di Hm trovato per Fol-PEG-
PCL, R1 e R2, sia in prima che in seconda scansione (come evidenziato in
Tabella 3.4), che suggerisce che il picco di fusione non può essere imputato
alla sola fusione del PCL (il cui Hm°= 139 J/g è inferiore al valore
calcolato), ma c'è un contributo dato anche dal PEG. Pertanto, si ritiene che le
temperature di cristallizzazione e di fusione dei due blocchi si avvicinino fino
a sovrapporsi nei copolimeri aventi Folato come terminale, a causa della
ridotta mobilità della catena di PEG che provoca un aumento della
temperatura di cristallizzazione.

Diversamente dal caso del copolimero di-blocco N3-PEG-PCL, che mostra una
diminuzione di Tm, il punto di fusione del PCL, nei copolimeri funzionalizzati
con Folato non sembra essere influenzato dal suo legame covalente con PEG.
Anzi, è stato verificato (in R1, R2 e, in misura minore in Fol-PEG-PCL) un
aumento della temperatura di fusione del PCL rispetto a N3-PEG-PCL e al
butinil-PCL libero, sia nella prima che nella seconda fase di riscaldamento.
Come noto, Tm è correlato alla dimensione e alla struttura dei cristalliti,
considerando che il grado di cristallinità non influenza il valore di Tm. Un
aumento di Tm indica un grado di impacchettamento più alto e/o una struttura
lamellare più spessa. Poiché la natura semicristallina del PCL e la sua
52
S.Z.D. Cheng, S.S. Wu, J. Chen, Q. Zhuo, and R.P. Quirk. Isothermal Thickening and Thinning Processes in
Low Molecular Weight Poly (ethylene oxide) Fractions Crystallized from the Melt. 4. End-Group Dependence.
Macromolecules 26, 5105-5117 (1993).

54
maggiore idrofobicità possono conferire alle micelle una maggiore stabilità
cinetica e minore possibilità di disgregamento53, il miglioramento della
struttura cristallina del PCL potrebbe essere un vantaggio in vista della
stabilità di nanoparticelle contenenti il copolimero rotassanato.

53
Yuan H, Wang LL, Du YZ, You J, Hu FQ, Zeng S. Preparation and characteristics of nanostructured lipid
carriers for control-releasing progesterone by melt-emulsification. Colloids Surf B Biointerfaces 2007; 60(2):
174-179

55
3.10 Analisi di diffrazione dei Raggi X

Gli spettri relativi all’analisi di diffrazione dei Raggi X di polveri di N3-PEG-


PCL, Fol-PEG-PCL, R1 e R2 sono mostrati in Figura 3.21. I picchi
caratteristici delle CD non sono visibili nello spettro di R1 e R2.
Probabilmente a causa della bassa quantità di CD inanellata i segnali si
perdono nel rumore di fondo.

Figura 3.21: Pattern di diffrazione dei Raggi-X per a) N3-PEG-PCL, b) Fol-PEG-PCL, c) R2 e d) R1; le frecce
indicano in a) il picco relativo al blocco PEG, in d) la cristallizzazione del complesso CD/polimero

56
Tutti i campioni mostrano i picchi di riflessione del PCL (2θ = 21,5 ° e 2θ =
23,9 °), mentre il picco a 2=19,3° caratteristico del PEG è presente solo nel
diffrattogramma del copolimero N3-PEG-PCL. Come rilevato dall'analisi
DSC, il PEG non mostra alcuna evidenza di cristallinità nei copolimeri
funzionalizzati con Folato. Tuttavia, la formazione dei complessi di inclusione
potrebbe causare una modifica cristallina del PEG e uno spostamento dei
picchi, che si andrebbero a sovrapporre a quelli del PCL. Un comportamento
simile è stato descritto da Ye et al. nel caso del complesso di inclusione di
PEG/urea54. Gli autori hanno suggerito che le catene di PEG adottano una
conformazione più estesa quando sono incluse nei canali dell'urea rispetto alla
conformazione trovata nel bulk. In effetti, ci sono pochi lavori sulla struttura
cristallina di PEG nei complessi di inclusione di CD-PEG. L'esatta
conformazione delle catene PEG nel complesso non è stata ancora
determinata. Alla luce dei risultati ottenuti, la struttura del PEG nel
copolimero folato e nei rotassani sarà oggetto di ulteriori approfondimenti in
futuro.

