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costo de producción industrial bajo del factor de coagulación IX bioencapsulado en células de lechuga para la
inducción de la tolerancia oral en la hemofilia B

Artículo    en    · Biomateriales de agosto de 2015

DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2015.08.004 · Fuente: PubMed

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10 autores , incluso:

Alexandra Sherman Shina Lin

Universidad de Florida
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Joey Norikane Roland W Herzog

Fraunhofer EE.UU. Centro de Biotecnología Molecular (FhCMB) Universidad de Florida

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costo de producción industrial bajo del factor de coagulación IX bioencapsulado en células de

lechuga para la inducción de la tolerancia oral en la hemofilia B

Jin Su una , 1 , Liqing Zhu si , 1 , 2 , Alexandra Sherman si , Wang Xiaomei si , Shina Lin una ,
Aditya Kamesh una , Joey H. Norikane C , Stephen J. Streat fi vejez C , Roland W. Herzog si , ** ,
Henry Daniell una , *
una Departamento de Bioquímica, Escuela de Medicina Dental de la Universidad de Pensilvania, Filadelfia, PA, EE.UU.
si Departamento de Pediatría de la Facultad de Medicina de la Universidad de Florida, Gainesville, FL, EE.UU.

C Fraunhofer EE.UU., Centro de Biotecnología Molecular, Newark, DE, EE.UU.

información del artículo resumen

Historia del artículo: Los anticuerpos (inhibidores) desarrollados por los pacientes con hemofilia B contra el factor de coagulación IX (FIX) son difíciles de eliminar
Recibido el 22 de junio de 2 015 debido a la anafilaxia o síndrome nefrótico después de la infusión continua. Para hacer frente a esta necesidad médica no cubierta urgente, FIX
recibida en forma revisada 01 de
fusionado con un portador transmucosa (CTB) se produce en una lechuga comercial (Simpson Elite) cultivar utilizando especies específicas fi vectores
agosto 2015
c cloroplasto regulado por endógena psbA secuencias. CTB-FIX (~ 1 mg / g) en células liofilizadas era estable con un plegamiento apropiado,
Aceptaron 4 de agosto de el año 2015 Disponible línea de
disulfuro fi de bonos y montaje pentámero cuando almacenan ~ 2 años a temperatura ambiente. La alimentación de las células de lechuga a
5 de agosto de el año 2015
ratones hemofilia B entregado, CTB-FIX ef fi cientemente al sistema inmunitario intestinal, LAP inducida þ células T reguladoras y formación / IgE
inhibidor suprimido y anafilaxis contra FIX. células liofilizadas habilitadas estudios de escalado de dosis de 10 veces y la inducción exitosa de la
palabras clave:
tolerancia oral se observó en todas las dosis probadas. La inducción de la tolerancia en un rango de dosis tan amplio debería permitir la
cGMP producción cloroplasto de
la planta Hemofilia Lechuga administración oral a pacientes de diferentes grupos de edad y diversa antecedentes genéticos. Usando el sistema hidropónico Fraunhofer cGMP,
~ 870 kg frescas o 43,5 kg de peso en seco se pueden cosechar por 1000 ft 2 por año produciendo 24.000 mi 36.000 dosis para pacientes
pediátricos de 20 kg, lo que permite fi desarrollo comercial del primer fármaco oral, dirigiéndose puri prohibitivamente caro fi catiónico,
pharming Molecular almacenamiento en frío / transporte y vida útil corta de fármacos de proteínas actuales.
tolerancia oral

© 2015 los autores. Publicado por Elsevier Ltd Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).

1. Introducción supera el PIB de> 75% de los países de todo el mundo, haciéndolos inaccesibles en estos países [1] .
Un tercio de la población mundial de ingresos <$ 2 por día no puede permitirse ningún fármaco
Biofarmacéuticos producidos en los sistemas actuales son prohibitivamente caros y no están al proteico. Aunque la insulina recombinante se vende comercialmente para fi cinco décadas, todavía no
alcance de la gran mayoría de la población mundial. El coste de los fármacos de proteínas (140 $ mil es asequible para una gran mayoría de la población mundial. Esto es debido a su producción en
millones en 2013) fermentadores prohibitivamente caros, Puri fi catiónico, almacenamiento en frío / transporte, la vida útil
corta y métodos de entrega estériles.

* Autor correspondiente. Traslacional Investigación de la Universidad de Pennsylvania, 240 Sur Calle 40, Edificio
La producción de proteínas biofarmacéuticas en plantas ofrece una solución rentable. La
547 Levy, Philadelphia, PA 19104 hasta 6030, EE.UU..
administración oral de fármacos de proteínas bioencapsulado en células de plantas signi fi cativamente
** Autor correspondiente. Universidad de Florida, Cáncer y Genética del Centro de Investigación de 2033 Mowry
Road, CGRC, Sala 203, Gainesville, FL 32610, EE.UU.. reduce los costes de procesamiento aguas abajo mediante la eliminación de puri caro fi cación,
Correos electrónicos: @ u rherzog fl. edu (RW Herzog), hdaniell@upenn.edu almacenamiento / transporte en frío, y la vida útil corta [2 mi 4] . Las células vegetales que expresan
(H. Daniell).
proteínas terapéuticas pueden ser económicamente procesados ​por liofilización y se almacenaron a
1 Jin Su y Liqing Zhu contribuyeron igualmente a este estudio.

