Mario Lucio Lopes, Silene Cristina de Lima Paulillo, Rudimar Antonio Cherubin, Alexandre Godoy,

Henrique Berbert de Amorim Neto, Henrique Vianna de Amorim

LINHAGENS DE LEVEDURAS
PERSONALIZADAS® PARA PRODUÇÃO DE
ETANOL: SELEÇÃO DIRIGIDA PELO PROCESSO

1a. Edição

Piracicaba
Fermentec Tecnologias em Açúcar e Álcool Ltda.
2015
 PREFÁCIO

Ciência e tecnologia nem sempre andam em paralelo, mas a médio e longo prazo, elas se
complementam muito bem. As vezes o conhecimento para se transformar em tecnologia leva tempo.
A razão pode estar nas dificuldades para escalonamento da produção ou na inviabilidade econômica.
Por outro lado, alguns processos conhecidos há milhares de anos levaram muito tempo para serem
explicados cientificamente, como é o caso da fermentação alcoólica.

Os seres humanos produzem bebidas alcoólicas há pelo menos oito mil anos e apenas 130 anos atrás,
franceses, alemães e britânicos descobriram que é a levedura que faz a transformação do açúcar em
álcool (etanol). Nos 30 anos subsequentes, nasceu uma outra área da ciência: a bioquímica, a química
da vida, tentando explicar como a levedura transforma o açúcar em etanol. Embora muitos
conhecimentos tenham sido adquiridos em aspectos científicos e tecnológicos (práticos), ainda
desconhecemos muitas características das leveduras selvagens e industriais, principalmente em
termos de adaptações às mudanças do ambiente.

Trabalhando na produção de etanol com uma equipe de bioquímicos, geneticistas, biólogos, químicos
e especialistas em agronomia e procurando melhorar o rendimento da fermentação em condições
industriais nos últimos quarenta anos, a Fermentec têm selecionando com sucesso leveduras para a
indústria. No Brasil, o processo de fermentação de etanol utiliza centrífugas contínuas para a
reciclagem de levedura (processo Melle-Boinot). Este processo possui muitas vantagens, se
corretamente conduzido, tais como a alta velocidade de fermentação, rendimentos elevados e baixa
contaminação bacteriana. Porém, ele é suscetível à contaminação por leveduras se a assepsia não for
executada adequadamente.

No Brasil, a levedura de pão ou algumas linhagens para fermentação de cerveja são usadas como
starters da fermentação. No entanto, quando novos métodos para identificação de leveduras foram
introduzidos, foi demonstrado que algumas linhagens de leveduras desaparecem dos fermentadores
enquanto outras leveduras dominam a fermentação. Novos métodos de monitoramento das leveduras
representaram o divisor de águas do conhecimento para entender a fermentação industrial e o
comportamento da levedura para direcionar o processo de seleção de novas linhagens.

A levedura produzida em laboratório não domina, nem tem uma permanência no fermentador em
escala industrial. Por esta razão, a equipe da Fermentec começou a selecionar linhagens de leveduras
que dominassem a fermentação e que fossem adequadas para a produção apresentando
características para um bom desempenho e baixo custo na produção do etanol.

Portanto, a melhoria do rendimento da fermentação e a diminuição dos custos foram obtidas através
de avanços no processo industrial (fermentadores, tubulações, assepsia, automação, etc.) e da seleção
de leveduras. A seleção de leveduras somente foi possível com o uso de metodologias que
diferenciavam linhagens de levedura (Saccharomyces cerevisiae). As duas análises que representaram
a grande mudança foram a cariotipagem do DNA nuclear e as análises do DNA mitocondrial. Hoje a
Fermentec é capaz de realizar a seleção de linhagens de Leveduras Personalizadas® para cada
destilaria, porque observamos que uma levedura pode ser boa para uma unidade industrial, mas não
necessariamente para outra.

2
Este processo de seleção que irá revolucionar a fermentação no Brasil e no mundo, a “seleção dirigida
pelo processo” se deve a adaptação da levedura a um determinado processo. O mecanismo de
adaptação é ainda desconhecido, mas merece mais investigação. Variantes de linhagens originais que
acumulam mutações e rearranjos cromossômicos surgem na população de leveduras e são
continuamente selecionadas através do processo industrial devido aos reciclos sucessivos das células.
Além disso, a epigenética pode desempenhar um papel fundamental neste processo de seleção de
novas linhagens.

Leveduras Personalizadas® já foram selecionadas para 13 destilarias que corresponderam por mais de
cinco bilhões de litros de etanol produzidos nos últimos sete anos. As Leveduras Personalizadas®
dominam todas as outras leveduras e evitam a contaminação das linhagens selvagens, além de
controlar melhor a contaminação bacteriana.

