INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y

BIOQUÍMICA

INFORME TÉCNICO DE RESIDENCIAL FINAL

“CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE

REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON EL
PLAGUICIDA ORGANOFOSFORADO DICLORVOS”

PROYECTO DE PRÁCTICAS PROFESIONALES

ALUMNO: ALEMÁN FONSECA JECFFERSON

No. CONTROL 13401019 INGENIERÍA QUÍMICA

ÁREA DE TRABAJO
LIIA (Laboratorio Integral de Investigación en
Alimentos)

TEPIC, NAYARIT 08 DE ENERO DE 2018

CARACTERIZACIÓN DE BACTERIAS CON POTENCIAL DE
REMEDIACIÓN DE SUELOS CONTAMINADOS CON EL
PLAGUICIDA ORGANOFOSFORADO DICLORVOS

ASESORES

ASESOR INTERNO:

M.C.A. FIDEL ALEJANDRO LOYA GÓMEZ

ASESOR EXTERNO:

DRA. SELENE AGUILERA AGUIRRE

 AGRADECIMIENTOS

A dios por darme dado la Oportunidad de estudiar en esta gran

Institución.

A mis padres, hermanos y a mis mejores amigos por haberme

apoyado durante mi transcurso de carrera profesional por su
paciencia y comprensión.

Al Médico Alquimista Theophrastus Phillippus Aureolus

Bombastus von Hohenheim (Paracelso) por ser una de las
principales fuentes de inspiración para estudiar esta maravillosa
de carrera de Ingeniería Química. “Es médico quien sabe de lo
invisible, de lo que no tiene nombre ni materia, y sin embargo,
tiene su acción” (Paracelso, 1493-1541).

Al M.C.A. Fidel Alejandro Loya Gómez y al Q.F.I. Salvador Barajas

González muchas gracias por su compañerismo, comprensión,
ayuda, enseñanza y por haberme compartido sus experiencias en
la industria para la formación académica como Ingeniero.

A la Dra. Selene Aguilera Aguirre, Profesora Investigadora del LIIA

por haberme aceptado en el proyecto de investigación y desarrollo.
Gracias a su apoyo constante e incondicional, por su tiempo para
transmitir sus conocimientos para el desarrollo del proyecto, por
su gran trato amable y su amistad.

A los alumnos de Maestría y Doctorado del área de Biotecnología,

por su valiosa ayuda y su apoyo constante en asesorías.
 RESUMEN

En el desarrollo de este proyecto se requirió realizar un estudio sobre algunas

muestras de suelo procedentes de tierras de cultivo y sedimentos localizadas en el
estado de Nayarit con un alto historial de contacto con plaguicidas organofosforados.
El plaguicida de estudio es el Diclorvos, se realizó una búsqueda exhaustiva de
aquellas bacterias que son resistentes y degradan al plaguicida Diclorvos a distintas
concentraciones usando medios de cultivo ricos y mínimos (medios de cultivo sólido)
incubando a condiciones a temperatura ambiente de 25 °C durante 24-48 h,
posteriormente se seleccionaron aquellas bacterias que crecieron en los medios de
cultivo sólidos ricos y mínimos usando el criterio de selección que las bacterias
estuvieran aisladas y de gran tamaño, las cepas aisladas se sembraron por picadura
y estriado (se obtuvieron 107 cepas de las M1, M2 y M3 para el caso de estudio). Se
realizó la caracterización de las cepas aisladas en medios de cultivo líquido ricos
(BROTH LB) aplicando el método de calentamiento a 100 °C para la identificación del
genero Bacillus. Se aplicó la tinción gram a las cepas aisladas para clasificarlas en
bacterias gram positivas o negativas, las pruebas bioquímicas para determinar la
actividad metabólica, identificación y clasificación de los géneros bacterianos. De las
cepas aisladas se seleccionaron 2 cepas bacterianas nombradas como “Cep.3 y
Cep.4” para evaluar la curva de crecimiento bacteriano y la cuenta viable por el
método de diluciones seriadas, realizando 6 tomas de muestra de absorbancia
durante un periodo de 3 ó 5 horas y sembrando las muestras en medios de cultivo
para registrando UFC. Se realizó la extracción de DNA Cromosómico de las cepas
“3” y “4” mediante electroforesis para identificar la especie a la que pertenece. Los
resultados de este estudio sugieren que las cepas bacterianas aisladas no degradan
al plaguicida Diclorvos, sin embargo se obtienen metabolitos (residuos) que son más
tóxicos que el propio plaguicida. Por lo tanto, es necesario buscar otra estrategia
para la degradación parcial o total del plaguicida Diclorvos presente en suelos.
 ÍNDICE DE CONTENIDO

Contenido
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................................... 1

CAPITULO 1.- ÁREA DEL TRABAJO ....................................................................................... 1

CAPITULO 2.- PROBLEMAS A RESOLVER ............................................................................ 1

CAPITULO 3.- OBJETIVOS ....................................................................................................... 2

GENERAL................................................................................................................................ 2

ESPECÍFICOS ......................................................................................................................... 2

CAPITULO 4.- JUSTIFICACIÓN ................................................................................................ 2

CAPITULO 5.- MARCO TEÓRICO/ANTECEDENTES .............................................................. 3

5.1.- DIFINICIÓN DE PLAGUICIDA ....................................................................................... 3

5.2.- TIPOS DE PLAGUICIDAS .............................................................................................. 3

5.2.1.- PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS. ............................................................. 3

5.3.- PLAGUICIDAS USADOS EN MÉXICO.......................................................................... 4

5.4.- PLAGUICIDAS USADOS EN EL ESTADO DE NAYARIT ............................................ 6

5.5.- PLAGUICIDA DICLORVOS ........................................................................................... 7

5.5.1.- DEFINICIÓN ............................................................................................................. 7

5.5.2.- BIODEGRADACIÓN Y BIORREMEDIACIÓN MICROBIANA ................................ 8

CAPITULO 6.- PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS ACTIVIDADES REALIZADAS

................................................................................................................................................... 10

6.1.- AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE CRECIMIENTO

BACTERIAS EN PRESENCIA DEL COMPUESTO DICLORVOS EN MEDIOS DE
CULTIVO SÓLIDOS .............................................................................................................. 10

6.1.1.- PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO ................................................ 10

6.1.1.1.- MEDIO MINERAL ............................................................................................ 10

6.1.1.2.- MEDIO LURIA (LB) ......................................................................................... 11

 6.1.2.- PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SUPLEMENTADOS CON
DICLORVOS ...................................................................................................................... 11

6.1.2.1.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS........................................................... 13

6.1.2.2.- ESCRUTINIO DE CEPAS BACTERIANAS RESISTENTES AL PLAGUICIDA

........................................................................................................................................ 13

6.2.- CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE BACTERIAS

TOLERANTES EN PRESENCIA DEL PLAGUICIDA DICLORVOS ................................... 13

6.2.1.- PRODUCCIÓN DE ESPORAS. ............................................................................. 13

6.2.2.- TINCIÓN GRAM ..................................................................................................... 14

6.3.- CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN PRESENCIA DEL PLAGUICIDA

DICLORVOS .......................................................................................................................... 14

6.3.1.- CURVA DE CRECIMIENTO LB ............................................................................. 14

6.3.1.1.- PREPARACIÓN DEL PRE INOCULÓ ............................................................ 14

6.3.1.2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DE LA CURVA DE CRECIMIENTO .. 15

6.3.1.3.- RESGUARDO DE CEPAS BACTERIANAS .................................................. 15

6.3.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS ..................................................................................... 15

6.3.2.1.- PRUEBA DE OF (OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN) .................................... 15

6.3.2.2.- PRUEBA DE MOTILIDAD ............................................................................... 16

6.3.2.3.- PRUEBA DE CATALASA ............................................................................... 16

6.3.2.4.- PRUEBA DE FLUORESCENCIA.................................................................... 17

6.3.3.- CUENTA VIABLE ................................................................................................... 17

6.3.4.- PURIFICACION DE DNA CROMOSOMICO ......................................................... 17

CAPITULO 7.- RESULTADOS ................................................................................................. 19

7.1.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORAS DICLORVOS .......................... 19

7.2.- CARACTERIZACIÓN BACTERIANA .......................................................................... 19

7.2.1.- BACTERIAS PRODUCTORAS DE ESPORAS .................................................... 19

7.2.2.- TINCIÓN GRAM ..................................................................................................... 20

 7.3.- CURVAS DE CRECIMIENTO ....................................................................................... 22

7.4.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS ........................................................................................... 25

7.4.1.- PRUEBA DE OF (OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN) .......................................... 25

7.4.2.- PRUEBA DE MOTILIDAD ..................................................................................... 26

7.4.3.- PRUEBA DE CATALASA ...................................................................................... 27

7.4.4.- PRUEBA DE FLUORESCENCIA .......................................................................... 28

7.5.- CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE ....................................................... 29

7.6.- PURIFICACIÓN DE DNA CROMOSOMICO ................................................................ 36

CAPITULO 8.- CONCLUSIONES............................................................................................. 37

