ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE APLICANDO UN ENSAYO MEJORADO DE DECOLORACIÓN DE

CATIONES RADICALES ABTS.

INTRODUCCIÓN

Se han introducido varios ensayos para medir la actividad antioxidante total de los fluidos
corporales [1 a 6], extractos de alimentos [7 a 11] y compuestos puros [7, 12 y 16]. Cada método
se relaciona con la generación de un radical diferente, actuando a través de una variedad de
mecanismos y la medición de un rango de puntos finales en un punto de tiempo fijo o sobre un
rango (revisado en las referencias 13 y 17). Se han adoptado dos tipos de enfoques, a saber, los
ensayos de inhibición en que la extensión de la captación mediante donación de hidrógeno o
electrones de un radical libre preformado es el marcador de la actividad antioxidante, así como
los ensayos que implican la presencia de antioxidantes. Sistema durante la generación del
radical.

La generación del radical catión ABTS [2,29-azinobis- (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)]

[18] forma la base de uno de los métodos espectrofotométricos que se han aplicado a la
medición de la actividad antioxidante total de las soluciones. de sustancias puras [12,19,20],
mezclas acuosas y bebidas [7,8]. El ensayo ABTS • 1 original se basó en la activación de la
metamioglobina con peróxido de hidrógeno en presencia de ABTS para producir el catión
radical, en presencia o ausencia de antioxidantes. Esto ha sido criticado sobre la base de que los
antioxidantes de reacción más rápida también podrían contribuir a la reducción del radical de
ferroglobina mioglobina. Un formato más apropiado para el ensayo es una técnica de
decoloración en la que el radical se genera directamente en una forma estable antes de la
reacción con los antioxidantes putativos. La técnica mejorada para la generación de ABTS • 1
descrita aquí implica la producción directa del cromóforo ABTS • 1 azul / verde a través de la
reacción entre ABTS y persulfato de potasio. Esto tiene máximos de absorción en las longitudes
de onda de 645 nm, 734 nm y 815 nm, como se informó anteriormente [1,13,17], así como el
máximo más comúnmente utilizado a 415 nm. La adición de antioxidantes al catión radical
preformado lo reduce en un grado y en una escala de tiempo dependiendo de la actividad
antioxidante, la concentración del antioxidante y la duración de la reacción. Por lo tanto, el grado
de decoloración como porcentaje de inhibición del catión radical ABTS • 1 se determina en
función de la concentración y el tiempo y se calcula en relación con la reactividad de Trolox como
estándar, en las mismas condiciones. El método es aplicable al estudio de antioxidantes solubles
en agua y solubles en lípidos, compuestos puros y extractos de alimentos.

MATERIALES AND METODOS

Trolox (Hoffman-La Roche) (ácido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrameticroman-2-carboxílico; Aldrich

Chemical Co., Gillingham, Dorset, Reino Unido) se usó como estándar antioxidante. Trolox (2,5
mM) se preparó en etanol o solución salina tamponada con fosfato 5 mM, pH 7,4 (PBS), para
uso como estándar estándar, como se describió anteriormente [1]. Se prepararon nuevos
estándares de trabajo diariamente en dilución con etanol. Se obtuvieron ABTS, 2,29-azinobis (3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfónico) sal de diamonio, y persulfato de potasio (peroxdisulfato de
potasio) de Sigma-Aldrich (Poole, Dorset, Reino Unido) y etanol de calidad HPLC de Rathburn
Chemicals Ltd (Walkerburn, Peebleshire, Escocia). Se obtuvieron hidroxicinamatos,
antocianidinas y flavonoides de Extrasynthese (Lyon-Nord, Francia), carotenoides, b-caroteno y
licopeno, de AOCS (Bitterne, Hampshire), y ácido ascórbico y a-tocoferol de Sigma-Aldrich (95%
de pureza) . Las soluciones madre de los carotenoides se prepararon en diclorometano y las
concentraciones se confirmaron utilizando el coeficiente de extinción. Las soluciones madre de
flavonoides e hidroxicinamatos se prepararon por disolución en etanol y posteriormente se
diluyeron en etanol para su introducción en el sistema de ensayo en concentraciones dentro del
rango de actividad del ensayo (concentración final de 1,5 mM a 15 mM). Las antocianidinas se
diluyeron en etanol ácido a pH 1.3 a una concentración de 0.5 mM. El ácido ascórbico y el ácido
úrico se prepararon como soluciones madre en agua de 18 MV a una concentración de 5 mM y
a-tocoferol en etanol a 2 mM. Ninguno de los disolventes interfiere en el ensayo. La actividad
antioxidante se evaluó como se describe a continuación. Los experimentos se realizaron en el
espectrofotómetro HewlettPackard modelo HP 8453 (Cheadle Heath, Stockport Cheshire, Reino
Unido) equipado con control de temperatura Peltier.