È interessante notare la presenza di un nuovo picco di bassa intensità a 2=


20° nel diffrattogramma di R1. Secondo la letteratura, il picco 2=20° è
associato all’organizzazione cristallina delle CD in una struttura
sovramolecolare denominata “channel-like” (Figura 3.22), caratteristica dei
complessi di inclusione del tipo polimero/CD55. Nel complesso di inclusione
le CD interagiscono tra di loro tramite legami idrogeno. Questa è una prova
della presenza di CD, anche se in piccola quantità, organizzate come
complesso di inclusione in R1. Invece, nel caso di R2, l'assenza del picco
2=20° indica che le CD sono sparse lungo la catena di PEG.

54
Hai-Mu YeYun-Yang Song, Jun Xu, Bao-Hua Guo, Qiong Zhou, Melting behavior of inclusion complex
formed between polyethylene glycol oligomer and ureaPolymer, Volume 54, Issue 13, 7 June 2013, Pages 3385-
3391
55
L.Huang,E.allen,AE Tonelli, Study of the Inclusion Compounds Formed between a-Cyclodextrin and High
Molecular Weight Poly (ethylene oxide) and Poly (e-caprolactone), Polymer,1998,39, 4857-4865

57
Figura 3.22: Disposizione delle Ciclodestrine lungo la catena polimerica (struttura" channel-like")56

3.11 Analisi TGA

Mediante analisi TGA è stata studiata la stabilità termica del copolimero e dei
rotassani. L'aumento della stabilità termica è un buon indice della formazione
del complesso di inclusione PEG-CD. Infatti, i rotassani mostrano proprietà
termoresistenti uniche, grazie alla struttura supramolecolare.

La curva termogravimetrica di Fol-PEG-PCL (Figura 3.23) segue un processo


di decomposizione in due fasi che inizia intorno ai 250°C.

Figura 3.23: Curve TGA di Fol-PEG-PCL e dei due rotassani

56
Araki, J. & Ito, K. Recent advances in the preparation of cyclodextrin-based polyrotaxanes and their
applications to soft materials. Soft Matter 3, 1456 (2007).

58
Secondo la letteratura, il PEG inizia a degradare a T=280°C, che corrisponde
al secondo stadio nella curva di Fol-PEG-PCL, mentre il primo stadio è
relativo alla degradazione di PCL. Il profilo di entrambi i rotassani mostra una
decomposizione termica ad unico stadio che inizia intorno a 290°C per R2 e
oltre 300°C per R1. Il valore di temperatura di degradazione più alto di R1
rispetto a R2 è stato attribuito all'organizzazione cristallina delle CD del
complesso di inclusione, come valutato dall'analisi ai Raggi X, che
contribuisce ulteriormente ad aumentare la stabilità termica.

3.12 Microscopia Ottica

Le foto al microscopio ottico di Fol-PEG-PCL, R2 e R1 sono mostrate in


Figura 3.24.

Figura 3.24: Morfologie messe a confronto a) Fol-PEG-PCL, b) R2 e c) R1. Le foto sono state ottenute
mediante microscopia ottica a luce polarizzata. I campioni sono cristallizzati a 48°C

59
Le foto di N3-PEG-PCL non sono state riportate perché molto simili al Fol-
PEG-PCL. In realtà, sebbene siano state chiaramente osservate al DSC due
differenti Tc e Tm per PEG e PCL, la crescita dei due blocchi di sferuliti non
può essere distinta poiché la cristallizzazione del PCL è dominante, a causa
della maggiore lunghezza del segmento PCL. Dopo la cristallizzazione
isotermica di PCL a 48°C, è stato notato solo un aumento diffuso di luminosità
scendendo a 23°C, che è la temperatura di cristallizzazione di PEG.

Nel copolimero R1 si può notare che la formazione di sferuliti di grandi


dimensioni è stata inibita. Questo comportamento è analogo a quanto riportato
nel caso di un complesso di inclusione CD/PCL57, ed è stato attribuito alla
presenza del complesso di inclusione CD/PEG. Infatti, poiché le analisi DSC
e RX non hanno dato prova della formazione di complessi di inclusione
relativi al blocco PCL, possiamo dedurre che la presenza dei complessi
CD/PEG organizzati in una struttura cristallina ha influenzato la morfologia
del PCL. Si suppone che i complessi di inclusione incorporati nella matrice
PCL disturbino la crescita degli sferuliti e allo stesso tempo, agiscano come
agenti di nucleazione, dando origine alla crescita di un numero maggiore di
sferuliti di dimensioni più piccole.