2 Dirección actual: En primer lugar Af fi El Hospital de la Universidad Médica liated Wenzhou, Wenzhou, China. temperatura ambiente durante varios meses o años

http://dx.doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.08.004
0142-9612 / © 2015 los autores. Publicado por Elsevier Ltd Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND licencia ( http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ ).
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sin afectar su ef terapéutico fi cacia [4,5] . Las plantas también pueden ser cultivadas en el fi ELD con la
contención biológica apropiada de genes extraños, tales como la herencia materna o la esterilidad
masculina y / o la cosecha de tejidos vegetativos antes Florida la floración [6] .
La administración oral de fármacos de proteínas ha sido difícil de alcanzar durante décadas
debido a su degradación en el sistema digestivo, la imposibilidad de cruzar el epitelio intestinal y la
entrega a las células diana. Sin embargo, varios estudios recientes han demostrado de manera
inequívoca que la pared celular vegetal protege fármacos de proteínas expresadas a partir de ácidos
y enzimas en el estómago a través de bio-encapsulación [2 mi 4] . enzimas digestivos humanos son
incapaces de romper los enlaces glucosídicos en hidratos de carbono que constituyen la pared
celular vegetal. Sin embargo, cuando las células vegetales intactas que contienen fármacos de
proteínas alcanzan el intestino, los microbios comensales digieren la pared celular vegetal y liberan
fármacos de proteínas en el lumen del intestino. Las bacterias que habitan en el intestino humano
han evolucionado para utilizar carbohidratos complejos en la pared celular vegetal y son capaces de
utilizar casi todos los glicanos de plantas [7,8] . La fusión de la (no tóxica) toxina del cólera subunidad
B (CTB) a una proteína reportera (GFP) expresada en cloroplastos y bioencapsulado en células de
plantas fue entregado por vía oral a través del epitelio intestinal a través de receptores GM1 y sitio de
escisión de furina ingeniería entre CTB-GFP GFP liberada en circulación o diferentes tejidos [9] .
Fusión de CTB a proteínas terapéuticas facilitar su administración oral eficaz para la inducción de la
tolerancia oral [10 mi 13] o entregar proteínas funcionales a sueros [5,14,15] o al otro lado de sangre
del cerebro o las barreras de la retina
[15,16] .
La hemofilia es un trastorno de sangrado ligado al cromosoma X causado por mutaciones en el
factor de coagulación VIII (FVIII, la hemofilia A) o factor IX (FIX, hemofilia B). pacientes con hemofilia
se tratan actualmente por la terapia de reemplazo con concentrado de factor recombinante o
derivado de plasma. Sin embargo, 20 mi 30% de los pacientes con hemofilia A grave (como de fi definido
por <actividad de coagulación 1%) y ~ 5% de los pacientes con hemofilia B grave desarrollan
anticuerpos inhibidores (o
“ inhibidores “), que complican seriamente el tratamiento y aumentar la morbilidad y mortalidad de la
enfermedad [17 mi 19] . Por lo tanto, se requiere la inducción de tolerancia inmune para eliminar estos
inhibidores para restaurar la eficacia de la terapia de reemplazo de factor. protocolos clínicos
actuales para la reversión de la respuesta de anticuerpos a través de la inducción de tolerancia
inmunológica (ITI) requieren la administración del factor de altas dosis frecuentes durante períodos
prolongados (de meses a más de 1 año), y los costos son extremadamente altas (a menudo superior
a un millón de dólares) [18] . Entre los pacientes con hemofilia B, los que tienen F9 deleciones de
genes están en un riesgo elevado de formación de inhibidores. A menudo, los protocolos de ITI para
los inhibidores de FIX no se puede completar debido a las reacciones o desarrollo del síndrome
nefrótico anafilácticas [20] . Actualmente no hay protocolos ITI profilácticos para prevenir la formación
de inhibidores. un protocolo de este tipo debería evitar idealmente fármacos supresores inmunes
porque los inhibidores tienden a formar a una edad muy joven (durante la fi primeros 50 días de
exposición) [18] . Para hacer frente a esta necesidad médica no satisfecha, estamos desarrollando un
protocolo de tolerancia oral usando factores de coagulación expresadas en células de plantas [11 mi 13,21]
. El análisis por inmunotransferencia y cuantificación de la fusión CTB-FIX proteinwere realizadas
En este estudio, hemos creado plantas FIX-transplastómica en un sistema ideal comestible para
la entrega oral. Producción de fármacos de proteínas en los cloroplastos ofrece varias ventajas
únicas, incluyendo expresión de alto nivel (hasta 70% de proteína de la hoja total) [22] , La contención
de transgenes de transmisión polen a través de la herencia materna de los transgenes y la falta de
efecto de silenciamiento génico / posición debido a especí sitio fi la integración de los transgenes c [23]
. Aunque suprimimos formación de inhibidores y anafilaxis contra FIX humano en ratones con
hemofilia B usando células de tabaco [11,13] el desarrollo clínico no era factible. Presentamos aquí la fi
rst éxito del desarrollo y la producción a gran escala de CTB-FIX en una instalación de cGMP en una
planta comestible cultivo (lechuga) y la evaluación de ef terapéutico fi cacia en una amplia gama de
dosis y producto estabilidad.
85
2. Materiales y métodos
2.1. Construcción de lechuga vector de transformación de cloroplastos
Para construir el CTB-FIX vector de expresión lechuga cloroplasto, la PCR se fi primera realizada
para amplificar el gen de fusión CTB-FIX con el conjunto de cebadores NdeI-CTB-Fw (5 0 TTCAT ATG ACACCTCA
3 0, los nucleótidos subrayados representan el codón de inicio de la etiqueta de fusión CTB) y
XbaI-FIX-Rv (5 0 GATCTAGA TTA AGTGAGCTTTG TTTTTTCCT 3 0, los nucleótidos subrayados
indican el codón de parada de FIX) de un plásmido plantilla PLD CTBFFIX [11] . Los productos de
PCR CTB-FIX fueron clonados en pCR-Blunt II-TOPO vector (Life Technologies Co., Carlsbad, CA).
después de verificación fi-
cación de secuencia de nucleótidos, el fragmento NdeI-CTB-FIX-XbaI se subclonó en un NdeI-XbaI
digerido vector intermedio PDVI-1 portadoras de una lechuga psbA promotor-5 0 UTR y lechuga psbA
3 0 UTR. El casete de expresión CTB-FIX incluyendo la lechuga psbA
promotor-5 0 UTR / CTB-FIX / lechuga psbA 3 0 UTR se obtuvo por digestión SalINotI y después se
clonó en SalINotI digerido pLS-LF vector
[10] para crear la CTB-FIX expresión cloroplasto lechuga vector pLS-CTB-FIX ( Figura 1 UNA).
2.2. Transformación y caracterización de líneas transplastómicas de lechuga
Lechuga ( Lactuca sativa) CV. hojas Simpson Elite fueron bom-
barda con el vector de expresión CTB-FIX y los transformantes de cloroplastos fueron seleccionados
sobre espectinomicina como se describió previamente [24] . Con el fin de identificar el sitio específico fi
integración c del transgén CTB-FIX en el genoma del cloroplasto y para verificar las plantas
homoplásmicas, análisis de PCR y ensayos de transferencia Southern se realizó de acuerdo con los
informes anteriores de nuestro laboratorio
[24,25] .
2.3. La liofilización de la CTB-FIX hojas transplastómicas
hojas de lechuga congelados que expresan proteínas de fusión CTB-FIX se secaron por
congelación en un liofilizador (Génesis 35XL, SP Scientific fi c, Stone Ridge, NY) a 40 C, 30 C, 20 C,
15 C, 10 C, 5 C y 25 C durante un total de 72 h bajo vacío 400 mTorr. Las hojas liofilizadas se
molieron en un molinillo de café (Hamilton Beach, Southern Pines, NC) a velocidad máxima durante 3
veces (cada vez, pulso en 6 s y fuera de 90 s). los fi polvo ne u hojas liofilizadas se almacenaron
inmoisture recipientes libres a temperatura ambiente con geles de sílice de hasta 2 años.
2.4. Análisis de la expresión CTB-FIX en hojas de lechuga transplastómicas
por protocolos previamente reportados [5,24] . Con el fin de analizar la estructura pentamérica de
proteína de fusión CTB-FIX se expresa en los cloroplastos de lechuga transformadas, ELISA y no
reductor ensayos de transferencia de gel de Western se realizaron como se informó anteriormente de
unión al receptor GM1ganglioside [5] .
2.5. Hemofilia experimentos B de ratón
ratones Hemofilia B con F9 la deleción del gen en C3H / HeJ fondo (C3H / HeJ F9 / ) Fueron
criados según lo publicado previamente
[11,26,27] . Los ratones macho de aproximadamente 2 meses de edad fueron utilizados en el inicio de
los experimentos y se alojaron en condiciones libres de patógenos especiales en la Universidad de
Florida bajo protocolos aprobados institucionalmente. células vegetales liofilizados se rehidrataron en
PBS estéril a una fi volumen final de 200 metro l por dosis por sonda (que contiene
1.5 mi 15 metro g de antígeno CTB-FIX) y brie Florida y agitó con vórtex durante 3-4 segundos. La administración oral se llevó
a cabo dos veces por semana durante 8 semanas por sonda nasogástrica
86 J. Su et al. / Biomateriales 70 (2015) 84 mi 93

