Facultad de Ciencias Naturales e Ingeniería

Departamento de Ciencias Básicas

Bioquímica

Informe No. 1
LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507
Pruebas De Reconocimiento De Aminoácidos Y
Separación Por Cromatografía En Capa Delgada

Nombre: ​Leidy Stefanny Rodriguez Quitian y Berny Camila Sánchez Cabeza

Grupo:​ ​2,1

I. TABLA DE DATOS
1.CROMATOGRAFÏA

Compuesto Distancia al Distancia al Rf Nombre del

No * centro de la límite del compuesto
mancha solvente probable

1
0,5 cm 4,5 cm 0,1

1,0 cm 4,0 cm 0.2

Espinaca
2,5 cm 2,5 cm 0.5
3,0 cm 2,0 cm 0.6

2 1.5 cm 3,5 cm 0.3 Alanina

3 0,5 cm 4,5 cm 0.1 Lisina

4 2,5 cm 2,5 cm 0,5 Triptófano

5 2,5 cm 2,5 cm 0.5 Cisteína

2. REACCIONES DE RECONOCIMIENTO : TABLAS DE DATOS
Reactivo:
ninhidrina

Muestras Observaciones Imagen

Cisteína se divisó que al cabo de

los 10 minutos a baño
maría, solo hubo un
leve cambio de color
transparente a rosado
claro. Por ende se
considera como
negativo​, por no dar
violeta o azul
característico de
positivo.

Prolina Se notó que al pasar 10

minutos a baño maría,
el aminoácido sufrió un
cambio de un color
cristalino a rojo. por lo
tanto se considera
negativo​, ya que no es
violeta o azul indicativo
de positivo a la prueba.

Gelatina Se percibió que al

transcurrir los 10
minutos a baño maría,
sucedió una variación
de color traslúcido a
color violeta, entonces
lo podemos considera
como ​positivo.
Reactivo : millón

Muestras Observaciones Imagen

Fenilalanina Se pudo apreciar que al

pasar los 10 minutos en
agua ebullendo, no
hubo ninguna transición
en su color por lo tanto
podemos considerarlo
como negativo, ya que
no da el color
característico de
positivo que es rojo.

Tirosina Se atisbo que al paso

de los 10 minutos en
agua ebullendo, el
aminoácido tuvo una
variación de un color
diáfano a rojizo,
característica de un
resultado​ positivo.

Gelatina Se contempló al
transcurrir los 10
minutos en agua
ebullendo, que hubo
una modificación de
color transparente semi
turbio a amarillo claro
con un precipitado
rojizo, que sería un
resultado ​positivo.
Reactivo: ​ ​Sakaguchi

Muestras Observaciones Imagen

Arginina Se vio que al paso de los

10 minutos en hielo no
sufrió ningún cambio en
la apariencia, luego al
aplicarle NaOH al 40%
tampoco sufrió alguna
transformación, después
se agregue 5 mL de
α-naftol y tampoco hubo
metamorfosis , pero al
agregar el reactivo de
Sakaguchi ,
instantáneamente
apareció un color rojizo
como una fase de la
mezcla, dándonos como
resultado a la prueba
positivo.

Gelatina Se divisó que al cabo de

los 10 minutos en hielo
sufrió un cambio en su
viscosidad, se vio más
espeso que al principio,
luego al aplicarle NaOH
al 40% no sufrió alguna
alteración, después se
agregue 5 mL de α-naftol
y tampoco hubo
transfiguración alguna ,
pero al agregar el
reactivo de Sakaguchi ,
inmediatamente apareció
un color rojizo como una
fase de la mezcla,
dándonos como
resultado a la prueba
positivo​.
Reactivo : ​ ​Ehrlich

Muestras Observaciones Imagen

Triptófano Al aplicar sobre la

mezcla previamente
hecha de ácido
sulfanílico 0.5% y el
nitrito de sodio no se vio
ningún cambio, pero al
agregar el NH4OH 10%.
La mezcla cambio de un
color transparente a
amarillo clarito, dando
como resultado
negativo

Gelatina Al aplicar sobre la

mezcla previamente
hecha de ácido
sulfanílico 0.5% y el
nitrito de sodio no se vio
ningún cambio, pero al
agregar el NH4OH 10%.
La mezcla cambio de un
color transparente a
amarillo fuerte como
segunda capa ya que
se dividió en 2 fases,
dando como resultado
negativo
DISCUSIÓN DE RESULTADOS CROMATOGRAFÍA

● Determine la cantidad de aminoácidos diferentes que encontró por

cromatografía en la muestra de espinaca.

Se pudo identificar un total de 4 aminoácidos en la muestra de espinaca.