3.13 Studi di formulazione di Nanoparticelle

E’ stato condotto uno studio preliminare per la formulazione di NP idonee alla


somministrazione di agenti chemioterapici utilizzando R1 in miscela con il
copolimero mPEG-PCL (R2 non è stato valutato a causa della sua instabilità in
soluzione). Le NP funzionalizzate con Folato (Fol-NP) sono state preparate
mediante nanoprecipitazione, partendo da una miscela di mPEG-PCL con
percentuali diverse di R1 (10 e 20% in peso). Sono state inoltre preparate NP
non funzionalizzate per confronto. Il diametro idrodinamico (DH), l’indice di
polidispersività (PdI) e il potenziale zeta (delle NP sono riportati in Tabella

57O. Jazkewitsch,A.Mondrzyk,R.Staffel, H. Ritter, Cyclodextrin-modified polyesters from lactones and from


bacteria: an approach to new drug carrier systems, Macromolecules, 2011

60
3.5. La percentuale di PEG esposto sulla superficie delle NP è stata valutata
mediante 1H-NMR come da letteratura58.

Formulazioni DH (nm) SD ξ (mV) SD PEG in CD in


(PdI) superficie(wt%) superficie(wt%)
mPEG-PCL 85.670.77 -25.10.3 7.1 -
(0.108)
Fol-NP10% 171.0±10 -42.3±1 5.5 84.4
(0.220)
Fol-NP20% 167.2±10 -38.8±0.5 7.1 88.2
(0.254)
Tabella 3.5: Dati DLS relativi alle diverse formulazioni

La nanoprecipitazione di mPEG-PCL ha dato NP di dimensioni inferiori a 100


nm con polidispersività e carica superficiale negativa molto basse. Dopo
l'aggiunta di R1, si formano nanoparticelle di dimensione superiore e con
valore di ξ molto più negativo. L'aumento della dimensione delle NP può
essere probabilmente attribuito a una leggera estensione delle catene di PEG
dopo la formazione dei complessi di inclusione che aumenta lo spessore dello
shell, mentre il valore più elevato di ξ è indicativo della presenza di gruppi
Folato sulla superficie (a causa dei gruppi carbossilato carichi negativamente).
Per valutare il PEG in superficie, è stato acquisito lo spettro 1H-NMR delle
Fol-NP in D2O (Figura 3.25b) e l’integrale relativo al segnale del PEG è stato
rapportato a quello dello spettro 1H-NMR di Fol-NPs liofilizzate e disciolte in
CDCl3 (Figura 3.25a). La quantità di PEG sulla superficie così calcolata è
molto inferiore al valore teorico, come già riscontrato in un lavoro
precedente59. Vale la pena notare, tuttavia, che non è stata rilevata nessuna
variazione della quantità di PEG presente in superficie dopo l'aggiunta di R1.

58
Xu,Q.,Ensign,L.M.,Boylan,N.J.,Schon,A.,Gong,X.,Yang,J.C., Lamb,N.W.,Cai,S.,Yu,T.,Freire,E.,Hanes,J.,2015
.Impact of surface polyethylene glycol (PEG) density on biodegradable nanoparticle transport in mucus ex vivo
and distribution in vivo. ACS Nano 9, 9217–9227

59A.Venuta,F.Moret,G.DalPoggetto,D.Esposito,A.Fraix,C.Avitabile,F.Ungaro,M.Malinconico,S.Sortino,A.Roma

nelli,P.Laurienzo,E.Reddi,F. Quaglia.Shedding light on surface exposition of poly(ethylene glycol) and folate


targeting units on nanoparticles of poly(ε-caprolactone) diblock copolymers:Beyond a paradigm. European
Journal of Pharmaceutical Sciences 111 (2018) 177–185

61
Lo spettro delle Fol-NP in D2O mostra chiaramente anche i picchi relativi al
Folato e alle CD, confermando la loro buona esposizione sulla superficie.

Figura 3.25a: Spettro 1H-NMR di Fol-NP in CDCl3; le NP si sono disgregate

Figura 3.25b: Spettro 1H-NMR di Fol-NP in D2O con particolare sulla zona relativa ai protoni aromatici del
Folato

62
Confrontando il rapporto tra le intensità del segnale del protone anomerico
delle CD e il segnale relativo al -CH3 del mPEG-PCL determinato dallo
spettro delle micelle in D2O con il rapporto corrispondente nello spettro di
Fol-NP disciolte in CDCl3, è stato possibile stimare la percentuale di CD
esposta. Come mostrato nella Tabella 3.5, è stata trovata una percentuale di
CD vicina al 90%. Questo risultato è estremamente importante, poiché
l'esposizione completa delle CD implica una esposizione completa sulla
superficie delle NP delle molecole di Folato.