CAPITULO 9.- COMPETENCIAS DESAROLLADAS Y/O APLICADAS ............................... 38

CAPITULO 10.- FUENTES DE INFORMACIÓN...................................................................... 39

ANEXOS .................................................................................................................................... 42

ANEXO 1 ............................................................................................................................... 42

ANEXO 2 ............................................................................................................................... 43

ANEXO 3 ............................................................................................................................... 44

ANEXO 4 ............................................................................................................................... 44

ANEXO 5 ............................................................................................................................... 45

ANEXO 6 ............................................................................................................................... 46

ANEXO 7 ............................................................................................................................... 47

ANEXO 8 ............................................................................................................................... 48

ANEXO 9 ............................................................................................................................... 48

ANEXO 10 ............................................................................................................................. 50

ANEXO 11 ............................................................................................................................. 51

ANEXO 12 ............................................................................................................................. 51

ANEXO 13 ............................................................................................................................. 52

ANEXO 14 ............................................................................................................................. 52
 ANEXO 15 ............................................................................................................................. 54

LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1. Frecuencia de uso de agroquímicos en los diferentes estados de México (Jiménez,
2001). ____________________________________________________________________________________ 5
FIGURA 2. Plaguicidas Usados en el Estado de Nayarit (González et al., 2010). _______________ 7
FIGURA 3. Estructura Química del Diclorvos (Dikshith, 1990). _______________________________ 7
FIGURA 4. Examen de Catalasa. __________________________________________________________ 17
FIGURA 5. Porcentaje de bacterias resistentes al tratamiento térmico. ______________________ 20
FIGURA 6. Representación de porcentajes de bacterias de Tinción Gram. ___________________ 20
FIGURA 7. Clasificación de Bacterias aisladas según su forma. _____________________________ 21
FIGURA 8. Curva de Crecimiento Cepa B5. _________________________________________________ 22
FIGURA 9. Curva de crecimiento bacteriano Cep.3. ________________________________________ 23
FIGURA 10. Curva de Crecimiento Bacteriano Cep.4. _______________________________________ 24
FIGURA 11. Resultados de la Prueba Bioquímica OF. ______________________________________ 25
FIGURA 12. Representación de porcentajes de bacterias de la prueba OF. __________________ 26
FIGURA 13. Resultados de la Prueba de Motilidad _________________________________________ 27
FIGURA 14. Resultados de la Prueba de Catalasa. _________________________________________ 28
FIGURA 15. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable CYL233 CON DICLORVOS. ______________ 29
FIGURA 16. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 Sólo. _____________________________ 30
FIGURA 17. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 con 250 ppm de Diclorvos. ________ 31
FIGURA 18. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 con 875 ppm de Diclorvos. ________ 32
FIGURA 19. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 Sólo. _____________________________ 33
FIGURA 20. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 con 250 ppm de Diclorvos. ________ 34
FIGURA 21. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 con 875 ppm de Diclorvos. ________ 35
FIGURA 22. Visualización con Luz UV de las muestras de DNA con gel agarosa al 1 %. ______ 36
FIGURA 23. Escrutinio de Bacterias resistentes al plaguicida Diclorvos. ____________________ 42
FIGURA 24. Caja de crecimientos bacterianos concentrados. _______________________________ 42
FIGURA 25. Método Por picadura M. Mineral. ______________________________________________ 43
FIGURA 26. Método por Picadura en Lb. __________________________________________________ 43
FIGURA 27. Tratamiento Térmico en Lb. ___________________________________________________ 44
FIGURA 28. Bacteria de Control E. Coli sembrada en Placa. ________________________________ 44
FIGURA 29. Cultivo Líquido Lb de la Cepa de control E. Coli a distintas concentraciones. ___ 45
FIGURA 30. Bacteria de Control B5. _______________________________________________________ 45
FIGURA 31. Estriadas sembradas en caja Lb sólido. _______________________________________ 46
FIGURA 32. Gram Positivas. ______________________________________________________________ 47
FIGURA 33. Gram Negativas. _____________________________________________________________ 47
FIGURA 34. Curva de Crecimiento en Lb líquido. ___________________________________________ 48
FIGURA 35. Control E. Coli. _______________________________________________________________ 48
FIGURA 36. Control B5. ___________________________________________________________________ 49
FIGURA 37. Control CYL233. ______________________________________________________________ 49
FIGURA 38. Prueba bioquímica de Motilidad. ______________________________________________ 50
FIGURA 39. Visualización en el Microscopio Binocular de bacterias con morfología bacilar. __ 50
FIGURA 40. Prueba bioquímica de Catalasa. ______________________________________________ 51
FIGURA 41. Prueba bioquímica Fluorescencia. ____________________________________________ 51
FIGURA 42. Cuenta viable. ________________________________________________________________ 52
FIGURA 43. Cámara de Electroforesis. ____________________________________________________ 52
FIGURA 44. Extracción de DNA cepas aisladas Cep.3 y Cep.4. ______________________________ 53
FIGURA 45. Constancia del programa del congreso UAN 2017. _____________________________ 54
 LISTA DE TABLAS
Tabla 1. Estados con mayor incidencia de intoxicación por plaguicidas (Ortíz et al., 2014). ------- 6
Tabla 2. Reactivos para la preparación de 1 l de Medio Mineral. ------------------------------------------------ 10
Tabla 3. Reactivos para la preparación de 1 l de Lb. ------------------------------------------------------------------ 11
Tabla 4. Concentraciones usadas en el estudio del Plaguicida Diclorvos. --------------------------------- 12
Tabla 5. Compuestos usados para la preparación de la prueba OF. ----------------------------------------- 15
Tabla 6. Tratamiento Térmico de las cepas bacterianas aisladas. ---------------------------------------------- 19
Tabla 7. Registro de No. Bacterias Obtenidas de la Tinción Gram. -------------------------------------------- 20
Tabla 8. No. de bacterias aisladas según su forma. ------------------------------------------------------------------- 21
Tabla 9. Registro de No. de Bacterias Prueba OF. ---------------------------------------------------------------------- 26
Tabla 10. Registro de No. Bacterias en la Prueba Motilidad. ------------------------------------------------------ 27
Tabla 11. No. de Registro de Bacterias en la Prueba de Catalasa. --------------------------------------------- 27
Tabla 12. Bacterias en la Prueba de Fluorescencia. ------------------------------------------------------------------- 28
INTRODUCCIÓN
A nivel nacional, los plaguicidas son utilizados en exceso, y el estado de Nayarit no
es la excepción. Uno de los principales tipos de plaguicidas usados son los
organofosforados que contribuyen a la contaminación de suelos agrícolas. El
Diclorvos, es un plaguicida perteneciente al grupo de los plaguicidas
organofosforados. En la actualidad en Nayarit, el Diclorvos constituye una grave
amenaza para las tierras de cultivo debido a su baja degradación en suelo.

Es por tal motivo que se han buscado estrategias biológicas que permitan mitigar el
efecto nocivo que ejercen estos contaminantes. Una de las alternativas es la
búsqueda de microorganismos que tengan la capacidad de degradar estos
compuestos. La remediación bacteriana es una alternativa viable que involucra el uso
de un banco de bacterias aisladas para la degradación del contaminante. Este es un
método de estudio que se obtienen muy buenos resultados y tiene bajo costo en
comparación con otros métodos de degradación de plaguicidas. Para ello se realiza
la selección rigurosa de grupos de bacterias que tienen un potencial alto en la
degradación del plaguicida.

En el presente proyecto de Investigación y desarrollo se describe el estudio que se

realizó a partir de muestras de suelo de suelo agrícola del municipio de Santiago
Ixcuintla, Nayarit y de sedimentos de la presa de Aguamilpa. A partir de una
investigación exhaustiva se planteó la necesidad de encontrar aquellas bacterias con
capacidad de crecer y degradar el plaguicida Diclorvos, adicionalmente se llevó a
cabo su caracterización bioquímica y extracción de DNA Cromosómico.

CAPITULO 1.- ÁREA DEL TRABAJO

El presente proyecto se desarrolló en el Laboratorio de Biotecnología de Alimentos,
en el Laboratorio Integral de Investigación en Alimentos (LIIA), perteneciente al
Instituto Tecnológico de Tepic. El laboratorio cuenta con equipo especializado para
trabajar en las áreas de biología molecular, ingeniería genética, aislamiento e
identificación de fitopatógenos.

1| P á g i n a
CAPITULO 2.- PROBLEMAS A RESOLVER
En los últimos años, la agricultura ha experimentado algunos cambios en distintos
aspectos (labores culturales, semillas, fertilización, protección vegetal, biotecnología,
etc.), lo cual hizo posible que el rendimiento de los cultivos aumenten en la misma
proporción que la población. La modernización de la agricultura y el incremento de la
producción han sido acompañados de un aumento de insumos y actividades
agrícolas limitando la práctica de lo que se llama agricultura sustentable. El uso
excesivo que se ha hecho de los plaguicidas, como es el caso de los
organofosforados, ha causado gran deterioro en los suelos cultivables.
Desafortunadamente, los beneficios aportados por estos compuestos han ido
acompañados de daños, algunos de ellos tan graves que ahora representan una
amenaza a largo plazo, para la supervivencia de importantes ecosistemas. En la
actualidad, los plaguicidas organofosforados en el estado de Nayarit constituyen el
52 % de los más vendidos en el estado.