Esta é uma nova fronteira do conhecimento e nesta publicação, você, caro leitor, irá saber como esta
fronteira foi alcançada além de conhecer os resultados das Leveduras Personalizadas® selecionadas
pela Fermentec.

Boa leitura.

Henrique Vianna de Amorim

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 AGRADECIMENTOS

Agradecemos todas as usinas e destilarias brasileiras que começam seus processos fermentativos com
leveduras selecionadas e linhagens personalizadas de leveduras. Essas destilarias nos autorizaram
divulgar esses dados e informações sobre seus processos industriais e estamos muito orgulhosos em
tê-las como parceiras da Fermentec em vários trabalhos científicos e na transferência de tecnologias.

Agradecemos os professores Graeme Walker (Abertay University – Reino Unido), Johan Thevelein
(Katholieke Universiteit Leuven - Bélgica) e Marc-André Lachance (Universidade de Western Ontario,
Canadá) pelas revisões, correções e sugestões que grandemente contribuíram com este trabalho além
da melhoria da linguagem usada para compartilhar nossos resultados e introspeções.

Nós somos gratos a Ariane Mendes Ferreira, Bruna Buch, Crisla Serra de Souza, Flávia Piacentini
Romano, Luciana Piccoli, Milene Bianchini Antonio, Thaise Freiberger e Vanessa Moreira Costa Diana
pelas análises de cariotipagem e mitocondriais, bem como pela preservação de linhagens de leveduras
em nosso Banco de Microrganismos. Obrigado Marta Moraes pela capa e Antonio Bianchi pelas dicas e
revisão da língua inglesa. Nossos agradecimentos a toda equipe da Fermentec que direta ou
indiretamente contribuiu para o sucesso deste trabalho.

A todos os nossos colaboradores, gostaríamos de expressar nossos sinceros agradecimentos.

4
 SUMÁRIO

Resumo ..................................................................................................................................................... 6
Introdução ................................................................................................................................................ 6
Revisão ..................................................................................................................................................... 8
Descrição do processo de produção de etanol no Brasil ........................................................... 8
Linhagens de leveduras industriais: metodologia para avaliar a diversidade.......................... 8
Leveduras contaminantes e complexidade genômica ............................................................... 9
Mecanismos de interação, seleção e evolução ........................................................................ 19
Métodos de seleção: o clássico e o novo.................................................................................. 22
Seleção dirigida pelo processo: Leveduras Personalizadas® ................................................... 23
Tolerância das leveduras industriais ao alumínio .................................................................... 28
Levedura personalizada e contaminação bacteriana.............................................................. 29
Conclusões .............................................................................................................................................. 33
Comentários ........................................................................................................................................... 33
Referências ............................................................................................................................................. 34

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 Linhagens de Leveduras Personalizadas® para produção de etanol:
seleção dirigida pelo processo

Resumo
Processos industriais de produção de etanol no Brasil são caracterizados pelo uso de fermentadores
de grandes volumes, pelo curto período de fermentação, pela reciclagem das células de levedura e por
condições estressantes que podem afetar a viabilidade da levedura e o rendimento geral da destilaria.
Além disso, existem várias características distintas de uma destilaria para outra, tornando cada uma
delas única. Processos fermentativos industriais estão sujeitos a contaminação por leveduras
selvagens (por espécies de Saccharomyces e não-Saccharomyces) devido às dificuldades na
esterilização dos grandes volumes de caldo de cana de açúcar, melaço e água. Portanto, leveduras
selvagens podem competir com linhagens de leveduras selecionadas, causando sérias dificuldades
operacionais, desestabilizando o processo e comprometendo o rendimento da fermentação. Além da
contaminação por leveduras selvagens, as bactérias competem pelo açúcar fermentescível e
produzem compostos que são tóxicos para as células da levedura. No entanto, linhagens de Leveduras
Personalizadas® são mais robustas, resistentes às condições estressantes e competem melhor com
contaminantes quando comparadas com as linhagens tradicionais. As linhagens personalizadas têm
apresentado as maiores taxas de dominância e persistência em fermentações industriais, em
comparação com leveduras selecionadas e a levedura de pão. Por conseguinte, o processo de
fermentação se mantêm mais estável durante toda a safra. Em 2015, 13 destilarias começaram seus
processos fermentativos com linhagens de Leveduras Personalizadas®. Aqui, apresentamos os
resultados dos últimos oito anos de acompanhamento e seleção de Leveduras Personalizadas® para a
indústria de etanol no Brasil: a seleção dirigida pelo processo.

