AMINOACIDOS Y PROTEINAS

En 1839, el químico holandés Gerardus Johannes Mulder investigaba

las propiedades de las albúminas, un grupo de sustancias tales como
la leche y los huevos, que coagulaban cuando se las sometía al calor.
Mulder determinó, lo que el pensó sería la fórmula química de todas las
sustancias albuminosas: C4OH62O12N10. El científico sueco Jons Jacob
Berzelius, uno de los fundadores de la química moderna, sugirió a
Mulder de que las albúminas deben ser llamadas proteínas (de la
palabra griega proteios, que significa "primero") debido a que el
sospechaba (basado en la fórmula determinada por Mulder, que
conocemos ahora está fuera de lo correcto) que estos compuestos
podían ser los más importantes de todas las sustancias biológicas. Así,
se impregnó el nombre de proteína. El nombre fue profético;
investigaciones desde 1839 hasta la fecha han revelado que las
proteínas están involucradas en cada proceso celular. Estos
compuestos nitrogenados, son los sólidos más abundantes en el
protoplasma celular. El núcleo celular, uno de los componentes del
protoplasma, contiene proteínas (nucleoproteínas) que están
íntimamente relacionadas con la división celular y con la herencia.
Otra parte, el citoplasma celular, contiene más de un millar de
proteínas distintas, denominadas enzimas, que catalizan los múltiples
cambios químicos requeridos para el mantenimiento de la vida celular.
Además, los animales, plantas y microbios producen enzimas
extracelulares necesarios en la descomposición de la dieta compleja de
proteínas, lípidos y carbohidratos, para simplificar los nutrientes que
son fácilmente absorbidos y utilizados por la célula. Para comprender
el amplio rango de sus funciones biológicas, se cita a continuación
algunos ejemplos:

1. La gran mayoría de los catalizadores bioquímicos, conocidos

como Enzimas son proteínas. Los enzimas catalizan casi todas las
reacciones biológicas que ocurren en las células vivientes y aceleran,
por muchos órdenes de magnitud, la tasa de esas reacciones. Sin éste
notable poder catalítico, por el cual las tasas de reacción se aceleran
hasta un millón de veces o más, la vida como conocemos no sería
posible. Algunas de éstas reacciones como la hidratación del dióxido
de carbono son muy sencillas. Otras, como la replicación de un
cromosoma entero, son extraordinariamente complicadas.

2. Las proteínas, conocidas colectivamente como inmunoglobulinas,

sirven como primera línea de defensa contra infecciones bacterianas y
virales. Estas proteínas altamente específicas, reconocen lo propio y lo
ajeno y se combinan con las sustancias extrañas para combatirlas.
3. Las proteínas transportadoras, acarrean materiales (iones y
moléculas pequeñas) a través de las membranas celulares. La
hemoglobina, por ejemplo, transporta el oxígeno en los eritrocitos,
mientras la mioglobina, una proteína relacionada, transporta el
oxígeno en el músculo. Así mismo, el hierro es transportado en el
plasma sanguíneo por la transferrina y se almacena en el hígado en
forma de un complejo con ferritina, otra proteína. Sin éste transporte,
las células morirían.

4. Muchas hormonas, tales como la insulina, son proteínas. Estas

proteínas reguladoras controlan muchos aspectos funcionales de la
célula, desde el metabolismo hasta la reproducción.

5. Las proteínas estructurales proporcionan soporte mecánico a

animales y algunas veces conforman sus esqueletos dérmicos. La
dureza y flexibilidad del tejido conectivo, la fuerza de tensión de la piel
y el hueso se debe a la presencia del colágeno, una proteína fibrosa
extracelular.

6. Ensamblajes de proteínas hacen posible la contracción muscular

por medio del movimiento deslizante de dos clases de filamentos
proteicos (actina y miosina). Movimientos coordinados a nivel
microscópico, tales como los movimientos de los cromosomas en la
mitosis, el movimiento de bacterias y la propulsión de esperma por
medio de flagelos también se producen por ensamblajes contráctiles
de naturaleza proteica.

7. La respuesta de las neuronas a estímulos específicos causados

en la sinapsis por el bombardeo de hormonas neurotrasmisoras
colinérgicas como la acetilcolina y andrenérgicas como la adrenalina,
depende de la asequibilidad de receptores proteicos, que
generalmente se encuentran ligados a las membranas. La rodopsina,
una cromoproteína sensible a la luz, es el receptor proteico en los
bastoncitos de la retina.

8. El control de la expresión genética, por enzimas, en el desarrollo

y la diferenciación celular es imprescindible para un metabolismo
celular coordinado. En el caso de organismos procariotes, tales como
las bacterias, las proteínas represoras son moléculas de suma
importancia, que sirven de control en la transcripción, silenciando
segmentos específicos (operones) del DNA de la célula.

9. El citoesqueleto está compuesto de varios tipos de proteínas que

desempeñan diversas funciones.
La lista se pudiera extender casi indefinidamente, sin embargo las
funciones mencionadas anteriormente, demuestran la importancia
central de las proteínas en el estudio de la bioquímica.

Aminoácidos: elementos constructivos de las proteínas

Las proteínas son polímeros de elevado peso molecular constituídas

por monómeros de bajo peso molecular (~110 Daltons) denominados
aminoácidos. Los aminoácidos se derivan de las proteínas animales,
vegetales y microbianas y son ácidos orgánicos que contienen ya sea
un grupo amino o un imino, un grupo carboxílico, un átomo de
hidrógeno y un grupo distintivo (o cadena lateral) R enlazados a un
átomo de carbono central alfa. Al carbono central se lo denomina alfa
por encontrarse ligado adyacente al grupo (ácido) carboxílico.

Los aminoácidos en solución, a pH neutro, son predominantemente

iones dipolares (zwitteriones) en lugar de moléculas no iónicas. La
forma dipolar de un aminoácido se caracteriza por tener protonado el
grupo amino (__NH3+) y disociado el grupo carboxílico ( __COO-). El
estado de ionización de los aminoácidos varía conforme al pH. En
condiciones ácidas, el grupo carboxilo no se encuentra ionizado
(__COOH) mientras que el grupo amino si está ionizado ( __NH3+). En
ambiente alcalino, por ejemplo a un pH aproximado a 11, el grupo
carboxilo se encuentra en su forma ionizada ( __COO-) y el grupo amino
no está ionizado (__NH2). En solución neutra, ambos grupos se
encuentran ionizados a la vez (__NH3+, __COO-).

Todos los aminoácidos, a excepción de glicina, contienen por lo menos

un átomo de carbón asimétrico. Estos átomos llevan ligados cuatro
grupos diferentes. Las moléculas que contienen un átomo de carbono
asimétrico existen en dos formas ópticamente activas, las que
contienen dos átomos de carbono asimétricos tienen cuatro formas
ópticamente activas, calculándose el número total de éstas formas por
la regla de Le Bel-Van't Hoff, la cual establece que el número total de
formas ópticamente activas será igual a 2n, en la que n representa el
número de átomos de carbono asimétrico en el aminoácido. El
agrupamiento tetrahédrico de cuatro grupos diferentes alrededor del
carbono confiere actividad óptica a los aminoácidos. Las dos formas
especulares objeto-imagen se denominan isómero L y D. Un isómero
son dos o más compuestos que poseen la misma fórmula, pero
diferente estructura o, la misma colección de átomos arreglados en
diferente manera. Unicamente los aminoácidos L (relacionado con el
L-gliceraldehído) son constituyentes de las proteínas. La mayoría de
los L aminoácidos existentes en la naturaleza hacen girar el plano de
luz polarizada hacia la izquierda, sin embargo, existen algunos
aminoácidos L que hacen girar el plano de la luz polarizada hacia la
derecha. (D y L se refiere a conformación; + y - se refiere a rotación).
Los isómeros ópticos o enantiómeros hacen girar el plano de luz
polarizada en igual extensión, pero en direcciones opuestas (dextrógiro
+ y levógiro -). Puesto que los enzimas actúan específicamente sobre
uno de los enantiómeros de un par, únicamente la mitad de una
mezcla racémica (una mezcla con iguales cantidades de ambos
enatiómeros) es, por lo general, fisiológicamente activa (ópticamente
inactivas por lo que se cancelan + y -).

