Método 1604: Coliformes totales y Escherichia coli en agua por filtración de

membrana usando una técnica de detección simultánea (medio MI)

Septiembre 2002

1.0 Alcance y aplicación

1.1 Este método de ensayo describe un medio de filtro de membrana (MF)
sensible y diferencial, utilizando MI agar o caldo MI, para la detección y la
enumeración simultáneas de coliformes totales (TC) y Escherichia coli (E. coli) en
muestras de agua en 24 horas O menos sobre la base de sus actividades
enzimáticas específicas. Se incluyen en el medio dos substratos enzimáticos, el
fluorógeno 4-metilhumbelliferil-$ Dgalactopyranoside (MUGal) y un cromógeno
Indoxil-$ -D-glucurónido (IBDG), para detectar las enzimas $ -galactosidasa y $ -
glucuronidasa producidas respectivamente Por TC y E. coli, respectivamente.

1.2 Los coliformes totales incluyen especies que pueden habitar los intestinos de
animales de sangre caliente o que se encuentran naturalmente en el suelo, la
vegetación y el agua. Por lo general se encuentran en el agua contaminada
fecalmente y se asocian a menudo con brotes de enfermedades. Aunque no son
usualmente patógenas, su presencia en el agua potable indica la posible
presencia de patógenos. E. coli, una especie del grupo coliforme, se encuentra
siempre en las heces y es, por lo tanto, un indicador más directo de la
contaminación fecal y la posible presencia de patógenos entéricos. Además,
algunas cepas de E. coli son patógenas (Referencia 16.12).

1.3 Este método, que ha sido validado para su uso con agua potable en estudios
de laboratorio único y multi-laboratorio (Referencias 16.8 - 16.10), será utilizado
principalmente por laboratorios certificados de agua potable para análisis
microbiano de agua potable. Otros usos incluyen agua recreativa, superficial o
marina, agua embotellada, aguas subterráneas, agua potable, efluentes de plantas
de tratamiento, agua de las líneas de distribución de agua potable, agua potable y
posiblemente alimentos, productos farmacéuticos, muestras clínicas (humana o
veterinaria) Muestras (por ejemplo, aerosoles, suelo, escorrentía o lodo) y / o
aislamiento y separación de transformantes mediante el uso de genes
informadores E. coli lac Z o gus A / uid (Referencia 16.11).

1.4 Puesto que se puede analizar una amplia gama de volúmenes o diluciones de
muestras mediante la técnica FM, se puede detectar y enumerar una amplia gama
de niveles de E. coli y CT en agua.

2.0 Resumen del método

2.1 Se filtra un volumen adecuado de una muestra de agua (100 ml para agua
potable) a través de un filtro de membrana de éster de celulosa de tamaño de poro
de 47 mm y 0,45 μm que retiene las bacterias presentes en la muestra. El filtro se
coloca en una placa de 5 ml de agar MI o sobre una almohadilla absorbente
saturada con 2-3 ml de caldo MI, y la placa se incuba a 35 ° C durante un máximo
de 24 horas. Las colonias bacterianas que crecen en la placa se inspeccionan
para determinar la presencia de color azul a partir de la descomposición de IBDG
por la enzima E. coli $ -glucuronidasa y la fluorescencia bajo luz ultravioleta de
onda larga (366 nm) del desglose de MUGal por la enzima TC $ -galactosidasa
(Referencia 16.8).

3.0 Definiciones
3.1 Coliformes totales (CT) - En este método, CT son aquellas bacterias que
producen colonias fluorescentes tras la exposición a la luz ultravioleta de onda
larga (366 nm) después del cultivo primario en agar MI o caldo (ver Figura 1). Las
colonias fluorescentes pueden ser completamente azul-blanco (CT distinto de E.
coli) o azul-verde (E. coli) en color o halos fluorescentes pueden observarse
alrededor de los bordes del azul colonias verdes de E. coli. Además, las colonias
azules no fluorescentes, que rara vez ocurren, se añaden al recuento total porque
la fluorescencia está enmascarada por el color azul del desglose de IBDG
(Referencia 16.8).

