Extracción de ADN

Finalidad: permite obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diversas fuentes, para después
realizar análisis específicos de modificaciones genéticas.

fenol-cloroformo: consta de 3 etapas:

1. Lisis celular: consiste en desestabilizar las estructuras que confinan el citoplasma y liberar
al medio su contenido. Para ello se emplean unos tampones de extracción que contienen
los siguientes compuestos: detergentes como el SDS o el Triton X100, que eliminaran
membranas y lípidos; agentes quelantes como el EDTA que elimina los cationes de la
solución, Desestabilizando las membranas celulares e inhibiendo las ADNasas (enzimas
que podrían degradar el ADN libre lisándolo en pequeños fragmentos); sales como el
cloruro de sodio (NaCl) que forma una capa iónica alrededor del ADN protegiéndolo; un
tampón como el Tris HCl que mantiene un pH de la solución estable y proteinasa K que
degradará proteínas y enzimas. La lisis se suele realizar a temperaturas elevadas alrededor
de 50ºC (nunca mayor de 80ºC, ya que a esta temperatura comienza a degradarse el ADN)
facilitando la ruptura de lípidos de la membrana y por ende la liberación de ADN de la
estructura celular.
2. Eliminación de proteínas: se realiza mediante la adición de una mezcla de
fenol:cloroformo: alcohol isoamílico (proporción 50:49:1) y posterior centrifugación, lo
que provoca que el ADN permanezca en el sobrenadante y en la interfase queden las
proteínas. El fundamento es el siguiente: el fenol y el agua (solución acuosa donde se
encuentra el ADN) no se pueden mezclar, por lo que el ADN que es muy polar debido a su
carga negativa, permanecerá en la fase acuosa de la solución, mientras que las proteínas
(formadas por grandes cadenas cuyos componentes elementales son aminoácidos algunos
polares y otros no) quedarán tras la centrifugación en la interfase y en la fase orgánica
debido a su polaridad. Hay que extraer el sobrenadante con cuidado para no arrastrar las
proteínas.
3. precipitación y limpieza del ADN: se realiza añadiendo al sobrenadante recuperado en el
paso anterior una sal a alta concentración (p.ej. acetato de sodio, cloruro de sodio o
acetato de amonio). Con la adición de la sal, el ADN que está cargado negativamente va a
obtener una capa iónica positiva que facilitará su precipitación. Posteriormente
añadiremos alcohol en la solución de precipitación para eliminar la concentración residual
de sales y promover la precipitación del ácido nucleico, ya que el alcohol va a sustraerle las
moléculas de agua al ADN y por tanto deshidratarlo Cuando se trata de muestras con baja
concentración de ácidos nucleicos, comúnmente se utiliza isopropanol (volumen a
volumen). La precipitación del ADN es casi inmediata en presencia de la sal y el alcohol, sin
embargo se recomienda incubar la muestra durante varios minutos a -20ºC o -80ºC para
acelerar el proceso de precipitación. Posteriormente, se centrifuga la muestra unos
minutos para recuperar el precipitado de ADN, lavándose el pellet obtenido varias veces
con etanol al 70% para eliminar todas las sales que permanezcan en la solución.
Posteriormente se vuelve a centrifugar, se elimina cuidadosamente el sobrenadante con
una pipeta y se deja secar para eliminar las trazas de alcohol. El ADN así obtenido es
rehidratado con agua bidestilada o tamponada con tampón Tris.
Técnica orgánica (solventes)

ADN de muy buena calidad y cantidad. – péptidos y proteínas son extraídas en la fase orgánica
(fenol), después se realiza digestión con proteinasa K. – El cloformo permite que todo el fenol
pueda ser lavado.

Desventajas: reactivos altamente tóxicos.- pérdidas significativas de ADN y mucho más si esta
degradado.

CHELEX:

Salting out
Enzimas de restricción
Las enzimas de restricción se descubrieron gracias al trabajo del suizo Werner Arber quien, en la
década de 1960, estudiaba la especificidad de la infección de bacterias por parte de un fago
llamado lambda. En 1970, el estadounidense Hamilton O. Smith purificó las primeras enzimas de
restricción y apenas un año más tarde, el estadounidense Daniel Nathans utilizó una enzima de
restricción para cortar y analizar el DNA del virus SV-40.

.ENZIMAS DE RESTRICCION: Son enzimas de carácter proteico, comúnmente se extraen de

especies procariotas (bacterias), ya que estas las producen para usarlas como mecanismo de
inmunidad, porque le permite a las bacterias distinguir su DNA de los DNA exógenos, debido a que
al ingresar este último al cuerpo bacteriano, estas enzimas actúan en el DNA exógeno
degradándolo, y creando rupturas de los enlaces fosfodiester y los puentes de hidrogeno que unen
a las base nitrogenadas y nucleótidos en un punto específico de la hebra palindrómica. Es decir, las
enzimas de restricción son proteínas cuya función es cortar las hebras de ADN. Se podría decir que
son “tijeras moleculares” de las bacterias que permiten defenderse de DNA extraño.

Además encontramos que estas bacterias desarrollan mecanismos evolutivos para la protección
de su material genético de las enzimas de restricción producidas, esto lo ha logrado creando
metilaciones a lo largo de su material genético con el fin de inhibir la acción enzimática sobre su
DNA.