Introdução
Desde a antiguidade, alimentos fermentados e bebidas alcoólicas têm sido consumidos em todas as
regiões do mundo. No entanto, durante séculos, os seres humanos adotaram práticas de fermentação
sem conhecer suas bases químicas e microbiológicas. Observações empíricas e conhecimentos
tradicionais eram transmitidos de geração em geração e levaram à melhoria dos processos
fermentativos (ALBA-LOIS; SEGAL-KISCHINEVZKY, 2010).

Na história da fermentação, Joseph Louis Gay-Lussac escreveu o primeiro relato científico em 1810,
descrevendo a reação geral, mostrando que o etanol e o CO2 eram os principais produtos de
decomposição do açúcar durante a fermentação alcoólica. No entanto, a fermentação permaneceu
como um fenômeno misterioso e incompreendido por muitos anos devido à falta de informações
sobre as transformações microbiológicas. Entre 1837 e 1838, Charles Cagniard de la Tour, Theodor
Schwann e Friedrich Traugott Kützing relataram evidências sólidas da natureza das leveduras vivas.
Estes autores publicaram em três relatórios independentes que a levedura é um organismo vivo que
se reproduz por brotamento e demonstraram que as células de levedura estavam intimamente
associadas à fermentação. Com base nestas obras e observações microscópicas, a levedura foi
reconhecida como um microrganismo vivo e não apenas como algo inanimado. Ademais, estes
resultados forneceram fortes evidências que a atividade metabólica das células vivas era responsável
pela fermentação e também demonstraram que o açúcar era usado para a multiplicação das células de

6
levedura. Porém, esta visão contrariava as teorias químicas da fermentação e, infelizmente, foi
criticada e refutada por pesquisadores proeminentes da época.

Quarenta anos mais tarde, o conhecimento sobre fermentação recebeu uma contribuição muito
importante de Louis Pasteur, que demonstrou ser a fermentação um processo realizado por
microrganismos vivos. Ele definiu fermentação como “vida sem ar”. Pasteur foi capaz de mostrar que
microrganismos, como leveduras e bactérias, realizam a fermentação de cerveja e vinho. Apesar das
evidências mostrando a ação de microrganismos vivos, a pesquisa de Pasteur não explicou a natureza
básica da fermentação alcoólica. No entanto, ele rejeitou as alegações de Berzelius, Liebig e Traube de
que a fermentação resultava de agentes químicos ou catalisadores dentro das células. Pasteur
concluiu que a fermentação era uma “ação vital” dependente das células e que não poderia ser
executada sem um microrganismo vivo.

Estes diferentes pontos de vista deram origem a longas e aquecidas discussões sobre a fermentação.
No entanto, esta disputa foi resolvida com elegância em 1897, quando o químico alemão Eduard
Buchner extraiu o conteúdo de células de levedura e relatou que o extrato líquido poderia ser usado
para fermentar uma solução de açúcar, formando CO2 e álcool, semelhante às leveduras vivas.
Buchner observou que a fermentação ocorria sem células vivas. O seu trabalho se juntou às teorias
biológicas e químicas e deu origem a uma nova disciplina científica: a bioquímica. O trabalho de
Buchner abriu uma nova área de investigação conciliando pontos de vista microbiológicos e químicos
sobre a fermentação (SCHLENK, 1997). Mais tarde, a investigação e a compreensão da fermentação
contribuíram para o progresso da medicina, nutrição, tecnologia e produção de bebidas fermentadas e
destiladas, biocombustíveis e diversas outras áreas biotecnológicas.

Em termos de fermentações industriais para produção de etanol, Firmin Boinot teve uma contribuição
muito importante. Ele trabalhou com destilarias na região de Melle, França, na década de 1930. Boinot
patenteou um processo de fermentação, com base na reciclagem das células de levedura, usando um
tratamento com ácido sulfúrico diluído para matar as bactérias (BOINOT, 1937). Devido à alta
concentração de células vivas recicladas no processo, Boinot foi capaz de reduzir o tempo de
fermentação e aumentar o rendimento. Este processo de fermentação mostrou diversas vantagens
quando comparado com fermentações sem reciclo de células e mais tarde, destilarias brasileiras
decidiram adotá-lo. O processo, conhecido como “Fermentação Melle-Boinot” foi aperfeiçoado ao
longo de vários anos e é caracterizado pela reciclagem de toneladas e toneladas de células de levedura
várias vezes durante o período de safra da cana de açúcar (6-8 meses).