Una de las principales actividades en el estado de Nayarit es la agricultura. Debido a

la creciente demanda en el mercado y la necesidad de obtener una mayor
producción agrícola. El uso excesivo de los plaguicidas, con la finalidad de eliminar
plagas que interfieren en el rendimiento de los cultivos, ha provocado problemas de
contaminación y en la salud de las personas y animales. El Diclorvos es un
insecticida usado en el estado de Nayarit para controlar plagas de insectos, sin
embargo, en el suelo es muy difícil que se degrade lo cual ha tenido un impacto
relativamente importante en la fertilidad de los suelos de cultivo en el estado de
Nayarit. En este sentido, la presente propuesta se enfocó en la atención a esta
problemática de la contaminación del suelo por plaguicidas.

1|Página
CAPITULO 3.- OBJETIVOS
GENERAL

Aislar y caracterizar cepas bacterianas nativas con la capacidad de crecer en

presencia del compuesto Diclorvos.

ESPECÍFICOS

a) Aislar y evaluar la capacidad de crecimiento bacterias en presencia del

Plaguicida Diclorvos en medios de cultivo sólidos.
b) Caracterizar las cepas bacterianas tolerantes en presencia del plaguicida
Diclorvos.
c) Determinar la curva de crecimiento bacteriano en presencia del plaguicida
Diclorvos.

CAPITULO 4.- JUSTIFICACIÓN

El proyecto se deriva debido a la creciente preocupación sobre la contaminación del
suelo con agroquímicos, como los plaguicidas. En este sentido, existe la necesidad
de reducir el exceso de plaguicidas, como lo es el Diclorvos, un organofosforado que
está presente en suelos de cultivo del estado de Nayarit. Este compuesto se
considera una amenaza y al mismo tiempo un gran desafío para resolver esta
problemática del sector de la agricultura. Para esto, el uso de bacterias degradadoras
(remediación bacteriana) de plaguicidas y adaptadas al tipo de suelo y sus
condiciones, representan una alternativa para poder contrarrestar el efecto nocivo de
estos compuestos. Las bacterias se consideran organismos que se adaptan con
facilidad a cambios de ambiente y son tolerantes a temperaturas extremas en el
medio donde se desarrollan. De acuerdo con esto, el presente estudio permitió
seleccionar y caracterizar bacterias nativas capaces de degradar al plaguicida
Diclorvos, lo cual sentará las bases para proponer estrategias de degradación.

2|Página
CAPITULO 5.- MARCO TEÓRICO/ANTECEDENTES
5.1.- DIFINICIÓN DE PLAGUICIDA

Los plaguicidas son los contaminantes de origen antrópico presentes en ambientes

naturales. En ese ambiente, factores naturales como la biodegradación, la
fotodegradación y la hidrólisis química disminuyen su persistencia y por lo tanto su
ecotoxicidad (Narváez et al., 2012).

La elevada toxicidad de la mayoría de los plaguicidas y de algunos de sus

compuestos aconseja atender con prontitud el estudio de esta problemática con la
finalidad de evitar los efectos nocivos sobre los seres vivos (Morrell & Candela,
1998). La FAO/OMS define el termino plaguicida como “cualquier sustancia o mezcla
de ellas utilizada para prevenir o controlar plantas o animales indeseables e incluso
aquellas otras destinadas a utilizarse como regulador del crecimiento de la planta,
defoliante o desecante” (Morrell & Candela, 1998).

Muchos plaguicidas han ayudado a la humanidad en el control de plagas, pero

también han causado un gran número de alteraciones, como son el cáncer,
mutaciones y abortos espontáneos (Jiménez, 2001). Los plaguicidas que más se han
estudiado a nivel mundial son el grupo de insecticidas organoclorados y
organofosforados, por varias razones: su uso indiscriminado, el daño que causan a la
salud humana y la persistencia y residualidad que poseen (IICA, 1983).

5.2.- TIPOS DE PLAGUICIDAS

De acuerdo con su estructura química, los plaguicidas se clasifican en diversas

familias: organoclorados, organofosforados, carbamatos, tiocarbamatos y piretroides,
entre otros (Ramírez & Lacasaña, 2001).

5.2.1.- PLAGUICIDAS ORGANOFOSFORADOS.

Químicamente son esteres del ácido fosfórico y sus homólogos. Estos compuestos
tienen alta presión de vapor por lo cual son muy volátiles, dicha volatilidad se
acrecienta con la temperatura. Desde el punto de vista toxicológico, están
clasificados como plaguicidas de alta toxicidad aguda (IICA, 1983).

3|Página
Los plaguicidas organofosforados son los más utilizados en la agricultura debido a su
escasa persistencia en el medio ambiente y su gran actividad. Son potencialmente
muy tóxicos para el hombre pero los riesgos se asocian sobre todo con episodios de
intoxicaciones agudas que cursan con la sintomatología colinérgica propia de la
inhibición de colinesterasas (Fest. & Schmidt, 1973, Primo & Carrasco, 1990)
(Brotons, 2003).

Los principales organofosforados degradados por microorganismos previamente

reportados son el clorpirifós, malatión, fenamifos, diazinón, diclorvos, paratión, metil
paratión, etoprofos, dimetoato, fosfato de tributilo, fenitrotión, profenofos, forato,
metamidofos, triazofos, cadusafos y tetraclorvinfos (Hernández et al., 2017).

5.3.- PLAGUICIDAS USADOS EN MÉXICO

En México, el uso de plaguicidas tiene una fuerte concentración en algunas regiones

y cultivos. Los estados con mayor uso de plaguicidas son Sinaloa, Chiapas,
Veracruz, Jalisco, Nayarit, Colima, Sonora, Baja California, Tamaulipas, Michoacán,
Tabasco, Estado de México, Puebla y Oaxaca. Se calcula que en ellos se aplica 80
% del total de plaguicidas usados en el país (Albert, 2005).

Por otro lado, en México existe una gran distribución geográfica de agroquímicos que
han sido restringidos en otros países. En la Figura 1 se muestra la distribución de
uso de plaguicidas en los diferentes estados de México, cabe señalar que Nayarit se
encuentra ocupando el noveno lugar, con una alta frecuencia de uso de estos
compuestos (Jiménez, 2001).

4|Página
FIGURA 1. Frecuencia de uso de agroquímicos en los diferentes estados de México
(Jiménez, 2001).

En México se calcula que existen alrededor de 900 plaguicidas y los cultivos en los
que se usa el mayor volumen de insecticidas químicos son: maíz, algodón, papa,
chile, tomate, frijol, trigo, etc. en cantidades que van desde 395 hasta 13,163 ton de
plaguicidas al año (AMIPFAC, 1995). Se emplean 260 marcas de productos químicos
de las cuales 24 están prohibidas y 13 restringidas, siendo las principales causas de
intoxicación debido a las deficientes medidas de control y previsión
(CICLOPLAFEST, 2008).

Por otro lado, la información del CENAVECE permite identificar las zonas donde se
presenta la mayor incidencia de accidentes relacionados con productos químicos,
particularmente plaguicidas. A este respecto, los estados con mayor incidencia
(Tabla 1) se encuentran en el Pacífico Mexicano, siendo Colima y Nayarit los que
presentaron índices hasta siete veces superiores a la media nacional, lo cual está
relacionado con su importante actividad agrícola (Ortíz et al., 2014).

5|Página
Tabla 1. Estados con mayor incidencia de intoxicación por plaguicidas (Ortíz et
al., 2014).

5.4.- PLAGUICIDAS USADOS EN EL ESTADO DE NAYARIT

Los plaguicidas son compuestos ampliamente utilizados en la agricultura y para

controlar vectores que transmiten enfermedades a hombres y animales. Se investigó
el patrón actual de venta y uso de plaguicidas en Nayarit, uno de los principales
estados agrícolas en México; estos datos no existen en la literatura. Se aplicó una
encuesta a los encargados de los establecimientos de venta de agroquímicos en el
estado; de acuerdo a los resultados, los insecticidas son los plaguicidas más
frecuentemente empleados (45.9 %), seguidos de los herbicidas (30.5 %), fungicidas
(20.1 %), entre otros. En la Figura 2, se muestra los distintos tipos de plaguicidas
usados en el estado de Nayarit (González et al., 2010).

6|Página
FIGURA 2. Plaguicidas Usados en el Estado de Nayarit (González et al., 2010).

5.5.- PLAGUICIDA DICLORVOS

5.5.1.- DEFINICIÓN

FIGURA 3. Estructura Química del Diclorvos (Dikshith, 1990).

El Diclorvos es un líquido de color incoloro a ámbar. Es miscible con la mayoría de

los disolventes orgánicos y en cierta medida, con agua, es altamente tóxico para los
animales (Dikshith, 1990; ATSDR, 1997). En la Figura 3 indica la estructura química
del Diclorvos (2,2-diclorovinil dimetil fosfato); DDVP.