1 TIPOS DE ENZIMAS DE RESTRICCION TIPO I Y III:  Tienen actividad de restricción (cortan) y

modifican metilaciones.  Cortan a cierta distancia de la secuencia de reconocimiento, las Tipo I
cortan lejos y al azar de la secuencia que es reconocida. Las Tipo III cortan de 25-27 bases antes o
después de la secuencia que reconocen.  Requieren ATP para moverse a lo largo de la cadena.
TIPO II:  Solo poseen actividad de restricción.  Se requiere Mg++ como cofactor.  Poseen lectura
de corte palindrómica.  Son de gran utilidad en ingeniería genética por su carácter selectivo y
especifico a la hora de actuar en el DNA.

NOMENCLATURA Las enzimas de restricción se nombran según la bacteria de la que provienen,

generalmente está estructurada por 3 letras principales: La primera indica el género de la bacteria,
las 2 siguientes la especie bacteriana, posterior a estas 3 letras principales encontraremos una que
prosigue en mayúscula, que indica la cepa bacteriana y por ultimo encontraremos unos números
romanos que me indica el orden de identificación de la enzima en la bacteria, EJEMPLO: Tomemos
la enzima EcoRl.
 EXTREMOS Las enzimas de tipo ll al realizar
sus cortes en la hebra generan los llamados extremos, los cuales pueden variar según la
especificad de la enzima en los siguientes:

CONDICIONES ÓPTIMAS PARA EL CORRECTO TRABAJO DE UNA ENZIMA DE RESTRICCION.

 Pureza del DNA – la reacción de enzimas es muy dependiente de la pureza, contaminantes como
proteínas, fenol, cloroformo, etanol, EDTA, SDS, altas concentraciones de sal, etc. inhiben la
endonucleasa.
 Temperatura y pH – las enzimas son muy sensitivas a temperatura y pH en lo que respecta a su
estabilidad y actividad.

 Contaminantes con carga (-).

 DNA contaminado con otro DNA.

 Grados de metilación – algunas endonucleasas son inhibidas por metilación.

 Tipo de molécula de DNA – si el DNA no tiene la secuencia que es reconocida por la enzima
accesible, esta no puede cortar el material genético (ej. si el DNA está superenrrollado el lugar de
restricción no va a estar accesible para la enzima).

 Buffer adecuado – este provee el ambiente que necesita la enzima para trabajar en condiciones
óptimas. 10 

Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se necesita para
cortar 1µg de DNA en 1 hora.

 El buffer siempre debe añadirse como un 10% de la reacción total de digestión.

MAPAS DE RESTRICCION Por medio de un mapa de restricción podemos identificar y relacionar

muestras desconocidas con otras ya conocida, esto se debe a que las enzimas cortan los
fragmentos del ADN dejando un patrón expuesto que se puede revelar y relacionar con otras
muestras por medio de la electroforesis.
USO DE LAS ENZIMAS DE RESTRICCION PARA VECTORES DE CLONACION Y PLASMIDOS Los vectores
de clonación son moléculas transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que
llevan insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector, una molécula
debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que transporta. También tiene que
tener secuencias de reconocimiento que permitan la inserción del fragmento de ADN a clonar, que
es el momento en el cual entra en juego el papel de las enzimas de restricción. Ya que para
insertar un fragmento de ADN al vector, se utiliza una enzima de restricción, y se mezcla con
fragmentos de ADN producidos con la misma enzima.

APLICACIONES  Hacer mapa de restricción de un plásmido o bacteriófago.

 Fragmentar DNA genómico para separación de electroforesis y “Southern Blot”.

 Generación de fragmentos para ser usados como sondas marcadas en “Southern”y “Northern”
blotting.

 Generación de fragmentos para ser subclonados en los vectores apropiados, creación de DNA
recombinante.
Los vectores de clonación
son plásmidos que llevan insertados fragmentos de ADN, que se introducen o se expresan dentro
de un huésped. Para poder ser insertado es necesario cortar el vector con enzimas de restricción y
una vez introducido pasa a denominarse: vector recombinante.

Un vector debe contar con la presencia en su ADN de una secuencia que le confiera la capacidad
de autoreplicarse; la presencia de un gen que lo haga resistente a un antibiótico para poder
seleccionar los clones de células bacterianas que contengan los plásmidos; y, por último, la
presencia de secuencias de reconocimiento por parte de enzimas de restricción para poder
integrar los fragmentos de ADN exógeno.

Los plásmidos son fragmentos de ADN de doble hélice, usualmente de forma circular que
contienen de 2 a 30 genes, aunque también pueden ser lineales o superenrrollados, poseen
tamaños variados que usualmente no superan el tamaño del cromosoma principal. Se pueden
encontrar de uno a varios plásmidos dentro de las bacterias o las levaduras, este no es
indispensable para la célula huésped sin embargo su presencia en esta le otorga ciertas ventajas o
características únicas. Son portadores de genes útiles para las bacterias que se transmiten por
transferencia horizontal y se encargan de codificar proteínas que otorgan ventajas adaptativas a su
portador mediante la conjugación bacteriana donde se transfiere material genético entre
bacterias. La célula que aporta se llama donadora y la que recibe receptora. La bacteria donadora
debe tener un plásmido, y un factor (F), que contenga la información genética necesaria para la
formación de un Pili sexual. Este es un “tubo” que se extiende desde la superficie de la célula
bacteriana donante. Las bacterias que no poseen este plásmido se conocen como (F-) y (F+)
aquellas que si poseen dicho factor en su citoplasma y (Hfr) high frequency of recombination, sí el
plásmido F, está integrado en su cromosoma (episoma*).

