VI Congreso Internacional de Ingeniería Mecánica

y IV de Ingeniería Mecatrónica
IV Congreso Internacional de Materiales, Energía y Medio Ambiente

Bogotá, Colombia.
2, 3 y 4 de mayo del 2013

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE BACTERIAS CELULOLITICAS

NATIVAS DE BOYACA, COLOMBIA.

Paola Andrea Viteri*, David Arturo Castillo†, Silvio Edgar Viteri‡

*
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia
paovit@hotmail.com
†‡
Universidad Pedagógica y Tecnológica de Colombia,
davidcastilloag@gmail.com
silvio.viteri@uptc.edu.co

RESUMEN

En Colombia el manejo de los residuos sólidos orgánicos ha generado serios problemas

ambientales, debido a que como resultado de su mala disposición en rellenos sanitarios y
botaderos a cielo abierto se ha contaminado el aire, el agua y el suelo. El objetivo de esta
investigación fue aislar bacterias nativas de Boyacá y seleccionarlas por su mayor capacidad para
degradar residuos sólidos orgánicos. Se tomaron muestras de suelo de 5 bosques nativos y 5
lotes cultivados con cereales y de 3 composteras. De cada muestra se tomaron 10g y se preparó
-4
una serie de dilución, en base 10, hasta 10 . Utilizando tubos que contenían 5 mL de medio
mineral Dubos y una tira de papel filtro se estimó la densidad de población de los microorganismos
celulolíticos por el Método del Numero Más Probable. De las tiras de papel que indicaron la
presencia de dichos microorganismos se realizaron subcultivos a cajas de Petri con medio AN. Las
colonias que crecieron en medio AN fueron luego subcultivadas a cajas Petri con medio CMC.
Colonias puras de los crecimientos en medio CMC fueron luego sometidas a la prueba del Rojo
Congo, para la determinación de la capacidad celulolítica en medio CMC. Los resultados indicaron
que en comparación a los suelos las composteras albergan una mayor población de
microorganismos celulolíticos. En relación a las bacterias, 29 aislamientos crecieron en medio de
cultivo CMC, utilizando celulosa como única fuente de carbono. De los 29 aislamientos, 27
procedieron de los bosques nativos, 1 de los suelos cultivados con cereales y 1 de una de las
composteras. En términos de la capacidad celulítica, 15 aislamientos produjeron halos de amplitud
diferente, destacándose los aislamientos 1 y 2, con 0.65 y 0.53cm, seguido de los aislamientos 7, 6
y 14 con halos de 0.33, 0.3 y 0.3cm, respectivamente.

Palabras Clave: Bacteria Celulolítica (Cellulolytic Bacteria), Bosques Nativos (Native Forests),
Celulosa (Cellulose), Descomposición (Decomposition), Residuos sólidos Orgánicos (Organic solid
wastes).
 2

1 INTRODUCCIÓN

En Colombia la producción de residuos sólidos es considerable, diariamente se generan 28.800

toneladas, de las cuales 18.720 corresponden a residuos orgánicos y 10.080 a inorgánicos (Rojas,
2005). Particularmente en Tunja, al relleno sanitario de Pirgua llegan diariamente 190 toneladas
(Angarita, 2009). Según el MAVDT (2008), de la cantidad total producida en el país, el 88.5% se
dispone en rellenos sanitarios, el 8.7% en botaderos a cielo abierto, el 2.4% en plantas de
aprovechamiento, el 0.3% son enterrados y más del 0.1% se arroja a las fuentes de agua o se
quema a cielo abierto. Los porcentajes anteriores sugieren que el tratamiento de residuos sólidos
en Colombia no es apropiado. El mal manejo de estos residuos ha generado una serie de
problemas, especialmente de orden ambiental, debido a que sus efectos impactan negativamente
el aire, el agua y el suelo. En los rellenos sanitarios y en los campos a cielo abierto, la mezcla entre
sí de los residuos seguida de su rápida putrefacción desencadena una serie de reacciones
bioquímicas, cuyos productos originan olores nauseabundos y lixiviados que pueden contaminar el
suelo y las aguas subterráneas hasta con metales pesados como el mercurio, el plomo y el cadmio
y con sustancias cancerígenas como el benceno o tóxicas como el tricloroetileno (Giraldo, 1998).

