1, FUNDAMENTOS:
pocas la presencia de tirosina, triptófano y fenilalanina es
Para conocer si en una determinada muestra biológica hay
proteínas pueden utilizarse numerosas reacciones de
identificación, unas relacionadas con la presencia en la
cadena polipeptídica de determinados aminoácidos
generalmente triptófano y tirosina o bien basarse en la
misma estructura polipeptídica, como es el caso de la
reacción del Biuret, propia de las series de al menos 2
enlaces peptídicos contiguos y que, por tanto, permite valorar
casi todos los tripéptidos y todos los péptidos del orden
superior incluidas las proteínas. A continuación se exponen
las principales reacciones de caracterización de los
aminoácidos, en las cuales se tiene en cuenta la reacción
con el grupo Amino, o la presencia de Azufre en algunos de
ellos o la importancia que tiene el poseer una estructura
Aromática lo que origina unas características especiales.
REACCIÓN DE LA NINHIDRINA:
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con el
grupo amino de aminoácidos libres y con los grupos amino
de la molécula proteínica para dar un compuesto azul violeta.
Los aminoácidos prolina e hidroxiprolina también reaccionan
con la ninhidrina pero en este caso se obtiene un color
amarillo en lugar del violeta. La reacción es muy sensible por
lo cual se utiliza en cromatografía y en la detección de
aminoácidos y proteínas en muestras biológicas.
REACCIÓN DEL BIÚRET:
Cuando una disolución alcalina de sustancias que contienen
enlaces peptídicos tales como el Biuret, la oxamida, los
polipéptidos y las proteínas, se añade sulfato cúprico, se
forman sales complejas de color violeta. El nombre de
“reacción del biuret” proviene de un derivado de la urea, el
biuret, que, en condiciones apropiadas, da esta reacción. El
biuret se forma en el curso del calentamiento de la urea, con
desprendimiento de amoniaco.
El biuret contiene en su molécula dos enlaces amida
sucesivos, de modo análogo a las proteínas, donde se
presentan numerosos enlaces peptídicos sucesivos. Este
biuret en medio alcalino forma unos complejos de
coordinación con el cobre, de color azul morado
característico. La reacción es cuantitativa y permite valorar la
presencia de proteínas con bastante exactitud e
independientemente del tipo de proteína.
REACCIÓN XANTOPROTEÍCA
La reacción xantoproteíca (del griego xanthos, amarillo)
permite descubrir en la molécula de proteína la presencia de
aminoácidos aromáticos (fenilalanina, tirosina, triptófano).
Estos aminoácidos, al nitrarse, producen un compuesto de
color amarillo, característico de los nitrobencenos. No todas
Baño maría
Hielo
20 ml caseína 0.5%
20 ml gelatina 0.5%
20 ml suero sanguíneo
1 clara de huevo diluida en 20 volúmenes de agua
20 ml glicina 0.1%
5 ml prolina 0.1%
10 ml metionina 0.1%
5 ml fenilalanina 0.1%
10 ml tirosina 0.1%
5 ml triptófano 0.1%
5 ml arginina 0.1% en ácido sulfúrico 0.1N
5 ml cisteina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N
5 ml cistina 0.1% en ácido clorhídrico 0.1N
las proteínas dan positiva esta reacción ya que en unas
extremadamente baja o nula. Este es el caso de la gelatina
derivada del colágeno.
REACCIÓN DE MILLON
Esta reacción se debe a la presencia, en la molécula de
proteína, de la tirosina, que tiene en su composición un
grupo fenólico. Este, por calentamiento con el reactivo de
Millón (una mezcla de nitrato y nitrito mercúrico disueltos en
ácido nítrico concentrado), produce una coloración roja que
se debe a la formación de nitrotirosina que, por adición de
mercurio en el curso del calentamiento, se transforma en una
sal mercúrica de color rojo.
RECONOCIMIENTO DE ARGININA
La arginina, en presencia de α-naftol, se oxida con
hipobromito, o hipoclorito de sodio un grupo imino. La
arginina oxidada, al combinarse con otra molécula de α-
naftol, forma una sustancia de color rojo que permite
reconocerla.
RECONOCIMIENTO DE TRIPTÓFANO.