El ABTS se disolvió en agua hasta una concentración de 7 mM. El catión radical ABTS (ABTS • 1)
se produjo haciendo reaccionar la solución madre de ABTS con persulfato de potasio 2,45 mM
(concentración final) y permitiendo que la mezcla permaneciera en la oscuridad a temperatura
ambiente durante 12–16 h antes de su uso (Fig. 1). Debido a que ABTS y el persulfato de potasio
reaccionan estequiométricamente en una proporción de 1: 0.5, esto resultará en una oxidación
incompleta del ABTS. La oxidación del ABTS comenzó inmediatamente, pero la absorbancia no
fue máxima y estable hasta que pasaron más de 6 h. El radical fue estable en esta forma durante
más de dos días cuando se almacenó en la oscuridad a temperatura ambiente. Para el estudio
de compuestos fenólicos y extractos alimentarios, la solución ABTS • 1 se diluyó con etanol y
para plasma antioxidantes con PBS, pH 7,4, hasta una absorbancia de 0,70 (60,02) a 734 nm y se
equilibró a 30 ° C. Las soluciones madre de fenólicos en etanol, carotenoides en diclorometano
y plasma antioxidantes en agua se diluyeron de tal manera que, después de la introducción de
una alícuota de 10 ml de cada dilución en el ensayo, produjeron entre 20% y 80% de inhibición
de la absorbancia en blanco. Después de la adición de 1.0 ml de solución de ABTS • 1 diluida
(A734nm 5 0.700 6 0.020) a 10 ml de compuestos antioxidantes o estándares de Trolox
(concentración final 0-15 mM) en etanol o PBS, la lectura de absorbancia se tomó a 30 ° C
exactamente 1 min después de la mezcla inicial y hasta 6 min. En cada ensayo se ejecutaron
blancos de disolvente apropiados. Todas las determinaciones se llevaron a cabo al menos tres
veces, y por triplicado, en cada ocasión y en cada concentración por separado del estándar y las
muestras. El porcentaje de inhibición de la absorbancia a 734 nm se calcula y grafica en función
de la concentración de antioxidantes y de Trolox para los datos de referencia estándar. La curva
de concentración-respuesta para 5 estándares de Trolox preparados de forma secuencial y por
separado se ilustra en la Fig. 2

Las diluciones de la solución ABTS • 1, preparada como se describió anteriormente, se diluyeron

más en etanol y en agua ultra pura para obtener valores de absorbancia de entre 0.12 a 0.9 a
415 nm (una dilución de entre 1/50 y 1/400). La relación entre la absorbancia a 415 nm y la
absorbancia a 734 nm se calculó a 5 diluciones diferentes. A partir de esta relación y del
coeficiente de extinción molar de ABTS • 1 a 415 nm (e 5 3.6 3 104 mol21 l cm21) informado por
Forni et al. [22], el coeficiente de extinción de ABTS • 1 a 734 se ha calculado en agua como 1,5
3 104 mol21 l cm21 6 549 (media 6 DE, n 5 9) y en etanol como 1,6 3 104 mol21 l cm21 6 606
(media 6 SD, n 5 8). En las condiciones utilizadas aquí para la preparación del ABTS • 1,
aproximadamente el 60% del ABTS presente se oxidó a la forma de catión radical.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El método descrito proporciona una medida de la actividad antioxidante de la gama de