El hecho que la mayor parte de los residuos sólidos está representada por materiales de tipo
orgánico, procedente principalmente de remanentes vegetales, genera la posibilidad de utilizar
microorganismos que han demostrado capacidad para acelerar el proceso de descomposición de
los mismos. Esta posibilidad se fundamenta en los reportes que aseveran que en hábitats naturales
como el suelo una alta diversidad de bacterias, actinomicetos y hongos tiene capacidad específica
para la biodegradación de la celulosa, polímero que junto con la hemicelulosa y lignina
representan la fracción de los residuos vegetales más resistente a la descomposición (Alexander,
1976; Sylvia et al., 2005, 2008). La celulosa es un carbohidrato que consiste de una cadena lineal
de moléculas de glucosa unidas por un enlace ß 1-4. La transformación de la celulosa por medio
de la actividad microbiana resulta en parte en la producción de di-óxido de carbono, en parte en la
inmovilización del carbono en materiales húmicos y en parte en la generación de compuestos
orgánicos más simples, que son utilizados por otras poblaciones microbianas (Atlas y Barta, 1981),
como por ejemplo, las transformadoras de hemicelulosa y lignina. Entre las bacterias
biodegradadoras de celulosa reportadas figuran especies de los géneros Bacillus, Cellulomonas,
Clostridium, Corynebacterium, Cytophaga, Polyangium, Pseudomonas, Sporocytophaga, Nocardia
y Vibrio (Alexander, 1977: Atlas y Barta, 1981). Según Sylvia et al. (2005), las bacterias de los
generos Streptomyces, Pseudomonas y Bacillus son importantes en la despolimerización inicial de
la celulosa.

Con base en la información anterior, el objetivo de la presente investigación fue aislar y seleccionar
bacterias nativas procedentes principalmente de los suelos del Departamento de Boyacá, que
demuestren el mayor potencial en cuanto a su capacidad celulolítica. Esta información es
pertinente porque contribuye positivamente al entendimiento de las posibilidades que existen para
la generación de tecnologías que conduzcan al rápido y adecuado tratamiento de los residuos
sólidos orgánicos, no solo en el Departamento de Boyacá, sino también en otras ciudades del país
y en general en el mundo en vía de desarrollo, donde los problemas generados por el inadecuado
manejo de los residuos sólidos orgánicos continúan agravándose gradualmente.
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2 MATERIALES Y MÉTODOS

2.1 Toma de Muestras

Las muestras procesadas en ese estudio fueron tomadas en bosques nativos, en terrenos
cultivados frecuentemente con cereales y en composteras. En el caso de los bosques nativos las
muestras de suelo se tomaron, en un trayecto de 2 km, en el Paramo del Malmo, el Paramo de
Rabanal, la Reserva de Iguaque, en la hoya del Rio Pomeca sector La Cumbre y en el trayecto
Iguaque – Agua Varuna, vía a Tunja. En cada trayecto se tomaron 10 muestras, representativas de
5 submuestras, ubicadas a distancia de 200m entre ellas. Para la toma de cada muestra se ubicó
un punto en el trayecto y cuatro puntos más, a distancia de 20m, atrás y adelante del punto, en
forma de cruz. Las muestras de suelo de terrenos cultivados frecuentemente con cereales fueron
tomadas en 5 fincas de la vereda Pirgua, del municipio de Tunja, 5 submuestras por finca. Tanto en
los bosques como en los terrenos de cereales la profundidad a la cual se tomó la muestra fue de
15 a 20 cm. Las muestras de compost se tomaron en tres composteras, la primera en la Empresa
Fundases, ubicada en Puente Piedra (Cundinamarca) y la segunda y tercera muestra en el
Municipio de Arcabuco y en las instalaciones del Comité de Cafeteros de Miraflores (Boyacá),
respectivamente. En cada caso la muestra de compost fue representativa de 5 submuestras. Una
vez llegadas las muestras al laboratorio, se tamizaron (malla N⁰ 35) y se procesaron
inmediatamente.

