TLR: si occupano di trasduzione del segnale. Sono 10 nell’uomo.

Agiscono come omo o

eterodimeri. Hanno una localizzazione particolare in quanto hanno una doppia localizzazione:
alcuni sono sulla membrana cellulare, altri su quella degli endosomi. In entrambi i casi, “leggono”
l’ambiente extracellulare e citoplasmatico.
Abbiamo due vie principali di trasduzione, sempre dovute al dominio TIR, che si trova nella zona C
terminale. Questo dominio può associarsi con due molecole adattatrici, MyD88 e TRIF. I pathways
terminano con la trascrizione di geni di citochine ad opera di NF-kB o di interferoni (IFN). In
quest’ultimo caso, ciò avviene ad opera degli IRF, fattori di trascrizione che attivano la produzione
di interferoni. MyD88 attiva IRF5 e 7 (citochine proinfiammatorie, IL-1, 6, TNF) e IFN.
TRIF, invece, attiva IRF3, con produzione di IFN.
In entrambi i casi c’è sempre l’attivazione di NF-kB. Tutti i TLR usano MyD88, tranne TLR3, che usa
TRIF. TLR4, che è il più studiato e il più famoso dei TLR, riconosce il lipopolisaccaride: utilizza
entrambe le vie di trasduzione. Questa capacità è dovuta alla localizzazione. Normalmente è
espresso sulla membrana cellulare, ma può anche essere internalizzato nell’endosoma: quindi può
utilizzare vie diverse, a seconda dell’associazione del dominio intracellulare con un’altra molecola
adattatrice (sorting o signaling adaptators), coinvolta nel reclutamento o di MyD88 o TRIF.

I microbi, quando entrano nell’organismo, sono in difficoltà, sia per la presenza della risposta
innata immediata (come quelle di barriera) sia per la produzione di citochine o per il reclutamento
di altre cellule. Alcuni microbi, per questo, si sono “inventati” dei meccanismi per entrare nelle
cellule e sfuggire al riconoscimento in sede extracellulare. Contro i microbi intracellulari quale è
stata la soluzione? La risposta è stata la localizzazione di PRR intracellulari. Questi possono
riconoscere microrganismi dal lato intracellulare. Esistono tre famiglie: NOD-like receptors
(riconoscono lipoproteine batteriche), RIG-like receptors, cytosolic DNA sensors.

NOD-like receptors
Hanno una evoluzione piuttosto conservata; si trovano in sede citosolica e hanno un ruolo
importante nella risposta immunitaria innata ma anche nella fisiologia dell’ospite, in quanto sono
conservate nell’evoluzione, sia negli animali, che nelle piante. L’identificazione di alcune mutazioni
su NOD ha portato all’identificazione di malattie ad essi correlati. Oltre alla loro funzione nel
sistema immunitario, sono coinvolti anche nella riproduzione.
Hanno un dominio centrale detto NOD (o NACHT): questo dominio ha come funzione principale
quella di indurre l’oligomerizzazione di queste proteine, alla base del loro meccanismo effettore.
Alll’N terminale c’è un dominio di interazione proteina/proteina, mentre al C c’è un dominio ricco
in leucine. Nell’uomo ne sono noti 22, divisibili in 4 o 5 gruppi: il 5° è considerato da alcuni nel
gruppo NLR-C. A fare la distinzione non è la struttura dei domini che legano il ligando, bensì al tipo
di dominio effettore.
- NLRA: dominio di tipo AD (acid transactivation domain). Esiste un solo membro di questa
famiglia (CIITA);
- NLRB: dominio di tipo BIR (baculovirus inibitor of apoptosis protein repeat);
- NLRC: dominio di tipo caspase recruitment domain (CARD) oppure X-domain;
- NLRP: pyrin domain (PYD).
Questi recettori di solito sono in una conformazione chiusa: il dominio di oligomerizzazione
impedisce l’attivazione della molecola ed è+ vicino al dominio ricco il leucine. Al riconoscimento
del ligando si ha l’attivazione della molecola con cambio di conformazione e liberazione del
dominio di oligomerizzazione. A questo punto, quest’ultimo è disponibile per la formazione di
oligomeri, alla base dell’attivazione dei meccanismi effettori.
Riconosciamo due meccanismi di funzione principale:
 a) Il primo meccanismo è dovuto al fatto che quando si forma un oligomero si ha l’attivazione
della caspasi1: l’oligomero che si forma prende il nome di infilammosoma: si ha il rilascio
così di IL-1, IL-18, IL-33. Si ha induzione di infiammazione e come conseguenza si ha
l’induzione anche di una morte per apoptosi, dovuta all’inflammosoma, detta piroptosi.
b) Il secondo non vede l’attivazione di caspasi, ma di NFkBm, di MAPK, di IFN e IRFs. Si ha così
la produzione di citochine che portano al rilascio di citochine. Questo tipo di NOD like
receptors può promuovere la formazione dell’autofagosoma. Servono a portare
informazioni riguardo al tipo di microbo che è entrato nella cellula. Il fagosoma prende
materiale dal microambiente, prende informazioni da che microbo è stato fagocitato etc.
questo tipo di meccanismo può prevedere l’uso anche di altre proteine adattatrici.
I NOD portano poi all’attivazione di NFkB, di MAPK e di IFN.
L’inflammosoma è una struttura di notevoli dimensioni: è possibile con il microscopio elettronico
vederne la struttura.
Tra i substrati della caspasi 1, ci sono anche altre molecole che portano ad un danno al DNA e che
portano infine alla piroptosi e alla lisi della cellula. Laddove una cellula sia infettata, è meglio
sacrificare una cellula piuttosto che quelle vicine, pur di eliminare il microrganismo.