A reciclagem contínua de células da levedura permite a seleção de novas linhagens de levedura mais
adaptadas às condições industriais específicas de cada destilaria no Brasil. Em outras palavras, isto
significa que as linhagens de Leveduras Personalizadas® e de alto desempenho poderiam ser
selecionadas para fermentações industriais de acordo com as características de cada destilaria, uma
abordagem conhecida como “seleção dirigida pelo processo”. Atualmente, linhagens de Leveduras
Personalizadas® têm garantido uma produção de mais de quatro bilhões de litros de etanol em 13
destilarias brasileiras. E este número vem aumentando a cada ano. No entanto, a biodiversidade das
leveduras industriais continua a ser um assunto largamente inexplorado e negligenciado em termos de
desafios científicos (AMORIM et al., 2011). O presente trabalho tem como objetivo apresentar os
princípios da seleção dirigida pelo processo industrial e discutir os resultados obtidos a partir de
linhagens de leveduras adaptadas para a fermentação alcoólica no Brasil.

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Revisão
Descrição do processo de produção de etanol no Brasil
O etanol é essencialmente produzido através dos processos de fermentação alcoólica e destilação. A
principal característica que distingue o processo brasileiro de outros bioprocessos em todo o mundo é
a reciclagem de células da levedura (WHEALS et al., 1999). Fermentações industriais são realizadas
com alta densidade de células (8-12% p/v) em grandes fermentadores e em curtos períodos (6-12
horas). Aproximadamente, 85% de todas as destilarias brasileiras utilizam o processo de fermentação
em batelada alimentada, enquanto os restantes 15% executam fermentações contínuas (GODOY et al.,
2008). Além disso, caldo de cana, melaço diluído com água e uma mistura de caldo e melaço são os
principais substratos para fermentação. Várias destilarias trabalham anexadas às usinas de açúcar e
fermentam uma mistura de melaço e caldo em proporções diferentes. Por esta razão, há uma grande
variação na composição dos mostos entre as destilarias (AMORIM; BASSO; LOPES, 2009).

No final do processo de fermentação, concentrações alcoólicas alcançam 7-11% (v/v), enquanto que
açúcares residuais representam menos de 0,1% (p/v). Após a fermentação, o vinho bruto é
centrifugado para separar as células de levedura em um creme que é diluído com água antes do
tratamento com ácido sulfúrico (pH 2,0-2,5 por 2-3 horas), enquanto o vinho centrifugado vai para
destilação. Após o tratamento com ácido sulfúrico diluído, as células de levedura retornam para os
fermentadores para iniciar um novo ciclo de fermentação. Em geral, considerando o tempo necessário
para todos os passos, é possível executar dois ciclos completos por dia. O período de colheita da cana
tipicamente dura em torno de 240 dias, o que significa que até 480 processos de reciclagem podem
ser efetuados durante este período (AMORIM et al., 2011).

Destilarias brasileiras possuem dornas com uma grande variação de tamanho, número e geometria.
Nos últimos 20 anos, várias destilarias passaram a utilizar dornas de fermentação com uma parte
inferior cônica desenhada pela Fermentec ao passo que dornas antigas ainda possuem o fundo
côncavo. O número e o tamanho também variam, e em geral as destilarias possuem 6-7 dornas de
fermentação com capacidade para 0,5-3,5 milhões de litros cada (AMORIM et al., 2011). Estas
diferenças nas dornas, mostos e processos de fermentação tornam cada destilaria única.

Devido ao fato das células de levedura serem recicladas várias vezes sob condições estressantes das
fermentações industriais, se faz necessária uma seleção da população de leveduras em busca das
melhores linhagens. Os fatores que afetam a população de leveduras variam de uma destilaria para
outra, bem como dentro da mesma destilaria em momentos diferentes durante a safra. Além disso,
linhagens de leveduras industriais estão sujeitas a uma competição com espécies de Saccharomyces
selvagens e não-Saccharomyces (BASSO et al., 2008).

Linhagens de leveduras industriais: metodologia para avaliar a diversidade

A levedura predominante em processos industriais de fermentação para a produção de etanol no
Brasil é a Saccharomyces cerevisiae que engloba linhagens industriais e linhagens selvagens (Figura 1).
Porém, antes de 1990, era difícil monitorar a composição das populações de leveduras nos processos
de fermentação devido à falta de metodologias adequadas e viáveis. No início da safra, para iniciar
seus processos de fermentação, as destilarias brasileiras usavam a levedura de pão ou até mesmo uma
conhecida linhagem para cerveja, IZ1904, do Instituto Zimotécnico-Universidade de São Paulo
(Piracicaba, Brasil). Acalorados debates surgiram sobre a permanência e o desempenho destas
linhagens em fermentações industriais que usavam o reciclo de células durante a safra da cana de
açúcar. Algumas destilarias afirmavam que estas linhagens eram muito boas fermentadoras enquanto

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outras diziam que o desempenho delas na fermentação era fraco. No entanto, todas essas destilarias
não possuíam métodos apropriados para monitorar as leveduras em seus próprios processos de
fermentação.

