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Alumnos:
EQUIPO 8
SECCIÓN: 2
Grupo: 5QV2
.
Fecha de entrega: 24 de Septiembre del 2019
INTRODUCCIÓN
La idea de que las mutaciones eran espontáneas no se aceptó hasta después de la
década de1940, antes de eso se creía que las mutaciones ocurrían en poblaciones de
bacterias en respuesta a condiciones particularmente selectivas. Fue hasta 1943 que
Luria y Delbruck demostraron mediante experimentos con cepas de Escherichia
coli sensibles a ser infectadas por un fago (T1) que las mutaciones que daban la
resistencia a este fago no dependía de si estas estaban expuestas al fago o no. Si no,
que dependían de que si las cepas eran crecidas en cultivos pequeños e individuales o
en un cultivo masivo y grande.
Las mutaciones son cambios debidos a una modificación heredable en el DNA, una
mutación en una cepa silvestre de cualquier célula genera una cepa mutante, el termino
mutante se refiere a un organismo en el cual la secuencia de bases de DNA ha sido
cambiada causando o no un fenotipo. Dichos cambios pueden originarse por varias
causas, sin embargo, las dos causas más probables son las siguientes:
1. Errores que ocurren durante la replicación y que la enzima Pol III no pudo corregir.
2. La alteración espontánea de un nucleótido.
Las mutaciones son eventos aleatorios, y no hay manera de saber cuándo o en que
célula va a ocurrir una mutación, además de esto las mutaciones son consideradas
aleatorias en el sentido de que la ocurrencia no está relacionada con alguna ventaja
adaptativa que le pueda conferir al organismo en su ambiente.
Dado que las células mutantes son raras en condiciones naturales, estas son inducidas
mediante un proceso llamado mutagénesis, usualmente la mutación en un gene dado es
de 10-6 el hecho de encontrar una mutación en un organismo equivale a buscar a ese
organismo entre un millón (o más) de individuos los “cazadores de mutantes” tratan los
cultivos con sustancias mutagénicas, aumentando así la frecuencia de mutación.
La estimación de rangos de mutación en bacterias es complicada, por el hecho de que
ocurren en bajas proporciones, el rango de mutación es la probabilidad de que un gene
sea mutado en una sola generación, la medida de los rangos de mutación es importante
sobre todo en estudios de evolución, y análisis del efecto del ambiente, la probabilidad
de no obtener mutantes en un cultivo de N número de células puede ser estimada
mediante una distribución de Poisson..
OBJETIVOS
● Conocer el manejo de agentes mutagénicos, como luz ultravioleta e hidroxilamina,
para producir mutaciones en Escherichia coli W 3350.
● Emplear parámetros como la frecuencia de mutación y la relación dosis-respuesta
para entender los procesos que realizan los agentes mutagénicos empleados.
● Proponer el daño que puede producir la hidroxilamina y la luz ultravioleta a nivel
de DNA, empleando diferentes mutágenos o antibióticos como revertantes de la
mutación.
RESULTADOS
Tabla 1. Cuantificación de colonias y títulos de células viables de Escherichia coli W3350
tratadas con Hidroxilamina a diferentes concentraciones.
