(197) PRUEBAS DE IDENTIFICACIÓN ESPECTROFOTOMÉTRICA

eL espectro de absorción IR de una sustancia, en comparación con el que se obtuvo

concomitantemente para el Estándar de Referencia USP correspondiente, proporciona quizá la
evidencia más concluyente de la identidad de la sustancia, que puede obtenerse en una sola
prueba. El espectro de absorción UV, por otro lado, no presenta un alto grado de especificidad.
La conformidad con las especificaciones de prueba referentes tanto para la absorción IR como
con la absorción UV, según se indica en una gran proporción de monografías oficiales, deja
pocas dudas, si las hubiera, con respecto a la identidad de la muestra que se está examinando.

Registrar los espectros de la muestra de prueba y el correspondiente Estándar de Referencia

USP en el intervalo de aproximadamente 2,6 µm a 15 µm (3800 cm-1 a 650 cm-1) a menos que
se especifique algo diferente en la monografía individual. El espectro de absorción IR de la
preparación obtenida a partir de la muestra de prueba, previamente secada bajo las
condiciones especificadas para el Estándar de Referencia correspondiente, a menos que se
especifique algo diferente, o que el Estándar de Referencia se emplee sin secar, presenta
máximos sólo a las mismas longitudes de onda que el de una preparación similar del Estándar
de Referencia USP correspondiente. Las diferencias que pueden observarse en los espectros
así obtenidos a veces se atribuyen a la presencia de polimorfos, lo cual no es siempre
aceptable. Por lo tanto, a menos que se especifique algo diferente en la monografía individual,
continuar del siguiente modo. si aparece una diferencia en los espectros IR del analito y del
estándar, disolver porciones iguales de la muestra de prueba y del Estándar de Referencia en
volúmenes iguales de un disolvente apropiado, evaporar la solución hasta sequedad en
envases similares, bajo condiciones idénticas, y repetir la prueba con los residuos.

ABSORCIÓN EN EL ULTRA VIOLETA La referencia (197U) en una monografía significa que una
solución de prueba y una Solución estándar se examinan espectrofotométricamente, en celdas
de 1 cm, sobre el intervalo espectral de 200 nm a 400 nm, a menos que se especifique algo
diferente en la monografía individual. Disolver una porción de la sustancia que se está
examinando en el Medio especificado para obtener una solución de prueba que tenga la
concentración especificada en la monografía para Solución. En forma similar, preparar una
Solución Estándar que contenga el Estándar de Referencia USP correspondiente. Registrar y
comparar los espectros obtenidos concomitantemente para la solución de prueba y la Solución
Estándar. Calcular los cocientes de absortividad y/o absorbancia si estos criterios están
incluidos en una monografía individual. A menos que se especifique algo diferente, las
absorbancias indicadas para estos cálculos son aquellas medidas a la absorbancia máxima,
aproximadamente a la longitud de onda especificada en la monografía individual. Cuando la
absorbancia se deba medir aproximadamente a la longitud de onda especificada en lugar de la
máxima absorbancia, las abreviaturas (min) y (sh) se utilizan para indicar un mínimo y un
hombro (shoulder), respectivamente, en un espectro de absorción. Los requisitos se cumplen
si los espectros de absorción UV de la solución de prueba y de la Solución Estándar presentan
máximos y mínimos a las mismas longitudes de onda y los cocientes de absortividad y/o
absorbancia están dentro de los límites especificados.

(853) ESPECTROSCOPÍA DE FLUORESCENCIA

INTRODUCCIÓN

La fluorescencia es un proceso de dos etapas que requiere la absorción de luz a una longitud
de onda específica (excitación) seguida de emisión de luz, por lo regular a una longitud de
onda mayor. La emisión de luz se denomina fluorescencia. El tipo más común de muestra
fluorescente es una solución transparente submicromolar que absorbe la luz siguiendo la Ley
de Lambert-Beer-Bouguer y emite fluorescencia con una intensidad que es directamente
proporcional a la concentración, a la absortividad y al rendimiento cuántico de fluorescencia
de las especies fluorescentes o del fluoróforo. La detección de fluorescencia también puede
ser altamente específica debido a que un fluoróforo tiene un patrón de emisión característico.
La especificidad y la sensibilidad son dos de los puntos fuertes más importantes de los
métodos de fluorescencia.