Como poder-se-ia afirmar que estas linhagens se mantinham no processo de fermentação? Ademais,
como pode ser definitivamente estabelecido qual linhagem de levedura é responsável por um bom ou
mau desempenho da fermentação? Respostas a estas perguntas foram obtidas quando a técnica de
cariotipagem foi utilizada para identificar e monitorar populações de leveduras de forma similar a
utilizada para linhagens de vinhos por Vezinhet, Blondin e Hallet (1990).

Graças a Françoise Vezinhet e Pierre Barre do Institut National de la Recherche Agronomique (INRA)
(Montpelier, França) a metodologia de cariotipagem foi compartilhada com o Professor Luiz Carlos
Basso, da Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz (ESALQ) (Piracicaba, Brasil). O Professor Basso
passou a monitorar e identificar as linhagens de leveduras de fermentações industriais em colaboração
com a Fermentec através de um projeto de pesquisa aprovado pela Fundação Luiz de Queiroz (FEALQ)
(Piracicaba, Brasil). A cariotipagem revelou a sucessão de linhagens de leveduras durante a safra
(BASSO et al., 1994). Além disso, foi demonstrado que as leveduras de pão e de cerveja utilizadas
como starters não sobreviviam mais do que duas ou três semanas devido a condições de estresse das
fermentações industriais. No entanto, quando essas linhagens eram substituídas por outras
contaminantes (com alto desempenho de fermentação), as leveduras de pão e de cerveja eram
consideradas boas fermentadoras. Ao contrário, quando substituídas por linhagens floculantes e de
baixo desempenho eram consideradas ruins para a produção de etanol. A cariotipagem, portanto, tem
permitido uma maior compreensão da dinâmica das linhagens de leveduras durante o período de
produção de álcool. Ademais, este método tem facilitado a seleção de novas linhagens tais como PE2
(1994), CAT1 (1998), FT858L (2007) e mais recentemente Fermel (2014).

Leveduras contaminantes e complexidade genômica

Espécies de Saccharomyces selvagens são as leveduras contaminantes mais abundantes no processo
de fermentação, competindo com as linhagens industriais (AMORIM; LEÃO, 2005). No entanto, outras
espécies de leveduras contaminantes não-Saccharomyces que causam sérios problemas para
fermentações foram descritas e estas incluem a Dekkera, Candida e Schizosaccharomyces (AMORIM et
al., 2004). Estas leveduras podem comprometer os ganhos de produção de etanol quando encontram
condições favoráveis para se multiplicarem durante o processo fermentativo, competindo com as
Saccharomyces. As leveduras contaminantes selvagens não-Saccharomyces podem ser facilmente
distinguidas das Saccharomyces através da cariotipagem devido aos distintos padrões de
cromossomos (Figura 2).

Apesar dos esforços da indústria para eliminar as leveduras contaminantes com tratamento térmico
de grandes volumes de caldo de cana, a contaminação por Saccharomyces selvagem ainda é um
problema predominante. Além disso, como as células da levedura são recicladas centenas de vezes
durante o período de produção, há uma constante batalha entre linhagens industriais e as
Saccharomyces contaminantes pelos açúcares da fermentação. Ademais, variações na composição do
caldo e melaço, assim como, erros no processo, podem contribuir para reduzir a população das
linhagens industriais e permitir o estabelecimento das leveduras contaminantes que forem mais
adaptadas para esta nova situação (Figuras 3 e 4).

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Figura 1. Diversidade de linhagens de leveduras isoladas de processos industriais de fermentação
alcoólica para produção de etanol. Variantes das linhagens industriais são identificadas pela
cariotipagem do DNA nuclear seguida da análise do DNA mitocondrial.

Figura 2. Cariotipagem eletroforética de diferentes espécies de leveduras. Perfis 1 a 8 (Saccharomyces)

e perfis 9 a 11 (não-Saccharomyces). Um único gel permite distinguir entre leveduras Saccharomyces e
não-Saccharomyces. (Fonte: Fermentec)

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Figura 3. Cariotipagem eletroforética da levedura industrial CAT 1 (perfis 1 a 8) e de leveduras
Saccharomyces contaminantes (perfis 9 a 11). As leveduras contaminantes apresentam perfis
cromossômicos distintos em comparação com a CAT1 e outras linhagens industriais. (Fonte:
Fermentec)

Figura 4. Cariotipagem eletroforética e monitoramento da dinâmica da população de leveduras

Saccharomyces em uma destilaria durante 28 semanas de safra. A levedura selecionada foi
completamente substituída pela levedura contaminante (Fonte: Fermentec)