*Episoma: Sí el plásmido posee la capacidad de insertarse en el cromosoma bacteriano se le

denomina episoma, dentro de este grupo de plásmidos se encuentras los de fertilidad, que
regulan el proceso de conjugación bacteriana.

Transformar una bacteria o una levadura, consiste en introducir en ella una molécula de ADN
foráneo. Para las células eucariotas (excepto las levaduras), se utiliza el termino transfectar esto
quiere decir que se transforma una célula hasta hacerla eterna o cancerosa. Los genes que son
transmitidos o heredados a una célula se pueden identificar mediante un marcador genético o
marcador molecular que es un segmento de ADN con una ubicación física identificable (locus) en
un cromosoma y cuya herencia genética se puede rastrear. Un marcador puede ser un gen, o
puede ser alguna sección del ADN sin función conocida, los marcadores se utilizan a menudo como
formas indirectas de rastrear el patrón hereditario de un gen que todavía no ha sido identificado,
pero cuya ubicación aproximada se conoce.
Un replicón es una unidad genética que consiste en un origen de replicación de ADN y sus
elementos de control asociados. En los plásmidos, el origen de la replicación es un segmento de
ADN identificado, cientos de pares de bases a lo largo: Su conjunto de elementos de control que
actúan en asocio y contienen sitios para factores difusibles de los plásmidos en el huésped y
codificados en el huésped implicados en el inicio de la síntesis de ADN. Un replicón de plásmido
puede definirse, por lo tanto, como la parte más pequeña de ADN de plásmido que es capaz de
replicarse de forma autónoma y mantener el número de copias normales.

VECTORES DE CLONACIÓN Los vectores de clonación son moléculas

transportadoras que transfieren y replican fragmentos de ADN que llevan
insertados mediante técnicas de ADN recombinante. Para que sirva de vector,
una molécula debe ser capaz de replicarse junto con el fragmento de ADN que
transporta. También tiene que tener secuencias de reconocimiento que permitan
la inserción del fragmento de ADN a clonar. Para insertar un fragmento de ADN
a un vector, se utiliza una enzima de restricción que se mezcla con fragmentos de
ADN producidos con la misma enzima, posteriormente, se adiciona la enzima
Fosfatasa Alcalina, la cual es la encargada de evitar la recircularización del
vector, ya que adiciona un extremo 3' Fosfato que evita la unión de ambos
extremos así como la complementariedad y formación de un enlace fosfodiéster.
Inmediatamente se adiciona el ADN que pretende insertarse en el vector, donde
uno de los extremos se une por complementariedad y se utiliza una ligasa para
generar la unión y su recircularización.

Los vectores que transportan un fragmento insertado se denominan vectores

recombinantes.

Todo vector de clonación debe contener los siguientes elementos:

* Origen de Replicación: Es la región que codifica para el inicio de la síntesis de

DNA, el cual le da la cualidad de poder replicarse de manera independiente al
DNA cromosómico, ya sea en un sistema bacteriano o en un sistema de expresión
en levaduras.

* Agente de Selección: Son genes contenidos en la secuencia del vector, los

cuales le confieren características adicionales al sistema de clonación (bacterias,
levaduras, etc.), que permiten la identificación y selección de las clonas
recombinantes, es decir, clonas que contienen el fragmento de DNA de interés.
Ejemplos de esto son los genes que codifican para la resistencia a antibióticos,
como lo son los de resistencia a laampicilina o a la tetraciclina.

* Polilinker o Sitio de Multiclonación: Región contenida dentro de las secuencias

de los genes que codifican para los marcadores, que contienen múltiples sitios de
restricción, es decir, múltiples sitios de reconocimiento para las enzimas de
restricción, que permiten la inserción de los fragmentos de DNA que se desea
clonar en un sistema.

TIPOS DE VECTORES

Plásmidos

Son moléculas extracromosómicas de ADN que varían en tamaño desde 1 hasta

más de 200 kb. La mayoría son de doble hebra, covalentemente cerrado, de
moléculas circulares que pueden ser aisladas de células bacterianas en su forma
superhelociodal. Los plásmidos:

* Son encontrados en una gran variedad de especies bacterianas, la mayoría de

los plásmidos tienen un estrecho rango de acogida y pueden ser mantenidos solo
en un limitado conjunto de determinadas especies estrechamente relacionadas.

* Son elementos extracromosómicos que se comportan como unidades genéticas

accesorias que replican y son inherentemente independientes del cromosoma
bacteriano.

* Han evolucionado una gran variedad de mecanismos para mantener un número

de copias estables de los plásmidos en las bacterias huésped y para dividir las
moléculas del plásmido con precisión en las células hijas.

* Son dependientes, en mayor o menor grado sobre las enzimas y proteínas

codificadas por su huésped para su replicación o transcripción.

* Frecuentemente contienen genes codificando para enzimas que son ventajosos

para la bacteria huésped, estos genes especifican notablemente un diverso
conjunto de rasgos, algunos de los cuales son de gran importancia médica y
comercial, entre los fenotipos conferidos por los plásmidos están la resistencia a
y producción de antibióticos, degradación de componentes orgánicos complejos y
producción de colicinas, enterotoxinas y enzimas de restricción y modificación.