● Compare los valores de Rf de las señales obtenidas en la espinaca con los

correspondientes patrones e identifique hasta donde sea posible los
aminoácidos presentes.
Valores Rf obtenido en el laboratorio vs valores Rf obtenidos de los
aminoácidos:
De la espinaca:
0,1 0.2 Alanina

0.2 0.1 Lisina

0.5 0,5 Triptófano

0.6 0.5 Cisteína

Como podemos observar en la comparación de los Rf de la espinaca con los
patrones se llegó a la conclusión que la alanina, la lisina y el triptófano , son
aminoácidos que componen a la espinaca debido a que sus Rf coinciden con los de
los patrones , aunque hubo una pequeña variación en el Rf de la cisteína , está
también esta hace parte de los aminoácidos de la espinaca y su posible variación
se dio a que las manchas salieron más grandes de lo normal y eso cambió la
precisión del Rf.
● Consulte en la literatura, los valores de Rf para sistemas cromatográficos
similares (fase estacionaria y fase móvil similar y analice qué tan válida es la
comparación con los valores por usted obtenidos.
Cada una de las manchas de la mezcla de aminoácidos obtenidas puede
identificarse comparando su migración con las manchas de los patrones. El valor del
recorrido relativo (Rf) de cada aminoácido es el mismo cuando está en una mezcla
de aminoácidos que cuando está sólo (Rodriguez, 2017).
Por lo tanto, es correcto comparar el Rf de los aminoácidos patrón con los
aminoácidos de la espinaca, que fue el método que se utilizó para identificarlos en la
placa.
Por ejemplo, se determinó que hay una mancha con un Rf de 0,3 perteneciente a la
alanina patrón, y en la espinaca hay una mancha con este mismo índice de
retención, por lo cual la espinaca tiene alanina.
El índice de retención de la alanina es aproximadamente 0,29 (Rodriguez, 2017).

● Estructuras de todos los aminoácidos usados en la práctica

● analice las estructuras y establezca cuál fue el orden de migración, es decir

¿cuáles aminoácidos migraron más, los polares con carga, polares sin carga,
o los apolares y por qué cree usted que fue así de acuerdo con las
condiciones de la cromatografía en cuanto a polaridad de la fase estacionaria
y móvil?.

Teniendo en cuenta que la fase estacionaria es celulosa, un polisacárido apolar y la

fase móvil butanol-acetona-ácido acético-agua (28:28:6:18) está compuesta en
mayor cantidad por compuestos polares, es razonable decir que los aminoácidos
apolares tendrán una corta distancia recorrida, debido a que son más afín a la fase
estacionaria; mientras que los aminoácidos polares recorren una mayor distancia
creando enlaces más fuertes con la fase móvil, es bueno aclarar que aquellos
aminoácidos polares con carga son los que recorrerán mayor distancia y tendrán un
Rf más pequeño, gracias a las fuertes interacciones con el solvente.
En el caso de la cromatografía de espinaca, los aminoácidos debieron migrar en
orden ascendente de la siguiente manera: alanina, triptófano,cisteína y lisina.
RECONOCIMIENTO DE AMINOÁCIDOS: DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

ENSAYO DE NINHIDRINA
Fundamento:
La ninhidrina reacciona específicamente con el grupo α -amino de los
aminoácidos, ya sean libres o bien unidos mediante enlaces peptídicos.Si se
encuentra en un pH entre 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona con
los grupos de α -amino liberando amonio, el cual se condensa con la ninhidrina
reducida y con otra molécula de ninhidrina formando un compuesto coloreado que
varía de azul a violeta púrpura (Bruce 1962).

Reacciones
● Ninhidrina y cisteína:
Imagen 1 generada en chemSketch. Ninhidrina-cisteína

Alcohol ​ mina Secundaria

A
Amina Primaria ​Púrpura de Ruhemann

● Ninhidrina y prolina
Imagen 2 generada en chemSketch Ninhidrina-prolina

Alcohol ​Amina Terciaria

Amina Secundaria

Discusión
En primera instancia la ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con la
cisteína (sola o en la gelatina) formando un producto que será descarboxilado y
deshidratado para formar un ion dipolar que se hidroliza y produce una amina, esta
se une a otra molécula de ninhidrina para producir el Púrpura de Ruhemann (Bruce,
1962).
Como se puede observar en la imagen 1 la ninhidrina une su ​alcohol a la ​amina
primaria ​de la cisteína formando un grupo amino secundario y continúa su
proceso hasta formar el color el ​Púrpura de Ruhemann​;mientras que en la imagen 2
el ​alcohol del hidrato de tricetohidrindeno se une a la ​amina secundaria de la prolina
formando una ​amina terciaria​, lo cual atrofia el curso normal de la reacción y no
permite formar el color caracteristico de el ensayo.
Debido a lo anteriormente explicado, las pruebas con resultado positivo son la
gelatina y cisteína (formando color púrpura), y la prueba con resultado negativo fue
la prolina (color amarillo-naranja).