Figura 1. CTB-FIX vector de expresión lechuga cloroplasto y evaluación de sitio especí fi integración c en el genoma de la lechuga cloroplasto. (A) Diagrama esquemático de CTB-FIX expresión lechuga vector PLS-CTB-FIX. genoma del cloroplasto
homóloga Florida secuencias Anking incluyen 16S (16S rRNA), isoleucina ARNt ( trnI), alanina tRNA ( ARNt) genes. Un glicina mi prolina mi glicina mi bisagra prolina y sitio de escisión de furina (RRKR) se insertan entre CTB y la secuencia de FIX. La
expresión CTB-FIX está regulada por la lechuga psbA promotor-5 0 UTR (PpsbA) y 3 0 UTR (TpsbA). El gen marcador de selección aadA ( codificación aminoglucósido 3 0- gen adeniltransferasa para conferir resistencia a la espectinomicina) es impulsado
por un promotor del operón de ARN ribosómico (Prrn) con sitio de unión a ribosoma GGAG. (B) análisis PCR de las líneas transplastómicas CTB-FIX. Los sitios de hibridación de cebador (16S-Fw / 3M, 5P / 2M y CTB-Fw / FIXRv1) para el análisis de
PCR de las líneas de control y transplastómicas se muestran en la Fig. 1A. L1, L2 y L3 representan tres líneas transplastómicas independientes. (C) Evaluación de la homoplasmia en líneas CTBFIX-transplastómicas. El ADN total lechuga se digirió
con HindIII y se sondeó con 32 P-etiquetados 1,12 kb trnI / trnA Florida Anking fragmento de la región. línea no transformada genera un fragmento de hibridación de 9,1 kb mientras que las líneas transplastómicas generan 12,6 kb fragmento debido a
especí sitio fi c integración del casete del transgén.

usando una aguja de sonda gástrica con punta de bulbo 20-G. Para la terapia de reemplazo de FIX,
los ratones se les administró 1 IU hFIX (Bene fi x, P fi Pfizer, Nueva York, Nueva York) en la vena de la
cola una vez por semana durante 8 semanas. Se recogió la sangre por sangrado de la cola en
tampón citrato. Para evitar la anafilaxia fatal en los animales de control (que no recibió la tolerancia
oral), anti-histamina y el factor activante anti-plaquetas (anti-PAF) se administraron a partir de la
cuarta inyección [11,13] . La formación de anticuerpos contra FIX en plasma murino se midió por el
ensayo de Bethesda (usando una fi brometer de Stago, Pasippany, NJ) y por inmunoglobulina especí fi c
ELISA tal como se publicó [11,13] . secciones de tejido congeladas de intestino delgado se
prepararon para inmunohistoquímica y se tiñeron para antígenos FIX y CD11c como documentado
anteriormente [13] .
sistema consistía en dos unidades de estantería del alambre. En cada estante había cuatro zonas de
cultivo que fueron iluminadas con tres iluminación sellado fi xtures que contienen 2-T8 Florida bombillas
fluorescentes. Dos bandejas de crecimiento que contiene lana de roca sustrato hortícola (Grodan,
Países Bajos) se colocaron en cada estante. El nutriente comprendía una proporción 20-10-20 de
nitrógeno, fósforo y potasio.
semillas CTB-FIX fueron colocados en la superficie de lana de roca a 2 pulgadas
2 espaciamiento pulgadas. Las plantas recibieron un promedio de
70 mi 90 metro mol m 2 s 1 de la luz en un 18 h fotoperíodo. La temperatura y la humedad en la sala de
crecimiento osciló from23 a 26 C y 20 mi 60%, respectivamente. Este sistema de crecimiento de
plantas hidropónico es un arreglo de pequeña escala que se puede escalar a cGMP producción a
escala piloto [28] . Para una comparación de las tasas de germinación y la acumulación de biomasa,
plantas CTB-FIX se cultivaron junto con el cultivar comercial Simpson Elite.