I NOD hanno come scopo la produzione di citochine: esempi di NOD sono NOD1-2 che riconoscono
prodotti di degradazione del peptidoglicano batterico. Promuovono la formazione
dell’autofagosoma, in modo dipendente dalla trascrizione di determinate proteine. L’effetto è
l’uccisione dei batteri fagocitati nella cellula; questo meccanismo funge anche da segnalazione e da
presentatore di antigeni, con lo scopo di scatenare la risposta immunitaria di tipo adattativo.
In condizione di omeostasi, si ha il riconoscimento dei peptidoglicani, si forma un complesso di
oligomerizzazione, si ha il reclutamento di RIP2 e infine l’attivazione di NFkB. Questo porta alla
trascrizione di nuovi geni, con la produzione di sostanze ad attività antimicrobica (come la mucina).
L’attivazione dei geni porta alla produzione di citochine, che attivano i monociti residenti oppure i
linfociti T17, che contribuiscono a mantenere l’integrità della barriera mucosale dell’intestino. Nel
caso di malattie croniche, come il morbo di Crohn, si è vista una mutazione di NOD2: non vengono
riconosciuti i microbi, si perde il programma infiammatorio protettivo. Si ha un fenomeno di
disfunzione della barriera: il microbiota andrà incontro a proliferazione indiscriminata e sostituito
da un altro tipo di microrganismi. Avremo un danno alla barriera. La reazione sarà un’innesco di
processi infiammatori che cronicizzano.

I recettori che percepiscono gli acidi nucleici riconoscono DNA o RNA di derivazione microbica. Può
trattarsi di RNA a doppia o singola elica e DNA a doppia elica. Nel lisosoma possiamo avere mRNA
o DNA a doppia elica. Alcuni nucleotidi ciclici possono facilmente essere espulsi dal fagosoma e
rappresentano segnali recepiti da recettori per acidi nucleici all’interno della cellula. Come si
distingue tra acidi nucleici self e non self? Questo si fa in base a tre elementi:
- Concentrazione dell’acido nucleico
- Localizzazione cellulare: se si trova a livello extracellulare, citosolico, endolisosomiale.
- Struttura: ci sono modifiche nella sequenza o della conformazione (es. diversa metilazione).
La somma di questi elementi fa compiere la scelta tra un programma pro infiammatorio oppure no.
Alcuni recettori che riconoscono queste strutture sono TLR, oppure sensori della presenza di DNA
esogeno. Tutto questo porta all’induzione della trascrizione di IFN oppure il riconoscimento
dell’RNA virale all’interno della cellula. Quest’ultimo caso deriva anche dalla presenza di recettori
con effetto diretto antivirale, ma che non hanno effetti in generale all’interno della cellula.