ENSAYO DE MILLÓN
Fundamento:
El mecanismo de reacción se basa en la presencia de un medio ácido (ácido
nítrico del reactivo), las proteínas se desnaturalizan dando un precipitado blanco,
la cual se debe a la adición del N=O. Dicha adición sucede en la posición 3 o 5 y
se explica ya que el grupo -OH, aumenta la densidad electrónica del anillo,donde
los pares no compartidos del oxígeno se deslocalizan hacia el anillo y su densidad
electrónica aumenta en la posición meta(a partir del radical), En esa posición hay
mayor estabilidad por la fuerte atracción que sufre el nitrógeno por los electrones
deslocalizados del oxígeno (Figura 2) Este mecanismo también sucede en la
síntesis de hormonas tiroideas (figura 3)(Bruce, 1962).
Imagen A generada en chemSketch.proteína anillos meta

​Imagen B generada en chemSketch.tiroxina

Luego,debido al calentamiento, el precipitado blanco se vuelve rojo gradualmente

por la reacción entre el mercurio (1) con el grupo -OH, en este caso lo que le
sucedió a la tirosina (figura 4) por eso, en el caso de una muestra proteica se
observa un rosado salmón acompañado con un precipitado rojo, lo cual se explica
por la presencia de algunas tirosinas en su cadena peptídica, pero en el caso de
peptonas(péptidos cortos) o de la presencia única de tirosinas,se observa una
solución roja por la adición del mercurio en todos los compuestos nitrogenados
formados(Bruce, 1962).
Imagen C generada en chemSketch.tiroxina reaccionando con el mercurio

Reacciones
● Millón y Tirosina
Imagen 3. Generada en Chemsketch. Millón-tirosina.

Fenol ​Grupo Nitro ​Complejo

● Millón y fenilalanina
Imagen 4. Generada en Chemsketch. Millón-fenilalanina.

Grupo Nitro

Discusión:
En la imagen 3 podemos observar la reacción y formación del ​nitrofenol ​y el
complejo ​de la tirosina y el reactivo de millon, explicada anteriormente.
En la imagen 4, la fenilalanina no cuenta con un grupo fenólico, entonces, aunque
puede formar un ​compuesto nitroso​, no puede formar un complejo con un mercurio
debido a la ausencia del fenol, por lo cual el resultado para esta prueba es negativa.
En el caso de la gelatina el resultado es positivo ya que esta muestra proteica
contiene el aminoácido tirosina.

ENSAYO DE SAKAGUCHI
Fundamento:
Del hidróxido de sodio con arginina se obtiene una solución alcalina, permitiendo
que el grupo guanidino del aminoácido arginina reaccione con el alfa-naftol y el
hipobromito de sodio del reactivo sakaguchi, formando un complejo color rojo y
esto nos muestra presencia de un grupo guanido o guanidino. De ahí que sea una
indicación de la presencia de arginina libre de proteínas que contengan arginina.El
desarrollo del color se altera o se previene por completo por la presencia de amino,
histidina o triptófano .(Bruce, 1962).

Reacciones:
● Sakaguchi y arginina:

Imagen 5. Generada en ChemSketch. Sakaguchi

​Amina Primaria​ Fenol ​Amina Secundaria ​Bromo

Discusión:
La reacción de Sakaguchi es específica para los derivados de guanidina (I) que
tienen al menos un hidrógeno no sustituido en cada uno de los grupos amino. La
arginina (II) es el único compuesto común en tejidos que cumple con estos
requisitos. Las secciones se tratan con una mezcla alcalina de α-naftol e hipoclorito
de sodio o hipobromito. Las ubicaciones positivas aparecen en rojo (Bruce, 1962).
En la imagen 5 se puede ver la prueba positiva anteriormente explicado para la
arginina. En el caso de la gelatina (la cual contiene arginina ) la prueba también es
positiva mostrando un color rojo intenso posiblemente alterado por la presencia de
amino, histidina o triptófano.
ENSAYO DE ERLICH:
Fundamento:
Mediante esta reacción se detecta la presencia de grupos imidazol o fenoles en la
muestra. Los fenoles y el grupo imidazol (característico de la histidina) reaccionan
con el ácido diazobenceno sulfónico y forman productos de sustitución que se
tornan rojo al alcalinizar el medio (Quesada Mora, 2007)
Reacciones
● Erlich y triptófano
Imagen 6. Generada en ChemSketch. Erlich-triptófano

● Ehrlich e Histidina
Imagen 7. Generada en ChemSketch. Ehrlich- Histidina.

ácido diazobenceno sulfónico ​Nitrilo

Discusión
El grupo imidazol de la histidina reacciona con el ​ácido diazobenceno sulfonico
(encerrado en amarillo en la imagen 6) y forman​ un producto de sustitución​ que se
tornan rojo al alcalinizar el medio. En la imagen 7 se puede observar la prueba
positiva con Histidina anteriormente explicada que arroja como resultado un color
rojo.
En el caso con triptófano (imagen 6), la prueba es negativa, ya que este aminoácido
no contiene fenoles o un grupo imidazol por lo cual no reacciona con el ácido
sulfanílico y no presenta color rojo.
En la prueba con gelatina, el resultado es positivo ya que esta muestra proteica
contiene Histidina.
BIBLIOGRAFÍA:

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