2.6. A mayor escala de producción hidropónica de cGMP de la biomasa CTB-FIX

Se ensambló un sistema hidropónico susceptible de desarrollo en un sistema de producción a

escala piloto cGMP. el hidropónica
 J. Su et al. / Biomateriales 70 (2015) 84 mi 93 87

3. resultados

3.1. Lechuga CTB-FIX vector de expresión cloroplasto

Nuestro objetivo es crear una planta de cultivo de hoja comestible (lechuga) capaz de producir
niveles adecuados de antígeno de FIX en los cloroplastos para facilitar los estudios clínicos
traslacionales. Con el fin de mejorar la transformación ef fi ciencia, las especies de lechuga especí fi vector
c cloroplasto se construyó usando longitud completa endógeno (~ 2 kb / Florida ANK) Florida Anking
secuencias. Del mismo modo, se utilizó la lechuga psbA promotor, 5 0 UTR y 3 0

UTR para aumentar la expresión del transgen. Estos conceptos fueron la base para el diseño y la
construcción del vector de expresión PLS-CTB-FIX ( Figura 1 UNA). Para la expresión del antígeno de
FIX, una versión truncada N-termial (47a mi 461 S t aminoácidos) de cADN de FIX humano
(FR846240.1) excluyendo el péptido señal (primera mi 28a) y el propéptido (29a mi 46a) se utilizó
para generar el vector de expresión CTB-FIX. El vector contenía el gen marcador de selección
espectinomicina aadA que podrían eliminarse por repeticiones directas (ver sección de discusión).
Además, una glicina mi prolina mi glicina mi prolina (GPGP) de bisagra para evitar el impedimento
estérico se ha creado entre CTB y elementos de fusión FIX. Un sitio de escisión de furina (RRKR)
también fue incluido en este vector de expresión CTB-FIX [11] . Si bien esta construcción carece de la
propéptido FIX (que se requiere para sol-

carboxilación) y por lo tanto no puede producir FIX funcional, se incluye toda la secuencia de
aminoácidos de FIX madura, cubriendo toda CD4 potencial þ células T epítopos para la inducción de
tolerancia.

3.2. Caracterización de CTB-FIX líneas transplastómicas de lechuga

CTB-FIX líneas de lechuga transplastómicas fueron creados por bombardeo de partículas

biolístico de hojas de lechuga de un cultivar comercial (Simpson Elite) con el vector de expresión
pLS-CTB-FIX. resultados de PCR mostraron los tamaños correctos de amplicones, 2,77 cebador
kbwith establece 16SFw / 3M, 3,60 kb con 5P / 2M y 1,34 kb con CTB-Fw / FIX-RV1 ( Figura 1 A y B).
El sitio especí fi integración c de la CTB-FIX gen en el genoma del cloroplasto era aún más con fi confirmada
por análisis de transferencia Southern sondada con la lechuga trnI y trnA Florida Anking secuencia.
Las tres líneas transplastómicas independientes mostraron fragmentos de hibridación distintas en
transferencias de Southern con el tamaño esperado de 12,6 kb, pero no las plantas de 9,1 kb de tipo
fragmento fromuntransformedwild ( Figura 1 A, C), con fi confirmando que las tres líneas
transplastómicas CTB-FIX fueron homoplasmic (en la que todos genoma del cloroplasto se han Figura 2. Evaluación de la expresión de CTB-FIX en las líneas transplastómicas lechuga. (A) Análisis de transferencia

transformado con la inserción del casete del transgén).
3.3. , La estabilidad y CTB-FIX montaje pentámero plegable en hojas de lechuga liofilizadas
Western de CTB-FIX en tres líneas independientes y controles WT. proteínas de las hojas total de la planta (5 metro g / carril)
se cargaron fromWT y plantas CTB-FIX. CTB, 3 ng por carril. L1, L2, L3: 3 líneas de lechuga transplastómicas
independientes. WT, no transformada planta de tipo salvaje. Los títulos de anticuerpos: conejo anti-CTB policlonal de
anticuerpos 1: 10.000; de cabra anti-FIX anticuerpo policlonal de 1: 2000. (B) Cuantificación de la expresión de CTB-FIX en
diferentes etapas de desarrollo. La proteína total de la hoja (1.5 metro g por carril) se cargó a partir de hojas jóvenes, maduros
y viejos (plantas de 2,5 meses de edad cultivadas en el invernadero). Sonda: anticuerpo policlonal de conejo antiCTB (título 1:
10.000). gráfico de barras de la derecha muestra las concentraciones de CTB-FIX de las hojas jóvenes, maduros y viejos. Los
datos mostrados son medios ± SD de dos réplicas de las hojas recogidas de dos líneas independientes. (C) no reductor gel
análisis de transferencia Western. Probe, anti-CTB anticuerpo policlonal de conejo (título 1: 10.000). La concentración de
proteína cargada: CTB, 3 ng por carril; CTB-FIX extractos de hojas (L1, L2 y L3) y WT, 5 metro g (TLP) por carril.