MEDICIONES CUALITATIVAS V CUANTITATIVAS DE FLUORESCENCIA

Las mediciones cualitativas de fluorescencia se usan para detectar la presencia de analitos

particulares y brindar una respuesta positiva o negativa. Las longitudes de onda de excitación y
de emisión a menudo se seleccionan en el máximo del pico del fluoróforo que se va a detectar.

Se debe considerar la cantidad mínima de analito requerida para obtener un resultado positivo
que asegure que el método es apropiado para la aplicación particular. La observación de
fluorescencia en la posición del pico por encima del límite de detección (generalmente 3 veces
el nivel de ruido) indica un resultado positivo.

Las mediciones cuantitativas de fluorescencia se usan para determinar las cantidades o

concentraciones de analitos en muestras desconocidas. Estas cantidades pueden determinarse
en unidades absolutas, tales como moles o moles por L, o en unidades relativas, tales como el
cociente entre las concentraciones de dos analitos fluorescentes contenidos en una sola
solución desconocida. Dichas determinaciones usan la siguiente proporcionalidad, que
relaciona la señal de fluorescencia (S) con la concentración de analito fluorescente (e) en un
par dado de longitudes de onda de excitación y de emisión O"ex, A.,m) :

INSTRUMENTOS Todas las mediciones modernas de fluorescencia implican irradiar la muestra

con el haz desde una fuente de luz adecuada, seleccionar la longitud de onda de excitación,
recopilar la fluorescencia resultante, rechazar la luz dispersada Rayleigh, seleccionar la
longitud de onda de emisión y detectar la señal de fluorescencia. Las siguientes funciones se
analizarán individualmente, junto con el equipo usado para lograr estas funciones en
instrumentos comerciales: 1 . fuente de luz de excitación 2. selector de longitud de onda de
excitación 3. dispositivo de muestreo 4. selector de longitud de onda de emisión 5. detector

Curvas de Concentración-Calibración del Analito

Las curvas de calibración de la respuesta del instrumento (intensidad de fluorescencia) en

función de la concentración de analito se determinan usando materiales de referencia que
contienen el analito de interés. Por ejemplo, las intensidades de fluorescencia de un conjunto
de soluciones a diferentes concentraciones conocidas de analito que abarcan un intervalo
deseado de concentración pueden medirse y graficarse en función de la concentración.
Posteriormente, la gráfica se ajusta a un polinomio, por lo regular una línea recta. La curva de
calibración resultante es específica del analito y del instrumento y se puede usar para
determinar las concentraciones de analito de muestras desconocidas

(854) ESPECTROSCOPÍA EN EL INFRARROJO MEDIO

INTRODUCCIÓN

La espectroscopía en el infrarrojo medio es un método instrumental que se usa para medir la

absorción de la radiación electromagnética sobre el intervalo de número de onda entre 4000 y
400 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda entre 2,5 y 25 µm). A menos que se
especifique algo diferente en una monografía u otro procedimiento validado, se debe usar la
región de 3800 a 650 cm-1 (correspondiente a longitudes de onda de 2,6 a 15 µm) para
asegurar el complimiento con las especificaciones de la monografía para absorción IR. La
absorción de fotones ocasiona la promoción de moléculas de un estado fundamental de su
modo vibratorio a un estado vibratorio excitado. Los modos vibratorios se definen por el
movimiento de todos los átomos en una molécula. Cuando las moléculas contienen ciertos
grupos funcionales, la absorción IR a menudo ocurre en intervalos espectrales estrechos
específicos. En estos casos, los números de onda en los que ocurren dichas transiciones se
conocen como frecuencias de grupos funcionales. Cuando un modo vibratorio implica
movimientos atómicos de más de unos pocos átomos, las frecuencias ocurren en intervalos
espectrales más amplios y no son característicos de un grupo funcional particular, sino que son
más característicos de las moléculas en conjunto. Dichas bandas se conocen como bandas de
huella dactilar. Todas las bandas fuertes que absorben a números de onda por encima de 1500
cm-1 son frecuencias de grupos funcionales. Las bandas fuertes que absorben por debajo de
1500 cm-1 pueden ser frecuencias de grupos funcionales o bandas de huella dactilar.

PROCEDIMIENTO

Los espectros en el infrarrojo medio se pueden medir mediante transmisión, reflexión externa,
reflexión interna (a menudo denominada reflexión atenuada total), reflexión difusa y
espectroscopía fotoacústica. Se encuentran disponibles diversas técnicas de preparación de la
muestra para dichas opciones. A continuación se presentan las técnicas más comunes de
preparación de muestra.

