UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO

FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES CUAUTITLÁN

Sección: Bioquímica y Farmacia Humana

Laboratorio de Bioquímica Microbiana

Grupo: ​1551 A

Reporte 7:

Metabolismo de Carbohidratos

Pruebas Bioquímicas primarias y secundarias

E​quipo: 1

ALUMNOS:

Carlos Daniel Martinez Anaya

Maria Luisa Ilse Miranda Salgado

Ricardo Francisco Olayo Aragón

PROFESORES:

QFB. Alma Susana García Barrón.

BQD. Maria Elizabeth Espinoza Matías.

QFB. Moises Missael Mejía Martínez.

Fecha de entrega:

Martes 22 de Octubre del 2019

 Introducción
En el procedimiento de inoculación el asa de cultivo o aguja de siembra, debe
calentarse al rojo sobre la llama inmediatamente antes y después de hacer la
transferencia.La flama destruye cualquier forma de vida sobre la superficie de la
aguja o del asa. Se mantiene la aguja hacia abajo sobre la flama, para calentar la
totalidad de la aguja y la parte inferior del mango.

Después de inocular, un cultivo bacteriano se conserva o se incuba en un lugar

apropiado para el crecimiento. En este caso “crecimiento”, significa el desarrollo de
una población de células a partir de una o pocas células. La masa de las células
hijas llega a ser visible a simple vista, bien como una opacidad “enturbiamiento”, en
medio líquido; o como una población aislada “colonia” en medio sólido, donde el
aspecto de éstas ofrece un medio para diferenciar especies.

La inoculación primaria puede hacerse con un asa, hisopo u otros dispositivos

adecuados.

● Inoculación de medios semi sólidos en tubo.

❖ Por picadura en forma vertical: Cuando se inocula agar semisólido en un tubo
para pruebas de motilidad (aunque no sea la única prueba que se valora),es
importante que el asa de inoculación sea retirada a lo largo del mismo camino
que se usó para atravesar inicialmente el medio. Solo se pica el agar con un
movimiento uniforme y recto y para ello se utiliza el asa recta.
● Inoculación en medios líquidos.
❖ El crecimiento bacteriano en medios líquidos se observa dela siguiente
manera:
1. Enturbiamiento, opacidad más o menos densa.
2. Formación de velo, pequeña masa de células que flotan en la parte superior
del cultivo.
3. Sedimento, depósito de células que permanece en la parte inferior del cultivo,
pero que se pone nuevamente en suspensión si el tubo se sacude
suavemente
● Inoculación en medios sólidos​.
1. Por punción (picadura).
2. Por estría.
3. Por punción y estría.

La interpretación de los cultivos primarios después de 24 –48 horas de la incubación

requiere de la observación y análisis de la morfología colonial. La evaluación debe
ser de la siguiente forma:

1. Observar las características y el número relativo de cada tipo de colonia

recuperado en medios de agar.
 2. Determinar la pureza,coloración de Gram morfología de las bacterias en cada
tipo de colonia.
3. Observar cambios en el medio que rodea las colonias, que reflejan
actividades metabólicas específicas de las bacterias recuperadas

La mayor parte de las pruebas usadas para evaluar la actividad bioquímica o

metabólica de bacterias (por mediode la cual puede hacerse una identificación final
de especie), se lleva a acabo mediante el subcultivo del aislamiento primario en una
serie de medios diferenciales,cuyos resultados pueden interpretarse después de uno
o dos días de incubación.

Pruebas bioquímicas:

Fermentación de carbohidratos:

La fermentación es un proceso metabólico de oxido-reducción que ocurre en un

medio ambiente anaerobio y, en lugar de oxígeno, un sustrato orgánico sirve como el
aceptor final de hidrógeno (electrones). En los sistemas de prueba bacteriológicos,
este proceso se detecta observando cambios de color en indicadores de pH a
medida que se forman productos ácidos.

Interpretación

Positiva = ​Color amarillo​ (ácido) Negativa = ​Color rosa​ - rojizo (alcalina)Color naranja

Pruebas de Citratos:

Determina si un microorganismo es capaz de utilizar citrato como única fuente de

carbono para el metabolismo y crecimiento, provocando alcalinidad.