2.2. Estimación de la Densidad de Población de los Microorganismos Celulolíticos

Para la estimación de la densidad de población de los microorganismos con capacidad celulolítica,

de cada muestra se pesaron 10g de suelo y se colocaron en una botella de dilución que contenía
95 ml de solución salina (NaCl al 0.85%). Después de agitar el contenido de la botella
vigorosamente durante 30 minutos se procedió a preparar una serie de dilución, en base 10, hasta
-4
10 , utilizando tubos de ensayo tapa rosca con 9 mL de solución salina cada uno. En cada paso,
para pasar al paso siguiente, el contenido del tubo se agitó durante 2 minutos. Posteriormente, de
cada una de las diluciones se tomaron 4 alícuotas de 1 mL y con cada una se inoculo un tubo de
ensayo que contenían 5 mL de medio líquido mineral Dubos. Después de la inoculación, en cada
tubo se introdujo una tira de papel filtro estéril (1 x 5 cm), como fuente de celulosa. Para cada
dilución se dejo un tubo sin inoculación, el cual sirvió como control. Los tubos inoculados fueron
o
almacenados a 30 C durante 3 semanas. Después de la primera semana, los tubos fueron
observados diariamente con el fin de detectar la aparición de manchas de color marrón en las tiras
de papel filtro. Finalizada la tercera semana, los tubos que mostraron la tira de papel con cambio de
color se registraron como positivos (+) y los tubos en los cuales la tira de papel no cambio de color
como negativos (-). Con base en el número de tubos positivos por muestra, se estimó la densidad de
población de microorganismos celulolíticos por el Método del Numero Más Probable (MPN),
utilizando las tablas de Fisher y Yates (1963).

2.3 Aislamiento de las Bacterias Degradadoras de Celulosa.

En la cámara de crecimiento, las tiras de papel filtro que mostraron cambio de color fueron sacadas de
los tubos y extendidas sobre toallas de papel estéril. De las áreas donde se observo mayor
descomposición, por medio de una asa se realizaron subcultivos en cajas de Petri para crecimiento en
medio agar nutritivo (AN). El subcultivo de caja a caja continúo hasta la obtención de colonias puras.
Una colonia pura de cada aislamiento fue luego subcultivada en cajas de petri con medio sólido
mineral Dubos, suplementado con celulosa pulverizada (20g por L), como única fuente de carbono. A
los aislamientos que crecieron en el medio mineral Dubos, con celulosa como única fuente de
carbono, se les determino la morfología de la célula y además se le aplico la prueba de Tinción de
Gram.
 4

2.4 Determinación de la Capacidad Celulolítica de los Aislamientos.

Cada uno de los aislamientos celulolíticos obtenidos fue subcultivado nuevamente en cajas Petri
con medio CMC. Una vez obtenido el crecimiento se paso una asada pequeña de células a un tubo
de ensayo que contenía 1 mL de solución salina. Con el objeto de homogenizar la suspensión de
células el contenido del tubo fue agitado en el vórtex durante 1 minuto. De la suspensión de células
así preparada se tomaron alícuotas, primero para la determinación de la capacidad celulolítica y
segundo para el conteo del número de células en la suspensión. Para la determinación de la
capacidad celulolítica, 4 alícuotas de 10 µL cada una, se distribuyeron equidistantemente a 2cm en
la superficie de una caja Petri, con medio CMC. Para la distribución de las alícuotas, las cajas Petri
se colocaron sobre una plantilla que fue marcada con anterioridad. Después que la solución salina
de cada alícuota quedó inmersa en el medio CMC, las cajas se incubaron para crecimiento a 30
o
C, en posición invertida, durante 3 días. A los 3 días, siguiendo el protocolo del IGAC (2006), la
superficie de la caja se cubrió enteramente con una solución de Rojo Congo al 0.05%, durante 10
minutos. Al termino de los 10 minutos, se retiro el rojo congo y se cubrió con solución salina 1M,
durante 1 hora. Al término de la hora, se retiro la solución salina y se cubrió con acido acético al
2%, por 10 segundos. Finalmente se retiro el acido acético y se midió el diámetro de crecimiento de
la colonia y la amplitud del halo producido. El conteo del número de células por mL por aislamiento
se realizo utilizando la cámara Petroff Hausser.