63
Conclusioni

In questo lavoro di tesi sono stati realizzati copolimeri diblocco Fol-PEG-PCL


in cui il blocco PEG forma un complesso di inclusione con CD
(polirotassano), allo scopo di realizzare nanoparticelle decorate con acido
folico per il targeting attivo, caratterizzate da una migliore esposizione del
ligando sulla superficie. La sintesi di questi sistemi è stata ottenuta con
successo partendo da un PEG pseudo-rotassano etero-bifunzionale, con una
metodologia originale che ha coinvolto due diverse reazioni di end-capping
per prevenire la fuoriuscita delle CD. Il Folato è stato legato ad una estremità
del PEG mediante reazione di sostituzione nucleofila; il butinil-PCL con Mn
4168 Da è stato legato alla seconda estremità del PEG mediante reazione di
click, realizzando infine un copolimero Fol-PEG(CD)-PCL selettivamente
inanellato. Ad oggi questo è il primo esempio di end-capping di uno pseudo-
rotassano a base PEG con due diverse molecole (o stoppers). Questo lavoro ha
inoltre permesso di valutare che quando le due reazioni di terminazione sono
eseguite simultaneamente (processo "one-step"), il complesso di inclusione
risulta stabile in soluzione, come dimostrato dalla spettroscopia 2D-DOSY, al
contrario, quando il rotassano è ottenuto mediante reazioni in sequenza
(processo "two-steps"), è stato rilevato un rapido sfilamento delle CD dalla
catena di PEG in soluzione. I risultati delle analisi DSC hanno mostrato che il
picco di fusione del PEG scompare nei rotassani, mentre quello relativo al
PCL è regolarmente presente in tutte le strutture analizzate, a conferma che il
blocco PEG è il solo a far parte del complesso di inclusione con le CD.
Mediante analisi di diffrazione dei raggi X è risultato che il complesso di
inclusione CD/PEG mostra la tipica struttura cristallina “channel-like” in cui
le CD sono incolonnate lungo la catena di PEG nel caso del rotassano "one-
step" (R1). L'analisi termogravimetrica ha evidenziato un miglioramento della
stabilità termica dei rotassani rispetto al copolimero non inanellato. La

64
microscopia ottica ha mostrato che la morfologia degli sferuliti di PCL è
fortemente influenzata dalla presenza di unità cristalline (il complesso di
inclusione PEG/CD) nel rotassano "one-step" (R1). Il rotassano R1 è stato
utilizzato al 10% e al 20% in peso in miscela con un copolimero PEG1000-
PCL4000, per la formulazione di nanoparticelle (Fol-NP) decorate in superficie
con gruppi folato per il targeting attivo, utilizzabili come Drug Delivery
Systems. La valutazione dei dati DLS ha mostrato un lieve aumento delle
dimensioni e della stabilità delle Fol-NP rispetto alle NP non decorate.
Mediante spettroscopia 1H-NMR è stata valutata la percentuale di PEG e di
CD esposti sulla superficie di Fol-NP. La % di PEG è risultata simile a
quella delle NP (~ 8%), mentre l’esposizione superficiale delle CD è risultata
ottima (~ 90%). Ciò implica a sua volta un’ottima esposizione del folato sulla
superficie delle Fol-NP. Presso l’Università di Padova (prof. Elena Reddi)
sono in corso studi sull’efficienza di uptake cellulare di Fol-NP utilizzando
cellule KB come modello di tumori solidi.

65
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Pharmaceutical Sciences 111 (2018) 177–185

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RINGRAZIAMENTI

E’ giunto il momento di scrivere la parte, probabilmente, più importante della


Tesi Magistrale. Non la feci alla triennale proprio per aspettare questo
momento che per me ha più significato. Questa parte è dedicata alle persone
che in tutto il mio percorso universitario mi hanno sostenuto, rincuorato nei
momenti di sconforto, fatto sorridere e ridere, hanno gioito con me e hanno
pianto con me!

Questa parte è dedicata ai miei genitori prima di tutti, perché credendo nelle
mie capacità hanno investito su di me e mi hanno dato l’opportunità di
costruirmi un futuro, spero, proficuo. Sappiate che impegnerò tutto me stesso
per affermarmi così da ripagarvi di tutti i vostri sforzi (attenzione non perché
me lo abbiate chiesto ma perché vi meritate una vita senza pensieri dopo
quello che abbiamo e stiamo passando).