Aproximadamente existen 300 aminoácidos en la naturaleza,

sinembargo, únicamente 20 de ellos están presentes en las proteínas.
Verdaderamente, todas las especies, desde las bacterias hasta el
hombre, se constituyen a partir del mismo conjunto de aminoácidos.
Este alfabeto fundamental de las proteínas tiene, por lo menos, dos
millones de años de antigüedad. El extraordinario conjunto de
funciones en las que intervienen las proteínas es el resultado de la
diversidad y del gran número de ellas que pueden constituirse con
distintos ordenamientos de los 20 aminoácidos. Como ejemplo se
puede notar que se pueden formar 6 X 10 11 decapéptidos con el
repertorio de 20 aminoácidos.
A= m(m-1)(m-2)...[m-(n-1)] en donde m=20 y n=10

Los aminoácidos son compuestos incoloros cristalinos, que a primera

vista, la apariencia de un polvo blanco. Las formas cristalinas son muy
características, variando desde haces de delgadas agujas (tirosina) a
gruesas placas hexagonales (cistina). El sabor varía desde el dulce
azucarado (glicina, alanina), pasando por el insípido (tirosina) hasta el
amargo (arginina).

lista de aminoácidos ????????????

Existen aminoácidos cuyas cadenas laterales se encuentran cargadas

a un pH fisiológico. Según su carga, estos aminoácidos se dividen en
dos categorías: aminoácidos ácidos cuya carga a pH fisiológico es
negativa (aspartato, glutamato y en algunos casos tirosina y cisteína),
y aminoácidos básicos cuya carga a pH fisiológico es positiva (arginina,
lisina y en algunos casos histidina). Los derivados no cargados del
aspartato y del glutamato son la asparagina y la glutamina,
respectivamente.

RXN ?????????????????????????????
Los aminoácidos se unen por enlaces peptídicos para formar cadenas
polipeptídicas

Para conformar las proteínas, el grupo α-carboxilo de un aminoácido,

se une al grupo α-amino de otro aminoácido por medio de un enlace
peptídico (también denominado enlace amídico). Los péptidos y
polipéptidos se forman a partir de dos aminoácidos por pérdida de una
molécula de agua. Se debe recordar que un péptido o un polipéptido
no necesariamente es una proteína. Un péptido que contiene diez o
menos aminoácidos se denomina un oligopéptido, mientras que más
de diez aminoácidos unidos constituyen un polipéptido. Muchas
proteínas están compuestas por varias subunidades polipeptídicas
(hemoglobina, deshidrogenasa láctica, etc.).

Cada unidad de aminoácido en una cadena polipeptídica se denomina

residuo.
Las cadenas polipetídicas tienen dirección porque sus elementos
constructores tienen extremos diferentes (polaridad), es decir, los
grupos α-amino y α-carboxilo. Por convención, se toma al extremo
amínico como el comienzo de una cadena polipeptídica. La secuencia
de aminoácidos en una cadena polipeptídica se ecribe comenzando
con el residuo amino terminal. Así, en el tripéptido glicina-tirosina-
fenilalanina la alanina es es residuo amino terminal y el triptófano es
el residuo carboxilo terminal. Se debe tener en cuenta que
fenilalanina-tirosina-glicina es un tripéptido diferente.

Una cadena polipeptídica consiste de una columna vertebral,

regularmente repetida, llamada la cadena principal del polipéptido y de
una parte variable constituída por las cadenas laterales distintivas. La
mayoría de las cadenas polipeptídicas naturales, contienen entre 50 y
2000 residuos de aminoácidos. Por lo tanto si la media del peso
molecular de los aminoácidos es de 110, los pesos moleculares de la
mayoría de polipéptidos está entre 5500 y 220000. La masa molecular
de las proteínas se puede expresar en unidades de daltons; un dalton
es igual a una unidad de masa atómica. Una proteína con un peso
molecular de 50000, tiene una masa de 50000 daltons, o 50
kilodaltons (kd).

En determinadas proteínas, algunas cadenas peptídicas o

polipeptídicas pueden estar unidas lateralmente por puentes o enlaces
disulfuro, como es el caso de la insulina o de las queratinas. Estos
enlaces cruzados se forman por la oxidación de los residuos de
cisteína. El compuesto disulfurado resultante se llama cistina.
Normalmente no existen otros enlaces cruzados covalentes entre las
proteínas. Proteínas intracelulares por lo general no contienen enlaces
disulfuro, mientras que las proteínas extracelulares muy a menudo
contienen varios enlaces de éste tipo. En algunas proteínas existen
enlaces cruzados, pero no del tipo disulfuro, derivados de las cadenas
laterales de los residuos de lisina. Por ejemplo, las fibras de colágeno
del tejido conectivo se encuentran reforzadas de esta forma, de igual
manera se encuentra la fibrina en los coágulos sanguíneos.

Se ha mencionado que los aminoácidos se encuentran como iones

dipolares en solución acuosa a un pH fisiológico. El pH al cual un ión
dipolar no migra en un campo eléctrico se conoce como el punto
isoeléctrico (pI). En ese punto isoeléctrico, el número de cargas
posotivas y negativas es el mismo.

Los α-aminoácidos tienen al menos dos grupos ácidos en potencia, el

grupo carboxilo sin disociar y el grupo amino protonado.

El clorhidrato de un aminoácido es un electrolito fuerte y se disocia en

agua completamente de la siguiente manera:

H H
I I
ClαNH3-C-COOH ⁄ Cl- + +H3N-C-COOH
I I
R R

La forma cargada positivamente, totalmente protonada, aparece en el

segundo término. Este catión posee dos grupos ácidos débiles, cada
uno con su valor pK característico; por convención se los designan
como pK1, pK2, y pK3, correspondiendo el menor número al grupo
ácido más fuerte.

Así, la constante de disociación pK1 para todo aminoácido corresponde

a la disociación del grupo α-carboxilo.

H H
I I
+H N-C-COOH ⁄ +H - H+
3 3N-C-COO +
I I
R R
por lo tanto,

K1=

La especie sobrante se disociará en el grupo amino de la siguiente

manera (pK2):

H H
I I
+H N-C-COO- ⁄ H2N-C-COO- + H+
3
I I
R R

por lo tanto,

K2=

Una vez obtenidos el K1 y el K2, se puede calcular el punto isoeléctrico

de un aminoácido neutro de la siguiente manera:

pI=

En el caso de poseer aminoácidos cargados positiva o negativamente,

existirá un K3. El K3 se utilizará solamente para los cálculos del pI en
aminoácidos cargados positivamente (básicos), ya que el K 3
corresponde al grupo amino de la cadena lateral de los aminoácidos
básicos (+H3N- , =NH2+). Para éstos aminoácidos, se debe utilizar la
siguiente ecuación:

pI=

como mencionado anteriormente, el pK 2 se refiere al grupo α-amino.

Para un aminoácido ácido (carga negativa), se utilizarán también los
pK1 y pK2 que en éste caso específico se refieren al grupo α-carboxilo y
al carboxilo de la cadena lateral, respectivamente. Así, la ecuación
que se debe utilizar para calcular el pI de los aminoácidos ácidos es
igual que la de los aminoácidos neutros pero teniendo en mente que
los pK's se refieren a grupos diferentes.

PROBLEMA:
Calcular el pI de apartato si el pk 1 es de 1.88, el pK2 es de 3.65 y el
pK3 es de 9.60.

SOLUCION:

1. Se determina el tipo de aminoácido que es, con respecto a su

carga. Esto implica que es una especie ácida.