Las proteínas totales de hojas se extrajeron con un tampón totalmente desnaturalizado y reducir
para analizar proteína CTB-FIX. Como se muestra en Figura 2 A, la proteína de fusión CTB-FIX
monómero con la masa molecular correcta de 59,2 kDa se detectó con anti-CTB o anticuerpo FIX.
Todas las líneas de lechuga transplastómicas que expresan CTB-FIX fueron semillas fértiles y
fijados. En plantas T1, los niveles de expresión CTB-FIX de las hojas jóvenes, maduros y viejos eran
0,63%, 0,58% y 0,48% de la proteína foliar total (TLP), respectivamente ( Figura 2 SI). La
concentración de CTB-FIX de las hojas maduras congelado fue de hasta 58,38 metro g por g de
hojas frescas. pentámero CTB-FIX (296,0 kDa) correctamente ensamblada en los cloroplastos de
lechuga transgénicas ( Figura 2 C). La ausencia de cualquier productos af escindido fi estabilidad rms
de pentámeros ensambladas en extractos de plantas.
después de la liofilización. Se observó la banda de monómero intacto de proteína de fusión CTBFIX
sin ninguna degradación detectable de CTBFIX en todas las muestras liofilizadas probados después
de almacenamiento durante 2, 6, 12 y 24 meses, a temperatura ambiente ( Fig. 3 B), con fi mediante
tonos que la proteína CTBFIX es estable en la lechuga liofilizado hojas de hasta 2 años. La
estabilidad de las concentraciones de proteína de fusión CTB-FIX fue similar en todas las muestras
analizadas cuando se normalizaron para la concentración de proteína total. concentraciones de
CTB-FIX fueron 0,59% TLP (to1478.54 equivalente metro g / gDW) después de 2 meses de
almacenamiento, 0,56% TLP (equivalente a

Congelados CTB-FIX lechuga hojas maduras se liofilizaron utilizando un liofilizador como se 1155.60 metro g / gDW) después de un almacenamiento de 6 meses, 0,54% TLP (equivalente a

describe en la sección de métodos. Fig. 3 A muestra una comparación directa de las concentraciones 846,43 metro g / gDW) después de 12 meses de almacenamiento y 0,57% TLP (equivalente a 927,02 metro g /

de proteína en muestras de hojas liofilizadas y congelados en peso (5 mi 200 metro g, 1 mi 40 dilución) gDW) después de un almacenamiento de 24 meses. Los resultados de la prueba t de estudiantes emparejados

y un aumento de 18 mi 21 de plegado de proteínas concentrationwas CTB-FIX observaron indicaron ausencia de cualquier significación fi diferencia no puede en% TLP de CTB-FIX entre muestras liofilizadas

almacenadas para diferentes

88 J. Su et al. / Biomateriales 70 (2015) 84 mi 93

Fig. 3. Evaluación de la concentración de CTB-FIX y la estabilidad después del almacenamiento a largo plazo de las hojas de lechuga liofilizados. (A) Comparación de CTBFIX concentración de proteína de lechuga CTBFIX liofilizado deja con las muestras de hojas
congeladas. 1X ̶ 40X indican veces de dilución. Uno de plegado (1X) es igual a 200 metro g (en peso) de polvo de tierra de la hoja. (B) Evaluación de la estabilidad de la proteína CTB-FIX en hojas de lechuga liofilizadas durante el almacenamiento a largo plazo a
temperatura ambiente. Dos manchas independientes por carga o bien 2,0 metro g o 1,5 metro se muestran g de TLP por carril. Sonda: anti-CTB anticuerpo policlonal de conejo (título, 1: 10.000). gráfico de barra de la derecha muestra las concentraciones de CTB-FIX de los
4 lotes de hojas liofilizadas después de diferentes períodos de almacenamiento (2, 6, 12 y 24 meses). Los datos mostrados son medios ± SD de tres experimentos independientes. (C) GM1 ensayo de unión. CTB: CTB proteína estándar (5 ng). Lyo-2M, Lyo-6M, Lyo-12M,
Lyo-24M: proteína soluble total (TSP, 100 metro g) a partir del liofilizado CTB-FIX expresando hojas después de almacenamiento durante 2, 6, 12 y 24 meses a temperatura ambiente. Lyo-WT, extracto de proteína (100 metro g, TSP) a partir de hojas de tipo salvaje
liofilizadas y no transformadas. BSA, albúmina de suero bovino (100 metro sol). Los datos mostrados son medios ± SD de dos experimentos independientes. (D) Análisis comparativo de concentraciones de proteína CTB-FIX en hojas de lechuga liofilizó a partir de Fraunhofer
(Fraun, sistema hidropónico) con muestras de hojas recogidas de la invernadero laboratorio Daniell en la Universidad de Pensilvania (Universidad de Pensilvania, los suelos en macetas). 1.5 metro g TLP por carril se cargó. Sonda: anti-CTB anticuerpo policlonal de conejo
(título, 1: 10.000). Panel izquierdo representa resultados de la cosecha primera hoja (edades de plantas: Fraunhofer, 32 días de edad; UPenn, 66-días de edad) y el panel derecho muestra los resultados de la cosecha segunda hoja (edades de plantas: Fraunhofer, 51-Days-
edad; UPenn, 86-daysold).

duraciones a temperatura ambiente.
Un receptor de membrana plasmática (gangliósido GM1) se une CTB
en vivo, y se requiere la formación de pentámero de CTB para unirse al receptor GM1 [29,30] . Para
promover la prueba si la estructura pentamérica con disulfuro fi de bonos se mantuvo en hojas de
lechuga liofilizadas, receptor gangliósido GM1 ELISA de unión se llevó a cabo usando las hojas
liofilizadas después de almacenamiento a largo plazo a temperatura ambiente. CTB-FIX extractos de
proteínas de fusión de todas las muestras analizadas mostraron una fuerte unión af fi nidad a GM1 ( Fig.
3 C), lo que demuestra la presencia y la estabilidad funcional de los pentámeros CTB-FIX en
liofilizado hojas, incluso después de almacenamiento a largo plazo (~ 2 años).
3.4. Escala de la biomasa y la CTB-FIX evaluación de dosis en cápsulas
sistema hidropónico, semillas de CTB-FIX se germinaron en lana de roca o en placas de Petri en fi papel
de filtro con la solución de nutrientes. La tasa de germinación de semillas de lechuga CTB-FIX en
lana de roca fue del 93% cuando se compara con 100% en placas de Petri en fi papel de filtro con la
solución de nutrientes. Después de 32 días de crecimiento, las plantas WT Simpson Elite produjeron
más hoja biomasa (236,72 g por Florida a) que las plantas de CTB-FIX (144,89 g por Florida a). Esta
diferencia en la acumulación de biomasa fue anticipado basa en la carga adicional de sintetizar
constitutivamente una proteína humana extranjera ( Fig. 4 UNA). La concentración de proteína
CTB-FIX en las hojas de lechuga liofilizadas recogidos del sistema hidropónico contenía 0,38% TLP
(equivalente a 1.007,55 metro g / gDW) que es inferior a 0,56% TLP (equivalente a 1.459,59 metro g
/ gDW) en liofilizado lechuga CTB-FIX hojas cosechadas del invernadero laboratorio Daniell en la
Universidad de Pensilvania ( Fig. 3 RE). Dos lotes de hojas de diferentes cosechas en Fraunhofer (32,
51 días de edad) y de efecto invernadero UPenn (66, 86 días de edad) eran muestras