Ringrazio i miei fratelli perché, anche se non lo sanno, con litigi e sclerate
post-litigio, mi hanno aiutato tantissimo a scaricare ansie, tensioni e paure che
mi hanno accompagnato lungo il percorso e che difficilmente riesco ad
esternare.

Ringrazio mio nonno che sarà sempre nel mio cuore e che mi ha spronato ad
andare avanti inesorabilmente.

Ringrazio mia nonna… vivere con te è ogni giorno una prova che mi aiuterà a
sopportare tutte le batoste che questa vita di merda ha da offrirmi.

Ringrazio la mia compagna di vita. Gabri, amore mio, tu solo sai


perfettamente come è stato e come ho vissuto questo intero percorso. Mi sei
stata sempre accanto mente e corpo, anche quando, in quei giorni di dolori
atroci che ti attanagliavano, avresti voluto solo farli smettere e non pensare a
niente e a nessuno, ma nonostante tutto eri tu che facevi coraggio a me! Mi hai
sempre spronato, invogliandomi a continuare e a fare sempre del mio meglio
nonostante le batoste, le delusioni, le brutte esperienze e le brutte persone. Per

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questo non saprò mai come ringraziarti a dovere e penso che non bastino tutte
le parole del mondo per farlo. Mi limiterò ad un semplice, ma deciso: Ti Amo.

Sono estremamente grato al dott. Bruno Galdi, senza il quale non sarebbe
potuta iniziare questa meravigliosa esperienza al CNR di Pozzuoli.

Un sincero ringraziamento va alla prof. Rosa Lanzetta e a tutto il suo gruppo


di ricerca dell’Università di Napoli “Federico II” per avermi dato la possibilità
di portare a termine il mio percorso formativo. Un ringraziamento speciale va
al Prof. Alfonso Iadonisi, e alla dott.ssa Roberta Marchetti per la loro
disponibilità, professionalità e grande competenza.

Ringrazio inoltre il dott. Mario Malinconico e la cara dott.ssa Paola Laurienzo


per avermi dato la possibilità di vivere questa esperienza formativa di cui farò
tesoro nel mio, spero splendido, futuro. Mi avete accolto nel vostro gruppo di
ricerca presso l’IPCB di Pozzuoli, seguendomi con grande professionalità e
interesse.

Inoltre ringrazio tutto il gruppo IPCB che mi ha accolto con disponibilità,


simpatia e pazienza. Voi tutti ragazzi (e meno ragazzi), avete reso la mia
esperienza in questo posto, la più bella cosa che mi potesse capitare. Siete
speciali. Spero vivamente di avervi lasciato un buon ricordo di me.

In particolar modo vorrei ringraziare il dott. Giovanni dal Poggetto che fin
dall’inizio di questo percorso di tesi si è dimostrato essere un buon amico
sempre disponibile e paziente… soprattutto paziente! Senza i tuoi preziosi
consigli sarebbe stato difficile svolgere questo lavoro di ricerca. Farò tesoro
per sempre di tutte le tue perle e di tutti i trucchetti che mi hai insegnato.

Doveroso ringraziare il dott. Mauro Milazzo per l’aiuto fornitomi con l’analisi
dei raggi X, e la dott.ssa Maria Toscanesi per l’analisi elementare.

Ringrazio tutti i miei amici e compagni di università e di vita, voi che siete
rimasti al mio fianco e anche quelli che hanno deciso di non condividere più

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con me il loro percorso di vita. Siete forti e avrete sempre un posto vivido nei
miei ricordi. So che senza di voi, questi anni sarebbero stati ancora più duri e
lunghi da affrontare. Siete tantissimi e non potrei nominarvi tutti.

Un ringraziamento speciale però tra questi va a Sergio e Francesco. Ragazzi


belli voi mi avete fornito i mezzi e la carica giusta per uscire da quel fossato in
cui mi ero buttato e che non mi permetteva di completare questo interminabile
ciclo di studi. Vi sarò sempre debitore.

Ringrazio Yago e Jessie… vite mie, siete il mio sprono e la mia ancora di
salvezza in questa vita avvolte anche troppo dura. So che non vivremmo
assieme tutto il tempo che meritate, ma vi prometto che tutto il vostro tempo
sarà bellissimo da trascorrere assieme.

Non me ne voglia chi ho dimenticato di nominare o ricordare…. Al momento


sono in preda a crisi mistica dovuta alla stesura dell’elaborato nella sua forma
definitiva… wa ch piezz aggia menat!!

Ve vogl’ ben assaj!

Sasi.

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