3. RESULTADOS

3.1 Densidad de población de microorganismos celulolíticos.

Los resultados de la estimación de la densidad de población de microorganismos celulolíticos en

las muestras procedentes de 5 bosques nativos, de 5 suelos cultivados frecuentemente con
cereales en la vereda Pirgua del Municipio de Tunja y de 3 composteras se muestran en la Tabla 1.
Los resultados indican que en comparación a los suelos las composteras albergan una mayor
población de este grupo específico de microorganismos. Efectivamente, la densidad de población
de celulolíticos en las composteras muestran los valores más altos, seguida en orden decreciente
por los suelos cultivados con cereales y los bosques nativos. Estos resultados concuerdan con
Alexander (1977), quien reporta que en un determinado hábitat la densidad de bacterias es
influenciada en gran medida por el contenido de materia orgánica y que en suelos cultivados la
población es más alta que en suelos vírgenes; según el mismo autor, la práctica del cultivo de
alguna manera crea en el suelo condiciones favorables para la proliferación de bacterias, por
medio de efectos que hasta ahora no se han entendido claramente. La existencia de una mayor
densidad de población de microorganismos celulolíticos en las composteras es explicable por la
mayor disponibilidad no solamente del sustrato específico celulosa sino también del resto de
nutrimentos que para su crecimiento requieren los microorganismos. A diferencia de las
composteras, en las cuales se incluye desde el inicio una alta diversidad de residuos en diferentes
estados de degradación, en los suelos la disponibilidad de dichos requerimientos depende
enteramente de la incorporación de residuos como fuente de materia orgánica, la cual dependiendo
del manejo puede ser esporádica y además localizada. En los suelos agrícolas y en particular en
los suelos destinados a la producción de cereales la incorporación del sustrato celulosa a través de
los residuos de cosecha generalmente ocurre una sola vez por año. En los suelos de los bosques
nativos se prevé que el suministro de celulosa por medio de la incorporación de ramas, hojas, tallos
y raíces es continuo, pero ello está sujeto a factores como la clase de especies vegetales y la
época en la cual las condiciones de ambientales lo permiten.
 5

TABLA 1. Densidad de población de microorganismos celulolíticos en diferentes hábitats, según el

Método del Número Más Probable (NMP).

Bosque Bosque Reserva Trayecto Orillas del Vereda Composteras

Nativo Nativo El Natural Iguaque- Rio Pirgua
El Horizonte Iguaque Agua Pomeca
Malmo Varuna
Muestra
No (UFC/g)
2 2
1 0.6 1.7 1.7 0.6 0.6 1.0 x 10 1.8 x 10
2
2 1.7 3.1 0.6 3.1 0.6 3.1 7.0 x 10
1 1 2
3 1.7 x 3.1 0.6 5.9 x 10 3.1 3.1 x 10 7.0 x 10
1
10
4 1.7 1.0 0.6 0.6 0.6 5.8 -
2 1
5 3.1 1.0 0.6 1.7 6.9 x 10 5.9 x 10 -
2
6 0.6 1.0 x 10 0.6 0.6 1.0 - -
1
7 0.6 0.6 1.0 x 10 0.6 1.7 - -
1
8 0.6 1.7 1.0 x 10 0.6 0.6 - -

9 0.6 0.6 0.6 1.0 1.0 - -

10 3.1 3.1 0.6 0.6 3.1 - -

3.2. Aislamientos Obtenidos.

De aproximadamente 97 aislamientos de bacterias obtenidos inicialmente en medio AN, 29

crecieron en medio de cultivo CMC, utilizando celulosa como única fuente de carbono. De los 29
aislamientos, 9 procedieron del bosque nativo del Paramo el Malmo, 10 del bosque nativo del
Paramo El Horizonte, 3 de la Reserva Natural de Iguaque, 1 del trayecto Iguaque – Agua Varuna, 4
de los bosques que se encuentran en la hoya del Rio Pomeca, sector La Cumbre, 1 de los suelos
de la vereda Pirgua y 1 de la compostera de la Empresa Fundases, ubicada en Puente Piedra,
Cundinamarca. De los 29 aislamientos celulolíticos obtenidos, a 20 de ellos se les determino la
morfología celular y su respuesta a la Tinción de Gram, cuyos resultados aparecen en la Tabla 2.