plantas de lechuga CTB-FIX fueron trasplantadas en los suelos en macetas en el invernadero para

establecer semillas. Para la producción de CTB-FIX en una solución escalable

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Fig. 4. La producción industrial de FIX bioencapsulado en las células de lechuga. (A) la producción de biomasa de la lechuga CTB-FIX. plantas de lechuga CTB-FIX se hicieron crecer en suelos en macetas en el invernadero laboratorio Daniell en la Universidad
de Pennsylvania o en Fraunhofer sistema hidropónico cGMP (Upper 2 paneles). Los inferior 2 paneles muestran el estado de crecimiento de la lechuga CTB-FIX (cv. Simpson Elite, 24 días de edad) y de tipo salvaje (WT) lechuga (cv. Simpson Elite, 24 días de
edad). (B) preparación de la cápsula. Una producción a gran escala de la lechuga FIX-expresando se estableció en Fraunhofer EE.UU. (Newark, DE). Después de la cosecha y la liofilización (liofilizador: Génesis 35XL, SP Scientific fi c, Stone Ridge, NY) de las
hojas frescas, las hojas FIX liofilizados fueron pulverizados y se preparó en forma de cápsulas.

analizado. Basándose en el rendimiento actual de producción FIX-lechuga en el sistema hidropónico,
~ 870 kg de hojas de FIX-lechuga fresca (~ 43,5 kg de peso seco) se pueden cosechar por mil pies 2 del
sitio de crecimiento anual. Hasta 43,5 g de FIX pueden producirse a partir de 43,5 kg de hojas de
lechuga FIX-secos, produciendo 24.000 mi 36.000 dosis para pacientes pediátricos de 20 kg (basado
en la dosis más baja o más alta eficaz para la inducción de tolerancia oral). Después de la
liofilización, las hojas de lechuga FIX liofilizadas se molieron en fi polvo NE y se utiliza para preparar
cápsulas FIX-lechuga ( Fig. 4 SI).
3.5. La administración oral de las células de lechuga CTB-FIX suprime la formación de inhibidores
contra FIX en ratones con hemofilia B
En primer lugar, queríamos para con fi rm que la administración oral de CTB-FIX bioencapsulado en
los resultados de células de lechuga en la entrega del antígeno FIX al sistema inmunitario intestinal.
lechuga liofilizado (después de almacenamiento durante ocho meses a temperatura ambiente) células
de la planta (que contiene 10 metro g CTB-FIX) se resuspendieron en PBS estéril y se entrega a los
ratones con hemofilia B mediante alimentación por sonda oral. Cinco horas más tarde, se retiró el
intestino delgado. La tinción inmunohistoquímica de secciones criogénicas
estafa fi rmó la entrega del antígeno FIX para el epitelio intestinal y de las placas de Peyer ( Fig. 5 A),
con ef fi eficiencia similar a nuestras observaciones anteriores sobre FVIII y FIX entrega de células de
tabaco [11 mi 13] . La captación de antígeno FIX a células dendríticas (DC) se demostró mediante la
co-localización con CD11c þ células (DCs, Fig. 5 si mi RE). El suministro sistémico de antígeno FIX se
observó 2 y 5 h después de la alimentación forzada de las células de lechuga en niveles similares a
los obtenidos a partir de la alimentación de dosis de antígeno idénticos contenidos en las células de
tabaco ( Fig. 5 MI). A continuación, los ratones recibieron la hemofilia B gavages orales del material
lechuga dos veces por semana durante 2 meses ( Fig. 6 UNA). Un aumento de la dosis de diez veces
(1,5 metro g o 15 metro Se investigó g) de CTB-FIX (en 1,9 o 19 mg liofilizados células lechuga).
Los ratones control recibieron WT lechuga transformada. Durante el segundo mes de este régimen,
todos los ratones (n ¼ 11 para el control y la baja dosis, n ¼ 7 para alta dosis) eran adicionalmente iv inyectado
con FIX recombinante (1 UI) una vez por semana. Esta terapia de reemplazo se continuó durante 1
mes después de gavages orales habían detenido ( Fig. 6 UNA). Las muestras de sangre se
recogieron 1 semana después de la última inyección de FIX. título del inhibidor FIX fue robustamente
suprimida por la administración oral de CTB-FIX células que expresan lechuga para ambas dosis ( Fig.
6 SI). Los títulos promedio fueron 15 mi veces menor, y
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Fig. 5. FIX suministro de antígeno con el intestino delgado de los ratones con hemofilia B. (A) FIX (rojo) entregó al epitelio de
las vellosidades intestinales y para las placas de Peyer (PP). DAPI se utiliza para teñir los núcleos azules. (B) Los ejemplos de
co-localización (flechas) de antígeno FIX y CD11c þ
células, lo que indica la entrega de antígeno a DC en PP. (C) Los ejemplos de co-localización (flechas) de antígeno FIX y
CD11c þ células, lo que indica la entrega de antígeno a DC en vellosidades. Los ratones habían recibido gavages orales de
CTB-FIX que expresan la lechuga (pero sin iv REPARAR). (D) No mancha FIX se observó en ratones que recibieron una sonda
oral de WT lechuga (muestra), o en secciones intestinales de los ratones alimentados con CTB-FIX cuando se omitió el
anticuerpo primario contra FIX durante la tinción (no mostrado). Magni original fi cación para todos los paneles: 200 . (E) los
niveles de FIX humano sistémicos medidos por ELISA 2 y 5 h después de una sonda oral de 10 metro g CTB-FIX
bioencapsulado en células de lechuga o de tabaco. Los datos mostrados son la media ± SD (n ¼ 3 / grupo). Las diferencias
entre la lechuga y el tabaco no fueron signi fi peralte ( “ ns “). ( Para la interpretación de las referencias de color en este fi leyenda
figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).
10 de 11 ratones en la dosis baja y 5 de 7 ratones en el grupo de dosis alta tuvieron muy baja (<2
BU) para los títulos de inhibidores de indetectables. En contraste, los ratones de control forman
inhibidores de títulos altos (11/11> 5BU, con 9/11> 10 BU). IgG1 era la subclase dominante de IgG
producidos contra FIX. Los títulos de Promedio de IgG1 fueron suprimidos por 3 mi plegar, y mi en
contraste con los ratones de control mi no hay títulos se midieron> 20.000 ng / ml ( Fig. 6 C). debido
repetida iv entrega de FIX provoca no sólo la formación de inhibidores, sino también la anafilaxia fatal
en el C3H / HeJ F9 / cepa, los ratones de control se trataron adicionalmente con fármacos que evitan