3.2 Escherichia coli - En este método, las E. coli son aquellas bacterias que
producen colonias azules bajo luz ambiente después del cultivo primario en agar o
caldo MI (Ver Figuras 1 y 2). Estas colonias pueden ser fluorescentes o no
fluorescentes bajo luz ultravioleta de onda larga (366 nm) (Referencia 16.8).

4.0 Interferencias y Contaminación

4.1 Las muestras de agua que contienen material particulado coloidal o
suspendido pueden obstruir el filtro de membrana, impidiendo así la filtración o
causando la propagación de colonias bacterianas que podrían interferir con la
identificación de colonias diana. Sin embargo, las colonias azules de E. coli a
menudo pueden contarse en placas con partículas pesadas o concentraciones
elevadas de bacterias totales (véase las figuras 2 y 3) (Referencia 16.8).
4.2 La presencia de alguna difusión lateral de color azul lejos de las colonias de E.
coli objetivo puede afectar la enumeración y la recogida de colonias en placas con
altas concentraciones de E. coli. Este problema no debe afectar a los filtros con
recuentos bajos, como los obtenidos con agua potable o muestras diluidas
apropiadamente (Referencia 16.8).
4.3 Las colonias azules (# 0,5 mm de diámetro en los filtros que contienen
colonias # 200) pequeñas, planas o en pico pueden deberse a especies distintas
de E. coli. Estas colonias ocurren ocasionalmente en números bajos y deben ser
excluidas del recuento de las colonias de E. coli, que son generalmente mucho
más grandes en tamaño (1-3 mm de diámetro). Las colonias pequeñas nunca se
han observado en ausencia de E. coli típica, pero si esto ocurre, la muestra no
debe ser considerada como E. coli-positiva a menos que por lo menos una colonia
haya sido verificada por otro método [por ejemplo, medio EC Con tiras de 4-
metilboneliferil-$ -D-glucurónido (MUG) o API 20E] (Referencia 16.8).
4.4 Las colonias de color verde claro, fluorescentes, no azules, observadas junto
con las típicas colonias fluorescentes azul / blanca o azulverde, pueden ser
especies distintas de los coliformes. Estas colonias, que generalmente se
producen en números bajos (# 5%) y normalmente se pueden distinguir de la CT,
deben eliminarse del recuento CT. Un aumento en el número de colonias de color
verde brillante puede indicar una población de muestra inusual o un desglose de la
cefsulodina en el medio (Referencia 16.8).

5.0 Seguridad
5.1 El analista / técnico debe conocer y observar los procedimientos normales de
seguridad requeridos en un laboratorio de microbiología mientras prepara, utiliza y
elimina cultivos, reactivos y materiales y mientras opera el equipo de esterilización.
5.2 Se prohíbe pipetear con la boca.
5.3 Evite la exposición prolongada a la luz ultravioleta de onda larga o germicida.
5.4 Autoclave todas las placas y materiales contaminados al final del análisis.