11
Durante oito safras consecutivas, foram analisadas 384 linhagens contaminantes de leveduras de
várias destilarias e observou-se que 91% das linhagens eram floculantes, espumantes ou de baixo
desempenho fermentativo. Algumas linhagens ainda possuíam uma combinação de duas ou três
dessas características. O comportamento da floculação pode resultar em teores mais elevados de
açúcar residual no vinho no final da fermentação, em comparação com células de leveduras não
floculantes. Portanto, a contaminação por leveduras selvagens floculantes e espumantes pode
dificultar a fermentação e resultar em perdas de açúcar e aumento dos custos com insumos (Figuras 5
e 6).
A B

Figura 5. Fermentação com células não-floculadas CAT1 (A) e linhagem de Saccharomyces

contaminante com floculação pronunciada das células (B). (Fonte: Fermentec).
A B

Figura 6. Fermentação com a levedura CAT1 apresentando pouca formação de espuma (A) e levedura
contaminante com pronunciada produção de espuma (B). (Fonte: Fermentec)

12
Até recentemente, o nosso conhecimento sobre a diversidade genética das linhagens de leveduras
industriais e das contaminantes era baseado em dados dos perfis de cromossomos (BASSO et al.,
1994). Linhagens de leveduras foram identificadas, classificadas e monitoradas usando a cariotipagem
eletroforética para estabelecer as porcentagens de dominância e persistência de cada linhagem no
processo de fermentação. Dominância significa a abundância de uma linhagem em relação a outras
leveduras presentes na mesma amostra, enquanto persistência refere-se à permanência das linhagens
de leveduras ao longo da safra nos processos industriais onde foram introduzidas. A cariotipagem
trouxe um grande avanço para o monitoramento e seleção de leveduras. Além disso, alterações
cromossômicas nas leveduras selecionadas passaram a ser observadas durante a safra. Lopes (2000)
relatou que a linhagem PE2 poderia acumular rearranjos cromossômicos durante a safra, tornando
difícil identificá-la em alguns casos (Figura 7). Mais tarde, a introdução das análises de DNA
mitocondrial permitiu o uso de outra ferramenta molecular para analisar a diversidade de levedura
(Figura 8), bem como a distinção entre linhagens relacionadas com a PE2 que acumulam rearranjos
cromossômicos e as linhagens selvagens sem nenhum parentesco. Os primeiros resultados obtidos em
2007 mostraram que o DNA mitocondrial era mais conservado do que o DNA cromossômico das
leveduras industriais como PE2, CAT1 e FT858L.

Os cromossomos estão sujeitos as leis mendelianas e podem sofrer recombinação mitótica e meiótica.
Além disso, podem ocorrer erros de replicação e segregação durante a mitose e meiose. Por outro
lado, o DNA mitocondrial é mais conservador, não segue as leis mendelianas de segregação
independente e ocorre em número de até 50 cópias por célula. Em outras palavras, a introdução de
uma mutação específica no DNA mitocondrial requer a incorporação desta mudança em várias cópias
antes de ser detectada como um novo polimorfismo. Assim, a combinação de dados de padrões
cromossômicos e do polimorfismo do DNA mitocondrial permitiu avaliar outra fonte de diversidade
genética relacionada com variantes de linhagens industriais. Mas ainda era preciso avançar com maior
profundidade e conhecer o genoma das principais leveduras industriais.

O primeiro genoma de uma célula eucariota a ser completamente sequenciado pertencia a levedura S.
cerevisiae e um grande esforço internacional foi necessário para realizar o sequenciamento (GOFFEAU
et al., 1996). Este trabalho aprimorou o nosso conhecimento da função genética e da arquitetura
genômica das células eucarióticas. Hoje em dia, o sequenciamento do genoma completo de muitas
espécies e linhagens de leveduras está disponível para investigação em estudos de genômica
comparativa e evolutiva. O perfil cromossômico de S. cerevisiae é muito bem caracterizado e distinto
da maioria das outras leveduras e das espécies de fungos devido ao seu tamanho de 12-14 milhões de
bases distribuídas em 16 cromossomos por genoma haploide. Cada cromossomo é uma única
molécula de DNA que pode variar em tamanhos de 200 a 2.200 kb. O DNA cromossômico é
responsável por aproximadamente 85% do genoma da levedura enquanto elementos não-
mendelianos estão presentes nas células de levedura em taxas menores tais como o DNA mitocondrial
(10%) e o DNA plasmidial de 2 µm (5%) (SHERMAN, 2002). Além disso, algumas linhagens abrigam um
RNA de dupla fita, semelhante a vírus, relacionado ao fator killer (MARQUINA; SANTOS; PEINADO,
2002). No entanto, o fator killer não foi uma característica importante para a substituição de linhagens
starters pelas linhagens de leveduras contaminantes na indústria brasileira de etanol (AMORIM et al.,
1998).