* Epísomas Es un plásmido que puede integrarse por sí mismo al ADN

cromosomal del organismo huésped. Por esta razón, puede mantenerse en
contacto por un largo tiempo, ser duplicado en cada división celular del huésped
y volverse parte básica de su mapa genético. Este término no se usa más en
plásmidos, debido a que ahora está claro que una región homóloga con el
cromosoma elabora un plásmido dentro de un epísoma.
Los plásmidos usados en ingeniería genética son llamados “vectores”. Estos son
usados para transferir genes desde un organismo a otro y típicamente contienen
un marcador genético confiriendo un fenotipo el cual puede ser seleccionado a
favor o en contra. La mayoría también contienen un polivinculador o sitio de
clonado múltiple (MCS), el cual es una pequeña región que contiene los sitios de
restricción más comúnmente usados, permitiendo una fácil inserción de
fragmentos de ADN en ese lugar.

TIPOS DE PLÁSMIDOS

* Plásmidos conjugativos: contienen “transgenes”, los cuales ejecutan complejos

procesos de conjugación, como la transferencia sexual de plásmidos a otra
bacteria.

* Plásmidos no-conjugativos: son incapaces de iniciar una conjugación, de allí

que ellos pueden transferirse únicamente con la asistencia de los plásmidos
conjugativos y lo hacen “por accidente”.

* plásmidos movilizables: los cuales llevan solo un subtipo de genes requeridos

para la transferencia. Ellos pueden “parasitar” un plásmido conjugativo,
transfiriéndose a una alta frecuencia solo en su presencia.

* Plásmidos de fertilidad: los cuales contienen transgenes, son capaces de

conjugarse.

* Plásmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir

resistencia contra antibióticos o venenos. Históricamente conocidos como
Factores R, antes de que se entendiera la naturaleza de los plásmidos.

* Col-plásmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la

producción de) colinas y proteínas que pueden matar a otra bacteria.

* Plásmidos degradativos: los cuales habilitan la digestión de sustancias

inusuales como tolueno o ácido salicílico.

* Plásmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patógeno.

ESTRUCTURA

El ADN plásmido puede aparecer en uno de cinco conformaciones, que corren a

diferentes velocidades en un gel durante electroforesis. Las conformaciones se
muestran abajo en orden de movilidad electroforética del más lento al más
rápido:

* Mellado abierto circular: el ADN tiene un solo corte filamentario.

* Lineal: ADN tiene terminales libres, ya sea porque los filamentos fueron
cortados o porque el ADN era linear in vivo. Se puede modelar este como un
cordón que no se ha conectado así mismo.

* circular relajado: ADN que interactúa completamente con ambos filamentos sin
cortar, pero que ha sido enzimáticamente “relajado”. Se puede modelar este
dejando un cordón relajado y luego conectándolo a sí mismo.

* superespiral desnaturalizado: ADN como el ADN superespiral o

superenrollado, pero que tiene regiones sin unir que lo hacen ligeramente menos
compacto; esto resulta de una excesiva alcalinidad durante la preparación del
plásmido.

* ADN superespiral: Es un ADN totalmente intacto con los filamentos sin cortar,
y con forma de remolino, resultando en una forma compacta.

LOS REPLICONES DE LOS PLÁSMIDOS DEFINEN SU NUMERO DE

COPIAS La replicación inicia en un origen al separarse la doble hebra de ADN,
al microscopio electrónico se observa una burbuja de replicación dentro de ADN
no replicado. El punto en el cual la replicación ocurre es llamado horquilla de
replicación o punto de crecimiento. El origen puede ser usado para iniciar una
replicación unidireccional o bidireccional dependiendo si se forman una o dos
horquillas de replicación.

El genoma de E. Coli se replica de manera bidireccional desde un sitio único en

el locus oriC. Dos horquillas de replicación surgen del sitio oriC y se mueven
alrededor del genoma. El iniciador de la replicación es la proteína DnaA que se
une a múltiples regiones llamadas cajas DnaA en el sitio oriC. La dnaA es una
proteína de unión a ATP y su unión con el ADN se regula dependiendo si se une
ATP, ADP o ningún nucleótido.

Uno de los mecanismos por los cuales se controla la actividad del origen del
replicón es mediante la metilación del ADN. El oriC de la bacteria E. Coli
contiene 11 copias de la secuencia GATC/CTAG el cual es un blanco para
metilación en la posición N6 de la adenina por la enzima Dam metilasa.
Antes de la replicación el sitio palindrómico se metila en las adeninas de cada
hebra. A través de la replicación se insertan las bases no modificadas a las hebras
hijas. Esto genera ADN hemimetilado en el cual se aprecia una hebra metilada y
una hebra no metilada. La habilidad de un plásmido dependiente de oriC de
replicarse depende de su estado de metilación. Si el plásmido se encuentra
metilado, es sometido a una sola ronda de replicación lo que ocasiona que los
productos hemimetilados se acumulen. El sitio GATC/CTAG puede permanecer
hemimetilado alrededor de 13 minutos.

* El inicio de la replicación en E. coli requiere varias actividades sucesivas:

1. La síntesis de proteínas es necesaria para sintetizar la proteína dnaA. A esta

proteína se le conoce como el factor de licencia que debe sintetizarse de novo por
cada ronda de replicación.

2. Uno de los dos genes que flanquean a oriC deben ser transcritos. Esta apertura
de la doble cadena ayuda a la proteína dnaA para abrir el sitio de origen.

3. La síntesis de membrana debe estar conservada. Fármacos como la penicilina

que inhiben la síntesis de la pared bacteriana también bloquean el inicio de la
replicación.