H
I
+H N-C-COO-
3
I
CH2
I
COO-

Aspartato

2. La ecuación que se debe utilizar es la que corresponde a un

aminoácido ácido. Por convención pK1 se refiere al grupo α-
carboxilo de todos los aminoácidos. Al no ser éste un aminoácido
neutro ni básico, el pK2, se refiere al otro grupo ácido y más no al
grupo α-amino como en el resto de los casos. El pK3 se ignora por
no ser aminoácido básico.

pI=

4. por lo tanto,

pI= = 2.77

PROBLEMA:

Calcular el pI de lisina. Pk1 = 2.18, pK2 = 8.95 y pK3 = 10.53

SOLUCION:

1. Se determina el tipo de aminoácido que es, con respecto a su

carga. Esto implica que es una especie básica.
 H
I
+H N-C-COO-
3
I
(CH2)4
I
NH3+

2. La ecuación que se debe utilizar es la que corresponde a un

aminoácido básico. Al tratarse de un aminoácido de éste tipo, los
grupos que interesan son el ααamino (pK2) y el α-amino (pK3).

pI=

3. por lo tanto,

pI= = 9.74

El punto isoeléctrico para aminoácidos neutros es – 7, para

aminoácidos ácidos «7 y para aminoácidos básicos es »7.

Nomenclatura

Para la nomenclatura de los péptidos, se enumeran los residuos de

aminoácidos por el orden en que se encuentran en la cadena
empezando a partir del grupo amino terminal. Se utiliza la terminación
-il - para cada uno de los residuos, excepto para el terminal carboxilo
no sustituído.

Ejemplo:

H2N-Ala-Tyr-Gly-Glu-COOH

El nombre de éste tetrapéptido es: ácido alanil, tirosil, glicil, glutámico.

Deben destacarse las diferencias entre glutamilo (glutamato), y

aspartilo (aspartato) de glutaminilo (glutamina) y asparraginilo
(asparragina).

Cargas netas de péptidos

A partir de la ecuación de Henderson-Hasselbalch, Dexter Moore, en el

año de 1985, derivó una simple expresión matemática para facilitar el
cálculo de las cargas netas tanto en péptidos como en aminoácidos a
cualquier pH. Es importante recordar, en la derivación, que la carga de
la especie HA es positiva para un ácido Brønsted, como el grupo
amino protonado, mientras que el grupo no protonado, la especie A - ,
es neutro. Por lo tanto, para dicho grupo, la meta es calcular la
fracción de especies protonadas y por lo tanto la fracción de carga
positiva. Para un ácido como el grupo carboxilo, la meta es calcular la
fracción de especies no protonadas y por lo tanto la fracción de carga
negativa. La carga molecular neta se obtiene sumando la contribuición
de carga de los varios grupos. Así, siguiendo el procedimiento
estándar para determinar la fracción de carga negativa (Q-), para los
grupos funcionales -COOH, -SH, -PhOH, la ecuación es:

Q-=

La expresión general para la fracción de carga positiva (Q +), para los

grupos funcionales -NH3+, =NH2+, NH+, es:

Q+=

La expresión general para la carga molecular neta a cualquier pH es

dada por:

Qmolécula= ∑Q- + ∑Q+

EJEMPLO:

Calcular la carga neta del péptido: Asp-Lys-Asp-Lys-Asp-Asp , a pH 7.0.

SOLUCION:

Los pKa de cada uno de los grupos en cuestión se pueden

obtener de tablas. Así, para el grupo terminal amino ( +H3N-) el pKa es
de 8.5; para el grupo terminal carboxilo (-COO-) el pKa es de 3.2;
para cada uno de los cuatro aspartatos-COO-, el pKa es de 3.9 y para
cada una de las dos lisinas-NH3+, el pKa es de 10.5. Se debe
recordar que a excepción de los grupos α-terminales, el resto de los
valores pKa se refieren a las cadenas laterales de cada residuo
aminoácido. Por lo tanto, sustituyendo los valores en las fórmulas
anteriormente mencionadas se obtiene:

Qpéptido = + + + = -2.0

Modificación protéica y rupturas confieren nuevas capacidades

El set de 20 aminoácidos puede ser modificado después de la síntesis

de una cadena polipeptídica (modificación postraduccional) para así
acrecentar sus capacidades. Por ejemplo, el grupo α-amino terminal
de muchas proteínas es acetilado, lo que hace que estas proteínas
sean más resistentes a una degradación. En el colágeno recién
sintetizado, muchos residuos de prolina son hidroxilados para formar
hidroxiprolina. Los grupos hidroxilos añadidos estabilizan la fibra de
colágeno.

El significado biológico de ésta modificación es evidente en el

escorbuto, que resulta por la insuficiente hidroxilación del colágeno por
una deficiencia de vitamina C. Otro aminoácido especializado,
producido por éste tipo de toques finales es el ©- carboxiglutamato.
En la deficiencia de vitamina K, la carboxilación insuficiente del
glutamato de la protrombina, una proteína de coagulación, puede
provocar hemorragias.

Conformación de las cadenas polipeptídicas

Una característica espectacular de las proteínas es que poseen

estructuras tridimensionales bien definidas. Una cadena polipeptídica
estirada o más o menos organizada al azar no tiene actividad
biológica. La función nace de la conformación, que es la organización
de los átomos de manera tridimensional, en una estructura. La
secuencia de aminoácidos es muy importante porque determina la
conformación de las proteínas. En los últimos años de la década de los
treinta, Linus Pauling y Robert Corey iniciaron los estudios
cristalográficos por rayos X, de la estructura precisa de los
aminoácidos y péptidos. Su intención era obtener un conjunto de
longitudes estándar de enlace para éstos silliares estructurales y
después utilizar ésta información para predecir la conformación de las
proteínas. Uno de sus importantes descubrimientos fue el que la
unidad peptídica es rígida y plana. El hidrógeno del grupo amino
sustituído está generalmente en posición trans con respecto al oxígeno
del grupo carboxilo. No existe libertad de rotación alrededor del enlace
entre el átomo de carbono carbonilo y el átomo de nitrógeno de la
unidad peptídica, porque éste enlace posee un carácter parcial de
doble enlace.

Ver estructuras dadas en clase

Por ser los enlaces entre el átomo de carbono α y el átomo de

nitrógeno; y el átomo de carbono α y el átomo de carbono carbonilo
enlaces sencillos, no existe resonancia y como consecuencia existe un
enorme grado de libertad rotacional de los enlaces ubicados a cada
lado de la unidad peptídica rígida. Las rotaciones alrededor de estos
enlaces se designan por los ángulos α y α. La conformación de la
cadena principal del polipéptido está definida completamente cuando
se conocen α y α para cada uno de los residuos de aminoácidos.

Estructura proteica

Al discutir la arquitectura de las proteínas, es conveniente referirnos a

seis niveles estructurales.

1. ESTRUCTURA PRIMARIA- es simplemente la secuencia de

aminoácidos y la localización de los enlaces disulfuro, si existe alguno.
Así, la estructura primaria es una descripción completa de las
conecciones o enlaces covalentes de una proteína.

2. ESTRUCTURA SECUNDARIA- se refiere a las relaciones estéricas de

los residuos de aminoácidos que están próximos uno a otro en la
secuencia lineal. Algunas de éstas relaciones estéricas son de un tipo
regular, lo que da lugar a una estructura periódica. La hélice α, la hoja
plegada α y la hélice del colágeno son ejemplos de estructura
secundaria.

a) Hélice α α es una estructura semejante a la de un cilindro. La

cadena polipeptídica estrechamente arrollada, forma la parte interior
del cilindro, y las cadenas laterales, de los aminoácidos, se extienden
hacia afuera en una disposición helicoidal.

Ver diagrama dado en clase.