Interpretación

Positivo: Crecimiento aunque no exista cambio de color.Crecimiento y el medio de

color azul intenso en pico de flauta.

Negativo: No se observa crecimiento y medio de​ color verde​.

Pruebas de óxido-reducción:

Determina el metabolismo oxidativo o fermentativo de un hidrato de carbono.

Pruebas de rojo de metilo:

Comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los

productos terminales ácidos de la fermentación de la glucosa y vencer la capacidad
amortiguadora del sistema. Es una prueba cualitativa de la producción de ácido
(determinación de pH).

Interpretación

Positiva: ​Rojo en la superficie del medio (pH = 4.4)Algunas bacterias pueden

producir menores cantidades de ácido a partir del sustrato por ello es posible que
aparezca un color naranja. Esto indica una prueba positiva.

Negativo:​ Amarillo​ (pH = 6) ó naranja

Pruebas de reducción de nitratos:

Determinar la capacidad de un organismo de reducir elnitrato en nitritos o en

nitrógeno libre.La reducción de nitrato en nitrito y en gas nitrógeno tienelugar
generalmente en condiciones anaerobias, en las cualesun organismo obtiene su
oxígeno del nitrato. El oxígenosirve como un aceptor de hidrógeno.

Interpretación

Positivo: ​rosa ​a ​rojo intenso​ Negativo: ​Amarillo

Pruebas de TSI:

Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono específico

incorporado en un medio de crecimiento básico, con producción o no de gases, junto
con la determinación de posible ácido sulfhídrico
Interpretación

1. Rojo en pico de flauta​: alcalino; degradación aeróbica de glucosa.Amarillo en

capa profunda: ácido; degradación anaeróbica de la glucosa.
2. Amarillo en pico​: ácido Amarillo en capa profunda: ácido
3. Rojo en pico de flauta​: alcalino Sin cambio de color en capa profunda:
alcalina.
4. Producción de H2S: precipitado​ negro
5. Producción de gases: Producción de burbujas,descomposición del medio,
ligera muesca del medio sobre el costado del tubo o desplazamiento del
medio del fondo,dejando un espacio libre.

Prueba de Movilidad, Indol y Ornitina (MIO):

El medio MIO se utiliza para la identificación de Enterobacterias sobre la base de

movilidad, la producción de ornitina descarboxilasa y de indo

Interpretación

1. Ornitina descarboxilasa

Positivo: color ​púrpura​ del medio

Negativo: Color amarillo en el fondo del tubo que puede ser púrpura al final.

2. Indol
Positivo: ​Anillo rojo en la superficie del medio​.
Negativa: No se produce color
Negativa: Color ​naranja en la superficie del medio.Indica desarrollo de escatol, un
compuesto metilado que puede ser el precursor de la formación de indol.La reacción
positiva después de 24 horas indica unaprueba completa.Si el cultivo de 24 horas es
negativo deberá incubarse otras 24 horas y repetirse la prueba.

3. Movilidad
Positiva. Los organismos móviles migran de la línea de siembra y se difunden en el
medio provocando turbidez.
Negativa. Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la línea de siembra.
*Se leen las reacciones de movilidad y de ornitina descarboxilasa antes de agregar
el reactivo de Kovacs para la prueba de indol.*
 Objetivos
Objetivos Generales:

- Conocer las diversas rutas metabólicas de asimilación de los carbohidratos

por las bacterias, con base en la producción de metabolitos secundarios tales
como ácidos orgánicos, aminas o gas.
- Con base a los resultados obtenidos en las diferentes pruebas bioquímicas
determinar la especie y el género bacteriano.