El Diclorvos ha sido ampliamente utilizado en el control de una variedad de plagas

agrícolas (Chen & Liu, 1995), tiene una fuerte tendencia a la alquilación, que podría
dañar el ADN y causar mutaciones o cáncer (McHenery et al., 1991).

Aunque el Diclorvos tiene la ventaja de una persistencia relativamente baja en el

suelo en comparación con los plaguicidas organoclorados, se ha detectado en
granos, verduras y suelos en algunas áreas tratadas con este compuesto (Dong &
Zhang, 2003; Fishbein, 1976; Li & Jiang, 2004). Los seres humanos y los animales
que ingieren alimentos contaminados con Diclorvos o que han estado expuestos a un

7|Página
ambiente contaminado durante un largo período de tiempo pueden exhibir el
fenómeno de toxicosis, pérdida de conciencia y trastorno mental (Liao et al., 2003).

5.5.2.- BIODEGRADACIÓN Y BIORREMEDIACIÓN MICROBIANA

Biorremediación es la eliminación de xenobióticos contaminantes del medio ambiente

mediante el uso de microorganismos y es un reto científico cada vez más importante
y en rápida expansión (Ilyina et al., 2003). Es un método muy rentable para degradar
compuestos tóxicos y convertirlos en productos inocuos. Se ha reportado para
muchos compuestos una exitosa eliminación de plaguicidas del suelo por la acción
bacteriana (Karpouzas et al., 2000). Los procesos de biodegradación se deben
fundamentalmente a la microflora del suelo. Los microorganismos degradadores de
plaguicidas se encuentran tanto en suelos y medios acuáticos como en aguas
residuales de tratamiento de plantas, además de que un gran número y diversidad de
microorganismos pueden ser encontrados en suelos de cultivo (Cruz Guzmán, 2007).

La biorremediación consiste en la inoculación con cepas de microorganismos que

son capaces de degradar las moléculas de contaminante. Idealmente, la degradación
completa de los contaminantes es deseable, pero, como mínimo, debe ser alcanzada
su transformación en productos no tóxicos. Son relativamente pocos los herbicidas
aplicados al suelo que han demostrado ser susceptibles a la mineralización de
cultivos puros de microorganismos (Shelton et al., 1996).

Los microorganismos que más se utilizan como biorremediadores de

organofosforados son los géneros Serratia, Bacillus y Pseudomonas. Se concluye
que el éxito de la biorremediación depende de la capacidad competitiva de los
microorganismos, de la biodisponibilidad y la concentración del organofosforado, del
pH, la temperatura y el tipo de suelo, así como de la presencia de suplementos
nutricionales y de la concentración alta del inóculo (Hernández et al., 2017).

Algunos de los microorganismos que disminuyen el grado de toxicidad de los

compuestos organofosforados son Lactobacillus (que incluyen especies como L.
bulgaricus, L. paracasei y L. plantarum) que demostraron tener una fuerte
aceleración de la degradación de estos compuestos (Zhao & Wang, 2012).

8|Página
La cepa identificada como Bacillus brevis resultó con mayor capacidad de
crecimiento en un medio mínimo con paratión metílico como única fuente de carbono
y en medio líquido. Burkolderia cepacia es una bacteria con capacidad de crecer en
medio liquido con cadusafos; se ha reportado para la recuperación de suelos
contaminados con residuos tóxicos (Castrejón et al., 2010).

Matsumura & Boush (1968) encontraron evidencia de que el Diclorvos se degrada

por microorganismos del suelo como Trichoderma viride y Pseudomonas melophtora
(Boush & Matsumura, 1968; Lavagelia & Dahm, 1977).

Estudios in vitro realizados por Lamoreaux & Newland (1978) mostraron que la
bacteria B. cereus (aislada del suelo) es capaz de usar Diclorvos como fuente de
carbono única o adicional, pero no como la única fuente de fósforo. La degradación
del Diclorvos fue rápida cuando se agregó B. Cereus a un suelo previamente
esterilizado. El 30% de la degradación fue atribuido a las bacterias (Lamoreaux &
Newland, 1978). Por otra parte, una bacteria degradadora de Diclorvos (cepa DDV-
1) fue aislada e identificada como Ochrobactrum sp. (Zhang et al., 2006).

9|Página
CAPITULO 6.- PROCEDIMIENTO Y DESCRIPCIÓN DE LAS
ACTIVIDADES REALIZADAS
6.1.- AISLAMIENTO Y EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD DE
CRECIMIENTO BACTERIAS EN PRESENCIA DEL COMPUESTO
DICLORVOS EN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS

El aislamiento de bacterias degradadoras de Diclorvos se realizó a partir de las

muestras de suelo que se colectaron en las tierras de cultivo localizadas cercas del
río grande de Santiago (Municipio de Santiago Ixcuintla, Nayarit) y muestras de
sedimentos de la presa de Aguamilpa, los cuales tienen un historial de contacto con
plaguicidas sintéticos. Se etiquetaron como M1: Muestra Aguamilpa, M2 y M3:
Muestras cultivos y fueron transportadas al LIIA. Se almacenaron hasta su uso.

6.1.1.- PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

6.1.1.1.- MEDIO MINERAL

Tabla 2. Reactivos para la preparación de 1 l de Medio Mineral.

Macronutrientes Elementos traza

Compuesto (mg/1 L) Compuesto (mg/1 L)

NH4Cl 1045 FeCl2*6H2O 2000

KCl 270 MnCl2*4H2O 786

KH2PO4 170 EDTA*2H2O 554

MgSO4*7H2O 185 H3BO3 50

CaCl2*2H2O 50 ZNCl2 50

NaHCO3 125 (NH4)6Mo7O24*4H2O 50

10 | P á g i n a
Extracto de 20 AlCl3*6H2O 91
Levadura

Sol. Elementos 1 ml/L

traza

6.1.1.2.- MEDIO LURIA (LB)

Tabla 3. Reactivos para la preparación de 1 l de Lb.

Preparación de 1 L

Triptona 10 g

Extracto de 5g
levadura

NaCl 5g

Agua destilada c.b.p 1 L

La preparación de cada medio se llevó a cabo mezclando los reactivos. El medio se

esterilizó en una autoclave a 121°C durante 15 min.

6.1.2.- PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO SUPLEMENTADOS CON

DICLORVOS

Se llevaron a cabo los cálculos para la preparación de las diluciones, del plaguicida a
razón de partes por millón (ppm), conociendo los siguientes datos:

Para las evaluaciones se utilizó un producto comercial que se aplica en los cultivos
nayaritas. Este producto es el DDVP 500 y contiene Diclorvos (2,2-Diclorovinil
dimetil fosfato) a razón de 47.5% en peso equivale a 500 g de i.a/L. Este compuesto
es un organofosforado clorado con actividad insecticida y acaricida por ingestión,
contacto y vapor, que se caracteriza por su capacidad de penetración y volatilidad.
Las concentraciones evaluadas para el Diclorvos fueron desde 50 hasta 1500 ppm.

11 | P á g i n a
 Tabla 4. Concentraciones usadas en el estudio del Plaguicida Diclorvos.

Concentración Plaguicida
𝝁𝒍
Diclorvos (𝟐𝟓𝟎 𝒎𝒍 )

1500 ppm 1578.94 𝜇𝐿

1375 ppm 1447. 36 𝜇L

1250 ppm 1315. 78 𝜇L

1125 ppm 1184.21 𝜇𝑙

1000 ppm 1052.63 𝜇𝑙

875 ppm 921.05 𝜇𝑙

750 ppm 789 𝜇𝑙

625 ppm 657. 89 𝜇𝑙

500 ppm 526.31 𝜇𝑙

375 ppm 394.73 𝜇𝑙

250 ppm 263.15 𝜇𝑙

125 ppm 131. 57 𝜇𝑙

100 ppm 105 𝜇𝑙

50 ppm 52.6 𝜇𝑙

Para preparar los medios suplementados con el plaguicida se adicionaron las

cantidades descritas en la tabla anterior.

12 | P á g i n a
6.1.2.1.- PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS

Se realizó el siguiente procedimiento, tomando en cuenta que la muestra señalada

como M1 fue muestra de sedimento de Aguamilpa, la M2 y M3 fueron las muestras de
suelo agrícola:

1. Se asperjaron las muestras de suelo con 200 ppm del compuesto. Se dejaron
en obscuridad por 20 días.
2. Se pesaron 20 gr de cada muestra y se mezclaron con 200 mL de agua
destilada y estéril.
3. Las mezclas se agitaron durante 1 h para el desprendimiento de las bacterias.

6.1.2.2.- ESCRUTINIO DE CEPAS BACTERIANAS RESISTENTES AL

PLAGUICIDA

Preparación de medio suplementado con plaguicida e inoculación.

Previamente se prepararon cajas de medio suplementado a las diferentes

concentraciones. A cada caja se agregaron 200 μL de la muestra correspondiente.

1. Se adicionaron perlas de vidrio estériles para distribuir la muestra, se esperó

hasta que la muestra se secara y se guardaron las cajas debidamente
etiqueta.
2. Se seleccionaron las colonias bacterianas que crecieron en las mayores
concentraciones del plaguicida.