La hélice α queda estabilizada por enlaces de hidrógeno entre los

grupos NH y CO de la cadena principal. El grupo CO de cada
aminoácido esta enlazado por puentes de hidrógeno al grupo NH del
aminoácido situado cuatro residuos más adelante en la secuencia
lineal.
Ver estrucura dada en clase

De ésta manera, todos los grupos NH y CO de la cadena principal

quedan enlazados por puentes de hidrógeno. Cada residuo queda
relacionado con el siguiente por una translación de 1.5 Å a lo largo del
eje de la hélice α y una rotación de 100° con un diámetro de rosca de
5.4 Å , lo que da 3.6 residuos de aminoácidos por vuelta de la hélice
(5.4 Å/1.5Å = 3.6). Así, aminoácidos espaciados tres o cuatro lugares
en la secuencia lineal, quedan espacialmente situados muy próximos
en la hélice α. Como contraste, aquellos aminoácidos separados dos
lugares en la secuencia lineal, quedan ubicados a lados opuestos en la
hélice y de ésta manera es poco probable que hagan contacto.
Aunque el sentido de la hélice pueda ser dextro o levorrotatorio, las
hélice α que se encuentran en las proteínas son dextrorrotatorias.

(b) Hoja plegada α - es denominada así por haber sido

descubierta inmediatamente después de la hélice α. La hoja plegada α
difiere profundamente de la hélice α en que es una hoja en vez de un
cilindro. La cadena polipeptídica en la hoja plegada α está casi
totalmente extendida en vez de estar estrechamente arrollada como
en la hélice α. La distancia axial entre los aminoácidos adyacentes es
de 3.5 Å, en contraste con la de 1.5 Å para la hélice α. Otra diferencia
es que la hoja plegada α queda estabilizada por enlaces de hidrógeno
entre los grupos NH y CO de cadenas polipeptídicas diferentes,
mientras que en la hélice α el enlace de hidrógeno se establece entre
los grupos NH y CO de la misma cadena polipeptídica.

ver diagrama dado en clase

Las cadenas adyacentes en una hoja plegada α pueden orientarse en

la misma dirección denominándose así, hoja plegada α paralela. Si las
cadenas se encuentran orientadas en direcciones opuestas, se
denomina hoja plegada α antiparalela.

diagrama ???????????????????

3. ESTRUCTURA TERCIARIA- se refiere a las relaciones estéricas de los

residuos de aminoácidos que se encuentran muy distanciados en la
estructura lineal. La línea divisoria entre la estructura secundaria y
terciaria es arbitraria

4. ESTRUCTURA CUATERNARIA- las proteínas que se componen de más

de una cadena o dominio polipeptídico (hemoglobina, deshidrogenasa
láctica, etc.) muestran un nivel de organización estructural adicional,
es decir, la estructura cuaternaria. Esta se refiere a la forma en la cual
están empaquetadas las cadenas entre sí. Cada cadena polipeptídica
en éste tipo de proteínas se denomina una subunidad.

5. ESTRUCTURA SUPERSECUNDARIA- es aquella que se encuentra

alternada entre las dos formas de estructura secundaria en una cadena
polipeptídica. Por ejemplo, una hoja plegada α separada de otra hoja
plegada α por una hélice α. Es provechoso considerar las estructuras
supersecundarias como intermediarios entre estructuras secundarias y
terciarias.

6. DOMINIOS- son unidades globulares compactas con un rango entre

100 y 400 aminoácidos. Por ejemplo, la cadena liviana de un
anticuerpo (25 kd) se dobla en dos dominios. Estos dominios
resemblan el uno al otro, lo que sugiere que provienen del mismo gen.

Los dominios proteicos son, por lo general, codificados por distintas

partes de un gen denominados exones.

Técnicas Para la Purificación de Proteínas

Las proteínas pueden ser separadas entre sí y de otros tipos de

moléculas, sobre la base de características tales como el tamaño, la
solubilidad, la carga y la afinidad específica de enlace.

Diálisis- Las proteínas pueden ser separadas de las moléculas

pequeñas, por medio de diálisis a través de una membrana
semipermeable. La membrana actúa como un tamiz molecular y
móleculas cuyas masas son mayores a los 15 kilodaltons, son
retenidas dentro de la membrana de diálisis típica, por el contrario,
iones y moléculas inferiores en tamaño, atraviesan los poros de la
membrana hacia el exterior de esta.

Cromatografía de filtración por gel- Es otro ejemplo de tamiz molecular

que separa moléculas de acuerdo a su forma y tamaño. La resina es
un polímero de glucosa (dextran) insoluble, altamente hidratado, su
morfología es esférica con radios variables de acuerdo al tipo, utilizada
como soporte dentro de una columna cromatográfica, generalmente de
vidrio.
El resultado es que las moléculas pequeñas se difunden en la solución
tampón dentro de las pequeñas esferas en las cuales penetran y
también entre ellas, mientras que las moléculas grandes quedan
localizadas en la solución, entre las esferas. Al no tener que penetrar
los poros de las esferas, las moléculas grandes fluyen más
reapidamente a través de la columna.
Cromatografía de intercambio iónico- Las proteínas nativas, poseen
cargas netas que hacen posible su separación, de acuerdo a esta
técnica. Si una proteína, tiene una carga positiva neta a pH 7,
normalmente esta se unirá a una resina de intercambio iónico que
contenga grupos negativos (COO-), mientras que una proteína cargada
negativamente no lo hará. Así, una proteína con carga neta positiva,
puede ser desligada de la resina en la columna añadiendo NaCl, en
forma de gradiente, u otra sal, al tampón de elución. El principio se
basa en que los iones sodio compiten con los grupos cargados
positivos, en la proteína, para ligarse al la resina. Obviamente, las
proteínas que tengan una baja densidad de carga neta positiva,
tenderán a eluir primero seguidas de aquellas que tienen una densidad
de carga mayor.

Electroforesis- Es una técnica utilizada para separar proteínas tanto en

base a su carga neta como también por peso molecular. La
electroforesis se define como la migración de partículas cargadas en
un campo eléctrico. Cualquier ión o grupo cargado migrará cuando
sometido a un campo eléctrico. Las proteínas llevan una carga neta a
cualquier pH que sea diferente al de su punto isoeléctrico, por lo tanto
estas migrarán y su tasa de migración dependerá de la densidad de
carga (la razón de carga a masa). Mientras más alta sea la razón de
carga a masa, más rápida será la migración de la molécula. La
aplicación de un campo eléctrico a una mezcla de proteínas en
solución, resultará en diferentes migraciones para diferentes proteínas
hacia uno de los electrodos. La velocidad de migración (α) de una
proteína (o cualquier otra molécula como DNA o RNA) en un campo
eléctrico depende de la fuerza del campo eleectrico (E ), la carga neta
de la proteína (z ), y el coeficiente de fricción (f ).

α=

La fuerza eléctrica Ez que conduce la molécula cargada hacia el

electrodo de carga opuesta es contenida por el arrastre viscoso f α
suscitado por la fricción entre la molécula en movimiento y el medio de
soporte. El coeficiente de fricción f depende de la masa y la forma de
la molécula en movimiento, como también de la visocidad del medio.

Las separaciones electroforéticas son generalmente ejecutadas en

soportes gélicos y no en soluciones libres por dos razones.
Primeramente, los geles minimizan la convección producida por
pequeñas gradientes de temperatura, un requisito para la separación
efectiva. Segundo, los geles se comportan como tamíces moleculares
que ayudan a la separación de las macromoléculas. Aquellas
moléculas con tamaños más pequeños que los poros del gel, migrarán
fácilmente a lo largo del soporte, mientras que aquellas moléculas con
tamaños más grandes que los poros del gel, estarán casi inmóviles.
Móleculas con tamaños intermedios migrarán a través del soporte con
diferentes grados de facilidad.