RIG-like receptors
Hanno localizzazione citosolica. Sono rappresentati da elicasi (RIG-1) e da MDA5. La RIG1 riconosce
una serie di virus, mentre MDA5 altri. Dopo aver riconosciuto il DNA o l’RNA, interagiscono con la
proteina MAVS, che è ancorata alla membrana esterna del mitocondrio. Si formano complessi di
oligomerizzazione attaccati ai mitocondri e avremo la produzione di citochine pro infiammatorie e
la produzione di IRF3 e 7 e NFkB. Nella famiglia dei RIG like, oltre a RIG1 e MDA5, abbiamo MAVS,
legata ai mitocondri e LGP2, che manca del dominio CARD ma può legarsi alle altre due molecole e
bloccarne l’attivazione.

In tutti i casi visti, si tratta di segnalazione autocrina, in cui la cellula produce sostanze che regolano
l’attività antimicrobica della cellula stessa.

Il riconoscimento del DNA all’interno del citoplasma coinvolge cGAS, che è in grado di riconoscere
il DNA a doppia elica: una volta legato, dà l’avvio a una via che prevede una serie di secondi
messaggeri, che portano all’attivazione di geni regolati dall’interferone . Lo scopo è sempre la
produzione di citochine pro infiammatorie.
AIM2 è un altro recettore citosolico che riconosce il DNA a doppia elica, con il rilascio di IL-1 e IL-
18: è in grado di dare l’avvio alla formazione a una struttura del tutto simile all’inflammosoma.

Esistono associazioni tra mutazioni in geni codificanti questi recettori oppure nei confronti di alcuni
antibiotici. Nel LES, è stata vista una correlazione tra la malattia e una mutazione in alcuni TLR; in
altre patologie, sono state viste correlazioni tra là malattia e MDA5.

Tutti questi recettori possono portare a vie comuni di attivazione della cellula. Per il mantenimento
dell’omeostasi, devono trovare un’equilibrio tra la presenza del mondo microbico (microbiota) e la
loro attivazione. Perché non c’è sempre una iper attivazione delle cellule dotate di PRR?
1) Si discrimina tra PAMP di tipo solubile e di tipo particolato: se la sostanza è solubile è stata
rilasciata dal microbo e la minaccia per la cellula è minore: non c’è infatti il microbo
direttamente in sede. Particelle di 0.5 µm o più di diametro danno il via alla fagocitosi, che
portano alla generazione, ad esempio, di ROS. Se recettori come le dectine riconoscono
elementi microbici (particolati), allora si avrà una intensa trasduzione del segnale che porta
alla produzione di citochine pro infiammatorie e di ROS. Diversamente non si avrebbe la
produzione di tutte queste sostanze.
2) Si discrimina tra microbo vivo oppure no: il sistema immunitario risponde in modo più
violento nei confronti dei batteri vitali che non in quelli morti. I batteri vivi contengono i
vita-PAMP, che segnalano che i batteri sono appunto vivi. I vita-PAMP possono essere
mRNA batterico, TLR o NLR, oppure molecole associate con la replicazione batterica.
3) Si distingue tra i patogeni e i non patogeni: un patogeno è tale perché esprime certi fattori
di virulenza, che ad esempio permettono l’invasione dei tessuti, cosa che non succede nei
batteri non patogeni. Il riconoscimento di queste molecole porta a una risposta
immunitaria solo nei confronti dei patogeni.
Alcuni virus e batteri Gram- hanno inventato alcuni meccanismi per eludere il riconoscimento da
parte dei PRR: alcuni mascherano l’’RNA a doppia elica, altre proteine virali inibiscono IRF, oppure
MyD88 e così via.
L’ultimo tipo di PRR è rappresentato da sostanze solubili presenti nel nostro organismo, con la
capacità di riconoscere diverse strutture. Secondo alcuni rappresentano precursori evolutivi degli
antibiotici e possono raggiungere qualsiasi distretto dell’organismo. Appartengono a differenti
famiglie: tre sono le principali e sono le collettine, ficoline e pentraxine. Hanno un meccanismo
d’azione conservato, con tre vie:
 - Attivazione del complemento
- Fenomeni di neutralizzazione dei microbi
- Opsonizzazione