El inicio del replicón en oriC inicia con la formación de un complejo que

ulteriormente requiere seis proteínas: dnaA, dnaB, dnaC, HUgirasa y SSB. De las
seis proteínas, la dnaA es la única involucrada en el inicio del replicón. El móvil
para el inicio después de la apertura del origen lo proveen la dnaB y la helicasa.
Estos eventos solo ocurren si el sitio de origen se encuentra completamente
metilado en ambas cadenas.

La primera etapa en la formación del replicón es la unión del complejo dnaA-

ATP al sitio oriC. El complejo dnaA-atp realiza actividad de atpasa al entrar en
contacto con los fosfolípidos de la membrana interna y en presencia de ADN de
cadena simple. Cuando el origen se abre, el complejo dnaA-ATP pasa a dnaA-
ADP, se inactiva y previene el reinicio de la replicación.

La apertura del sitio oriC involucra la acción de dos tipos de secuencia en el

origen: repetidos de 9 pares de bases y de 13 pares de bases. Ambos repetidos
definen los límites del origen que debe tener como mínimo 245 pares de bases.

A la derecha del sitio oriC se encuentran 4 repetidos de 9 pares de bases que

proveen el sitio de unión inicial para el complejo dnaA-ATP. Complejos de
dnaA-ATP se aglomeran un núcleo central helicoidal alrededor del cual el ADN
de oriC se envuelve. el complejo dnaA-ATP actúa en un grupo de repetidos de
AT a la izquierda del sitio oriC. Al activarse, la dnA-ATP sufre un cambio
conformacional que abre la cadena de DNA en oriC y lo estabiliza.

REPLICACIÓN DE LOS PLÁSMIDOS

La replicación del ADN de los plásmidos se origina siempre en el mismo lugar y

utiliza un mecanismo denominado de círculo rodante. En el punto de origen,
sobresale una protuberancia en forma de horquilla donde se engancha la proteína
RepB para iniciar la replicación. La proteína iniciadora es un hexámero en forma
de anillo y, por lo tanto, contiene seis centros activos y seis motivos de unión al
ADN que, además, son móviles. Estas características le confieren varias
habilidades: reconocer el lugar de origen de la replicación, cortar una de las
cadenas de ADN, rodear la otra y desenredarla para que la maquinaria de
replicación -el replisoma- pueda avanzar a lo largo del ADN y, finalmente,
volver a atar la cadena de ADN cortada, completando el círculo.

La estructura de la proteína RepB muestra similitudes con la familia de proteínas

helicasas de tipo anillo que intervienen en diversos procesos relacionados con el
ADN, por ejemplo, en la replicación de los virus. En particular, una parte de
RepB tiene una estructura muy similar a los iniciadores de la replicación de dos
virus que provocan cáncer en humanos: el virus del papiloma humano (útero) y el
virus SV40 (mesoteliomas). Esta coincidencia estructural muestra la relación
evolutiva entre los mecanismos y las proteínas de replicación de los plásmidos y
los virus.

INCOMPATIBILIDAD DE PLÁSMIDOS

cuando dos plásmidos comparten elementos de la misma maquinaria de

replicación, ambos compiten durante la replicación y la posterior partición en
células hijas dichos plásmidos son incapaces de coexistir sin la selección en una
colonia de bacterias, los plásmidos que portan el mismo replicón pertenecen a un
mismo grupo incompatible y son incapaces de ser mantenidos dentro de una
misma bacteria, los plásmidos que portan replicones cuyos componentes no son
intercambiables, pertenecen a grupos con diferentes incompatibilidades y pueden
ser mantenidos en la misma bacteria, por ejemplo los plásmidos que son
compatibles con la E. Coli son los plásmidos p15A, R6K y F.
MARCADORES SELECTIVOS

Los vectores plásmidos contienen marcadores genéticos que confieren fuertes

ventajas de crecimiento sobre las bacterias portadoras de plásmidos bajo
condiciones selectivas. En el clonado molecular, estos marcados son usados para:

* Seleccionar clones de bacterias portadoras de plásmidos: dado a que se puede

introducir en una bacteria de manera artificial un plásmido de ADN en un
proceso de transformación, este generalmente es ineficiente y los plásmidos solo
se establecen en una pequeña minoría de la población bacteriana. Los marcadores
selectivos portados por los plásmidos permiten estas raras transformaciones ser
seleccionadas con facilidad, estos marcadores codificados por plásmidos
proporcionan resistencia específica a. Por ejemplo: la habilidad para crecer en
presencia de los antibióticos como kenamicina, ampicilina, carbenicilina y las
tetraciclinas.

MARCADORES DE EXPRESIÓN

Los vectores de expresión (construcciones de expresión) expresan el transgén en

la célula diana, y tienen una secuencia promotora que dirige la expresión del
transgén.

Bacteriófago lambda o fago λ

Es un virus que infecta a la bacteria E. Coli y es igualmente conocido como un

vector de clonación

Se trata de un virus complejo de ADN lineal bicatenario. Los extremos de su

material genético son cohesivos y ello hace que tras la infección su genoma se
haga circular,
comportándose, en caso de seguir un ciclo lisogénico, como un plásmido y
aprovechando las enzimas de la recombinación de la bacteria para integrarse en
el genoma de ésta. El fago no tiene por qué integrarse, y de hecho es más habitual
que se comporte como un virus de ciclo lítico.