6.0 Equipo y suministros

6.1 Incubadora regulada a 35 ° C ± 0,5 ° C, con aproximadamente 90% de

humedad, si las placas de Petri sueltas son usadas.
6.2 Microscopio estereoscópico, con ampliación de 10-15x, tipo de campo ancho.
6.3 Una lámpara de microscopio que produce luz difusa de lámparas fluorescentes
blancas frescas ajustadas para dar el Máximo color.
6.4 Recuento manual.
6.5 Recipiente de pipeta de acero inoxidable, aluminio o vidrio Pyrex, para pipetas.
6.6 Cilindros graduados (100 ml para agua potable), cubiertos con papel de
aluminio o papel kraft y esterilizado.
6.7 Unidades de filtración de membrana (base del filtro y embudo), vidrio, plástico
o acero inoxidable. Estos son Envuelto con papel de aluminio o papel kraft y
esterilizado.
6.8 La caja de luz germicida ultravioleta (254 nm) para desinfectar los embudos de
filtro es deseable, pero Opcional.
6.9 Se utiliza vacío de línea, bomba de vacío eléctrica o aspirador como fuente de
vacío. En caso de emergencia, Se puede utilizar una bomba de mano o una
jeringa. Tales dispositivos de producción de vacío deberían estar equipados con
Válvula de retención para evitar el flujo de retorno de aire.
6.10 Frasco de filtro de vacío, generalmente 1 litro, con tubería apropiada. Filtro de
colectores para contener las bases de filtro son deseables, pero opcionales.
6.11 Frasco de seguridad, colocado entre el matraz de filtro y la fuente de vacío.
6.12 Pinzas, rectas (preferidas) o curvadas, con puntas lisas para facilitar el
manejo de los filtros sin dañarlos.
6.13 Alcohol, etanol al 95%, en frascos pequeños de boca ancha, para fórceps
esterilizantes.
6.14 Quemador Bunsen o de tipo Fisher o unidad de incinerador eléctrico.
6.15 Las pipetas bacteriológicas o de Mohr estériles (para suministrar), de vidrio o
de plástico (1 ml y 10 ml Volúmenes).
6.16 Filtros de membrana (MF), blanco, marcado con rejilla, éster de celulosa,
diámetro de 47 mm, 0,45 μm ± 0,02 -Μm de tamaño de poro, preesterilizado o
esterilizado durante 10 minutos a 121 ° C (15 lb de presión).
6.17 Lámpara ultravioleta de onda larga (366 nm), 4 vatios de mano (preferente) o
6 vatios, o un microscopio adjunto archivo.
6.18 Agua de dilución: Agua de dilución tamponada con fosfato estéril, preparada
en grandes volúmenes (por ejemplo, 1 litro) Para mojar las membranas antes de la
adición de la muestra y para enjuagar el embudo después de la Filtración de la
muestra o en blancos de dilución de 99 mL [Sección 9050C en Métodos Estándar
(Referencia 16.2)].
6.19 Marcador de tinta indeleble para placas de etiquetado.
6.20 Termómetro, comprobado contra un Instituto Nacional de Ciencia y
Tecnología (NIST) –certificado, o uno rastreable a un termómetro NIST.
6.21 Placas de Petri, estériles, de plástico, 9 x 50 mm, con tapas herméticas o de
15 x 60 mm, de vidrio o plástico, Con tapas sueltas; También se pueden utilizar
platos de 15 x 100 mm

6.22 Botellas, dilución de leche, vidrio de borosilicato, tapa roscada con

revestimientos de neopreno, marcados a 99 ml para diluciones 1: 100 (si es
necesario). Se pueden utilizar botellas de dilución marcadas a 90 ml o tubos
marcados con 9 ml para diluciones de 1:10.
6.23 Frascos, vidrio de borosilicato, tapón de rosca, de 250 a 2000 ml de
volumen, para la preparación de agar.
6.24 Baño de agua mantenido a 50 ° C para templar el agar.
6.25 Filtro de jeringa, estéril, desechable, diámetro de 25 mm, tamaño de poro de
0,22 μm, para filtrar cefsulodina para agar MI.
6.26 Jeringa, estéril, plástico, desechable, capacidad de 20 cc. Las jeringuillas de
vidrio autoclavadas también son aceptables.
6.27 Tubos de ensayo, estériles, de tapa roscada, 20 x 150 mm, de vidrio
borosilicato o plástico, con tapas.
6.28 Unidades de filtro de esterilización, preesteril, desechables, capacidad de 500
ó 1000 ml, tamaño de poro de 0,2 μm, para filtrar soluciones tampón de stock.
6.29 Almohadillas absorbentes estériles de 47 mm de diámetro (usadas con caldo
MI).
Nota: Los nombres de marca, los proveedores y los números de parte son sólo
ilustrativos. No hay respaldo implícito. Se puede lograr un rendimiento equivalente
usando aparatos y materiales distintos de los especificados aquí, pero la
demostración de un rendimiento equivalente que cumple con los requisitos de este
método es responsabilidad del laboratorio.
7.0 Reactivos y normas
7.1 Pureza de los reactivos: En todos los ensayos se utilizarán productos químicos
de calidad reactiva. A menos que se indique lo contrario, los reactivos deberán
ajustarse a las especificaciones del Comité de Reactivos Analíticos de la American
Chemical Society (Referencia 16.1). El agar utilizado en la preparación de los
medios de cultivo debe ser de grado microbiológico.
7.2 Siempre que sea posible, utilice medios de cultivo comerciales como medio de
control de calidad.
7.3 Pureza del Agua: Agua destilada de grado reactivo conforme a la
Especificación D1193, Agua Tipo II o mejor, Manual Anual de Normas ASTM
(Referencia 16.3).
7,4 Agua de dilución tamponada (referencia 16.2)
7.4.1 Solución de tampón de fosfato de reserva (referencia 16.2):
Dihidrogenofosfato de potasio (KH2PO4) 34.0 g Agua destilada de grado reactivo
500 mL
7.4.2 Preparación de la Solución Tampón Stock: Ajustar el pH de la solución a 7,2
con NaOH 1 N, y llevar el volumen a 1000 mL con agua destilada de grado
reactivo. Esterilizar por filtración o autoclave durante 15 minutos a 121 ° C (15 lb
de presión).
7.4.3 Solución de MgCl2 (Referencia 16.2): Disolver 38 g de MgCl2 anhidro (o
81,1 g MgCl2C6H2O) en un litro de agua destilada de grado reactivo. Esterilizar
por filtración o autoclave durante 15 minutos a 121 ° C (15 lb de presión).