reacciones anafilácticas. Los ratones que habían recibido la tolerancia oral usando alta o baja dosis
CTB-FIX en la lechuga, a pesar de no ser tratados con estos medicamentos, no se desarrolló
anafilaxia, en consonancia con la supresión de la formación de IgE ( Fig. 6 RE). Al final de estos
experimentos, se analizaron diferentes órganos para la inducción de LAP þ
Treg por Florida flujo citometría. Un significante fi aumento peralte en la frecuencia de LAP þ CD25 CD4 þ Treg
se encontró en el bazo, los ganglios linfáticos mesentéricos, y Peyer de parches (pero no en los ganglios
linfáticos de control) de los ratones FIX alimentado ( Fig. 6 MI).
4. Discusión
A pesar de que un fármaco proteína producida en células de zanahoria ha sido aprobado por la
FDA [1] , Esto no eliminó la fermentación prohibitivamente caro, Puri fi cationes, almacenamiento en
frío o los costos de transporte. Por lo tanto, este informa el fi avance clínico primera de un fármaco
proteína producida en células vegetales comestibles para administración oral de fármacos.
generación exitosa de plantas de lechuga transplastómicas a escala industrial es un paso importante
hacia el desarrollo de un protocolo clínico para la inducción de tolerancia oral en pacientes con
hemofilia.
Además, la fusión a CTB asegura altamente ef fi ciente de orientación del sistema inmunitario
intestinal para la inducción de tolerancia oral [10 mi 13] . CTB se ensambla en un anillo pentamérica
estable que consiste en fi ve idéntica
11.5 kDa monómeros polipéptido. pentámeros CTB unen a los receptores de gangliósido GM1 en las
membranas de las células epiteliales del intestino y en DCs [10 mi 13,31,32] . Papel de CTB en la
inducción de la tolerancia oral se ha informado por varios investigadores [10 mi 13,33,34] . Los datos
clínicos que apoyan la seguridad de la administración a los seres humanos CTB [35] ya ha sido
aprobado para uso humano hace una década y es utilizado por cientos de millones de personas en
todo el mundo [36] . La inducción exitosa de la tolerancia oral por conjugados CTB-autoantígeno en
sistemas experimentales también se ha demostrado ser seguro en ensayos clínicos [37] . Amplia
evaluación preclínica que conduce a estos estudios clínicos han demostrado que fusiones de CTB o
CTB recombinante no causan histopatología en el intestino delgado, ni hacer que aumentan la
permeabilidad vascular [38] .
CTB puede mejorar la inducción de tolerancia también por la inducción de indolamina 2,
3-dioxigenasa (que se conoce para ayudar en la inducción de Treg) en DC [39] . Tras la absorción por
las células epiteliales, FIX se escinde en el sitio de escisión de furina de ingeniería y, en parte,
sistémicamente entregado [11] . Además, el antígeno de FIX se entrega a varios subconjuntos de
células presentadoras de antígeno (APCs) en el GALT. Estos incluyen F4 / 80 þ células en el duodeno
y CD11c þ DC (incluyendo tolerogénico CD103 þ DC) en la lámina propia y en las placas de Peyer (PP)
en todo el intestino delgado [13] . absorción directa por DC que muestra el lumen intestinal y el
transporte a DC en PP por las células M probable también contribuyen a la captación de antígenos
dando como resultado un aumento en varios subconjuntos de DCs y CD4 þ células T. IL-10
dependiente y antígeno-específica fi c respuesta reguladora inmune en última instancia suprime
anticuerpo sistémico
formación a través inducción de
CD4 þ CD25 þ FoxP3 þ Treg y CD4 þ LAP CD25 FoxP3 þ Treg [13] . REGAZO þ Treg Sobreexpresan TGF b ( resultante
de la latencia detectable péptido asociado (LAP) en la superficie celular, suprimir a través de un TGF si
mecanismo dependiente, y puede ser de supresión más inmunes que FoxP3 þ Treg [40,41] . Tras la
exposición sistémica con FVIII o FIX, nuestro protocolo de tolerancia oral aumenta la frecuencia
global de LAP þ Treg, y estas Treg inducidas hasta de regular IL-10 y TGF si
expresión en respuesta al antígeno [12,13] . El uso de células de plantas liofilizadas facilita la
producción farmacéutica y formulación. En este estudio, se observó que la proteína de fusión
CTB-FIX en lechuga liofilizado se puede almacenar a temperatura ambiente hasta 2 años sin
ninguna degradación detectable de esta proteína. Se utilizó material que había sido almacenado
durante 8 meses a inducir tolerancia a los ratones hemofílica sobre un amplio rango de dosis. El
longshelf-vida de las hojas de lechuga CTB-FIX liofilizados elimina la necesidad de costosos
purificación de proteínas fi catiónico, almacenamiento en frío, transporte frío y direcciones de un reto
importante en la producción y entrega de fármacos de proteínas actuales. Por lo tanto, la lechuga
FIX-hecho sería ideal para gran escala y la producción rentable de esta biofarmacéutica para
estudios de traducción de la hemofilia B.
En el presente estudio, no signi fi diferencia no puede por tolerancia oral inductionwas observó
entre baja dosis (1,5 metro g de CTB-FIX) y de alta dosis-tratado (15 metro g de CTB-FIX) ratones
con hemofilia B, que puede ser debido a altamente ef fi entrega de antígeno FIX ciente CTB-mediada.
Esta será una ventaja importante en el avance adicional clínica
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Fig. 6. Supresión del inhibidor y la formación de IgE contra FIX en ratones con hemofilia B. (A) Los ratones recibieron dos gavages semanal (de diferentes dosis CTB-FIX) de células de lechuga y se expusieron a inyecciones iv de FIX. (B) Los títulos anti-FIX 1 semana
después de la última inyección iv de FIX se grafican como inhibidor de los títulos en BU / ml. (C) IgG1, 2a, y 2b títulos de anti-FIX. (D) de IgE títulos de anti-FIX. (E) Las frecuencias de LAP þ CD25 CD4 þ Treg en el bazo, los ganglios linfáticos mesentéricos, placas de
Peyer, y el control de los ganglios (inguinal) nodos de Fed FIX y ratones de control. Fluya parcelas la izquierda muestran ejemplos representativos individuales. Gráfico de la derecha muestra los resultados para ratones individuales (n ¼ 5 / grupo), así como promedios ±
DAKOTA DEL SUR.