Las proteínas pueden separarse mayormente en base a su masa

molecular, por electroforesis en gel de poliacrilamida, bajo condiciones
desnaturalizantes. La mezcla de las proteínas se disuelven
primeramente en una solución de dodecil sulfato sódico (SDS), un
detergente aniónico que interrumpe casi todas las interacciones no
covalentes de las proteínas nativas. Mercaptoetanol o ditiotreitol
también se añade para reducir los enlaces disulfuro. Los aniones del
SDS se unen a las cadenas principales a razón de aproximadamente un
SDS por cada dos residuos aminoácidos (1.4g de SDS por gramo de
proteína). El complejo SDS-proteína formado posee una carga neta
negativa casi proporcional a la masa de la proteína. Así, todas las
proteínas migrarán desde el polo negativo hacia el polo positivo. Las
proteínas pequeñas migrarán más rápido a través del gel, mientras
que las grandes quedarán más cerca al punto de aplicación de la
muestra. La migración de la mayoría de las cadenas peptídicas, bajo
estas condiciones, es linealmente proporcional al logaritmo del peso
molecular de su masa. Esta relación empírica no es obedecida por
algunas proteínas, por ejemplo, algunas proteínas ricas en
carbohidratos y proteínas de membrana, las cuales migran
anormalmente.

La electroforesis en poliacrilamida-SDS, es rápida, sensible y capaz de

un alto grado de resolución. Cantidades pequeñas hasta de 0.1µg (~ 2
pmol) de proteína dan una banda detectable cuando teñida con azul de
Coomasie. Cantidades mucho menores (~ 0.02 µg) pueden ser
fácilmente detectadas con tinción de plata. Proteínas que difieren en
masa por aproximadamente 2% (por ejemplo, 40 y 41 kd,
aproximadamente 10 residuos de aminoácidos) generalmente pueden
ser distinguidas una de la otra.

Las proteínas también pueden ser separadas electroforéticamente en

base a su contenido de residuos ácidos y básicos. Anteriormente se ha
mencionado que el punto isoeléctrico (pI) de una proteína es el pH al
cual su carga neta es cero. A este pH, su movilidad electroforética es
cero porque z en la ecuación de velocidad de migración es igual a
cero. Por ejemplo, el pI del citocromo c , una proteína transportadora
de electrones altamente básica, es de 10.6, mientras que el pI de la
albúmina de suero, una proteína ácida en la sangre, es de 4.8.
Suponga que la mezcla de estas proteínas se someten a electroforesis
en una gradiente de pH en un gel carente de SDS. Cada proteína
migrará hasta que alcance una posición en el gel en la que el pH sea
igual al pI de la proteína. Este método de separar proteínas de
acuerdo al punto isoeléctrico se denomina enfoque isoeléctrico. La
gradiente en el gel se crea sometiendo a electroforesis una mezcla de
polianfolitos (pequeños polímeros con cargas múltiples) que contienen
varios valores de pI. La técnica de enfoque isoeléctrico puede separar
de forma muy efectiva, proteínas que difieren tan solo 0.01 en sus
valores de pI. Esto significa que proteínas que difieren entre sí por una
sola carga neta, pueden ser separadas.

Las técnicas de enfoque isoeléctrico y electroforesis en gel de

poliacrilamida con SDS, pueden combinarse para obtener separaciones
de muy alta resolución. Primeramente, la muestra se somete a
enfoque isoeléctrico; este gel es luego colocado en forma horizontal
sobre la parte superior de la matriz de poliacrilamida con SDS y corrido
verticalmente para generar un patrón de puntos bidimensional. Con
una técnica de este tipo, las proteínas se separan en la dirección
horizontal en base a punto isoeléctrico y en la dirección vertical en
base a la masa. Con esta técnica se han podido separar más de mil
proteínas diferentes provenientes de E. coli, en un solo experimento.

Cromatografía de afinidad- Esta es otra técnica eficaz y generalmente

utilizada en la purificación de proteínas. Esta técnica se aprovecha de
la alta afinidad de proteínas por grupos químicos específicos. Así por
ejemplo, la muy conocida proteína vegetal, concavalina A, puede ser
purificada al pasar el extracto crudo a través de una columna que
contenga residuos de glucosa ligados a las esferas del soporte. La
concavalina A se adhiere a una columna de este tipo por tener una alta
afinidad por glucosa, mientras que la mayoría de otras proteínas no la
tienen. La concavalina adherida a la columna es subsecuentemente
eluída del medio de soporte añadiendo una solución concentrada de
glucosa. La glucosa en solución, compite más fuertemente por los
sitios de unión de la concavalina A y desplaza la proteína de los
residuos ligados al soporte.

Centrifugación- Esta técnica es muy utilizada para separar y analizar

células, organelos y macromoléculas biológicas. Una partícula en
movimiento circular con radio r a una velocidad angular α está sujeta
a un campo centrífugo equivalente a α 2r. La fuerza centrífuga Fc para
esta partícula es igual al producto de su masa efectiva m' y de su
campo centrífugo.
-
Fc = m' α 2r = m( 1-αα) α 2r

La masa efectiva m' es menor que la masa m debido a que el líquido

desplazado ejerce una fuerza opuesta. Este factor boyante es igual a
(1-αα), en donde α es el volumen parcial específico de la partícula y α
es la densidad de la solución. Una partícula se mueve en este campo a
una velocidad constante v cuando F c es igual al arrastre viscoso αf, en
donde f es el coeficiente de fricción de la partícula. Por lo tanto, la
velocidad de migración (velocidad de sedimentación) de la partícula es

α==

Nótese que esta expresión para movimiento en un campo centrífugo es

análogo a la ecuación para movimiento en un campo eléctrico.

La ecuación anterior demuestra que la velocidad de sedimentación es

directamente proporcional a la fuerza del campo centrífugo. Por lo
tanto, es posible definir una medida de sedimentación que depende de
las propiedades de la partícula y de la solución, pero es independiente
de cuan rápido gire la muestra. El coeficiente de sedimentación s,
definido como la velocidad dividido para el campo centrífugo , es igual
a

s==

Los coeficientes de sedimentación son generalmente expresados en

unidades Svedberg. Un Svedberg (S) es igual a 10 -13 segundos. Por
ejemplo, si se somete un anticuerpo de 150 kd a un campo centrífugo
de un radio de 8 cm a 75.000 revoluciones por minuto (rpm), el campo
centrífugo bajo estas condiciones es de 4.9 x 10 8 cm s-2, el cual es
aproximadamente 500.000 veces el campo gravitacional de la tierra
(g). Si la velocidad de una proteína en este campo es de 3.4 x 10 -4
cm/s, entonces su coeficiente de sedimentación es 7S.

Varias conclusiones importantes se pueden derivar a partir de la última

ecuación:

1. La velocidad de sedimentación de una partícula es proporcional a

su masa. Una proteína de 100 kd se mueve al doble de la velocidad
que una proteína de 50 kd, que tenga la misma morfología y densidad.

2. Una partícula densa se mueve más rápido que una partícula

menos densa debido a que la fuerza boyante opuesta es menor para
una partícula de mayor densidad.

3. La forma de la partícula también es importante, porque afecta el

arrastre viscoso. El coeficiente de fricción de una partícula compacta
es menor que el de una partícula extendida de la misma masa.

4. La velocidad de sedimentación también depende de la densidad

de la solución (α). Las partículas tienden a undirse cuando αα <1, a
flotar cuando αα >1 y a no moverse cuando αα =1.