carotenoides, fenólicos y algunos antioxidantes plasmáticos, determinada por la decoloración
del ABTS • 1, a través de la medición de la reducción del radical catión como el porcentaje de
inhibición de la absorbancia a 734 nm . La Figura 3 ilustra los efectos de la duración de la
interacción de antioxidantes específicos en la supresión de la absorbancia del catión radical ABTS
• 1 a 734 nm para Trolox, el compuesto de referencia estándar, comparado con glutatión, ácido
úrico, ácido ascórbico, a-tocoferol. y los flavonoides aglicona, antioxidantes, kaempferol y
cianidina. Los resultados demuestran que la reacción con ABTS • 1 se completa en 1 minuto, a
excepción de la cianidina y el glutatión que muestran un pequeño efecto inhibitorio pequeño
hasta 4 minutos de reacción. El grado de inhibición de la absorbancia del ABTS • 1 se grafica
como una función de la concentración para determinar el TEAC, que puede evaluarse como una
función del tiempo. La curva de dosis-respuesta obtenida mediante el análisis de un rango de
concentraciones de compuestos antioxidantes, estándares de Trolox y extractos de alimentos
seleccionados, en puntos de tiempo seleccionados en la reacción, 1, 4 y 6 min, en algunos casos,
se graficó como el porcentaje de inhibición de la absorbancia de la solución ABTS • 1 en función
de la concentración de antioxidante (Fig. 4). La concentración de antioxidante que proporciona
el mismo porcentaje de inhibición de la absorbancia del catión radical a 734 nm como Trolox 1
mM se calculó en términos de la actividad antioxidante equivalente de Trolox en cada punto de
tiempo específico. Para calcular el TEAC, el gradiente de la gráfica del porcentaje de inhibición
de la absorbancia frente a la gráfica de concentración para el antioxidante en cuestión se divide
por la pendiente de la gráfica de Trolox. Esto le da al TEAC en el momento específico y los
resultados calculados para los flavonoides, carotenoides, algunos antioxidantes plasmáticos y
una muestra representativa de frutas y bebidas se dan en la Tabla 1. La actividad antioxidante
también se puede expresar en términos de la contribución total a la actividad antioxidante en el
intervalo de tiempo estudiado calculando el área bajo la curva, derivado de trazar el gradiente
de los gráficos de porcentaje de inhibición / concentración como una función del tiempo de
reacción. La relación entre el área bajo la curva para la reacción del antioxidante específico y la
de Trolox da la actividad antioxidante relativa (AUC), como en la Fig. 5. La comparación entre la
actividad antioxidante determinada a partir del AUC y los valores TEAC derivados a partir del
ensayo de decoloración, los puntos de tiempo individuales de 1, 4 y 6 minutos se tabulan en
relación con el valor TEAC original obtenido del ensayo de ferril mioglobina / TEAC. Todos los
compuestos fenólicos seleccionados (excepto la delfindina) muestran valores TEAC más bajos
con el ensayo de decoloración en los puntos de tiempo individuales de la reacción de 1 y 4 min
que los obtenidos con el ensayo original de mioglobina / ABTS a los 6 min. A los 6 min, los valores
están cerca, excepto la quercetina y la cianidina, entre los flavonoides más reductores [23], para
los cuales los valores no alcanzan los niveles como en el sistema de análisis de mioglobina /
ABTS. Es probable que esto se tenga en cuenta por la posibilidad de que se produjo alguna
interacción en el ensayo previo de los polifenoles con ferril mioglobina, antes de la reacción de
este último con ABTS, y la naturaleza compleja del procedimiento del ensayo de ferril mioglobina
en que la formación de el catión radical y su inhibición ocurrían en el mismo marco de tiempo.
Strube et al. [24] propusieron previamente esta explicación para los valores más altos obtenidos
para la quercetina en el ensayo de mioglobina de ferril / ABTS. Cabe señalar que la quercetina