CONJUGACION BACTERIANA

Es el proceso de transferencia de material genético entre una célula procariota

(bacteria o arquea) donadora y una receptora mediante el contacto directo o una
conexión que las una. la conjugación es un mecanismo de transferencia
horizontal de genes como la transformación y la transducción, con la diferencia
de que estos últimos no involucran contacto intercelular.

La información genética transferida a menudo beneficia al receptor. Las ventajas

pueden incluir resistencia antibiótica, tolerancia xenobiótica o la capacidad de
usar nuevos metabolitos. La conjugación de plásmidos benéficos puede ser
considerada una endosimbiosis procarionte. Sin embargo, la conjugación de otros
elementos génicos puede ser vista como un tipo de parasitismo y un mecanismo
desarrollado para su propagación.

MECANISMO BACTERIANO

Este proceso es promovido por determinados tipos de plásmidos, que portan un

conjunto de genes cuyos productos participan en el proceso, y que requiere
contactos directos entre ambas células, con intervención de estructuras
superficiales especializadas y de funciones específicas (pili sexuales en los Gram
negativos, y contacto íntimo en los Gram positivos). Algunos de estos plásmidos
se comportan como episomas, es decir, que pueden integrarse en el cromosoma;
en este caso, si se produce la conjugación, se puede transferir el propio plásmido
más un segmento adyacente del cromosoma, que a su vez podrá recombinarse
con secuencias homólogas del cromosoma del receptor, dando lugar a un
cromosoma híbrido. El plásmido conjugativo prototípico es el F-plásmido (Factor
de fertilidad). El F-plásmido es un episoma (un plásmido que puede unirse por sí
mismo al cromosoma procarionte por recombinación homóloga). Él transporta su
propio origen de replicación, el oriV, y un origen de transferencia, o oriT. Solo
puede haber una copia del F-plásmido en un procarionte, ya sea libre o integrado,
un organismo que posee una copia es llamada F-

positivo o F+. Las células que carecen del F-plásmido son llamadas F-negativo o
F- y como tales pueden actuar como células receptoras. El F-plásmido transporta
junto a otras informaciones genéticas los locus tra y trb, los cuales constan de 10
genes. El locus contiene el gen del pilus y genes reguladores, los cuales juntos
dirigen la síntesis del pilus. El locus también contiene los genes de las proteínas
que se adhieren a la superficie del procarionte F- e inician la conjugación.
Cuando se inicia la conjugación por una señal que la enzima relaxasa muesca
(corta el enlace fosfodiéster entre dos nucleótidos, separándolos) una de las
hebras del plásmido conjugativo en una secuencia particular denominada oriT.
La relaxasa puede trabajar en un complejo de más de doce proteínas conocido
como un relaxosoma. En el sistema F-plásmido la enzima relaxasa es llamada
TraiI y el relaxosoma está formado por TraI, TraY, TraM y el factor huésped de
integración (IHF, integrated host factor). La hebra muescada, o hebra-T, es
entonces desenrollada desde la hebra no daña y es transferida a la célula
receptora en dirección 5'-3'. La hebra restante es replicada independiente de la
acción de la conjugación (la replicación vegetativa comienza en el oriV) o
conjuntamente con la conjugación (replicación conjugativa similar a la
replicación en círculo rodante del fago λ). La replicación conjugativa puede
requerir una segunda muesca antes de que pueda ocurrir una transferencia
exitosa.

Si el F-plásmido que es transferido ha sido previamente integrado en el genoma

del donante, también una parte de su ADN cromosómico puede ser transferido
con el plásmido ADN. La cantidad de ADN cromosómico que es transferida
depende de cuánto tiempo permanezcan los dos organismos en contacto.

TRANSDUCCIÓN

Es un proceso mediante el cual el ADN es transferido desde una bacteria a otra

mediante la acción de un virus. También se utiliza para designar al proceso
mediante el cual ADN exógeno es introducido en una célula mediante un vector
viral. Cuando los bacteriófagos infectan una célula bacteriana, su modo normal
de reproducción consiste en capturar y utilizar la maquinaria de replicación,
transcripción, y traducción de la célula de la bacteria receptora para producir gran
cantidad de virones, o producir partículas virales, incluido el ADN o ARN viral y
la cubierta de proteína.

CICLO LITICO

Es usualmente el principal método de replicación viral e involucra la destrucción

de células infectadas, consta de las siguientes fases:

* 1. Fase de adsorción o fijación: El virus se une a la célula hospedadora de

forma estable. La unión es específica, ya que el virus reconoce complejos
moleculares de tipo proteico, lipoproteico o glucoproteico, presentes en las
membranas celulares. * 2. Fase de penetración o inyección: el ácido nucleico
viral entra en la célula mediante una perforación que el virus realiza en la pared
bacteriana.

* 3. Fase de eclipse: en esta fase no se observan copias del virus en la célula,

pero se está produciendo la síntesis de ARN, es decir la duplicación y
transcripción de ARN, necesario para generar las copias de proteínas de la
cápsida. También se produce la continua formación de ácidos nucleicos virales y
enzimas destructoras del ADN bacteriano. * 4. Fase de ensamblaje: en esta fase
se produce la unión de los capsómeros para formar la cápsida y el
empaquetamiento del ácido nucleico viral dentro de ella. * 5. Fase de lisis o
ruptura: conlleva la muerte celular. Los viriones salen de la célula, mediante la
rotura enzimática de la pared bacteriana. Estos nuevos virus se encuentran en
situación de infectar una nueva célula.