7.4.4 Almacenamiento de Soluciones Buffer y MgCl2: Después de la esterilización

de las soluciones madre, almacenar en el refrigerador hasta su uso. Manipular
asépticamente. Si la presencia de moho u otros Contaminantes aparece en
cualquiera de las existencias, la solución debe ser desechada, y una solución
fresca debe ser preparada
7.4.5 Solución de trabajo (pH final 7,0 ± 0,2): Añadir 1,25 ml de solución tampón
de fosfato (Sección 7.4.2) y 5 ml de MgCl2 (Sección 7.4.3) por cada litro de agua
destilada de grado reactivo preparada. Mezclar bien y distribuir en cantidades
apropiadas para diluciones en botellas de dilución de tapa roscada o tubos de
cultivo y / o en recipientes más grandes para usar como agua de enjuague.
Autoclave a 121 ° C (15 libras de presión) durante 15 minutos. Pueden ser
necesarios tiempos de esterilización más largos dependiendo del recipiente y el
tamaño de la carga y la cantidad de tiempo necesario para que el líquido alcance
121ºC.
7.5 MI Agar (Referencia 16.8).
7.5.2 Solución de cefsulodina (1 mg / 1 ml): Añadir 0,02 g de cefsulodina a 20 ml
de agua destilada de grado reactivo, esterilizar con un filtro de jeringa de 0,22 μm
y almacenar en un tubo estéril a 4 ° C hasta que sea necesario. Prepare una
solución fresca cada vez. No guarde la parte no utilizada.
7.5.3 Preparación: Autoclave el medio durante 15 minutos a 121 ° C (15 libras de
presión) y agregue 5 ml de la solución recién preparada de Cefsulodin
(concentración final de 5 μg / mL) por litro de medio de agar templado. Pipetar el
medio en placas de Petri de 9 x 50 mm (5 ml / placa). Guarde las placas a 4 ° C
durante un máximo de 2 semanas. El pH final debe ser de 6,95 ± 0,2.
7.6 MI Caldo: La composición del caldo MI es la misma que MI agar, pero sin el
agar. El pH final del caldo MI debe ser 7,05 ± 0,2. El caldo se prepara y esteriliza
mediante los mismos métodos descritos para agar MI en las secciones 7.5.1, 7.5.2
y 7.5.3, excepto que se colocan almohadillas absorbentes en placas de Petri de 9
x 50 mm y se saturan con 2-3 ml de MI que contiene 5: g / mL de concentración
final de Cefsulodin. Alternativamente, el caldo puede esterilizarse por filtración. El
exceso de caldo se vierte antes de usar las placas. Las placas deben almacenarse
en el refrigerador y desecharse después de 96 horas (Referencia 16.15).
7.7 Agar de soja tríptico / agar de soja tripticasa (Difco 0369 - 17 - 6, BD 4311043,
Oxoid CM 0129B, o equivalente) (TSA)
7.7.2 Preparación: Añadir los ingredientes secos enumerados anteriormente a
1000 ml de agua destilada de grado reactivo, y calentar a ebullición para disolver
completamente el agar. Autoclave a 121 ° C (15 libras de presión) durante 15
minutos. Dispense el agar en placas de Petri de 9 x 50 mm (5 ml / placa). Incubar
las placas durante 24 - 48 horas a 35 ° C para verificar la contaminación. Deseche
las placas con crecimiento. Si> 5% de las placas muestran contaminación,
descartar todas las placas, y hacer nuevo medio. Guarde a 4 ° C hasta que sea
necesario. El pH final debe ser de 7,3 ± 0,2.