para superar las diferencias potenciales entre los pacientes en ef fi ciencia de la administración oral de
fármacos de proteínas bioencapsulado en células vegetales. En el caso improbable de que requiere
materiales liofilizados con dosis más alta (que podría ser simplemente logra tomando más cápsulas),
los genes de codones optimizados se podrían utilizar en lugar de los genes humanos nativos. Una
mejora adicional necesaria puede ser la eliminación de gen marcador seleccionable de genomas de
cloroplastos transformados. Varios métodos están disponibles para la eliminación de los genes
marcadores de selección [42,43] . la escisión precisa del gen marcador seleccionable ( aadA)
También se llevó a cabo recientemente en el sitio de integración (ARNt / trnI) utilizado en este
estudio con Bxb1 recombinasa y sitios de reconocimiento / attB attP [44] .
La demostración de cultivo de plantas de CTB-FIX y lechuga WT (cv. Simpson Elite) en un
sistema hidropónico ambiente controlado ilustra que las plantas transformadas se comportaron bien
utilizando los métodos de producción escalables que son traducible a cGMP (Buenas Prácticas de
Manufactura). No hubo necesidad de germinar las semillas en presencia de antibióticos. El sistema
hidropónico de interior no requiere el uso de pesticidas y herbicidas. Este sistema también puede
evitar enfermedades del suelo. La tasa de crecimiento rápido es otra ventaja única del sistema
hidropónico y hojas de lechuga-FIX de un mes de edad, estaban listos para el fi cosecha de primera.
Esto abre un camino hacia la evaluación clínica humana de CTB-FIX, así como otras proteínas que
se expresan de manera similar. Por ejemplo, las instalaciones de producción biofarmacéuticas
basadas en plantas existentes operadas bajo las normas GMP de la FDA potencialmente pueden ser
modificados fi ed para dar cabida a la producción de biomasa lechuga [28] . Bajo condiciones de
crecimiento actual, la concentración de CTB-FIX en las hojas de lechuga cosechadas del sistema
hidropónico no era tan alta como la de la Universidad de Pensilvania Daniell invernadero laboratorio
(1 mg / g vs 1,5 mg CTB-FIX / g DW). Esta diferencia puede ser debida principalmente al diferente
fuente de luz y 3 veces menor intensidad (luz solar ~ 280 metro mol m 2 s 1 vs sistema hidropónico ~
90 metro mol m 2 s 1) debido a la luz reguladas
psbA promotor-5 0 UTR determinar el nivel de expresión de la proteína CTB-FIX.
Estudios mecanísticos para entender base molecular de tolerancia conferida por diferentes
factores de coagulación sanguínea expresadas en células de plantas y ef fi cacia de este sistema, no
sólo para inducir la tolerancia, sino también lograr la reversión [11 mi 13] un buen augurio para nuevos
avances clínicos. En este estudio para la inducción de la tolerancia oral, la secuencia de propéptido
de FIX no se incluyó en la proteína de fusión CTB-FIX expresado en los cloroplastos de lechuga. Se
ha demostrado que se requiere este propéptido para gamma-carboxilación del dominio Gla de la
proteína madura para producir FIX funcional [45] .
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Por lo tanto, la lechuga cloroplasto-FIX expresado de este estudio no tiene actividad de coagulación
de la sangre. Los estudios futuros se explorar la entrega de factores de coagulación funcionales. Lo
más importante, la eliminación de la fermentación prohibitivamente caro, Puri fi catiónico,
almacenamiento en frío / transporte, la vida útil corta de fármacos de proteínas actuales hace que
este enfoque novedoso altamente ef fi ciente, rentable y ecológico para la producción a gran escala de
proteínas terapéuticas en plantas, un hito importante en el avance de esta fi vejez.
Contribuciones de autor
HD y captación de aguas pluviales concebido y supervisado el estudio y experimentos diseñados.
JS, captación de aguas pluviales y HDwrote el manuscrito. JS contribuido a los datos Higos. 1 mi 3 ; Los
datos y el texto relacionado para Fig. 4 fue aportado por JS, SL, AK, JHN y SJS; LZ, AS, XW aportó
datos en Higos. 5 y 6 . Todos los autores participaron en el análisis de datos.
compitiendo fi intereses financieros
Henry Daniell es un inventor en varias patentes internacionales sobre la tecnología de la
transformación de cloroplastos de Estados Unidos y para producir productos biofarmacéuticos, en
particular, la inducción de la tolerancia oral. Henry Daniell y Roland Herzog son co-inventores de
patentes hemofilia. Novo Nordisk está financiando el proyecto hemofilia.
Expresiones de gratitud
Esta investigación fue apoyada por Novo Nordisk, subvenciones del NIH R01 HL107904 y R01
HL109442 a HD y RWHLZ el apoyo de subvención no. 81371748 por la Fundación Nacional de
Ciencia Natural de China. El apoyo de Rebecca Snow también era muy valiosa para este proyecto.
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