Os genomas de três leveduras industriais selecionadas pela Fermentec: PE2 (ARGUESO et al. 2009),
CAT1 (BABRZADEH et al., 2012) e mais recentemente FT858L (THEVELEIN, 2013 - comunicação
pessoal) foram sequenciados e algumas características importantes foram observadas para estas

13
linhagens. Apesar da importância destas linhagens para a indústria brasileira, os mecanismos
moleculares responsáveis pelos elevados desempenhos em comparação com levedura de pão e
linhagens laboratoriais ainda são pouco compreendidos.

No entanto, novas reflexões surgiram a partir dos resultados dos projetos de sequenciamento do DNA
e revelaram características especiais no genoma destas linhagens. Uma detalhada análise molecular da
linhagem JAY 291 (um derivado haploide da PE2) mostrou diferenças estruturais extensas e um
elevado nível de polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP) (aproximadamente 2 SNPs/kb) em
comparação com outras linhagens de leveduras sequenciadas, com grandes diferenças nas regiões
teloméricas (ARGUESO et al., 2009).

Rearranjos cromossômicos amplificam o número de genes envolvidos em respostas ao estresse

ambiental associadas às sequências teloméricas. Isso pode atribuir a PE2 um genoma com maior
plasticidade. Sequências teloméricas estão sujeitas à recombinação mitótica e meiótica, bem como a
outros rearranjos, enquanto genes próximos das regiões centroméricas dos cromossomos são mais
conservados (ANDY CHOO, 1998). Na prática, encontramos várias linhagens com dominância e
persistência em fermentações industriais que estão intimamente relacionadas com a PE2. Um total de
18 linhagens foram identificadas que apresentam perfis muito semelhantes de DNA mitocondrial e
cromossômico em comparação com a PE2. Postulamos que essas linhagens são derivadas da PE2 e
surgiram em processos industriais de acordo com a tolerância e adaptação às condições específicas de
cada fermentação.

Outra importante característica observada para essas linhagens industriais é o metabolismo das
vitaminas B1 (tiamina) e B6 (piridoxina). Linhagens de leveduras industriais tais como PE2, CAT1 e VR1
apresentam um maior número de cópias dos genes SNO e SNZ em comparação com leveduras de pão
e de laboratório (STAMBUCK et al. 2009). Estes genes estão relacionados com a biossíntese das
vitaminas B1 e B6, respectivamente. Os autores também demonstraram que o número elevado de
cópias de SNO e SNZ confere à linhagem a capacidade de crescer mais eficientemente sob efeitos
repressivos de tiamina, especialmente em um meio com elevado teor de açúcar sem piridoxina. Além
disso, o mesmo trabalho mostrou que, na ausência de vitaminas, a CAT1 tem uma fase lag inferior ao
da linhagem de laboratório (S288c) com um baixo número de cópias de SNO e SNZ. Ou seja, a levedura
CAT1 se adapta mais rápido.

Segundo Benitez, Martínez e Codón (1996), genomas de linhagens de leveduras industriais são mais
complexos, heterogêneos e distintos do que aqueles de linhagens de laboratório, em termos de
conteúdo de DNA, número e tamanho dos cromossomos, homologia de genes e fragmentos
polimórficos de restrição do DNA mitocondrial. Grandes polimorfismos cromossômicos, bem como a
amplificação gênica, podem estar relacionados às condições seletivas impostas por processos
industriais de fermentação alcoólica. Além disso, variações no número de cópia de genes específicos
podem ser observadas devido a rearranjos cromossômicos durante a meiose e a mitose, para
diferentes espécies de leveduras e fungos (ZOLAN, 1995). Rearranjos cromossômicos, amplificação
gênica e aneuploidia relacionam-se à resistência ao alumínio em Saccharomyces (CHANG et al., 2013)
e não-Saccharomyces (HARRISON et al., 2014). De acordo com Chang et al. (2013), estes rearranjos
cromossômicos podem ter sido mediados por transposons durante as fases iniciais da evolução
adaptativa.

14
Figura 7. Cariotipagem das colônias da levedura PE2 de fermentações industriais mostrando rearranjos
cromossômicos, indicados pelas setas amarelas (A, C, E, G) em comparação com o perfil original sem
rearranjos (B, D, F, H). (Fonte: LOPES, 2000)

Figura 8. Diversidade das leveduras baseada no polimorfismo do DNA mitocondrial de diferentes

linhagens isoladas de processos industriais de fermentação alcoólica. M = marcador molecular de
tamanho do DNA. (Fonte: Fermentec)

15
A arquitetura do genoma pode contribuir para a adequação das linhagens industriais, de acordo com
Argueso et al. (2009). Em um ambiente competitivo como o processo de fermentação alcoólica, células
diploides ou aneuploides podem reorganizar seus genes para a tolerância aos estresses ou ajustar o
número de cópias em novas gerações. Estes rearranjos nas regiões teloméricas e subteloméricas dos
cromossomos podem explicar a plasticidade da PE2 e sua capacidade de adaptação em diferentes
destilarias. Por outro lado, nem todas as alterações físicas e estruturais nos cromossomos podem melhorar
a adaptação em comparação com outras linhagens uma vez que alguns rearranjos cromossômicos podem
ser neutros (ZOLAN, 1995). Além disso, a recombinação meiótica, a hibridação e rearranjos cromossômicos
são mecanismos comuns da evolução do genoma em S. cerevisiae.