6.2.- CARACTERIZACIÓN MACROSCÓPICA Y MICROSCÓPICA DE

BACTERIAS TOLERANTES EN PRESENCIA DEL PLAGUICIDA
DICLORVOS

6.2.1.- PRODUCCIÓN DE ESPORAS.

1. En tubos Eppendorf estériles se agregaron 500 μL de LB y se inoculó la cepa

bacteriana.
2. Los cultivos se incubaron a 25 oC durante 48 horas.
3. Se aplicó calentamiento los tubos Eppendorf en un Termoblock a 100 oC
durante 40 minutos.

13 | P á g i n a
 4. Posteriormente, se tomaron muestras de los tubos y se inocularon en cajas
con LB. Las cajas se incubaron a 25 oC durante 48 horas.
5. Se seleccionaron las bacterias que crecieron en medio LB ya que son aquellas
que producen esporas.

6.2.2.- TINCIÓN GRAM

1. Se colocó 1 una gota de agua destilada en el centro de un portaobjetos y se

mezcló con el cultivo bacteriano dejando una capa delgada. La muestra se fijó
al frotis pasando el portaobjetos sobre la llama de un mechero de Bunsen.
2. Se adicionó en el frotis una solución de cristal violeta durante un minuto. Se
lavó suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
3. Se adicionó yodo-lugol un minuto. Se lavó con agua el exceso de yodo-lugol.
4. Se agregó por goteo alcohol-acetona de forma continua hasta que la
preparación perdió color y se lavó con agua.
5. Se cubrió la preparación con una solución de safranina durante un minuto. Se
lavó con agua y secó a temperatura ambiente.
6. Las muestras se observaron al microscopio.

6.3.- CURVA DE CRECIMIENTO BACTERIANO EN PRESENCIA DEL

PLAGUICIDA DICLORVOS

Se seleccionaron dos de las cepas que toleraron la concentración más alta de

plaguicida Diclorvos. Estas cepas fueron la 3 y 4. Para los ensayos se utilizaron
cepas control. Una de ellas fue la cepa rizosférica B5 y la cepa de Pseudomonas
CYL233.

6.3.1.- CURVA DE CRECIMIENTO LB

6.3.1.1.- PREPARACIÓN DEL PRE INOCULÓ

1. En tubos falcón se colocó medio LB y se inoculó con la cepa seleccionada.

2. Se incubaron con agitación constante durante 24 h a una temperatura de 25
°C.

14 | P á g i n a
6.3.1.2.- PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL DE LA CURVA DE CRECIMIENTO

1. Se agregó pre inoculó a matraces conteniendo 50 mL de LB líquido

suplementado con el plaguicida a la concentración deseada. Se estandarizó a
una absorbancia de 0.01 a una D.O. de 600 nm.
2. Los matraces se incubaron a 25 °C hasta alcanzar la etapa estacionaria del
crecimiento.
3. Cada tres horas se colectaron muestras para llevar a cabo la lectura en el
espectrofotómetro.

6.3.1.3.- RESGUARDO DE CEPAS BACTERIANAS

1. En tubos Eppendorf se colocaron 500 µL de un cultivo crecido de la cepa de

interés.
2. Se adicionaron 500 µL de una solución de glicerol al 80% estéril.
3. Las muestras se almacenaron en un REVCO a una temperatura de -80 °C.

6.3.2.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

6.3.2.1.- PRUEBA DE OF (OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN)

Tabla 5. Compuestos usados para la preparación de la prueba OF.

Reactivo Cantidad

Peptona. 2g

NaCl. 5g

D-glucosa. 10g

Azul de bromotimol. 0.03g

Agar. 3g

Fosfato dipotásico. 0.3g

Agua destilada. 1000 ml.

15 | P á g i n a
 1. Se prepararon 750 ml de medio OF. Se agregaron 4 mL de medio OF a tubos
de ensayo estériles.
2. Los medios se inocularon por picadura utilizando un asa recta. Se colocaron
dos tubos por cepa. Uno de los tubos se adicionó 1 ml de aceite mineral.
3. Los cultivos se incubaron a 25 °C durante 72 h.

6.3.2.2.- PRUEBA DE MOTILIDAD

1. En un portaobjetos se colocó una gota de medio mineral estéril. Con un palillo

estéril se colocó muestra bacteriana.
2. Se homogeneizó de tal forma que la gota no se extendiera demasiado. Por
encima se colocó un cubreobjetos al que previamente se le ha puesto una
base de 4 bolitas pequeñas de plastilina con el objetivo de evitar que aplaste
totalmente la gota con la bacteria.
3. Se observó al microscopio con un objetivo de 40X. Se evaluó la movilidad de
las bacterias.

6.3.2.3.- PRUEBA DE CATALASA

1. En un portaobjetos se colocó una gota de medio mineral estéril. Con un palillo

estéril se colocó muestra bacteriana.
2. Se agregó una gota de Peróxido de Hidrógeno. Se observó la aparición de
burbujas.
Si se observa el burbujeo significa que hay producción de oxígeno por lo tanto
se entiende que hay presencia de la enzima catalasa es control positivo tal
como lo indica la Figura 4.

16 | P á g i n a
 FIGURA 4. Examen de Catalasa.

6.3.2.4.- PRUEBA DE FLUORESCENCIA

1. A cajas de Petri conteniendo cultivos bacterianos, se les incidió luz

ultravioleta.
2. Utilizando un equipo Logic 100 IMAGING SYSTEM, se capturó la imagen.
Se evaluaron las colonias fluorescentes.

6.3.3.- CUENTA VIABLE

1. Durante el desarrollo de las curvas de crecimiento se tomaron muestras en

intervalos de 3 horas.
2. Se prepararon cajas Petri conteniendo LB.
3. A partir de las muestras de cultivo colectadas se llevaron a cabo diluciones
seriadas 1:10, 1:100; 1:1,000, 1:10,000, 1:100,000, 1:1,000,000.
En las cajas de Petri se plaquearon 100 µL de las diluciones correspondientes.
Se incubaron durante 24-48 h a 25 oC.
4. Se contaron las colonias en cada caja y se llevó a cabo el cálculo de las
unidades formadoras de colonia por mL.

6.3.4.- PURIFICACION DE DNA CROMOSOMICO

1. Se preparó un cultivo bacteriano como se ha descrito anteriormente.

2. Se transfirió el cultivo bacteriano a tubos Eppendorf y se centrifugaron a
12,000 rpm a 25 oC por 5 min. Se desechó el sobrenadante para recuperar las
células bacterianas.

17 | P á g i n a
3. Por cada 1.5 ml de cultivo se adicionaron 200 μl de la solución de Lisis. Se
resuspendió la pastilla celular y se incubó a 37 oC por 15 minutos.
4. Se adicionaron 66 μl de NaCl 5 ml y se mezcló vigorosamente. Se centrifugó a
12,000 rpm a 4 oC por 10 min.
5. Se recuperó el sobrenadante y se adicionó un volumen de fenol: cloroformo
(1:1) y se mezcló. Se centrifugó a 12,000 rpm a 25 oC por 5 min.
6. Se recuperó el sobrenadante y se adicionó 1 volumen de cloroformo, se
mezcló y centrifugó a 12,000 rpm a 25 oC por 5 min.
7. Se recuperó el sobrenadante y se adicionaron 2 volúmenes de isopropanol a 4
oC. Se mezcló y se eliminó el sobrenadante. Al precipitado se adicionaron
volúmenes de etanol al 70 %. Se mezcló y centrifugó a 12000 rpm a 25 oC por
30 s y se eliminó el sobrenadante.
8. Se dejó secar el DNA a temperatura ambiente por 10 min.
9. Se adicionaron 30 μl de TE/RNAsa, se mezcló e incubó a 37 oC por 15 min.
Se almacenó el DNA A -20 oC.
10. Las muestras de DNA se visualizaron mediante electroforesis en geles de
agarosa al 1%.

18 | P á g i n a
CAPITULO 7.- RESULTADOS
7.1.- AISLAMIENTO DE BACTERIAS DEGRADADORAS DICLORVOS

A partir de las muestras de estudio del suelo de tierras de cultivo del río de Grande
Santiago y de sedimentos de suelo de la Presa Aguamilpa, se aislaron las cepas
bacterianas realizando un escrutinio riguroso. Se obtuvieron 107 cepas bacterianas
aisladas en LB sólido (7 cepas M1, 50 cepas M2 y 50 cepas M3). Estas bacterias
fueron capaces de crecer en las concentraciones más altas del plaguicida.

7.2.- CARACTERIZACIÓN BACTERIANA

7.2.1.- BACTERIAS PRODUCTORAS DE ESPORAS

Las 107 cepas bacterianas aisladas se sometieron a un tratamiento térmico se

sometieron a condiciones extremas a una temperatura de 100 oC durante 40 minutos
para identificar cuál de ellas podrían pertenecer al género Bacillus. De este
tratamiento se identificaron 10 bacterias productoras de esporas, las cuáles
probablemente pertenezcan al género Bacillus sp., como se muestra en la Tabla 6.
Estas 10 bacterias representan el 9 % del total de las cepas bacterianas aisladas
evaluadas (Figura 5).

Tabla 6. Tratamiento Térmico de las cepas bacterianas aisladas.