La centrifugación puede separar proteínas con diferentes coeficientes

de sedimentación. El primer paso en la centifugación zonal (también
llamada centrifugación de bandeo), es el formar una gradiente en un
tubo de centrífuga, mezclando diferentes proporciones de una solución
de baja densidad (tal como 5% sucrosa) y otra de alta densidad ( tal
como 20% sucrosa). La función de la gradiente de densidad es la de
prevenir el flujo convectivo. Un pequeño volumen de la solución que
contiene la muestra de proteína, entonces se coloca en la parte
superior de la gradiente creada. Cuando el rotor gira, las proteínas
migran a través de la gradiente y se separan de acuerdo a los
coeficientes de sedimentación. La centrifugación se para antes de que
la proteína más rápida alcance el fondo del tubo. Las bandas de
proteínas pueden ser colectadas por goteo, al provocar un orificio en la
base del tubo. Las gotas pueden ser analizadas por contenido proteíco
actividad catalítica o algún otro parámetro de interés. Esta técnica de
velocidad de sedimentación, fácilmente separa proteínas que difieren
en coeficientes de sedimentación por un factor de dos o más.

La masa (peso molecular) de una proteína, puede ser directamente

determinada por el equilibrio de sedimentación, en el cula una muestra
es centrifugada a relativamente una baja velocidad de tal manera que
la sedimentación es contrabalanceada por difusión. Bajo éstas
circunstancias, una gradiente uniforme, de concentración proteíca, se
forma. La dependencia de la concentración en la distancia a partir del
eje de rotación, elucida la masa de la partícula. La masa m es dada
por

m= loge c2 /(c1 (r22-r12))

en donde c1 y c2 son las concentraciones a las distancias (desde el eje

de rotación) r1 y r2, k es la constante de Boltzmann, y T es la
temperatura absoluta. Esta técnica de equilibrio de sedimentación
para determinar masa, es rigurosa y puede ser aplicada bajo
condicones no desnaturalizantes, en la cual la estrucutura nativa de
las proteínas multiméricas es preservada. Al contrario, electroforesis
en geles de poliacrilamida con SDS proveen un estimado de la masa de
las cadenas polipeptídidcas, bajo condiciones desnaturalizantes.

Reacciones de los aminoácidos: secuenciación

Ver estructuras dadas en clase

Pasando, de la purificación de las porteínas y el análisis de sus

propiedades hidrodinámicas, a la elucidación de la secuencia de sus
aminoácidos, consideremos como la secuencia de un péptido corto tal
como

Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly

puede ser establecida. Primeramente, la composición de residuos de

aminoácidos del péptido, es determinada. El péptido se hidroliza en
sus aminoácidos constituyentes al someterlo a calentamiento (110°C)
con 6 N HCl, por 24 horas. Stanford Moore y William Stein demostraron
que los aminoácidos hidrolizados de un péptido, pueden ser separados
por cromatografía de intercambio iónico en columnas de poliestireno
sulfonado y cuantificados al reaccionar con ninhidrina. Los α-
aminoácidos tratados en ésta forma, dan un color azul intenso
denominado azul de Ruheman, mientras que iminoácidos, como la
prolina dan un color amarillo. La concentración de los aminoácidos en
solución es proporcional a la absorbancia de la solución, después de
calentrala con la ninhidrina. Esta técnica puede detectar hasta un
microgramo (10 nmoles) de un aminoácido, que es aproximadamente
la cantidad presente en una huella dactilar. Cantidades
considerablemente más pequeñas como es la de un nanogramo (10
pmoles) de un aminoácido pueden ser detectadas utilizando
fluorescamina, una sustancia que reacciona con el grupo ααamino para
formar un producto altamente fluorescente. La identidad del
aminoácido se revela por el volumen de elución, que es el volumen de
tampón necesario para remover el aminoácido de la columna. La
comparación de los patrones cromatográficos de la muestra hidrolizada
y de la muestra estándar de aminoácidos determinarán que la
composición de aminoácidos en el péptido es

(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)

El paréntesis denota que ésta es la composición de aminoácidos del

péptido en cuestión, mas no de su secuencia.

El residuo amino terminal de una proteína o péptido, puede ser

identificado al marcarlo con un compuesto que forme un enlace
covalente estable, con éste grupo. El fluorodinitrobenceno (FDNB), fue
el primer compuesto utilizado para éste propósito, por Frederick
Sanger. El FDBN reacciona con el grupo α-amino, no cargado (NH2),
para formar un derivado dinitrofenílico (DNP) del péptido, de color
amarillo. El enlace entre el dinitrofenilo y el grupo amino terminal se
establece en condiciones en las que se hidrolizan los enlaces
peptídicos. La hidrólisis del DNP-péptido en 6N HCl da lugar a un DNP-
aminoácido, que en el caso del péptido puesto como ejemplo se
identifica como DNP-alanina, por sus propiedades cromatográficas.

El cloruro de dabsilo es comunmente utilizado porque forma derivados

intensamente coloreados que pueden ser detectdos con gran
sensibilidad. El compuesto reacciona con el grupo ααamino, neutro (-
NH2), para formar un derivado sulfonamida, el cual es estable bajo
condiciones que hidrolizan enlaces peptídicos. La hidrólisis del péptido
hipotético (dabsilo-péptido) en 6 N HCl producirá un dabsilo-
aminoácido, que sería identificado como dabsilo-alanina, por sus
propiedades cromatográficas. El cloruro de dansilo, otro reactivo
frecuentemente utilizado para marcar grupos α-NH2, forma derivados
sulfonamida fluorescentes.

Aunque el método del dabsilo, para determinar el grupo amino

terminal, es sensible, éste no puede ser utilizado repetitivamente
sobre el mismo péptido porque éste se degrada por completo en la
etapa de hidrólisis ácida. Pehr Edman desarrolló un método para
marcar el residuo amino terminal y romper el primer enlace petídico
sin destruir el resto de enlaces, entre los residuos de aminoácidos del
péptido. La degradación de Edman remueve, en forma secuencial, un
residuo aminoácido a la vez, empezando desde el grupo amino
terminal del péptido. En éste procedimiento, el fenilisotiocianato
reacciona con el grupo amino terminal no cargado del péptido para
formar un derivado fenilisotiocarbamato; luego, bajo condiciones
ácidas leves, se libera un derivado cíclico del aminoácido terminal,
dejando así el péptido intacto, pero acortado en un residuo. El
compuesto cíclico es una feniltiohidantoína (PTH) del aminoácido. El
derivado PTH-aminoácido puede ser fácilmente identificado por medio
de procedimientos cromatográficos tal como la cromatografía líquida
de alta resolución (HPLC). Además, la composición de aminoácidos del
péptido acortado:

(Arg, Asp, Gly2, Phe)

puede ser comparada con el péptido original:

(Ala, Arg, Asp, Gly2, Phe)

La diferencia existente entre estos análisis es el de un residuo de

alanina, lo que demuestra que la alanina es el residuo amino terminal
del péptido original. El procedimiento de Edman puede así ser
repetido sobre el péptido acortado. El análisis de aminoácidos después
de la segunda vuelta de degradación es:

(Arg, Asp, Gly, Phe)

lo cual indica que el segundo residuo desde el extremo amínico es la

glicina. Un PTH-aminoácido individual puede ser identificado
cromatográficamente, por HPLC, comparándolo con los perfiles de
volumenes de elución de estándares conocidos.

Los análisis de secuenciación de aminoácidos han sido acelerados por

el desarrollo de secuenciadores automáticos. En un secuenciador de
fase líquida, se coloca una capa fina de proteína en un recipiente
cilíndrico que se somete a la degradación de Edman mientras este
gira. Los reactivos y solventes de extracción se pasan sobre la capa
inmóvil de proteína y el PTH-aminoácido es identificado por
cromatografía líquida de alta resolución. Un ciclo de degradación es
llevado a cabo en menos de dos horas. Esta técnica puede secuenciar
péptidos de hasta más o menos cincuenta residuos de aminoácidos.
Un secuenciador de fase gaseosa, recientemente ideado, puede
analizar cantidades de péptidos y proteínas en el orden de picomoles.
Esta alta sensibilidad hace posible que se analice la secuencia de una
banda proteica eluída de un gel de poliacrilamida.

Las proteínas pueden ser escindidas en un sitio específico para formar

péptidos de menor tamaño y facilitar su análisis.