Collettine
Hanno insieme proprietà di collagene e di lectine (in grado di riconoscere carboidrati ed
eventualmente lipidi). Sono collettine la SPA, SPD, la MBL e C1q (ma quest’ultimo non è una
lectina, anche se ha una struttura simile). Hanno strutture che ricordano il collagene e hanno
anche strutture globulari che riconoscono sostanze di tipo diverso.

Ficoline
Sono strutturalmente simili alle collettine. Nell’uomo ce ne sono 3: sieriche (L, H), nel citosol di
neutrofili, monociti, cellule alveolari del polmone (M).

Pentraxine
Esistono pentraxine corte come CRp e SAP e lunghe. Sono pentameriche. Legano sia microbi che
cellule apoptotiche (sia PAMP che DAMP). SAP si può legare alla matrice extracelluare. CRP e SAP
possono legare Fc-gamma-R. In ogni caso, sono in grado di legare anche le teste globulari di C1q.
La CRP (proteina C reattiva) è il maggior componente delle proteine della fase acuta. La si valuta
negli esami del sangue per capire se è presente un’infiammazione.
Fan parte delle pentraxine lunghe la PTX3 e la pentraxina neuronale NP1 e 2. La PTX3 è un
multimero (due tetrameri legati covalentemente). Riconoscono varie sostanze microbiche,
componenti del complemento, proteine della matrice.. sono prodotte da vari tipi cellulari. La
produzione avviene in risposta a citochine pro infiammatorie. Sono da considerarsi proteine della
fase acuta. PTX3 è contenuta nei granuli dei neutrofili ed è utilizzata anche nelle Nets.
Tutte queste proteine portano all’attivazione della cascata del complemento.

SISTEMA DEL COMPLEMENTO

La sua scoperta non è recente è infatti portò all’assegnazione del Nobel a J. Bordet. Lo definì così
perché vide la presenza di fattori che “complementavano” l’atttività degli anticorpi nella lisi
cellulare. Studiava i batteri e prese siero fresco contenente anticorpi verso un batterio: mescolando
siero immune e batteri, si otteneva la lisi dei batteri. Da questo si poteva dedurre che la lisi era
dovuta alla presenza degli anticorpi. Prese poi del siero immune vecchio o riscaldato a 56 gradi, lo
mescolò ai batteri e la lisi batterica non avveniva. Bordet quindi capì che la lisi non è mediata solo
dagli anticorpi, ma ci deve essere qualcosa che complementa l’attività degli anticorpi. Prende un
siero fresco, normale (non immune), prende di nuovo il siero invecchiato o scaldato e mescola
queste due cose insieme ai batteri: questa volta si ha la lisi dei batteri. In condizioni normali, nel
siero è contenuto uno o più fattori che possono aiutare gli anticorpi nel dare la lisi batterica.
Il sistema del complemento è un insieme di proteine inattive presenti in tutti i liquidi organici: è
raprresentato da più di trenta proteine: la gran parte è sono plasma proteine, altre sono proteine
di membrana. Sono sintetizzate per il 90% dal fegato e per il 10% da monociti, macrofagi... Sono
proteine poco stabili e termolabili. Il meccanismo è a cascata ed è estremamente potente: va
incontro ad amplificazione. Una molecola attivata infatti riconosce più molecole di substrato, prima
di inattivarsi. I substrati attivati sono a loro volta enzimi che riconoscono altri enzimi è così via. È un
costituente importante sia dell’immunità innata che di quella adattativa.