Discos de Bromuro de Potasio (KBr)

Algunos haluros alcalinos en polvo tales como bromuro de potasio, cloruro de potasio y
yoduro de cesio se fusionan a alta presión y pueden formar discos autoportantes que son
transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. El haluro alcalino que se usa más
comúnmente es el bromuro de potasio seco en polvo de alta pureza, que es transparente a
una radiación en el infrarrojo medio por encima de 400 cm-1• Se encuentran disponibles
prensas y matrices comerciales en una variedad de diámetros para la preparación de discos de
haluros alcalinos y similares.

materiales que no son de grado espectroscópico pueden contener impurezas con bandas de
absorción en la región en el infrarrojo medio. El diámetro más común de los discos de KBr es
13 mm, aunque se pueden preparar minidiscos con un diámetro tan pequeño como 0,5 mm
usando prensas disponibles comercialmente. Se deben seguir los procedimientos
recomendados del fabricante para operar el accesorio para la fabricación de discos y la prensa.
Por lo regular, la relación de peso entre la muestra y el haluro alcalino está en el orden de 1
parte de la muestra a 100-400 partes de bromuro de potasio. Un procedimiento óptimo para
preparar un disco con un diámetro de 13 mm es moler previamente la muestra hasta un
tamaño de partícula fino en un mortero de ágata. Posteriormente, se pesa 1-2 mg de la
muestra molida y se transfiere a un mortero (o vial) limpio. Luego, se agrega una cantidad
pesada de polvo de bromuro de potasio molido y seco (300 mg) y se mezcla suavemente con el
analito para formar una mezcla homogénea. Posteriormente, la mezcla de bromuro de potasio
y de analito se transfiere completamente a una matriz de 13 mm, la cual se rellena y ensambla
de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Cuando la matriz se conecta a una bomba de
vacío rotatoria, se debe evacuar durante aproximadamente 2 minutos. Colocar la matriz (aún
al vacío) en una prensa hidráulica y aplicar una presión suficiente para formar un disco que
presente una transparencia uniforme.

Suspensiones de Aceite Mineral

Un procedimiento típico para preparar una suspensión es colocar 10-20 mg de la muestra en

un mortero de ágata y luego moler la muestra hasta obtener un polvo con un tamaño fino de
partícula aplicando un movimiento rotatorio y vigoroso con la mano del mortero. Se agrega
una pequeña gota del agente de suspensión al mortero. El movimiento rotatorio de la mano
del mortero se usa para mezclar los componentes hasta formar una pasta uniforme, la cual se
transfiere al centro de una ventana limpia y transparente para IR (p.ej., bromuro de potasio,
cloruro de sodio, bromuro de plata o yoduro de cesio). Se coloca una segunda ventana igual,
que calce sobre la parte superior de la suspensión y se aplica presión a la suspensión para
formar una película delgada y translúcida libre de burbujas. El agente de suspensión más usado
para la región del infrarrojo medio es aceite mineral de hidrocarburos saturados (parafina
líquida, Nujol).

Películas de Polímero Autoportantes

En ocasiones, el espectro de transmisión en el infrarrojo medio de muchos polímeros usados

como materiales de envasado se registra a partir de muestras preparadas a manera de
películas delgadas autoportantes usando moldeado por compresión en calor o microtomía.

Películas Capilares

Los líquidos no volátiles pueden examinarse sin diluirlos, usando una capa delgada colocada
entre dos ventanas iguales que sean transparentes a la radiación en el infrarrojo medio. La
capa de líquido debe estar exenta de burbujas y cubrir completamente el diámetro del haz del
infrarrojo que se enfoca sobre la muestra.

Líquidos y Soluciones en Celdas de Transmisión

Para examinar muestras líquidas y en solución, se encuentran disponibles comercialmente

montajes de celdas de transmisión que constan de un par de ventanas, un espaciador, puertos
de llenado y un soporte, en configuraciones para macro y micro muestras. Para aplicaciones de
laboratorio, los espaciadores por lo regular están hechos de plomo, poli(tetrafluoroetileno) o
poli(etilén tereftalato) y, dependiendo de los materiales del espaciador, se pueden ofrecer en
longitudes de paso con espesores estándar que van de aproximadamente 6 µm hasta 1 mm o
más.