CRECIMIENTO DE LAS BACTERIAS DESPUÉS No. DE

DEL TRATAMIENTO TERMICO. BACTERIAS

CRECIERON 10

NO CRECIERON 97

TOTAL 107

19 | P á g i n a
 FIGURA 5. Porcentaje de bacterias resistentes al tratamiento térmico.

7.2.2.- TINCIÓN GRAM

De las 107 cepas bacterianas, se seleccionaron 37 cepas bacterianas las cuáles

fueron las que toleraron la mayor concentración del plaguicida. Se llevó a cabo la
tinción Gram. En la Tabla 7 se muestran los resultados. En la Figura 6 se observa
que las Gram positivas representan el 41 % de bacterias mientras que las negativas
el 59 % de bacterias.

Tabla 7. Registro de No. Bacterias Obtenidas de la Tinción Gram.

TIPO DE GRAM No. DE BACTERIAS

GRAM POSITIVAS 15

GRAM NEGATIVAS 22

TOTAL 37
TINCIÓN GRAM

41%

59% GRAM POSITIVAS

GRAM NEGATIVAS

FIGURA 6. Representación de porcentajes de bacterias

de Tinción Gram.

20 | P á g i n a
Adicionalmente, se visualizó en el microscopio con un objetivo de 100X, la forma
bacteriana. En la Tabla 8 se indica que la mayoría de las bacterias son bacilos y
cocos mientras que minoría son estreptococos y estreptobacilos. En la Figura 7 se
representa los porcentajes de la clasificación de las bacterias según su forma en
base a la interpretación de los resultados.

Tabla 8. No. de bacterias aisladas según su forma.

FORMA BACTERIANA No. DE BACTERIAS

ESTREPTOCOCOS 3

BACILOS 9

COCOS 9

ESTREPTOBACILOS 3

ESTAFILOCOCOS 5

COCOBACILO 8

TOTAL 37

TINCIÓN GRAM
24% 24%
25% 22%

20% ESTREPTOCOCOS
14%
Porcentaje

BACILOS
15%
8% 8% COCOS
10%
ESTREPTOBACILOS
5% ESTAFILOCOCOS

0% COCOBACILO
1
Forma
FIGURA 7. Clasificación de Bacterias aisladas según su forma.

21 | P á g i n a
7.3.- CURVAS DE CRECIMIENTO

Se realizaron cinco pruebas de curva de crecimiento bacteriano en presencia del

plaguicida Diclorvos evaluándolo a distintas concentraciones de 500, 625 y 750 ppm
en cultivo líquido LB. Se seleccionaron dos cepas para las curvas, la Cep.3 y Cep.4.
Se seleccionaron los resultados de la cuarta prueba de la curva de crecimiento
debido a la aproximación del comportamiento de una curva de crecimiento
bacteriano.

De acuerdo con los resultados obtenidos, se muestran de manera gráfica en las

Figuras 8, 9 y 10 el comportamiento del crecimiento bacteriano sin y con el plaguicida
Diclorvos de acuerdo a la cepa evaluada.

FIGURA 8. Curva de Crecimiento Cepa B5.

En la Figura 8 de la cepa evaluada B5 como control una muestra sin plaguicida

denominada “B5 sola” se adaptó rápidamente a la fase de latencia, la fase de
crecimiento bacteriano fue entre 1-12 h y alcanza la fase estacionaria a partir de 20
horas. En cambio, la cepa “B5 en presencia del plaguicida Diclorvos, la fase de
crecimiento fue de 1-7 h, fase estacionaria 7-10 h y fase de muerte 10-20 h. Por lo
tanto el comportamiento del crecimiento de la cepa B5 usado como control no
sobrevivió en presencia del plaguicida a 500 ppm.

22 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO CEPA 3 Caj.2
1.8
1.6
1.4
1.2 Cep. 3 Sola
ABS (nm)

1 Cep. 3+ Plag.(500 ppm)

0.8 Cep. 3 + Plag.(625 ppm)

0.6 Cep.3+ Plag. (750 ppm)

0.4 B5 sola
B5 + Plag.(500 ppm)
0.2
0
0 10 20 30 40
TIEMPO (h)
FIGURA 9. Curva de crecimiento bacteriano Cep.3.

En la Figura 9 se evaluó la cepa “Cep.3”, la muestra sin plaguicida denominada

“Cep.3 Sola” se adaptó rápidamente a la fase de latencia en un intervalo de 0-1 h, la
fase de crecimiento bacteriano fue entre 1-15 h y alcanza la fase estacionaria a partir
de las 15-19 h. En cambio, las cepas “Cep.3 + Plag. (500 ppm)”, Cep.3 + Plag. (625
ppm)” y Cep.3 + Plag. (750 ppm)” en presencia del plaguicida Diclorvos, la fase de
lactencia 0-1 h, la fase de crecimiento fue de 1-8 h, fase estacionaria 8-9.5 h, la fase
de muerte 9.5-19 h.

23 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO CEPA 4 Caj.2
1.8
1.6
1.4
1.2 Cep. 4 Sola

1 Cep. 4 + Plag.(500 ppm)

ABS (nm)

0.8 Cep. 4 + Plag.(625 ppm)

0.6 Cep. 4 + Plag. (750 ppm)
0.4 B5 sola
0.2 B5 + Plag.(500 ppm)
0
-0.2 0 10 20 30 40
TIEMPO (h)
FIGURA 10. Curva de Crecimiento Bacteriano Cep.4.

En la Figura 10 se evaluó la cepa “Cep.4”, la muestra sin plaguicida denominada

“Cep.4 Sola” se adaptó rápidamente a la fase de latencia en un intervalo de 0-1.5 h,
la fase de crecimiento bacteriano fue entre 1.5-17 h y alcanza la fase estacionaria a
partir de un intervalo de tiempo de 17-19 h. En cambio, las cepas “Cep.4 + Plag. (500
ppm)”, “Cep.4 + Plag. (625 ppm)” y “Cep.4 + Plag. (750 ppm)” en presencia del
plaguicida Diclorvos, la fase de lactencia 0-1.5 h, la fase de crecimiento exponencial
fue de 1.5-7.5 h, fase estacionaria es un intervalo de 7.5-9.5 h, la fase de muerte en
un intervalo de tiempo de 9.5-19 h.

A partir los datos registrados de absorbancia en el espectrofotometro UV y el

comportamiento gráfico de las cepas estudias (Cep.3, Cep.4 y B5 como control) a
distintas concentraciones (sólo, 500, 625 y 750 ppm) del plaguicida Diclorvos resultó
un rápido crecimiento y degradación de las cepas de estudio en un determinado
periodo de tiempo menor de 24 horas. Aparentemente, el Diclorvos es mineralizado
por las bacterias de estudio durante el tiempo de incubación entre 24-48 h, con lo
cuál se produjo un metabolito mucho mas tóxico que el propio plaguicida Diclorvos.
Asi mismo se tiene que realizar una investigacion mas amplia para determinar que
compuesto se esta obteniendo al degradar el Diclorvos mediante implementacion de

24 | P á g i n a
bacterias aisladas para identificar la via de degradación más óptima para el
Diclorvos.

7.4.- PRUEBAS BIOQUÍMICAS

Se realizó la aplicación de pruebas Bioquímicas a 37 Cepas Aisladas de interés para

investigar sobre su actividad metabólica.

7.4.1.- PRUEBA DE OF (OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN)

Se aplicó la prueba de Oxidación y Fermentación a 37 cultivos puros de cepas

aisladas y 3 cepas adicionales (CYL233, B5 y E. Coli), a continuación se muestran los
resultados obtenidos en esta prueba.

Para la generación de ácido se tiene que verificar el cambio de color en tubo de

ensayo sin aceite (aerobio) y con el aceite (anaerobio). En la Figura 11 indica tubos
de ensayo con aceite y sin aceite sin cambios tanto de color (el color en el medio se
mantuvo azul) y crecimiento es resultado no sacarolítico de la cepa aislada a
estudiar. El cambio de color azul a color verde en la parte superior en el tubo de
ensayo sin aceite en cambio el tubo de ensayo con aceite se mantuvo sin cambios
indica un metabolismo oxidativo, solo produjo acido en el tubo sin aceite. Un
pequeño cambio de color verde en la parte inferior de los ambos tubos de ensayo,
indicó que las bacterias produjeron acido en el medio denotando un metabolismo
fermentativo.

Positivo Oxidativo Positivo Fermentativo No sacarolítico

FIGURA 11. Resultados de la Prueba Bioquímica OF.

25 | P á g i n a
En la Tabla 9 indica el número de bacterias obtenidas en la interpretación de los
resultados de la prueba OF, se obtuvo un metabolismo positivo oxidativo con 13
bacterias, metabolismo positivo fermentador con 4 bacterias y no sacarolítico con 23
bacterias. En la Figura 12 indica los porcentajes de la interpretación de resultados de
acuerdo al número de bacterias. Los resultados de las bacterias E. coli fueron no
sacarolítico; B5, no sacarolítico; CYL233, metabolismo oxidativo.

Tabla 9. Registro de No. de Bacterias Prueba OF.