NOMENCLATURA
 1. I componenti della via classica sono designati con una C seguita da un numero, ma a causa
dell’ordine con cui sono stati scoperti i primi quattro componenti sono noti come C1, C4,
C2, C3.
2. L’attivazione può essere dovuta alla via classica oppure alla via alternativa: scoperta in
seguito, vede i suoi componenti designati cona una lettera (B, P, D...).
3. Sono secreti come pro enzimi inattivi. Si attivano per cambiamenti conformazionali oppure
per scissione enzimatica. I frammenti di taglio sono designati con una lettera maiuscola
dopo il nome del componente da cui derivano (C3a e C3b, ad esempio). Normalmente il
segmento di dimensione maggiore non resta solubile ma si lega al complesso di attivazione
o a un substrato, a differenza di quello di dimensioni minore.
4. Generalmente si assegna la lettera b al frammento di membrana e la a a quello solubile. Il
C2 è un’eccezione per cui si designa con a il frammento principale, che rimane ancorato al
substrato e con b il frammento solubile.
5. I recettori della membrana cellulare per il C3 sono abbreviati come CR1, CR2, CR3 e CR4.
6. Esiste una terza via di attivazione, che è la via lectinica.

La via classica è dovuta all’intervento della proteina C reattiva e degli anticorpi sulla superficie del
patogeno. Nonostante sia la prima scoperta, è l’ultima ad agire, dato che gli anticorpi sono
sintetizzati nella risposta adattativa.
La prima ad agire è la via alternativa, attivata dal microambiente generato dalla superficie del
patogeno. La via lectinica è la seconda ad agire: la lectina che lega il mannosio si lega alla
superficie del patogeno.
In tutti i casi, si taglia il C3 in due parti (a e B): il b si lega covalentemente alla superficie del
patogeno, mentre il C3a è solubile. A fare questo taglio, è un enzima detto C3 convertasi. Da qui in
poi è tre vie proseguono insieme con tre effetti:
- Reclutamento di cellule infiammatorie grazie ai frammenti a
- Opsonizzazione dei patogeni (fagocitosi e uccisione)
- Perforazione della membrana cellulare dei patogeni
Il C3 è una proteina del siero che subisce idrolisi. Il taglio del fattore B da parte della serinproteasi
fattore D produce una C3 convertasi solubile (iC3Bb) che agisce su altre molecole di C3 generando
c3a e C3b. Quest’ultimo si lega infine covalentemente alla superficie del patogeno. Al C3b legato
sul patogeno, si lega il fattore B.
Via lectinica: nel siero c’è la collettina MBL, che si lega a carboidrati contenenti il mannosio, tipici
dei microbi. La MBL nel siero circola associata a delle altre molecole (MASP1-2), per formare un
grande complesso. Quando MBP lega gli zuccheri, MASP2 si attiva e riconosce come substrato il C4
è il C2 e li scinde. Il C4b si lega sulla membrana microbica e lega il C2a, formando la C3 convertasi
(= C2a+C4b). Nella via classica, l’innesco è dato dal legame di C1q con le pentraxine. È associato a
delle serinesterasi (C1r e C1s). Quando il C1q riesce a legare delle pentraxine, si attiva e mette in
funzione l’attività serinesterasi a di C1r che attiva C1s, i cui substrati sono C4 e C2. La convertasi
quindi è la stessa per tutte le vie. La C3 convertasi scinde il C3 in C3a e C3b: da qui in poi le vie
sono comuni.
Il C3a è una anafilotossina (liberata nell’anafilassi) ed è un peptide proinfiammatoria.
Il C5a in realtà ha l’attività proinfiammatoria maggiore; anche il C4a ha questa attività. Questi
frammenti esplicano la loro attività legandosi a recettori espressi su cellule endoteliali, mastociti,
macrofagi, neutrofili (edema, rilascio di istamina, shock, chemiotassi, degranulazione...).
Il C3b è quello che dà gli effetti più importanti: porta all’opsonizzazione oppure ulteriore
prosecuzione della via del complemento. C3b lega C5: la C3 convertasi acquisisce la capacità di
tagliare il C5. C5b recluta C6,7,8,9 formano pori nella membrana. In questo modo, si ha così il
richiamo di acqua nella cellula, che si lisa. Non basta un solo poro, ma sono necessari più pori
perché la lisi sia efficace.