El triptófano en presencia de iones de magnesio y de ácido
oxálico (reactivo de Hopkins-Cole) y con la presencia de un
ácido mineral, como el ácido sulfúrico, produce coloraciones
violetas en la interfase que se forma, debido a la formación
de complejos con el grupo indol del triptófano.
DETERMINACIÓN DE LA PRESENCIA DE AMINOÁCIDOS
AZUFRADOS EN LAS PROTEÍNAS
La determinación de la presencia de aminoácidos sulfurados
se realiza mediante una hidrólisis (puede ser incompleta) de
la proteína en un medio fuertemente alcalino, que conlleva a
la destrucción de los aminoácidos sulfurados liberando el
azufre que contienen en forma de sulfuro, ion que se puede
poner de manifiesto con la adición de una sal soluble de
plomo, con el que precipita el sulfuro de plomo, de color
negro fácilmente reconocible:
2. OBJETIVOS:
 Efectuar algunas reacciones para comprobar la
presencia de proteínas.
 Comprobar la presencia de algunos aminoácidos en
forma libre o haciendo parte de las proteínas con base
en las reacciones características de los grupos
funcionales de esos aminoácidos.
3. MATERIALES Y REACTIVOS:
10 ml ninhidrina al 0.1% en acetona
10 ml NaOH 30%
1 ml sulfato cúprico 1%
10 ml ácido nítrico concentrado
10 ml reactivo de Millón
10 ml de reactivo de Hopkins-Cole. 10 g de Mg en polvo
diluirlos en agua, se agrega 250 ml de ácido oxálico fresco.
Se agita y se filtra. Se acidifica el filtrado con ácido acético y
diluir hasta 1 litro con agua.
10 ml de ácido acético glacial.
1 ml α-naftol 0.05% en etanol-agua (1: 1)
1 ml hipobromito sódico 1N
10 ml acetato de plomo 5%
10 ml de nitrito de sodio. 1%

MATERIAL QUE DEBE TRAER CADA GRUPO DE
ESTUDIANTES:
Clara de un huevo, Un sobre de Gelatina sin sabor, y
una cucharada de leche de soya en polvo, fosforera,
marcador o cinta de enmascarar, guantes, gafas, franela,
tapabocas.
CONSULTA PREVIA AL LABORATORIO
Consultar la fórmula general de un aminoácido, y las
estructuras de los siguientes aminoácidos: Glicina,
Alanina, Tirosina, Triptófano, Fenilalanina, Arginina,
Cistina, Cisteina, Metionina.
4. PROCEDIMIENTO:
1. PREPARACIÓN DE LAS MUESTRAS:
 Disolver en 100ml de agua a 37° medio sobre de
gelatina sin sabor
 Solubilizar la clara de un huevo en con el doble de
agua destilada
 Muestra de leche de soya: Diluir 5 g, en 100 ml de
agua
ANTES DE COMENZAR EL LABORATORIO ROTULAR LOS
TUBOS DE ENSAYO CON LOS NOMBRES DE LOS
AMINOACIDOS Y PROTEINAS QUE SE ENCUENTRAN EN
LA MESA DE TRABAJO, ASI COMO CON LOS NOMBRES
DE LAS MUESTRAS PROBLEMAS DE PROTEINAS Y LA
MUESTRA PROBLEMA DE AMINOACIDOS ENTREGADA
POR LA PROFESORA.
REACCIÓN DE LA NINHIDRINA
Tome 1 ml de la solución de cada una de las proteínas en un
tubo de ensayo diferente (las preparadas por usted y una de
las que se encuentran en la mesa de reactivos) y 1 ml de
glicina, metionina y prolina en tubos diferentes, agregue 1 ml
de ninhidrina a cada tubo (proteínas y aminoácidos) y
caliente a ebullición en baño maría durante 10 minutos. La
solución debe adquirir un color violeta azul o amarillo en el
caso de la prolina. Discuta sus resultados y consulte la
reacción.
REACCIÓN DEL BIURET
Tome en diferentes tubos 1 ml de la solución de cada
proteína y en otro tubo 1 ml de glicina se les añade 2 ml de
hidróxido de sodio al 30%, se mezcla cuidadosamente y se
agregan tres gotas de sulfato cúprico al 1%. Se mezcla de
nuevo. La aparición de una coloración rojiza violeta indica la
presencia de enlaces peptídicos. Analice sus resultados y
consulte la reacción.