8.0 Recolección, conservación y almacenamiento de muestras

8.1 Las muestras de agua se recogen en recipientes estériles de polipropileno con
tapas.
8.2 Los procedimientos de muestreo se describen detalladamente en las
Secciones 9060A y 9060B de la 18ª edición de Métodos Estándar para el Examen
de Aguas y Aguas Residuales (Referencia 16.2) o en el Manual de Métodos de
Microbiología de la USEPA, Sección II, A (Referencia 16.6). El cloro residual en
las muestras de agua potable (o efluente clorado) debe neutralizarse con tiosulfato
sódico (1 ml de una solución al 10% por litro de agua) en el momento de la
recogida. La adhesión a los procedimientos de conservación de la muestra y los
límites de tiempo de retención son fundamentales para la producción de datos
válidos. Las muestras no recogidas de acuerdo con estas reglas no deben ser
analizadas.
8.2.1 Temperatura de almacenamiento y condiciones de manejo: Hielo o refrigerar
las muestras de agua a una temperatura de 1-4 ° C durante el transporte al
laboratorio. Utilice recipientes aislados para asegurar el mantenimiento adecuado
de la temperatura de almacenamiento. Tenga cuidado de que las botellas de
muestra no estén totalmente sumergidas en agua de hielo fundido durante el
tránsito o almacenamiento.
8.2.2 Limitaciones del tiempo de retención: Analizar las muestras tan pronto como
sea posible después de la recolección. Las muestras de agua potable deben
analizarse dentro de las 30 h de la recolección (Referencia 16.13). No retenga
muestras de agua de fuente durante más de 6 h entre la recolección y el inicio de
los análisis, y los análisis deben completarse dentro de las 8 h de la recolección de
la muestra.
9.0 Calibración y normalización
9.1 Comprobar las temperaturas en las incubadoras dos veces al día para
asegurar el funcionamiento dentro de los límites establecidos (Referencia 16.14).
9.2 Revise los termómetros al menos una vez al año contra un termómetro
certificado por NIST o un rastreable al NIST. Revise las columnas de mercurio
para romper.