Objetivos Específicos:

- Poner de manifiesto a las enzimas presentes en los microorganismos, con la

finalidad de poder definir la especie bacteriana con la que se esté trabajando.
- Determinar la capacidad de un organismo para degradar los hidratos de
carbono específicos presentes en cada medio de cultivo utilizado.
 Tabla de materiales, equipos y reactivos

MATERIALES MATERIALES EQUIPO REACTIVOS

BIOLÓGICOS

*20 tubos de *Tubos de ensaye *2 Autoclaves *HCl 1 N (frasco

ensayo chicos con con tapón de rosca gotero) 50 mL.
tapón de rosca. chicos y con: *2 mecheros fisher.
*Peroxido de
*1 gradilla. -Medio de oxido *Microscopio óptico hidrogeno al 30%
fermentación (OF). compuesto. (frasco gotero) 100
*1 matraz mL.
Erlenmeyer de -Medio rojo de *Microscopio
500 mL. metilo-Voges estereoscópico. *NaOH 1 N
Proskauer.
*1 matraz *1 parrilla con (frasco gotero) 100
Erlenmeyer de -Caldo rojo de termo agitación. mL.
250 mL. fenol, campana de
Durham y con *KOH 1 N (frasco
*1 Espátula. diferentes azúcares gotero) 100 mL.
(glucosa, lactosa,
*2 pipetas *Ácido sulfanílico al
xilosa y almidón).
graduadas de 10 0.8% (frasco gotero)
mL. -Medio de citrato 50 mL.
Simmons.
*Reactivo de
-Medio KIA. Kovack´s

-Medio (frasco gotero) 50

Agar-hierro-triple mL.
azúcar.(TSI)
*Rojo de metilo al
-Caldo nitratado. 0.2% (frasco gotero)
50 mL.
-Cepas
microbiológicas *Alfa-naftilamina
problema (frasco gotero) 50
mL.

*Reactivo para
oxidasa.
 Procedimiento Experimental

PRUEBAS BIOQUÍMICAS PRIMARIAS 

 
  

 
PRUEBAS BIOQUÍMICAS SECUNDARIAS
 Resultados Experimentales

Pruebas bioquímicas primarias

Cepas Tinción de Motilidad Oxidasa Catalasa O/F

Gram

Serratia SP (-) (+) (-) (+) La bacteria

streptobac pseudomo es capaz de
illus nas oxidar y
fermentar al
carbohidrato

Enterobacter (-) (+) (-) (+)

Pruebas bioquímicas secundarias:

MR-VP

Prueba MR-VP para la muestra serratia SP

Nitratos:

Los nitratos se reducen a nitritos debido al vire

SIM:

Prueba de SIM
CITRATOS:

Prueba de citratos

KIA

El compuesto es alcalino-alcalino
Análisis de resultados

Las pruebas bioquímicas primarias son de gran utilidad en el estudio de

microorganismos ya que nos dan un primer acercamiento sobre el
género del microorganismo a tratar, en el caso de esta práctica, los
pruebas bioquímicas primarias realizadas fueron ​GRAAM​, dando
negativo para ​Serratia SP ​y ​Entherobacter c​ onfirmado en la
observación de muestras en el microscopio denotando una coloración
rosada/roja. Otra prueba primaria realizada fue ​Motilidad ​positiva para
ambos casos de los microorganismos estudiados, este se corroboró al
observar al microscopio movimiento a lo largo de todo el campo visual,
dado los movimientos vistos podemos decir que los bacilos vistos tienen
flagelos de tipo peritrico y monotrico; el peritrico dado a que tiene varias
extremidades tiene un movimiento más lento a diferencia del monotrico
que se mueve con facilidad y más rápido. La prueba de ​Oxidasa ​arrojó
resultados negativos ya que al poner la muestra en el disco de oxidasa
el color desapareció casi de inmediato dando a entender que esta
bacteria carece de la enzima oxidasa en su éxito taxonómico. La prueba
de ​Catalasa ​fue positiva para ambos casos de microorganismos
estudiados, ambos presentaron el burbujeo característico de esta
prueba lo que nos indica que estos microorganismos son anaerobios
obligados pues poseen esta enzima. A partir de la prueba ​O/F ​podemos
darnos cuenta que ​Entherobacter es capaz de oxidar y fermentar el
carbohidrato, al igual que ​Serratia SP e​ s capaz de oxidar y fermentar el
carbohidrato.