BACTERIA No. DE BACTERIAS

Metabolismo Positivo Oxidativo 13

Metabolismo Positivo Fermentador 4

No sacarolítico (Sin cambios) 23

TOTAL 40

PRUEBA BIOQUÍMICA OF
(OXIDACIÓN Y FERMENTACIÓN)

Metabolismo
Positivo
No Oxidativo
sacarolítico 32.50%
(Sin
cambios)
57.50%
Metabolismo
Positivo
Fermentador
10.00%

FIGURA 12. Representación de porcentajes de bacterias de la prueba OF.

7.4.2.- PRUEBA DE MOTILIDAD

Se realizó la prueba de motilidad a 37 cepas aisladas de cultivo puro bacteriano, los

resultados se muestran en la Tabla 10.

26 | P á g i n a
 Tabla 10. Registro de No. Bacterias en la Prueba Motilidad.

PRUEBA DE MOTILIDAD No. DE BACTERIAS

POSITIVO 11

NEGATIVO 26

TOTAL 37

PRUEBA DE MOTILIDAD
POSITIVO NEGATIVO

30%

70%

FIGURA 13. Resultados de la Prueba de Motilidad

En la Figura 13 indica que el 70 % de las bacterias que se visualizaban en el

microscopio binocular a un objetivo de 100X moviéndose a distintas direcciones son
de morfología bacilar o bacilos. Esto significa que esas bacterias tienen estructuras
como flagelos que les permiten desplazarse.

7.4.3.- PRUEBA DE CATALASA

Se realizó la prueba de catalasa a 37 cepas aisladas de cultivo puro bacteriano. Los

resultados se muestran en la Tabla 11. Cabe mencionar que la prueba de catalasa
es para identificar si las cepas aisladas producen una enzima denominada catalasa.

Tabla 11. No. de Registro de Bacterias en la Prueba de Catalasa.

PRUEBA DE CATALASA No. DE BACTERIAS

27 | P á g i n a
 POSITIVO 24

NEGATIVO 13

TOTAL 37

PRUEBA DE CATALASA

NEGATIVO
35%

POSITIVO
65%

FIGURA 14. Resultados de la Prueba de Catalasa.

En la Figura 14 indica que el 65 % de las bacterias aisladas producen la enzima

catalasa en cambio el 35 % no producen la enzima catalasa.

7.4.4.- PRUEBA DE FLUORESCENCIA

Se incidió luz UV sobre las 37 cepas aisladas para verificar si las bacterias producen
pigmentos fluorescentes. La Tabla 12 indica los resultados obtenidos en esta prueba.

Tabla 12. Bacterias en la Prueba de Fluorescencia.

PRUEBA DE FLUORESCENCIA No. DE BACTERIAS

POSITIVO 0

NEGATIVO 37

28 | P á g i n a
 TOTAL 37

Al parecer ninguna de las cepas evaluadas produce pigmentos fluorescentes.

7.5.- CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE

Se realizó una prueba de curva de crecimiento bacteriano en presencia del

plaguicida Diclorvos evaluándolo a distintas concentraciones de 250, 500, 750 y 875
ppm en cultivo líquido LB y un recuento bacteriano por diluciones seriadas en
sembradas en cajas de Petri con LB para conocer el número de UFC (Unidades
Formadoras de Colonia). Las curvas de crecimiento se realizaron con los
aislamientos de las cepas aisladas “CYL233” como cepa de control, “Cep.3” y
“Cep.4”.Realizando diluciones seriadas cada 3 horas durante 6 tomas de muestra y
CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE CEPA CYL233 CON
sembrando en placa. Los resultados se muestran en las siguientes figuras.
DICLORVOS
0.8 4.50E+07

0.7 4.00E+07

0.6 3.50E+07

3.00E+07 CYL 233 sólo

0.5
2.50E+07
ABS (nm)

0.4 CYL 233+ Plag.(250 ppm) de Diclorvos

2.00E+07
0.3 Cuenta Viable (UFC mL -1) CYL233 SÓLO
1.50E+07
0.2
1.00E+07 Cuenta Viable (UFC mL -1). CYL233 con 250
0.1 ppm de Diclorvos
5.00E+06
0 0.00E+00
0 2 4 6 8 10 12 14 16
-0.1 -5.00E+06
TIEMPO (h)

FIGURA 15. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable CYL233 CON DICLORVOS.

En la Figura 15 se muestra la curva de crecimiento y la cuenta viable de la cepa

CYL233. Se observó que conforme pasa el periodo de incubación del cultivo de 0-15
h el crecimiento exponencial va en un aumento y en la cuenta viable sólo en la
primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 1.03 𝑥 105 UFC en
la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6
(t=15 h) se registró un valor de 4.00 𝑥 107 UFC, lo cual significa un aumento en el

29 | P á g i n a
número de UFC durante el tiempo de incubación. Por el contrario a 250 ppm no se
observa crecimiento bacteriano y en la cuenta viable, en la primera toma de muestra
(t=0) se registró un valor de 0 de UFC, sin embargo en la toma de muestra 6 (t=15 h)
se indicó un valor de 3 𝑥 107 UFC, lo cual en la Figura 15 indica pequeñas
CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE
variaciones de UFC. Este último resultado tendría que revalidarse.
Cep.3 SÓLO
6 1.00E+10
1.00E+09
5
1.00E+08
1.00E+07
4
1.00E+06
ABS (nm)

3 1.00E+05 Cep. 3 sólo

1.00E+04
2 Cuenta Viable (UFC mL -1)
1.00E+03 Cep.3 SÓLO
1.00E+02
1
1.00E+01
0 1.00E+00
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)

FIGURA 16. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 Sólo.

En la Figura 16 la cepa evaluada “Cep.3”, en las Cep.3 Sólo y Cuenta Viable Cep.3,
se observa que conforme pasa el tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el
crecimiento exponencial va en un aumento, la muestra Cuenta Viable Cep.3 Sólo en
la primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 3.09𝑥 104 UFC
en la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6
(t=15 h) se registró un valor de 3.92 𝑥 109 UFC en 1 ml de muestra, lo cual significa
un aumento en el numero de unidades formadoras durante el tiempo de incubación
de 0-15 h.

30 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE
Cep.3 CON 250 ppm DE DICLORVOS
2 5.00E+09
1.8
4.00E+09
1.6
1.4
3.00E+09
ABS (nm) 1.2 Cep. 3+ Plag.(250 ppm) de
1 2.00E+09 Diclorvos
0.8
1.00E+09 Cuenta Viable (UFC mL -1)
0.6
Cep.3 con 250 ppm de
0.4 Diclorvos
0.00E+00
0.2
0 -1.00E+09
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)

FIGURA 17. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 con 250 ppm de
Diclorvos.

En la Figura 17 la cepa evaluada “Cep.3 con 250 ppm de Diclorvos”, en las Cep.3
con 250 ppm de Diclorvos y Cuenta Viable Cep.3 con 250 ppm de Diclorvos
conforme pasa el tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el crecimiento
exponencial va en un aumento, la muestra Cuenta Viable Cep.3 con 250 ppm de
Diclorvos en la primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de
5.56 𝑥 104 UFC en la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la
toma de muestra 6 (t=15 h) se registró un valor de 4.72 𝑥 109 UFC en 1 ml de
muestra, lo cual significa un aumento en el numero de unidades formadoras durante
el tiempo de incubación de 0-15 h.

31 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE
Cep.3 CON 875 ppm DE DICLORVOS
3 3.50E+02
3.00E+02
2.5
2.50E+02
2
2.00E+02 Cep.3+ Plag. (875 ppm) de
ABS (nm)

1.5 1.50E+02 Diclorvos

1.00E+02
1 Cuenta Viable (UFC mL -1)
5.00E+01 Cep.3 con 875 ppm de
0.5 Diclorvos
0.00E+00
0 -5.00E+01
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)

FIGURA 18. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.3 con 875 ppm de
Diclorvos.

En la Figura 18 la cepa evaluada “Cep.3 con 875 ppm de Diclorvos”, en las Cep.3
con 875 ppm de Diclorvos y Cuenta Viable Cep.3 con 875 ppm de Diclorvos
conforme pasa el tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el crecimiento va en
disminución, la muestra Cuenta Viable Cep.3 con 875 ppm de Diclorvos en la
primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 𝟑. 𝟎𝟎 𝒙 𝟏𝟎𝟐 UFC
en la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6
(t=15 h) se registró un valor de 𝟎 UFC en 1 ml de muestra, lo cual significa una
disminución en el numero de unidades formadoras conforme el tiempo de incubación
de 0-15 h debido a la alta concentración del plaguicida Diclorvos.

32 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE Cep.4
SÓLO
6 1.00E+10
1.00E+09
5
1.00E+08
1.00E+07
4
1.00E+06
ABS (nm)

3 1.00E+05 Cep. 4 sólo

1.00E+04
2 Cuenta Viable (UFC mL -1) Cep.4
1.00E+03 SÓLO
1.00E+02
1
1.00E+01
0 1.00E+00
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)

FIGURA 19. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 Sólo.