Para examinar muestras líquidas y en solución, se encuentran disponibles comercialmente

montajes de celdas de transmisión en configuraciones para micro y macromuestras que
constan de un par de ventanas construidas con materiales transparentes en el infrarrojo
medio, tales como espaciadores de bromuro de potasio, puertos de llenado, y un soporte.
Además, pueden estar selladas, ser semipermanentes o de flujo. Se encuentra disponible una
amplia variedad de espaciadores con espesor estándar y de materiales de ventana. Para
aplicaciones de laboratorio, los espaciadores a menudo se forman a partir de plomo,
poli(tetrafluoroetileno) o poli(etilentereftalato), y se pueden proveer, dependiendo de los
materiales del espaciador, con longitudes de paso de espesor estándar que van de
aproximadamente 6 µm hasta 1 mm o mayores. Usualmente se debe determinar de manera
empírica la longitud de paso óptima requerida para examinar un líquido o solución particular
que dependerá de sus características de absorción y de si la aplicación es cualitativa o
cuantitativa. En algunos casos para el trabajo cualitativo, las celdas de transmisión se pueden
reemplazar con medios porosos desechables tales como polietileno o poli(tetrafluoroetileno)
montados en un soporte adecuado.

Reflexión Total Atenuada

La espectroscopía de reflectancia total atenuada se basa en el fenómeno óptico de la radiación

pasando a través de un medio con un alto índice de refracción a un cierto ángulo de incidencia
que se refleja totalmente de manera interna en un borde que está en contacto con un material
con un índice de refracción más bajo. El medio con alto índice de refracción también se conoce
como elemento de reflexión interna. La muestra en análisis debe colocarse en contacto
cercano con el elemento de reflexión interna, por ejemplo, diamante, germanio, selenuro de
cinc u otro material adecuado con un alto índice de refracción. El contacto cercano y uniforme
entre la sustancia y toda la superficie de cristal debe asegurarse mediante la aplicación de
presión para las muestra sólidas o disolviendo la sustancia en el disolvente apropiado y luego
cubriendo el elemento de reflexión interna con la solución y evaporándola hasta sequedad.

Los elementos de reflexión interna de prisma individual y reflexión individual, y de diseño

novedoso también se usan en unidades comerciales H-ATR. Estos proveen medios efectivos y
convenientes para analizar y estudiar muestras en un rango variado de formas físicas. En
particular, dentro de la industria farmacéutica, los accesorios H-ATR con área de contacto
pequeña, reflexión individual y ángulo fijo de incidencia y que no requieren preparación de
muestra se han convertido en dispositivos populares de muestreo debido a que proveen
medios listos para registrar de manera simple y rápida un espectro en el infrarrojo medio a
partir de una cantidad limitada de casi cualquier material en fase condensada. Los elementos
de reflexión interna hemisféricos actúan como lentes de enfoque de modo que el área
muestreada es por lo general más pequeña que la muestreada con los elementos de reflexión
interna prismáticos. Aunque los elementos de reflexión interna pueden ser opacos a la luz
visible, muchos accesorios cit

Reflexión Difusa

La forma más importante y de uso común para la preparación de muestras para reflexión
difusa es diluir la muestra mezclándola íntimamente con diluyentes transparentes al infrarrojo
al 90%-99% tales como bromuro de potasio o cloruro de potasio reducidos a polvo fino. Diluir
la muestra tiene el beneficio adicional de reducir las intensidades de las bandas de absorción
hasta un nivel apropiado.

(857) ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA-VISIBLE INTRODUCCIÓN

Los espectros en el ultravioleta-visible (UV-Vis) se obtienen cuando la interacción entre la
radiación incidente y la nube de electrones en un cromóforo resulta en una transición de
electrones, la cual implica la promoción de uno o más de los electrones de la capa externa o de
unión de un estado fundamental a un estado de energía más elevado. Las bandas de los
espectros UV y visibles de las sustancias por lo general son amplias y sin un alto grado de
especificidad para identificación de compuestos. Sin embargo, son adecuados para
valoraciones cuantitativas y, en el caso de muchas sustancias, son útiles como formas
adicionales de identificación.