Las proteínas grandes, con mucho más de aproximadamente cincuenta

residuos de aminoácidos, no pueden ser confiablemente secuenciadas
por el método de Edman. Esto se debe a que no todos los péptidos
involucrados en la reacción generan el aminoácido derivado en cada
ciclo. Si la eficiencia de generación de cada ciclo fuese del 98%, la
proporción del aminoácido "correcto" generado después de 60 ciclos
sería de únicamente 0.3 (0.98 60). Este obstáculo se puede obviar por
medio de esciciones específicas de las proteínas, que generen
segmentos peptídicos de no más de cincuenta residuos de
aminoácidos. En esencia, la estrategia es de dividir y conquistar.

Cortes específicos se pueden obtener con métodos químicos o

enzimáticos. Por ejemplo, Bernhard Witkop y Erhard Gross
descubrieron que el bromuro de cianógeno (CNBr) rompe cadenas
polipeptídicas únicamente sobre el lado carboxílico de los residuos de
metionina. Por lo tanto, con éste método, una proteína que contenga
diez residuos de metionina proporcionará once péptidos. Cortes
altamente específicos se pueden obtener también con la tripsina, un
enzima proteolítico del jugo intestinal. La tripsina corta a las cadenas
polipeptídicas por el lado carboxílico de los residuos de arginina y
lisina, por lo tanto, una proteína que contenga diez residuos de lisina y
siete de arginina, suministrará dieciocho péptidos mediante la
digestión con tripsina. Cada uno de los péptidos trípticos formados,
terminarán ya sea con arginina o con lisina.

Los péptidos obtenidos por escición específica, química o enzimática,

se separan mediante métodos cromatográficos. La secuencia de
aminoácidos de cada péptido purificado es subsecuentemente
determinada mediante el método de Edman. En este punto, la
secuencia de los segmentos peptídicos generados por la degradación
queda aún desconocida. La información adicional para determinar la
secuencia de los segmentos generados se obtiene por superposición
de péptidos. Para esto se utiliza un enzima distinto a la tripsina para
cortar la cadena polipeptídica por enlaces diferentes. Por ejemplo, la
quimotripsina corta preferencialmente sobre el lado carboxílico de los
residuos aromáticos y otros residuos voluminosos apolares. Puesto
que estos péptidos quimotrípticos se superponen sobre dos o más
péptidos trípticos, pueden ser utilizados para obtener su ordenación.
Así, queda determinada la secuencia completa de la proteína.

péptidos trípticos péptido quimotríptico

Ala-Ala-Trp-Gly-Lys Val-Lys-Ala-Ala-Trp
Thr-Asn-Val-Lys

péptido tríptico péptido tríptico

_______________ __________________
I I I I
Thr-Asn-Val-Lys-Ala-Ala-Trp-Gly-Lys
I________________I

péptido quimotríptico
superpuesto

Esta metodología se aplica a las proteínas que constan de una sola

cadena polipeptídica sin ningúb enlace disulfuro. Procedimientos
adicionales son necesarios para proteínas con más de una cadena
polipeptídica o que contenga enlaces disulfuro. Para proteínas que
contengan dos o más cadenas polipeptídicas unidas por enlaces no
covalentes, se utilizan agentes desnaturalizantes tales como urea y el
clorhidrato de guanidina para disociar las cadenas. Las cadenas
disociadas deben ser separadas antes de determinar su secuencia.
Para las cadenas polipeptídicas unidas covalentemente por puentes
disulfuro, primeramente se procede a la reducción, con α-
mercaptoetanol o ditiotreitol, de los enlaces disulfuro. Para prevenir la
re asociación de los residuos de cisteína, estos son alquilados con
iodoacetato para formar S- carboximetil derivados estables.

La posición de los enlaces disulfuro puede ser determinada por la

técnica de electroforesis diagonal. Primeramente, la proteína es
escindida específicamente hasta péptidos bajo condiciones que
preserve los enlaces disulfuro. La mezcla de los péptidos es sometida
a electroforesis y subsecuentemente expuesta a vapores de ácido
perfórmico, para de esa manera romper los enlaces disulfuro y
convertir los residuos de cistína en residuos de cisteína. Así, los
péptidos originalmente ligados por puentes disulfuro se encontrarán
separados y también con carácter más ácido por la formación de un
grupo SO3-.

R-Cisteína-S-S-Cisteína-R' + H2CO3 · R-Cisteína-SO3- + -O3S-Cisteína-

R'
CISTINA AC. PERFORMICO AC.
CISTEICO

Esta mezcla se somete a electroforesis en dirección perpendicular bajo

las mismas condiciones que en la primera electroforesis. Los péptidos
que nunca tuvieron enlaces disulfuro tendrán una mobilidad igual a la
primera vez, y como consecuencia todos estos se encontrarán
ubicados en línea diagonal. Por el otro lado, los nuevos péptidos
formados, conteniendo ácido cisteíco, migrarán en forma diferente al
péptido original que contenía el enlace disulfuro y por lo tanto se
encontrará fuera del patrón diagonal de migración.

La secuenciación proteíca ha sido revolucionada por la tecnología del

DNA recombinante.

Cientos de proteínas han sido secuenciadas por el método de la

degradación peptídica de Edman, derivado de escisiones específicas.
La secuenciación proteíca es un evento laborioso que demanda mucho
tiempo. La elucidación de secuencias de proteínas largas, aquellas con
más de 1000 residuos, requieren de un esfuerzo sumamente especial.
Afortunadamente, un proceso experimental complementario, basado
en la tecnología del DNA recombinate, se encuentra al alcance hoy en
día. Largos segmentos de DNA pueden ser clonados y secuenciados.
La secuencia de los cuatro tipos de bases que integran el DNA
-adenina(A), timina (T), guanina (G) y citosina(C)- revelan en manera
directa la secuencia de los aminoácidos de la proteína codificada por el
gen o la molécula correspondiente de RNA mensajero (mRNA).
GGG.TTC.TTG.GGA.GCA.GCA.AGG.AAG.CAC.TAT.GGG.GCA. DNA
Gly Phe Leu Gly Ala Ala Gly Ser Thr Met Gly Ala AMINOACIDOS

FIGURA ? Parte de la secuencia de nucleótidos del virus del SIDA

(síndrome de inmunodeficiencia adquirida) especificada por el genoma
de RNA del virus y la secuencia de los aminoácidos correspondientes
deducida por el conocimiento del código genético.

La secuencia de aminoácidos deducida por lectura de la secuencia del

DNA es aquella de la proteína original (naciente), o sea, el producto
directo de la maquinaria traductora en los ribosomas, que liga los
aminoácidos en la secuencia especificada por la cadena de mRNA.
Pero, como se conoce, muchas proteínas son modificadas después de
su síntesis. Así, algunas pierden residuos terminales, nuevas aparecen
por cortes de algún péptido original más grande, otras oxidan sus
residuos de cisteína para formar enlaces disulfuro con la misma
proteína u otra diferente. También, residuos específicos de algunas
proteínas son alterados, como aquellas dirigidas hacia membranas,
que unen grupos carbohidratos a residuos específicos de asparragina.
Por lo tanto, secuencias de aminoácidos derivadas de un DNA tienen
gran información, pero no revelan modificaciones posttraduccionales,
como las mencionadas. Es por este motivo, que los análisis químicos
son necesarios para delinear la naturaleza de estos cambios, los cuales
son críticos para la actividad biológica de la mayoría de proteínas. Así,
la secuenciación del DNA y los análisis químicos de las proteínas son
procesos complementarios para elucidar las bases fundamentales de la
función proteíca. La tecnología del DNA recombinante a contribuido
enormemente a proporcionar información más rápida y exacta de las
secuencias de los aminoácidos, especialmente para proteínas con un
gran número de residuos. Hoy en día se conoce la secuencia de
aproximadamente 3000 proteínas con un número de residuos de más
de106.