CICLO LISOGÉNICO

Se caracteriza por presentar dos fases iguales a las del ciclo lítico, la fase de
anclaje y la fase de penetración. En la fase de eclipse, el ácido nucleico viral, se
recombina con el ADN bacteriano y permanece inactivo. Esta forma viral se
denomina prófago y la célula infectada se denomina célula lisogénica. Esta célula
se puede mantener así indefinidamente e incluso puede llegar a reproducirse. Un
cambio en el medio celular, va a llevar consigo un cambio celular y con él, la
liberación del prófago, convirtiéndose en un virus activo que continuará con el
ciclo infeccioso o ciclo lítico.

TRANSFORMACIÓN

Es la alteración genética de una bacteria resultante de la absorción directa,

incorporación y expresión de material genético exógeno (ADN exógeno). El
ADN exógeno se encuentra en el ambiente y se introduce a través de la
membrana de la célula bacteriana. La transformación ocurre de forma natural en
algunas especies de bacterias, aunque también se puede efectuar por medios
artificiales. Para que ocurra la transformación, la bacteria debe estar en un estado
de competencia, lo que puede ocurrir como una respuesta limitada en el tiempo a
las condiciones ambientales, tales como la falta de nutrientes y una densidad
celular elevada. La transformación es uno de los tres procesos por los que el
material genético exógeno se puede introducir en una célula bacteriana.

MECANISMOS

Transformación de plásmido
Para ser mantenido de manera estable por la célula, el ADN plasmidial debe
contener un origen de replicación, que permitirá la replicación en la célula,
independientemente del cromosoma. Debido a que la transformación usualmente
produce una mezcla de inusuales transformaciones y abundantes células no-
transformadas, se necesita de un método para identificar las células que han
adquirido el plásmido. Los plásmidos utilizados en este tipo de experimentos,
contienen usualmente un gen que les otorgue resistencia a un antibiótico. La cepa
bacteriana a transformar, debe ser sensible a éste.

Las células capaces de crecer en un medio de cultivo con este antibiótico, serán
las que han sido transformadas por el plásmido, y las células que no puedan
crecer carecerán de éste. Otro marcador, usado para identificar bacterias E. coli
que han adquirido plásmidos recombinantes, es el gen lacZ, que codifica para β-
galactosidasa. Debido a que la β-galactosidasa es un homotetrámero, en que cada
monómero esta hecho de una proteína lacZ-α y lacZ-ω, si solo una de estas
proteínas se expresa en la célula resultante, no se formará la enzima funcional.
De esta manera, si una cepa de E. coli que ni tenga el gen lacZ-α en su genoma,
es transformado usando un plásmido que contiene el gen faltante, las células
producirán β-galactosidasa, mientras que las no-transformadas no lo harán.

RESUMEN

Los plásmidos son vectores que se introducen en células bacterianas y levaduras,

éstos son fragmentos extracromosómicos que les dan ventajas adaptativas tales
como resistencia a antibióticos, productos químicos o fertilidad, los plásmidos
deben tener una secuencia de ADN que les permita auto-replicarse en el
hospedador y Tienen secuencias de reconocimiento por enzimas de restricción
para poder integrar dichos fragmentos de ADN extraño. Estos pueden ser
identificados a través de marcadores de selección y expresión; Esto se puede
hacer mediante la transformación de la célula a través de ciertos procedimientos
en el laboratorio con el fin de introducir nuevos fragmentos exógenos de ADN en
una bacteria. Los plásmidos son de gran ventaja no solo en el campo de la
biología, sino también, en el campo de la industria farmacéutica debido a que nos
brinda una fuente de producción y síntesis de distintos compuestos que facilitan
el desarrollo de nuevos, más potentes y efectivos medicamentos.

CONCLUSION

El estudio, análisis, desarrollo e implementación de vectores plásmidos entre

otros, es de gran importancia en varios campos de estudio, no solo en ingeniería
genética, sino también para la salud en este caso la farmacia. Nos brinda
herramientas indispensables a la hora de formular e investigar nuevas alternativas
en el área de la producción de medicamentos que ayudan a combatir
enfermedades bacterianas con antibióticos por ejemplo o en la producción de
bacterias benéficas no solo para el uso médico; también en la agronomía y en la
zootecnia.

Este trabajo nos ha permito comprender que los plásmidos son moléculas de
ADN cuya replicación es independiente del cromosoma del ADN, también tienen
reproducción y pueden adherirse al ADN cromosómico, su ausencia no genera
problemas dentro de una célula. Pero su presencia otorga grandes ventajas al
organismo huésped, mediante la codificación de funciones esenciales para la
célula contenedora y que a su vez debe contar con ciertas condiciones que
garanticen un entorno estable para estos y poder conservar los caracteres
hereditarios, existen otros mecanismos que contribuyen a mantener su estabilidad
como sistemas de recombinación específicos según al sitio al que son fijados y
que algunos casos eliminan a las células más débiles.