En la Figura 19 la cepa evaluada “Cep.4 Sólo”, en las Cep.4 Sólo y Cuenta Viable
Cep.4 Sólo conforme pasa el tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el
crecimiento exponencial va en un aumento, la muestra Cuenta Viable Cep.4 Sólo en
la primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 3.20𝑥 105 UFC
en la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6
(t=15 h) se registró un valor de 7.76 𝑥 109 UFC en 1 ml de muestra, lo cual significa
un aumento en el numero de unidades formadoras durante el tiempo de incubación
de 0-15 h.

33 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE Cep.4
CON 250 ppm DE DICLORVOS
2.5 8.00E+09
7.00E+09
2 6.00E+09
5.00E+09
1.5
ABS (nm)

4.00E+09
Cep. 4 + Plag.(250 ppm) de
3.00E+09 Diclorvos
1
2.00E+09 Cuenta Viable (UFC mL -1) Cep.4
con 250 ppm de Diclorvos
0.5 1.00E+09
0.00E+00
0 -1.00E+09
0 5 10 15 20
TIEMPO (h)

FIGURA 20. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 con 250 ppm de
Diclorvos.

En la Figura 20 la cepa evaluada “Cep.4 con 250 ppm de Diclorvos”, en las Cep.4
con 250 ppm y Cuenta Viable Cep.4 con 250 ppm de Diclorvos conforme pasa el
tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el crecimiento exponencial va en un
aumento, la muestra Cuenta Viable Cep.4 con 250 ppm de Diclorvos en la primera
toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 1.59 𝑥 105 UFC en la caja
Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6 (t=15 h) se
registró un valor de 7.24 𝑥 109 UFC en 1 ml de muestra, lo cual significa un aumento
en el numero de unidades formadoras durante el tiempo de incubación de 0-15 h.

34 | P á g i n a
 CURVA DE CRECIMIENTO Y CUENTA VIABLE Cep.4 CON
875 ppm DE DICLORVOS
3 1.20E+02

2.5 1.00E+02

8.00E+01
2
ABS (nm)

6.00E+01
1.5 Cep. 4 + Plag. (875 ppm) de Diclorvos
4.00E+01
1 Cuenta Viable (UFC mL -1) Cep.4 con
2.00E+01 875 ppm de Diclorvos
0.5 0.00E+00

0 -2.00E+01
0 2 4 6 8 10 12 14 16
TIEMPO (h)

FIGURA 21. Curva de Crecimiento y Cuenta Viable Cep.4 con 875 ppm de
Diclorvos.

En la Figura 21 la cepa evaluada “Cep.4 con 875 ppm de Diclorvos”, en las Cep.4
con 875 ppm de Diclorvos y Cuenta Viable Cep.4 con 875 ppm de Diclorvos
conforme pasa el tiempo de incubación del cultivo de 0-15 h el crecimiento va en
disminución, la muestra Cuenta Viable Cep.4 con 875 ppm de Diclorvos en la
primera toma de muestra (t=0) se logró evidenciar la formación de 1.00 𝑥 102 UFC en
la caja Petri presentes en 1 ml de muestra, sin embargo en la toma de muestra 6
(t=15 h) se registró un valor de 0 UFC en 1 ml de muestra, lo cual significa una
disminución en el numero de unidades formadoras conforme el tiempo de incubación
de 0-15 h debido a la alta concentración del plaguicida Diclorvos.

Brevemente en la cuenta viable CYL233 sólo aumenta las UFC conforme incrementa
el periodo de incubación, en cuanto a CYL233 con 250 ppm de Diclorvos conforme
incrementa el tiempo de incubación aumenta pequeñas variaciones de UFC. En las
bacterias evaluadas Cep.3 Sólo, Cep.3 con 250 ppm de Diclorvos, Cep.4 Sólo y
Cep.4 con 250 ppm de Diclorvos aumenta las UFC conforme incrementa el número
de horas de incubación debido a la baja concentración de plaguicida Diclorvos lo cual
es la sometida las muestras. Sin embargo en las bacterias evaluadas Cep.3 con 500

35 | P á g i n a
ppm de Diclorvos, Cep.3 con 750 ppm de Diclorvos, Cep.3 con 875 ppm de
Diclorvos, Cep.4 con 500 ppm de Diclorvos, Cep.4 con 750 ppm de Diclorvos y
Cep.4 con 875 ppm de Diclorvos disminuye las UFC conforme incrementa el número
de horas de incubación debido a la alta concentración utilizada del plaguicida
Diclorvos.

7.6.- PURIFICACIÓN DE DNA CROMOSOMICO

Para llevar a cabo una futura una caracterización molecular de dos cepas aisladas,
se llevó a cabo la extracción de DNA CROMOSÓMICO. Se hizo la purificación de las
cepas “Cep.3” y “Cep.4” y el material genético se resguardó a - 20oC. Las muestras
DNA se visualizaron mediante electroforesis en gel agarosa al 1 % tal como lo
muestra en la Figura 22. Estas muestras serán enviadas a un laboratorio
especializado para identificar las bacterias estudiadas.

FIGURA 22. Visualización con Luz UV de las muestras de DNA con gel agarosa
al 1 %.

36 | P á g i n a
CAPITULO 8.- CONCLUSIONES
Se obtuvo un banco de bacterias degradadoras de Diclorvos, a partir de las tres
muestras analizadas (muestra de sedimentos de Aguamilpa y dos muestras de suelo
de cultivo agrícola). En lo que respecta la caracterización de las bacterias se
obtuvieron resultados en los que se demuestra que son diferentes tipos de bacterias
las que se reportan como degradadoras de plaguicida y cada una de ellas muestra
diferente grado de tolerancia a la presencia del compuesto. Se lograron seleccionar
dos cepas que toleraron las más altas concentraciones de Diclorvos. Estas cepas
fueron caracterizadas parcialmente y en un futuro podrán ser utilizadas para
desarrollar estrategias de biorremediación de suelos contaminados con este
plaguicida.

En el presente proyecto se cumplió con todas las actividades planeadas e incluso se

anexo una actividad más que fue la purificación de DNA, el cual será utilizado para
llevar a cabo la identificación del género y especie bacteriana, mediante técnicas de
biología molecular.

37 | P á g i n a
CAPITULO 9.- COMPETENCIAS DESAROLLADAS Y/O
APLICADAS
Las competencias aplicadas o desarrolladas fueron las siguientes:

 Búsqueda de logro

 Capacidad crítica y autocritica

 Compromiso ético

 Capacidad para gestionar y formular el proyecto

 Capacidad para trabajar en equipo

 Dominio metodológico de la investigación

 Flexibilidad

 Organización de actividades

 Responsabilidad

38 | P á g i n a
CAPITULO 10.- FUENTES DE INFORMACIÓN
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40 | P á g i n a
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41 | P á g i n a
ANEXOS
ANEXO 1

BÚSQUEDA DE CEPAS BACTERIANAS EN MEDIOS MÍNIMOS

FIGURA 23. Escrutinio de Bacterias resistentes al plaguicida Diclorvos.

FIGURA 24. Caja de crecimientos bacterianos concentrados.

42 | P á g i n a
ANEXO 2

MÉTODO POR PICADURA

FIGURA 25. Método Por picadura M. Mineral.

FIGURA 26. Método por Picadura en Lb.

43 | P á g i n a
ANEXO 3

TRATAMIENTO TÉRMICO

FIGURA 27. Tratamiento Térmico en Lb.

ANEXO 4

E. COLI

FIGURA 28. Bacteria de Control E. Coli sembrada en Placa.

44 | P á g i n a
FIGURA 29. Cultivo Líquido Lb de la Cepa de control E. Coli a distintas
concentraciones.

ANEXO 5

FIGURA 30. Bacteria de Control B5.

45 | P á g i n a
ANEXO 6

ESTRIADA

FIGURA 31. Estriadas sembradas en caja Lb sólido.

46 | P á g i n a
ANEXO 7

TINCIÓN GRAM

FIGURA 32. Gram Positivas.

FIGURA 33. Gram Negativas.

47 | P á g i n a
ANEXO 8

FIGURA 34. Curva de Crecimiento en Lb líquido.

ANEXO 9

PRUEBA BIOQUÍMICA OF (OXIDACIÓN Y FERMANTACIÓN)

FIGURA 35. Control E. Coli.

48 | P á g i n a
 FIGURA 36. Control B5.

FIGURA 37. Control CYL233.

49 | P á g i n a
ANEXO 10

FIGURA 38. Prueba bioquímica de Motilidad.

FIGURA 39. Visualización en el Microscopio Binocular de bacterias con

morfología bacilar.

50 | P á g i n a
ANEXO 11

FIGURA 40. Prueba bioquímica de Catalasa.

ANEXO 12

FIGURA 41. Prueba bioquímica Fluorescencia.

51 | P á g i n a
ANEXO 13

FIGURA 42. Cuenta viable.

ANEXO 14

FIGURA 43. Cámara de Electroforesis.

52 | P á g i n a
FIGURA 44. Extracción de DNA cepas aisladas Cep.3 y Cep.4.

53 | P á g i n a
ANEXO 15

FIGURA 45. Constancia del programa del congreso UAN 2017.

54 | P á g i n a