La secuencia de aminoácidos provee gran información en una variedad

de formas.

1. La secuencia de la proteína de interés puede ser comparada con

secuencias conocidas para determinar si existen similitudes,
pudiéndose cuestionar si la proteína pertenece a alguna familia ya
establecida. Por ejemplo, mioglobina y hemoglobina, pertenecen a la
familia de las globinas, quimotripsina y tripsina pertenecen a la familia
de las serina proteasas. En este tipo de comparaciones se han logrado
obtener resultados sorprendentes tal como el de una proteína que
produce cáncer en un huesped susceptible que es casi idéntica a un
factor de crecimiento celular totalmente normal.

2. La comparación de las secuencias de la misma proteína en

diferentes especies da un conocimiento inmenso sobre las vias
evolutivas. Relaciones genealógicas entre especies se pueden asumir
a partir de las diferencias en secuencia entre dos proteínas. El tiempo
de divergencia de los dos caminos evolutivos pueden ser estimados
por el reloj evolutivo de mutaciones al azar. Por ejemplo, la
comparación de albúminas de suero de primates indican que los seres
humanos y los apes africanos han divergido únicamente hace cinco
millones de años y no treinta millones como se pensaba.

3. Las secuencias de aminoácidos contienen señales que determinan el

destino de las proteínas y controlan su procesamiento. Muchas
proteínas destinadas para ser exportadas fuera de la célula o dirigidas
hacia una membrana contienen una secuencia indicativa de
aproximadamente veinte residuos hidrofóbicos de aminoácidos
localizados en el lado amino terminal de la proteína, que los dirige a
su destino. Además, sitios con potencial para la adición de unidades
de carbohidratos a residuos de asparragina, pueden ser identificados
encontrando en la secuencia Asn-X-Ser y Asn-X-Thr (X denota cualquier
residuo). Pares de residuos básicos tales como Arg-Arg, marcan un
sitio potencial para una escisión proteolítica como en el caso de
proinsulina, el precursor de la insulina.

4. Datos de secuenciación proveen las bases para preparar anticuerpos

contra una proteína específica. Anticuerpos específicos pueden ser
muy útiles en la determinación de la cantidad de proteína y su
distribuición en la célula.

5. Las secuencias de aminoácidos hacen posible elaborar sondas de

DNA que son específicas para genes que codifican las proteínas
correspondientes.

Las proteínas pueden ser cuantificadas y localizadas por anticuerpos

altamente específicos.

Un anticuerpo es una proteína sintetizada por un animal en respuesta

a la presencia de una sustancia foránea, llamada antígeno. Los
anticuerpos, también llamados inmunoglobulinas, tienen afinidad
específica por los antígenos que provocaron su síntesis. Las proteínas,
polisacáridos y ácidos nucléicos extraños a un sistema celular, pueden
ser antígenos efectivos. Anticuerpos también pueden ser formados
contra moléculas pequeñas como aquellos péptidos sintéticos, siempre
y cuando la proteína pequeña esté ligada a un componente acarreador
macromolecular. El grupo que reconoce el anticuerpo, en una
molécula foránea, se denomina una determinante antigénica o epítopo.
Los animales tienen un repertorio muy grande de células productoras
de anticuerpos, cada una de ellas produciendo anticuerpos de
especificidad única. El tipo de anticuerpo presente en el plasma
sanguíneo, en mayor cantidad, es la inmunoglobulina G, una proteína
de 150 kd, que contiene dos sitios idénticos para la unión con el
antígeno.

FIGURA ? Diagrama de la inmunoglobulina G (IgG), la clase mayoritaria

de anticuerpos en el plasma sanguíneo. La IgG contiene dos unidades
de unión al antígeno (Fab) y una unidad mediadora de funciones
efectoras (Fc), tales como la lisis de las membranas celulares.

Los anticuerpos que reconocen una proteína en particular, pueden ser

obtenidos inyectando la proteína a un conejo. Las inyecciones deben
ser dos, a tres semanas de separación la una de la otra. Varias
semanas después se obtiene la sangre del conejo inmunizado y se la
somete a centrifugación. El suero resultante se denomina antisuero,
que usualmente contiene el anticuerpo deseado. El antisuero o su
fracción de inmunoglobulina G, puede ser utilizada directamente.
Alternativamente, moléculas de anticuerpos específicas para el
antígeno, pueden ser purificadas por cromatografía de afinidad. Los
anticuerpos producidos en esta manera son policlonales. Esto significa
que son productos de muchas poblaciones diferentes, de células
productoras de anticuerpos, y por lo tanto, difieren de alguna manera
en la precisión de la especificidad y afinidad por el antígeno. Un
avance significativo de los últimos años es el descubriemiento de un
método para la producción de anticuerpos monoclonales, con cualquier
especificidad deseada. Los anticuerpos monoclonales, en contraste
con los policlonales, son homogéneos, porque son producidos por una
población de células idénticas (clones). Cada población de células de
este tipo, descienden de una sóla célula híbrida, llamada hibridoma,
formada por la fusión de una célula productora de anticuerpos con una
célula tumoral, la cual tiene una capacidad ilimitada de proliferación.
Proteínas con alarmantes similitudes entre ellas, pueden ser
distinguidas por la gran especificidad de los anticuerpos. Tanto así,
que hasta la más mínima diferencia en la superficie (un sólo residuo)
puede ser detectada. Los anticuerpos pueden ser utilizados como
reactivos analíticos específicos, para cuantificar la cantidad de una
proteína u otro antígeno. En un inmunoensayo de fase sólida, un
anticuerpo específico para una proteína de interés, es ligado a un
soporte polimérico, como puede ser una hoja de polivinilcloruro (PVC).
A ésta, se le añade una gota de extracto celular, o se esparce una
muestra de sangre u orina, para lograr la formación del complejo
anígeno-anticuerpo, y luego se la somete a un primer lavado. A
continuación se añade un anticuerpo específico, el cual reconoce un
segundo sitio en el antígeno, y se vuelve a lavar la hoja de PVC para
eliminar el exceso de anticuerpo. El segundo anticuerpo añadido, lleva
una marca radioactiva o fluorescente que puede ser detectada con
facilidad debido a su sensibilidad. La cantidad del segundo anticuerpo
ligado a la hoja de PVC es proporcional a la cantidad de antígeno
presente en la muestra. La sensibilidad por este método, puede ser
incrementada aún más si el segundo anticuerpo está ligado a un
enzima como la fosfatasa alcalina, ya que ésta convierte, de manera
rápida, una sustancia incolora en un producto coloreado, o un
substrato no fluorescente en un producto intensamente fluorescente.
Menos de un nanogramo (10-9 g) de proteína puede ser medido por
este ensayo inmunosorbente ligado a un enzima (ELISA), el cual es
rápido y conveniente. Por ejemplo, con éste método, el embarazo
puede ser detectado a los pocos días después de la concepción ,
utilizando la orina de la paciente como muestra biológica, para la
detección de la hormona gonadotropina coriónica humana (HCG), una
proteína de 37 kd, producida por la placenta.

Muy pequeñas cantidades de una proteína de interés, en una célula o

líquido biológico, pueden ser detectadas por una técnica de
inmunoensayo, denominada Western blotting. Una muestra es
sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. Las
proteínas resueltas en el gel, se transfieren a una hoja de nitrocelulosa
(blotting) proporcionando mayor facilidad a la proteína de interés, para
reaccionar con el anticuerpo específico añadido. El complejo antígeno-
anticuerpo formado en la nitrocelulosa, puede ser detectado,
enjuagando la hoja de nitrocelulosa con un segundo anticuerpo
específico para el reconocimiento del primero. Marcando
radioactivamente el segundo anticuerpo, se produce una banda
obscura en una película de rayos X. Alternativamente, para detectar la
proteína de interés, se puede utilizar un enzima que utilice como
sustrato, el segundo anticuerpo, y que genere un producto coloreado.