tiene un potencial de oxidación a la mitad más bajo que la luteolina, que a su vez es menor que
el kaempferol, debido a la importancia de la estructura del catecol en el anillo B, así como al
grupo 3-hidroxilo reductor en el anillo C insaturado adyacente a un grupo carbonilo [23].
Los resultados demuestran la dependencia temporal de la reacción y la influencia del punto de
tiempo seleccionado de medición en la actividad antioxidante informada; por lo tanto, los
determinantes de la actividad antioxidante son el grado de reducción y la tasa de reducción del
radical. Por ejemplo, mientras que el ácido cafeico y el kaempferol demuestran el menor grado
de inhibición que el ácido ferúlico y la luteolina, respectivamente, las reacciones del primero son
esencialmente completas después de 1 minuto de reacción. Los flavonoides variaron en el
intervalo de tiempo durante el cual tuvo lugar la reacción (Fig. 5). Mientras que la mayoría de
los fenólicos habían completado la reacción a los 4 minutos, algunos compuestos, especialmente
la luteolina y la naringenina, todavía reaccionaban. Expresar los resultados como área bajo la
curva puede tomar en cuenta estos factores. La mejora principal en el ensayo de compuestos
lipófilos como los carotenoides es la mejora del diseño que incorpora el catión radical y el
antioxidante en la fase lipófila. La reacción entre los carotenoides y ABTS • 1 se completa
esencialmente después de 1 minuto, una pequeña reacción posterior tendrá lugar
posteriormente. La actividad antioxidante del licopeno fue del mismo orden que la obtenida con
la metodología previa que produjo el catión radical utilizando dióxido de manganeso como
oxidante [20]. El valor para b-caroteno fue significativamente mayor. Este método mejora el
ensayo también sobre la base de que la aplicación de dióxido de manganeso como agente
oxidante puede involucrar la química molecular con el potencial de producir una oxidación de
dos electrones de ABTS a la dicación radical, que limita su definición y aplicabilidad. Las
actividades antioxidantes de los antioxidantes plasmáticos, ácido ascórbico, a-tocoferol y ácido
úrico, así como la de glutatión, se muestran en la Tabla 1. Los valores de TEAC obtenidos son
cercanos a los obtenidos por el ensayo de mioglobina / ABTS [1,13 ], siendo los dos últimos
ligeramente más altos. Hay diferencias entre los valores de TEAC para los flavonoides y los
hidroxicinamatos a 1 minuto, 4 minutos y 6 minutos por el ensayo de decoloración ABTS • 1
comparado con el ensayo de mioglobina / ABTS monitoreado a los 6 minutos. El último ensayo
involucró la formación continua del catión radical ABTS a partir de mioglobina ferril, derivado de
metamioglobina y el peróxido de hidrógeno en presencia de los reductores. Los estudios
preliminares de cinética rápida (datos no mostrados) indican una reacción bifásica con una fase
inicial muy rápida, presumiblemente indicativa de los grupos más reductores seguidos de una
fase más lenta. El método AUC es una forma alternativa de describir la actividad antioxidante de
los compuestos cuando se tienen en cuenta las variadas tasas de reacción de los antioxidantes
con ABTS • 1. El cálculo del AUC se deriva tanto de la concentración de antioxidantes como del
tiempo de reacción y, por lo tanto, es una medida general de las capacidades de los compuestos
para eliminar los radicales libres en comparación con el Trolox estándar durante el rango de
tiempo específico, teniendo en cuenta la variación en el valor con el tiempo. Los valores TEAC
se obtienen de la capacidad de un antioxidante individual o una mezcla para inhibir el ABTS • 1
en un punto de tiempo definido, en relación con Trolox. Como un análisis de las actividades
antioxidantes relativas de compuestos puros o extractos de alimentos, la actividad antioxidante
referida a la medición en el momento de 4 min parece ser apropiada.