10.0 Control de calidad (QC)

10.1 Ensayar previamente cada lote de agar MI o caldo para el rendimiento (es
decir, reacciones enzimáticas correctas) con cultivos conocidos (E. coli, CT y un
no coliforme).
10.2 Pruebe nuevos lotes de filtros de membrana contra un lote de referencia
aceptable usando el método de Brenner y Rankin (Referencia 16.7).
10.3 Realizar pruebas específicas de control de filtración cada vez que se analizan
muestras y registrar los resultados
10.3.1 Control del filtro: Colocar uno o más filtros de membrana en placas TSA, e
incubar las placas durante 24 horas a 35 ° C. La ausencia de crecimiento indica la
esterilidad del (de los) filtro (s).
10.3.2 Controles de agua de dilución con tampón de fosfato: Filtre un volumen de
50 ml de agua de dilución estéril antes de comenzar las filtraciones de la muestra
y un volumen de 50 ml de agua de dilución después de completar las filtraciones.
Colocar los filtros en placas TSA, e incubar las placas durante 24 horas a 35 ° C.
La ausencia de crecimiento indica la esterilidad del agua de dilución.
10.3.3 Controles de agar o de caldo: Colocar una o más placas de TSA y una o
más placas de agar MI o placas de caldo de caldo MI en la incubadora durante 24
horas a 35 ° C. Las placas de la almohadilla de caldo deben ser incubadas con la
parrilla hacia arriba, no invertidas como las placas de agar. La ausencia de
crecimiento indica la esterilidad de las placas.
10.4 Véanse las recomendaciones sobre control de calidad de los análisis
microbiológicos en el "Manual de Certificación de Laboratorios de Análisis de Agua
Potable: Criterios y Procedimientos; Garantía de Calidad "(Referencia 16.15) y el
Manual de Métodos de Microbiología de la USEPA, parte IV, C (Referencia 16.6).
11.0 Procedimiento
11.1 Preparar MI agar o caldo MI y TSA como se describe en las Secciones 7.5,
7.6 y 7.7. Si las placas se hacen antes de tiempo y se almacenan en el
refrigerador, saquelas y déjelas calentar a la temperatura ambiente. Los cristales
que se forman en el agar MI después de la refrigeración desaparecerán a medida
que se calientan las placas (Referencia 16.8).
11.2 Etiquetar la parte inferior de las placas de MI agar o MI con el número /
identificación de la muestra y el volumen de la muestra a analizar. Etiquetar las
placas de TSA de control de calidad y las placas de control de la esterilidad del
caldo de agar MI.
11.3 Con una pinza flameada, coloque un filtro de membrana, con la rejilla hacia
arriba, sobre la placa porosa de la base del filtro. Si tiene dificultades para retirar
los papeles de separación de los filtros debido a la electricidad estática, coloque
un filtro con el papel encima de la base del embudo y active el vacío. El papel de
separación se enrollará, permitiendo una extracción más fácil.
11.4 Conecte el embudo a la base de la unidad de filtro, teniendo cuidado de no
dañar o desalojar el filtro. El filtro de membrana se encuentra ahora entre el
embudo y la base.
11.5 Coloque aproximadamente 30 ml de agua de dilución estéril en el fondo del
embudo.
11.6 Agitar el recipiente de muestra vigorosamente 25 veces.
11.7 Mida un volumen adecuado (100 ml para agua potable) o diluya la muestra
con una pipeta estéril o un cilindro graduado y colóquelo en el embudo. Encienda
el vacío y déjelo encendido mientras se enjuaga el embudo dos veces con
aproximadamente 30 ml de agua de dilución estéril.
11.8 Retire el embudo de la base de la unidad de filtro. Se puede usar una caja de
luz germicida ultravioleta (254 nm) para mantener y desinfectar el embudo entre
las filtraciones. Se requiere por lo menos 2 minutos de tiempo de exposición para
la descontaminación del embudo. Proteja los ojos de la irradiación UV con gafas,
gafas o una cámara UV cerrada.
11.9 Sujetar el filtro de membrana en su borde con una pinza flameada, levantar
suavemente y colocar la rejilla del filtro sobre la placa de agar MI o la placa del
cojín de MI. Deslice el filtro sobre el agar o la almohadilla, utilizando una acción de
rodadura para evitar atrapar burbujas de aire entre el filtro de membrana y el agar
o la almohadilla absorbente subyacente. Ejecutar la punta de la pinza alrededor
del borde exterior del filtro para asegurarse de que el filtro hace contacto con el
agar o la almohadilla. Vuelva a colocar la membrana si se producen áreas no
humedecidas debido a burbujas de aire.

11.10 Invertir la placa de Petri agar e incubar la placa a 35 ° C durante 24 horas.

Las placas de cojinetes usadas con caldo MI deben ser incubadas en la parrilla
hacia arriba a 35 ° C durante 24 horas. Si se usan placas con tapa suelta para
agar MI o caldo, las placas deben colocarse en una cámara húmeda.
11.11 Cuente todas las colonias azules en cada placa MI bajo luz normal /
ambiental y registre los resultados (Ver Figuras 1 y 2.). Esta es la cuenta de E.
coli. Los resultados positivos que ocurren en menos de 24 horas son válidos, pero
los resultados no pueden ser registrados como negativos hasta que se complete el
período de incubación de 24 horas (Referencia 16.14).
11.12 Exponga cada placa MI a luz ultravioleta de onda larga (366 nm) y cuente
todas las colonias fluorescentes [E. coli fluorescente azul / verde, TC fluorescente
azul / blanco distinto de E. coli y azul / verde con bordes fluorescentes (también E.
Coli)] (Ver Figura 1.). Registre los datos.
11.13 Añada las colonias azules no fluorescentes (si las hay) que se encuentren
en la misma placa al recuento TC (Referencia 16.8).