Dilución
Equipo [HA] Título %Sobrevivencia
10−4 10−5 10−6
0.0 - 1556,1435 487, 357 1.74𝑥109 100%
90 Equipo 8
80 equipo 10
70 Equipo 12
% sobrevivencia
60
50
40
30
20
10
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8
[HA]
Tiempo Dilución
Equipo −4 Título %Sobrevivencia
luz UV 10 10−5 10−6
0 - 350, 390 75, 72 4.03𝑥108 100%
15 - - 1.14𝑥108 11.06%
300
Equipo 7
250 Equipo 9
Equipo 11
% Sobrevivencia
200
150
100
50
0
0 15 30 45 60
Tiempo (seg)
720, 125,
0.0 - - 24 7.48𝑥108 100% - - -
650 135
0.2 - 318,360 85,122 16 - 4.08𝑥107 5.45% - - -
8 2.48𝑥107
0.4 - 218,222 65, 41 3 - 3.31% - - -
0.6 420,442 56, 57 13 - - 4.47𝑥106 0.59% 2, 0 1𝑥104 0.0022
0.8 112,166 10, 15 4 - - 1.39𝑥106 0.18% 0,1 5𝑥103 0.0036
0.0 - - 256,288 - 3 2.73𝑥108 100 % - - -
0.2 - 375,351 41,45 25,31 - 3.69𝑥107 13.51 % - - -
10
0.4 - 91, 101 13,12 4 - 9.81𝑥106 3.59% - - -
0.6 207,215 13,29 2 0 - 2.11𝑥106 0.77% - - -
0.8 INC 72,76 7 - - 7.38𝑥106 2.7% 1,0 1x106 0.135
1.68x1
0.0 - - 208,350 45,49 3 2.96𝑥108 100% 0,1 5x105
0-3
1.75x1
0.2 - 526,572 75,78 7 - 5.69𝑥107 19.22% 1,1 1x105
0-3
12 4.58x1
0.4 - 107, 97 16,23 0 - 1.09𝑥107 3.68% 1,0 5x105
0-2
0.135
0.14
Equipo 8
Frecuencia de Mutación
0.12
Equipo 10
0.1 Equipo 12
0.08
0.06
0.0458
0.04
0.02
00
0.00168 00
0.00175 00 0.0022 0.0036
0 0
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8
Concentración de Hidroxilamina (M)
Figura 4. Relación de la concentración de HA con la frecuencia de mutación de
Escherichia coli W3350.
Tabla 4. Frecuencia de Mutación de Escherichia coli W3350 con tratamiento de Luz UV.
M
u
E t
a Frecu
q Dilución %Sobr n encia
u Luz
Título eviven t Título de
i UV
cia e Muta
p
s ción
o
10−4 10−5 10−6 10−7 10−5
0.04
Frecuencia de mutación
0.03
Equipo 7
0.02
Equipo 9
0.013
Equipo 11
0.01 0.0078
0.0028
0 0 0 0 0
1E-17
0 10 20 30 40 50 60
-0.01
Tiempo (seg)
Figura 5. Relación del tiempo de exposición con luz UV con la frecuencia de mutación
de Escherichia coli W3350.
Tabla 5. Registro del efecto de reversión con diferentes mutágenos o antibióticos en la
cepa de Escherichia coli tratada con HA y luz UV.
Tratamiento Equipo Sm 9-AA NTG 5-BU HA Agua
estéril
Luz UV 7 - - - - - -
9 - - - - - -
11 - - - - - -
Hidroxilamina 8 - - - - - -
10 - - - - - -
12 - - - - - -
“Sm”: Estreptomicina; “AA”: Amino Acridina; “5-BU”: 5 Bromo Uracilo; “+”: Reversión; “-“:
No reversión.
Frecuencia de mutación
La frecuencia de mutación espontánea es de 1x10^7 a 1x10^10 en cambio la inducida
es de 1x10^4 a 1x10^7 que es mayor, en la gráfica podemos ver que la frecuencia de
mutantes aumenta conforme la concentración de hidroxilamina lo hace, sin embargo los
resultados no son los esperados para la exposición a luz UV pues son muy variables esto
puede deberse a que los equipos 7, 9 y 10 que trabajaron con luz UV no realizaron bien
la diluciones lo que se puede ver en la tabla 4 de frecuencia de mutacióno simplemente
no cubrieron correctamente con aluminio los tubos, lo que provocó la activación de
mecanismos de fotorreparación que repararon una mutación sobre el marcador seguido.
Por último, se realizó un tratamiento con diferentes mutágenos y antibióticos, (los cuales
eran nitrosoguanidina, 5-Bromouracilo, Estreptomicina, 9-aminoacridina, Hidroxilamina y
agua estéril) para producir un efecto de reversión en las colonias mutantes para
determinar el tipo de daño que realiza la HA y la luz UV.