Electroforesis
La electroforesis es una técnica de separación que puede ser utilizada con fines analíticos y
que fue introducida por el químico sueco Arne tiselius. El interés principal fue la química
de las químicas séricas. Por su trabajo pionero en este campo, Tiselius recibió premio nobel
en 1948. La electroforesis de ADN fue, y sigue siendo, una herramienta de importancia
primordial en el desarrollo de las técnicas del ADN recombinante o ingeniería genética. La
idea de utilizar la técnica de electroforesis a través de una matriz para analizar muestras de
ADN

corresponde a Vin Thorne, un bioquímico del Instituto de Virología de Glasgow, quien a

mediados de los años 60 del pasado siglo estaba interesado en caracterizar las distintas
formas de ADN

Electroforesis
Se denomina electroforesis a la técnica mediante la cual se separan las biomoléculas en
disolución cuando se ven sometidas a un campo eléctrico. Se trata de una técnica
fundamentalmente analítica, aunque también se puede realizar con fines preparativos. Cada
molécula se desplaza por efecto del campo, alcanzando rápidamente una velocidad
constante al equilibrarse la fuerza impulsora (fuerza del campo eléctrico) con la resistencia
al avance (fuerza de fricción o rozamiento) impuesta por el medio en el que se desplaza.
VERTICAL

Se usa casi exclusivamente con gel de poliacrilamida (más resistente físicamente, no se

desliza), para proteínas o para ácidos nucleicos de pequeño tamaño. El gel puede rellenar
tubos de vidrio (este formato ya apenas se usa) o estar contenido entre 2 placas
rectangulares. Contacto eléctrico y disolvente gracias al tampón que embebe el gel y llena
las cubetas o compartimentos del ánodo y cátodo. La muestra se deposita con micropipeta
llenando un “pocillo” creado al polimerizar el gel. En cuanto a la composición del gel hay
dos variantes: electroforesis continua (un solo tipo de gel) y electroforesis discontinua (2
tramos de gel de composición ligeramente diferente
Gel de poliacrilamida, en placa, vertical.

Separación de acuerdo con la masa molecular (estrictamente, con la longitud de la cadena

polipeptídica).

La muestra se trata con SDS (a mayor concentración que en la composición del gel) y se
calienta brevemente a 90-100°C, para provocar la desnaturalización. Se suele añadir
también β-mercaptoetanol para reducir los puentes disulfuro, separando así las subunidades
de la proteína y permitiendo que se extiendan por efecto del SDS.

En la preparación del gel se mezclan:

 un tampón de pH (comúnmente Tris-HCl)

 acrilamida y bisacrilamida

 un agente iniciador de la polimerización, como el persulfato amónico (genera radicales

libres)

 un agente catalizador de la polimerización, como el TEMED (N,N,N’,N’-

tetrametiletilenodiamina)

 SDS

Permite obtener una estimación de la masa molecular de las proteínas separadas. Para ello
es preciso analizar en la misma electroforesis unas proteínas patrón, de tamaño conocido,
con las que se construye una curva de calibrado, representando movilidad frente a
logaritmo de masa molecular. Para controlar el avance del frente de electroforesis (posición
de máxima movilidad) se añade a la muestra un colorante marcador (“tracking dye”),
molécula cargada y de pequeño tamaño que avanza más que cualquier componente de la
muestra; el más habitual es el azul de bromofenol. Para mejorar la resolución (obteniendo
bandas más compactas) se suele emplear electroforesis discontinua:

 En la parte superior, un gel acumulador o concentrador (stacking gel), que tiene como
efecto concentrar la muestra en una banda estrecha.

 Ocupando la mayor parte de la placa, un gel separador (resolving gel) en el que tiene
lugar la separación de los componentes.

El efecto concentrador se debe a una mayor porosidad del gel acumulador combinada con
una diferente composición de los tampones de cubeta (Tris-glicina) y de gel (Tris-HCl) y
distinto pH para ambos geles.

Nota: “Tris” es tris (hidroximetil) aminometano, una sustancia habitual para preparar
disoluciones tampón de pH próximo a 7.
Electroforesis de campo pulsante

Las moléculas o fragmentos de DNA de longitud superior a 20-40 kb no se pueden

resolver (separar) empleando la electroforesis convencional en gel de agarosa. Esto se debe,
en primer lugar, a la dificultad de manejo de los geles preparados con las bajas
concentraciones de agarosa que requerirían (inferior al 0,4%). Además, las moléculas de
DNA, que adoptan una conformación más o menos globular, poseen un tamaño
excesivamente grande para atravesar los poros del gel y no se separan en función de su
tamaño. Para solventar este problema se ha ideado una modificación de la técnica, conocida
como electroforesis de campo pulsante (o pulsado, pulsed-field gel electrophoresis, PFGE).
Se emplean geles de agarosa al 1%, pero se altera periódicamente la orientación del campo
eléctrico aplicado, activando alternativamente dos pares de electrodos. El frecuente cambio
de dirección del campo eléctrico consigue que las moléculas se desplieguen y avancen a
través de los poros en conformación extendida. A mayor tamaño, se reorientan con más
dificultad, por lo que avanzan más despacio.
Las muestras han de contener el DNA sin fragmentar, por lo se requiere una preparación
especial (al purificar el DNA por los métodos habituales se fragmenta por debajo de 100
kb). Para obtener preparaciones con los cromosomas intactos se mezclan las células con
agarosa caliente (37°C) y se vierte en pequeños moldes de unos milímetros, de forma que al
solidificarse la agarosa (4°C) forma bloques (“insertos”) que incluyen las células intactas.
En éstos se realiza la lisis celular y la digestión de las proteínas (p.ej., con EDTA, SDS y
proteinasa K, que difunden a través de los poros del gel) sin que se alteren las grandes
moléculas de DNA. Tras una diálisis para eliminar los restos de la digestión, se consigue un
bloque de agarosa con el DNA intacto en su interior, y se deposita el bloque entero en un
pocillo del gel de electroforesis.