12.0 Análisis de datos y cálculos

12.1 Utilice las siguientes reglas generales para calcular la E. coli o TC por 100 mL
de muestra:
12.1.1 Seleccionar y contar los filtros con # 200 colonias totales por placa.
12.1.2 Seleccionar y contar el filtro con # 100 colonias diana (idealmente, 20-80).
12.1.3 Si el número total de colonias o TC en un filtro es demasiado numeroso
para contar o confluente, registre los resultados como "TC + (TNTC)" y cuente el
número de E. coli. Si ambos organismos objetivo son $ 200, registre los resultados
como "TC + EC + (TNTC)".
12.1.4 Calcular los valores finales usando la fórmula:

E. coli/100 mL = Numero de colonias azules x 100

Volumen de la muestra filtrada (mL)
CT/100ml =
Numero de colonias fluorescentes + Numero de colonias azules no fluorescentes
(si hay) Volumen de muestra filtrada (mL) x100

12.2 Véase el Manual de Microbiología de la USEPA, Parte II, Sección C, 3.5, para
las reglas generales de conteo (Referencia 16.6).
12.3 Informe los resultados como E. coli o TC por 100 mL de agua potable.

13.0 Rendimiento del método

13.1 Los límites de detección de este método son una E. coli y / o un coliforme
total por volumen de muestra o dilución ensayada (Referencia 16.8).
13.2 Los índices de falsos positivos y falsos negativos para E. coli son ambos
reportados como 4.3% (Referencia 16.8).
13.3 La recolección de E. coli en un solo laboratorio se indica (referencia 16.8)
como el 97,9% del conteo de placas heterotróficas (referencia 16.2) y el 115% de
la placa separada R2A (referencia 16.2). Para Klebsiella pneumoniae y
Enterobacter aerogenes, dos coliformes totales, las recuperaciones son 87,5% y
85,7% de HPC (Referencia 16.8), respectivamente, y 89.3% y 85.8% de la placa
extendida R2A, respectivamente.
13.4 Las especificidades para E. coli y coliformes totales son 95.7% y 93.1%
(Referencia 16.8), respectivamente.
13.5 Los únicos coeficientes de variación del laboratorio para E. coli y coliformes
totales se reportaron en 25.1% y 17.6% (Referencia 16.8), respectivamente, para
una variedad de tipos de agua.
13.6 En un estudio colaborativo (Referencias 16.4, 16.5 y 16.9), 19 laboratorios
analizaron simultáneamente seis muestras de agua de grifo de Cincinnati, con 3
concentraciones diferentes de E. coli (# 10, 11-30 y> 30 por 100 mL ).
13.6.1 La precisión de un solo laboratorio (coeficiente de variación), una medida
de la repetibilidad, varió de 3.3% a 27.3% para E. coli y de 2.5% a 5.1% para TC
para las seis muestras analizadas, mientras que la precisión general Coeficiente
de variación), una medida de reproducibilidad, varió de 8,6% a 40,5% y de 6,9% a
27,7%, respectivamente. Estos valores se basan en datos transformados con
log10 (Referencia 16.5).
13.6.2 La Tabla 1 contiene el resumen estadístico de los resultados del estudio
colaborativo (Referencia 16.9).

14.0 Prevención de la contaminación

14.1 La prevención de la contaminación es cualquier técnica que reduzca o
elimine la cantidad o toxicidad de los residuos en el punto de generación. Es la
herramienta de gestión ambiental preferida sobre la eliminación o reciclaje de
residuos. Cuando sea factible, el personal de laboratorio debe utilizar una técnica
de prevención de la contaminación, como la preparación de los volúmenes
prácticos más pequeños de reactivos, normas y medios o reducción de tamaño de
las unidades de prueba en un método.
14.2 El personal de laboratorio también debería revisar la adquisición y uso de
equipos y suministros para otras formas de reducir los residuos y prevenir la
contaminación. El reciclaje debe considerarse siempre que sea práctico
15.0 Gestión de Residuos
15.1 La Agencia de Protección Ambiental requiere que las prácticas de manejo de
desechos de laboratorio sean consistentes con todas las reglas y regulaciones
aplicables. La Agencia insta a los laboratorios a proteger el aire, el agua y la tierra
minimizando y controlando las descargas de campanas y operaciones de banco,
cumpliendo con la letra y el espíritu de los permisos y regulaciones de descarga
de alcantarillado y cumpliendo con las regulaciones de residuos sólidos y
peligrosos, Reglas de identificación y restricciones de eliminación de tierras. Todos
los desechos infecciosos deben ser autoclavados antes de la eliminación.