Como se sabe una reversión es una segunda mutación en donde se restaura el fenotipo
y/o el fenotipo. Y este se divide a su vez reversiones verdaderas y no verdaderas, en
donde las verdaderas se restaura el fenotipo y el genotipo. Y en las reversiones no
verdaderas se restaura el fenotipo, pero no se restaura el genotipo.
Los resultados esperados en el tratamiento con Hidroxilamina, son que aparezcan
revertantes (estos con presencia de un halo alrededor de los discos impregnados con el
agente, con un césped bacteriano y crecimiento de colonias bien definidas alrededor de
los discos).
Se sabe que este agente mutagénico provoca transiciones unidireccional GC-AT. Se
esperaba la presencia de revertantes en 5-bromouracilo, debido a que provoca
transiciones bidireccionales, al igual en Nitrosoguanidina, que provoca transiciones.
En los reactivos que no se esperaba la presencia de revertantes son, 9-Aminoacridinica,
en Hidroxilamina, estreptomicina y agua estéril. Esto debido a que en el caso de 9-
Aminoacridina se provocan inserciones y deleciones, en el caso de la Hidroxilamina,
como ya se mencionó con anterioridad, son transiciones pero están son unidireccionales,
por lo tanto no provoca una reversión. La estreptomicina es un antibiótico, que hasta lo
que se conoce hasta el momento, provoca únicamente una lectura incorrecta en el RNA,
por lo cual no se podría considerar un agente mutágeno verdadero.
Existen una serie de artículos en donde se discute si la estreptomicina podría llamarse
agente mutágeno, en el artículo leído, se revisaron 4 antibióticos, los cuales fueron
penicilina, estreptomicina, cloranfenicol y aureomicina. En donde se buscaba conocer y
comprobar que estos antibióticos actuaban como agente mutagénicos, se llegó a la
conclusión, que la estreptomicina es una alteración en el marco de lectura y no afecta el
DNA, además no es hereditaria la modificación observabada. Por lo que se dedujo que
no influía a ser un agente mutagénico, ya que estos afectan el ADN y son heredables.
En el caso del tratamiento con Luz UV, la cual se sabe que provoca inserciones y
deleciones en el DNA por la formación de dímeros de pirimidina y como efecto secundario
provoca transiciones y transversiones. Este agente físico provoca reversiones en casi
todos los agentes mutagénos usados, como lo son nitrosoguanidina, el cual al ser un
agente alquilante, puede revertir la luz UV, el 5-Bromouracilo que puede revertir la luz
UV, así como 9- aminoacridina que es un agente intercalante que provoca inserciones y
deleciones. Se esperaban revertantes de hidroxilamina de igual forma.
Y en el caso de los que no se esperaba era en estreptomicina, por las mismas razones
explicadas en hidroxilamina y tampoco en el agua estéril. Estos resultados se presentan
en la tabla 6, para verificar cuales son los que se esperaban y cuales no.
En la tabla número 5 se presentan los resultados obtenidos en la experimentación y aquí
se puede decir que no fueron los esperados, debido a que no se encontraron revertantes
en ninguno de los agentes y en ningún tratamiento con hidroxilamina ni luz UV. Esto se
puede deber, a que los discos que se utilizaron, quizás no estaban impregnados con la
sustancia o bien estos eran demasiado viejos, esto se puede deducir debido a que desde
el momento que se sujetaron los discos con las pinzas, los papeles estaban adheridos
unos con otros y era muy difícil separarlos. Otra situación que pudo ocurrir pudo ser que
la sustancia a utilizar estaba caducada, esto provocaría que se encontraran estos
valores.
CONCLUSIONES
La frecuencia de mutación aumenta conforme la dosis del mutágeno es más alta
La hidroxilamina es un mutágeno que forma transiciones en el DNA
A mayor concentración de Hidroxilamina mayor número de mutantes
La radiación UV forma dímeros de pirimidinas que provocan inserciones y deleciones
La radiación UV es más eficiente para producir una mutación en un organismo.
Bibliografía
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