Según la morfología de la célula la gran mayoría de las bacterias celulolíticas son de forma bacilar
y en cuanto a la Tinción de Gram, aproximadamente la mitad de los aislamientos son Gram
positivos (+) y la mitad Gram negativos (-). Que en el grupos específico de las bacterias
celulolíticas existen bacilos Gram positivos (Gram +) y Gram negativos (Gram -) se encuentra
reportado en la literatura (Alexander, 1977 y Atlas y Barta, 1981).
 6

Tabla 2. Aislamientos de bacterias celulolíticas obtenidos en los bosques nativos y en una de las
composteras.

Aislamientos ORIGEN Morfología de la Tinción de

Obtenidos Célula Gram
1 Bosque el Malmo Bacilos +
2 Bacilos -
6 Bacilos +
7 Bacilos +
8 Bacilos +
9 Bacilos +
11 Bacilos +
12 Bosque el Bacilos -
13 Horizonte Cocos y +
Diplococos
14 Bacilos +
17 Bacilos -
20 Bacilos +
Esporulados
31 Reserva de Bacilos -
32 Iguaque Diplococos +
33 Bacilos -
41 Trayecto Iguaque- Bacilos -
Agua Varuna
51 Bacilos -
53 Riveras Río Bacilos +
54 Pomeca Bacilos -
Compost (Muestra
71 Empresa Bacilos -
FUNDASES)

3.3 Capacidad Celulolítica de los Aislamientos Bacterianos.

Los resultados de la prueba del Rojo Congo para determinar la capacidad celulolítica de los
aislamientos se reportan en la Tabla 3, ordenados de mayor a menor según la amplitud del halo
producido. Los valores correspondientes al número de células por mL en la suspensión de cada
uno de los aislamientos, utilizada en la prueba, indican que el crecimiento de estas bacterias con
celulosa como única fuente de C es similar al crecimiento que generalmente se reporta para otras
bacterias con otras fuentes de C. Al tercer día de crecimiento, el diámetro de la colonia de los
diferentes aislamientos fluctuó entre 1.75cm (Aislamiento No. 7) y 0.7cm (Aislamiento No. 17) y la
amplitud del halo producido entre 0.65cm (Aislamiento No.1) y 0.1cm (Aislamiento No. 51). No se
refleja una correlación bien definida entre el número de células utilizado en la prueba, el tamaño de
la colonia y el tamaño del halo producido. Esta aseveración se basa en la observación que el
aislamiento 7 que alcanzo el mayor diámetro de la colonia (1.75cm) produjo un halo (0.325cm) que
es menos del 50% del mayor halo producido (0.65cm) por el aislamiento 1 con un tamaño de
colonia de solo 1.2cm. La Figura 1 ilustra la amplitud de los halos producidos por el aislamiento 2,
que en cuanto a capacidad celulolítica resulto uno de los mejores, el aislamiento 12 a nivel
intermedio y el aislamiento 8, que creció pero no produjo halo. Estos datos indican que las
bacterias celulolíticas no tienen la misma capacidad para degradar celulosa, pues hay unas más
eficientes que otras, lo cual genera la posibilidad de clasificarlas de acuerdo a su capacidad
celulolítica y con las mejores producir inóculos, que aceleren efectivamente el proceso de
transformación de los residuos sólidos orgánicos.
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Tabla 3. Capacidad Celulolítica de los Aislamientos, segun la Prueba del Rojo Congo en Medio de
Cultivo CMC.

Número de células DIÁMETRO de la Amplitud del halo

por mL en la colonia al tercer producido por la
suspensión utilizada día de colonia, al tercer día
en la prueba CRECIMIENTO en de crecimiento, en
medio de cultivo medio de cultivo CMC
*
Aislamiento CMC (cm)* (cm)
7
1 2.95 x 10 1.2 0.65
7
2 1.23 x 10 1.35 0.53
7
7 2.83 x 10 1.75 0.33
6
6 9.5 x 10 0.875 0.30
6
14 7.5 x 10 1.05 0.30
7
12 3 x 10 0.9 0.25
8
17 3 x 10 0.7 0.25
7
20 1. 3 x 10 1.3 0.25
8
31 1.2 x 10 0.9 0.20
7
32 6.9 x 10 0.825 0.20
8
41 1.4 x 10 0.8 0.20
7
53 1.7 x 10 0.875 0.20
8
54 1.75 x 10 0.825 0.20
7
11 5.63 x 10 0.8 0.18
7
51 6.6 x 10 1.15 0.10
6
8 6.3 x 10 0.75 0
7
9 1.93 x 10 0.8 0
6
13 3.8 x 10 0.875 0
8
33 1.7 x 10 1.2 0
7
71 1.6 x 10 1.1 0