REACCIÓN XANTOPROTEÍCA
Se toma en diferentes tubos 1 ml de la solución de cada
proteína y en otros tubos 1 ml de la solución de los
aminoácidos (glicina, fenilalanina, tirosina, triptófano)
Ninhidrina
agregue luego 1 ml de ácido nítrico concentrado a cada uno.
En el caso de las proteínas se observa la aparición de un
precipitado blanco que corresponde a la proteína
desnaturalizada. Caliente en baño maría durante 5 minutos.
La solución o el precipitado se tiñen de amarillo.
En caso de duda se deja enfriar el tubo de ensayo y se
añaden 2 ml de hidróxido de sodio al 30%. El color amarillo
vira a naranja fuerte. Analice sus resultados y consulte la
reacción.
REACCIÓN DE MILLON
Tome en diferentes tubos de ensayo 1 ml de la solución de
cada proteína y 1 ml de las soluciones de aminoácidos
(glicina, tirosina y triptófano) adicione 0.5 ml del reactivo de
Millón y agite, realice un calentamiento suave a temperatura
moderada por 5 minutos. Deje enfriar y posteriormente
agregue 0,5 ml de nitrito sódico. En los tubos que contienen
proteínas se forma un precipitado blanco. Caliente los tubos
en baño maría durante 5 minutos. La tirosina y las proteínas
que la contienen adquieren un color rojo. Analice sus
resultados y consulte la reacción.
RECONOCIMIENTO DE ARGININA
A 1 ml de la muestra (proteínas, arginina y glicina) añada 0.1
ml de hidróxido de sodio al 30% y 0.3 ml de α-naftol al
0.05%. Se agita y se deja 5 minutos en un baño de hielo.
A continuación se añaden 2 gotas de hipobromito sódico 1N.
La reacción es positiva indicando la presencia de arginina u
otra guanidina, al aparecer una coloración roja viva que se
desvanece con relativa rapidez. La adición de 0.3 ml de urea
al 40% estabiliza el color.
RECONOCIMIENTO DE TRIPTÓFANO.
a) Reacción de Hopkins-Cole
A 1 ml de solución de aminoácidos (glicina, triptófano,
metionina, glicina) y a 1 ml de proteína, adicione 1 ml de
reactivo de Hopkins-Cole. Agite y luego agregue
cuidadosamente por las paredes del tubo inclinado, 1,5 ml de
ácido sulfúrico concentrado. La aparición de un anillo violeta
en la interfase de los líquidos es señal de la presencia de
triptófano.
B) REACCIÓN DEL ÁCIDO GLIOXÍLICO:
Se toma en diferentes tubos de ensayo 1 ml de los
aminoácidos arginina, glicina, metionina y triptófano, y en
otro tubo 1 ml de proteína. Adicione a cada tubo 1 ml de
ácido acético glacial; luego deje caer lentamente por las
paredes del tubo 1 ml de ácido sulfúrico concentrado hasta
que se formen dos fases. Observe el cambio de color en la
interfase. Si en ella se forma un anillo violeta, la reacción es
positiva e indica la presencia del aminoácido triptófano.
RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
Rotule 8 tubos de ensayo como: , metionina, cisterna,
cisteína, arginina, albúmina de huevo, gelatina, leche de
soya, caseína. En cada uno agregue 2 mL. de la solución
correspondiente, 2 mL. de NaOH 10%. Caliente hasta
ebullición por 10 minutos, enfrié y agregue 1,0 mL. de
acetato de Plomo al 10%. Caliente en baño de agua a
ebullición por 5 min. La formación de un precipitado gris
oscuro o negro es prueba positiva para aminoácidos
azufrados.
RESULTADOS:
biuret xantoproteíca Millón arginina triptófan
En cada casilla escriba el signo + para la prueba positiva y el
signo – para la prueba negativa. Además escriba el color que
presenta cada prueba y cuando realice el informe, coloree
cada casilla con los colores observados
Compare sus resultados con los reportados en la literatura,
determine las posibles causas de error, determine que
aminoácidos conforman las proteínas estudiadas en el
laboratorio.
¿Qué grupos de alimentos son más ricos en proteínas?.
¿Pierden valor nutricional una proteína cuando se expone a
calor excesivo?
¿Son las proteinas estudiadas en el laboratorio de alto valor
nutricional y porqué?