Las pruebas bioquímicas secundarias son empleadas para poder

conocer la especie del microorganismo estudiado, el microorganismo
estudiado fue ​Serratia SP,​ las prueba de ​MR-VP ​dió un resultado
positivo ya que se obtuvo la coloración roja característica de esta
prueba debida a la producción de acetoína, la prueba de ​Nitratos se
observó un cambio de coloración lo que indica una reducción de nitratos
a nitritos, siendo esta una prueba positiva. ​La prueba ​SIM ​dio como
resultado positivo a la movilidad ya que hay cierta turbidez en el
medio,lo que indica la presencia de una Enterobacteria, pero negativa
para la producción de H​2​S e Indol. La prueba de ​Citratos ​fue positiva ya
que hubo un cambio de color a azul, lo que nos indica que es un
microorganismo capaz de utilizar los citratos como fuente de carbono
para su metabolismo. La prueba ​KIA dio como resultado que el
microorganismo es capaz de fermentar lactosa y glucosa sin producir
ácido sulfhídrico.

CONCLUSIONES:

La bacteria de género ​Serratia sp​., pertenece a la familia Enterobacteriaceae, por lo

tanto, es un bacilo Gram negativo, anaeróbico facultativo, oxidasa negativo, que
crece abundantemente sobre agar sangre, agar chocolate y agar McConkey,
produciendo colonias que pueden ser pigmentadas, especialmente Serratia
marcescens y Serratia rubias.

Gracias la prueba primaria, Tinción de Gram, observamos que son bacilos

pequeños,Gram(-), agrupados en cadenas.

Con base la los resultados experimentales y a lo reportado en la literatura podemos

afirmar que la las pruebas para ​Serratia sp ​arrojaron resultados correctos.

En cuanto a su metabolismo podemos concluir que el microorganismo es capaz de

utilizar citrato como única fuente de carbono para el metabolismo y crecimiento.

ANEXOS:

Para la prueba de oxidasa existen distintas formas de determinarla por

ejemplo existe:

Reactivo de Gordon y McLeod 

Está compuesto por diclorhidrato de dimetil-p-fenilendiamina, también conocido

como N-dimetil-p-fenilendiamina o monoclorhidrato de p-aminodimetilanilina. Se

prepara como fue descrito para el reactivo de oxidasa de Kovacs, sustituyendo por

la sustancia involucrada. Este reactivo es ligeramente más estable que el reactivo

de oxidasa de Kovacs, aunque todos los reactivos que contienen p-fenilendiamina

son inestables. Esta reacción es más tardía, se interpreta como positiva con la

aparición de un color azul –púrpura dentro de 10 a 30 minutos.

-Reactivo de Carpenter, Suhrland y Morrison

Está compuesto por oxalato de p-aminodimetilalanina al 1%. Preparar de igual

manera a la descrita para reactivo de oxidasa de Kovacs, cambiando por la

sustancia correspondiente. Con la solución lista, se preparan tiras reactivas de la

siguiente manera: se impregnan tiras de papel de filtro Whatman N°1 de 6-8 cm con

el reactivo de oxalato de dimetil-p-fenilendiamina al 1%. Se dejan secar sin que

tenga contacto con metal, guardar en frascos tapa de rosca con desecante y

conservar en nevera. Estas tiras son estables hasta por 6 meses. Es el reactivo más

estable de todos los mencionados, pudiendo durar en solución hasta 6 meses. Otro

punto a favor es que no colorea el medio alrededor de la colonia, si se usa directo

sobre la placa. La aparición de un color rojo se interpreta como una prueba positiva.

Vire de los indicadores:

Indicador Intervalo de pH al que vira

Azul de bromotimol 6.0-7.6

Rojo de metilo 4.2-6.3

Rojo de fenol 6.8-8.4

Referencias:

Bailey and Scot´s, 1985, Diagnostic microbiology, Mosby, fouredition, España.

Baker, F. J. Breach M. R, 1990, Manual de técnicas demicrobiología médica, tercera

edición. Acribia, España.

Balows A, Hausler W. J. Hermann K. L. Isenberg H. D, ShadomyH. J, 1991, Manual

of clinical microbiology, quinta edición,American society for microbiology, USA.
Bernard D. D, Renato D., Herman N. E., 1985, Tratado demicrobiología, Tercera
edición, Salvat, España.

Murray P. R, Baron E. J, Pfaller M. A, Tenover F. C, Yolken R. H,1995, Manual of

clinical microbiology, sexta edición, Americansociety microbiology, USA.