Todas las mediciones modernas UV-Vis implican la detección y medición del cociente de
intensidad de la radiación a cierta longitud de onda en presencia o ausencia de la muestra
absorbente. La Figura 2 es una representación esquemática de un espectrofotómetro de doble
haz. La dispersión de luz para alcanzar la resolución deseada puede ocurrir antes o después de
introducir la muestra, pero todos los instrumentos UV-Vis comerciales comparten las
siguientes características para realizar dichas funciones: • fuente continua • monocromador o
policromador • área de muestreo •detector

PROCEDIMIENTO

Salvo algunas excepciones, las pruebas y valoraciones espectrofotométricas farmacopeicas

requieren una comparación contra un Estándar de Referencia USP. Esto ayuda a asegurar una
medición en idénticas condiciones para la muestra de prueba y la sustancia de referencia.
Dichas condiciones pueden incluir el ajuste de la longitud de onda, la selección del ancho de
banda espectral, la colocación y corrección de la celda y los niveles de transmitancia. Las celdas
que presentan características de transmitancia idénticas a una longitud de onda dada pueden
diferir considerablemente en otras longitudes de onda. Se deben establecer y usar
correcciones de celda apropiadas cuando así se requiera. La mejor manera de realizar
comparaciones entre una muestra de prueba y un estándar de referencia es en un máximo de
absorción espectral para el compuesto de interés. Las valoraciones que se realizan mediante
espectrofotometría proveen la longitud de onda comúnmente aceptada para el pico de
absorción espectral de la sustancia en cuestión.

Diferentes espectrofotómetros pueden presentar una variación menor en la longitud de onda

aparente de este pico. Las buenas prácticas requieren que las comparaciones se realicen a la
longitud de onda en la que ocurre el pico de absorción. Si ésta difiere de la longitud de onda
especificada en la monografía individual en más de ±1 nm (en el intervalo de 200-400 nm) o ±2
nm (en el intervalo de 400-800 nm), puede ser una indicación de la necesidad de recalibrar el
instrumento. Los términos "preparación similar" y "solución similar", según se usan en pruebas
y valoraciones que implican espectrofotometría, indican que la referencia para comparación,
que es por lo regular un Estándar de Referencia USP, debe prepararse y observarse, para todos
los propósitos prácticos, de una manera idéntica a la usada para la muestra de prueba.
Generalmente, al preparar una solución del estándar de referencia especificado, se prepara
una solución de aproximadamente (es decir, dentro del 10% de) la concentración deseada y se
calcula la absortividad basándose en la cantidad exacta pesada. Cuando no se haya usado una
muestra del estándar de referencia previamente secada, la absortividad se calcula con
respecto a la sustancia anhidra. Las expresiones "determinar concomitantemente" y "medir
concomitantemente", según se usan en las pruebas y valoraciones que implican
espectrofotometría, indican que las absorbancias de la solución que contiene la muestra de
prueba y la solución que contiene la muestra de referencia, con respecto al blanco de prueba
especificado, deben medirse en sucesión inmediata. Preparación de la Solución Muestra Para
determinaciones usando espectrofotometría UV o visible, la muestra por lo general se disuelve
en un disolvente. A menos que se indique de otro modo en la monografía, las determinaciones
se realizan a temperatura ambiente, usando una longitud de paso de 1 cm. Muchos
disolventes son adecuados para estos intervalos, incluyendo agua, alcoholes, hidrocarburos
pequeños, éteres y soluciones diluidas de ácidos y álcalis fuertes. Los disolventes de calidad
espectrofotométrica especial, que garantizan estar exentos de contaminantes, están
disponibles comercialmente de diversos proveedores. Las valoraciones en la región visible por
lo regular exigen comparar concomitantemente la absorbancia producida por la preparación
de valoración con la producida por una preparación estándar que contenga una cantidad
aproximadamente igual de un Estándar de Referencia USP. En algunas situaciones, se puede
omitir el uso de un estándar de referencia (p.ej., cuando as valoraciones espectrofotométricas
se llevan a cabo rutinariamente) cuando se dipone de una curva estándar adecuada, preparada
con el Estándar de Referencia USP adecuado, y cuando la sustancia valorada cumple con la Ley
de Lambert-Beer dentro del intervalo de aproximadamente 75%-125% de la concentración
final usada en la valoración. En estas circunstancias, la absorbancia medida en la valoración se
puede interpolar en la curva estándar y se puede calcular el resultado de la valoración. Dichas
curvas estándar deben ser confirmadas con frecuencia y siempre que se vayan a utilizar
nuevos espectrofotómetros o nuevos lotes de reactivos.