Figura 1. Ilustracion de los halos producidos por 3 de los aislamientos de bacterias celuloliticas.
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4. DISCUSIÓN

Los resultados de esta investigación permiten comprobar que al igual que en los suelos
temperados bajo las condiciones tropicales también existen microorganismos que se
responsabilizan de la transformación de los residuos sólidos orgánicos. Los aislamientos obtenidos
de diferentes hábitats, representados por suelos de bosques nativos, suelos provenientes de lotes
cultivados con cereales y composteras demostraron no solamente su capacidad para crecer
utilizando celulosa como única fuente de C sino también que existen diferencias entre ellos en
cuanto a dicha capacidad, generando por lo tanto la posibilidad de seleccionar a los mejores y con
ellos producir inóculos que conduzcan efectivamente a acelerar el proceso de transformación de
residuos sólidos orgánicos, reduciendo así la gravedad de los problemas ambientales generados
por el mal manejo de residuos, principalmente en los países en vía de desarrollo. Según los
resultados obtenidos por medio de la técnica del Número Más Probable, la densidad de población
de microorganismos celulolíticos fue mayor en las muestras provenientes de compostaje, frente a
los suelos cultivados con cereales y los de los bosques nativos. Según Alexander (1977), la
densidad de bacterias en general depende en alto grado del contenido de materia orgánica en un
determinado hábitat, este concepto puede ser aplicado específicamente al grupo de las bacterias
celulolíticas, obviamente en una compostera la disponibilidad del sustrato específico celulosa y de
otros requerimientos nutricionales es mayor que en los suelos procedentes de lotes de cereales y
más aún que en los suelos de los bosques nativos. En términos de los resultados concernientes
con la capacidad celulolítica de los aislamientos demostrada por la prueba del rojo congo, se
evidenció la hidrólisis de la celulosa en medio CMC, debido a que el Rojo Congo permitió visualizar
un halo de aclaramiento alrededor de las colonias, similar a los resultados de los ensayos
realizados por (Gaitán et al., 2007; Sáenz, 2009). Los halos se observaron en todos los
aislamientos excepto en los correspondientes a los números 8, 9, 13, 33 y 71, en los cuales hubo
crecimiento de la colonia pero no la producción de halo. Los aislamientos que produjeron los halos
de mayor amplitud fueron el No. 1 y 2, con 0.65 y 0.53cm, seguido de los aislamientos 7, 6 y 14
con halos de 0.33, 0.3 y 0.3cm, respectivamente. Esta capacidad celulolítica de los aislamientos es
similar a la de los aislamientos reportados por Gaitán et al., 2007, con valores de 0.2 a 0.35cm y
baja con relación a los valores de 0.74 a 2.14cm reportados por Gutiérrez et al., 2008 en
aislamientos procedentes de suelos cultivados con Stevia. Entre los aislamientos obtenidos se
observó el predominio de bacilos Gram negativos y Gram positivos y en menor proporción cocos,
diplococos y bacilos esporulados tal como lo registran diferentes autores (Alexander, 1977;
Cariello, 2007).

En general, la información sobre las bacterias celulolíticas existente corresponde a los suelos
temperados o en su mayoría procede de estudios enfocados a las bacterias celulolíticas del rumen
de bovinos (Guerrero, 2011; Sánchez et al., 2002; Rodríguez et al., 1996), en los trópicos esta
información es aún casi nula. Mediante esta investigación se corrobora que bajo las condiciones
tropicales existen también bacterias capaces de degradar celulosa, generando la incógnita
respecto a si la diversidad de bacterias celulolíticas de los suelos temperados reportada es la
misma (Alexander, 1977; Atlas y Barta, 1981; Silvia 2005, 2008) o varía en los hábitats tropicales.
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REFERENCIAS

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