Em geral, muitas linhagens de leveduras isoladas do ambiente e de fermentações espontâneas são

homotálicas e apresentam baixos níveis de heterozigosidade. Mortimer et al. (1994) analisaram 43
linhagens de Saccharomyces isoladas de fermentações naturais de mostos de uvas na Itália e
demonstraram que a maioria das linhagens eram diploides e homozigóticas para os genes homotálicos
(HO/HO), mas heterozigóticas para os loci 1-7 investigados. Os autores argumentaram que essas linhagens
se originaram da esporulação de heterozigotos que tinham acumulado mutações recessivas em diferentes
loci durante longos períodos de reprodução mitótica seguidos do cruzamento entre células mãe e filha.
Este processo, conhecido como autodiploidização, facilitaria a perda de genes deletérios e seleção de
novas variedades diploides abrigando alelos benéficos em ambos os loci, permitindo as linhagens de
leveduras uma melhor adaptação e substituição da linhagem original. Mortimer e colegas denominaram
este processo de “Renovação do Genoma”.

No entanto, o sequenciamento do DNA do genoma inteiro mostra que muitas leveduras S. cerevisiae
isoladas do ambiente exibem vários loci com polimorfismos abundantes e consistentes com a idéia de que
as linhagens são altamente homotálicas ou homozigóticas. Estes resultados sugerem que linhagens
homozigóticas podem ser isoladas de diferentes ambientes e não poderiam ser explicadas pela teoria de
Mortimer de renovação do genoma (MAGWENE, 2014). O autor propôs que a heterozigosidade está
relacionada com a domesticação humana das linhagens de leveduras, seguida por ciclos raros de meiose,
enquanto linhagens homozigóticas são menos afetadas pela domesticação. Além disso, raros ciclos
meióticos e autocruzamento facilitariam a rápida adaptação destas linhagens às novas condições
ambientais.

Provas de heterotalismo em linhagens de leveduras industriais foram apresentadas em 1999 quando as

linhagens PE2, VR1 e CAT1 foram esporuladas e os esporos apresentaram a formação de “shmoo” por
linhagens haploides com mating-type “a” e “α”. Ademais, estas linhagens apresentaram cromossomos
homólogos com tamanhos diferentes que não são consistentes para linhagens homotálicas. Além disso, de
acordo com Lopes (2000), estas linhagens esporulam muito bem e rapidamente (Figura 9). Depois de
algumas horas, é possível ver ascos completamente formados com quatro esporos (Figura 10). Mesmo em
um meio de cultivo sólido a base de ágar, contendo glicose como fonte de carbono, apresenta colônias de
leveduras com ascos como relatado por Piccirillo e Honigberg (2010). Além disso, esses autores
demonstraram uma forte relação entre crescimento invasivo das células de levedura e esporulação das
colônias em meio sólido. Após oito dias de incubação em meios contendo glicose como fonte de carbono,
os autores encontraram 5-16% de ascos na população de S. cerevisiae. Estes resultados destacam a
importância de selecionar as melhores condições para evitar esporulação e prevenir que linhagens de
leveduras industriais entrem em um ciclo de meiose uma vez que a mesma afeta o balanço original de
genes nestas linhagens superiores. A simples manutenção das colônias em meio de cultivo sólido pode
gerar diversidade na população de leveduras e perda das características genéticas originais da linhagem.

16
Figura
Figura 9. Frequência de esporulação para cinco linhagens de leveduras industriais (PE-2, VR-1, BG-1,
SA-1 e CR-1) e levedura de pão (PAN) após 48 horas em meio de acetato de potássio (1%). Linhagens
industriais apresentaram uma alta frequência de ascos em comparação com a levedura de pão. LC =
células vivas; DC = células mortas; AS = ascos. (Fonte: LOPES, 2000)

Figura 10. Micrografia eletrônica de varredura de uma célula vegetativa (A) e de um asco contendo
quatro esporos (B) da linhagem PE2. (Fonte: Fermentec)

17
Linhagens de leveduras selecionadas de fermentações industriais esporulam muito bem mas não
produzem apenas ascos com quatro esporos. Em alguns casos pode-se observar uma alta frequência
de ascos com dois e três esporos. Cruzamentos entre esporos do mesmo asco podem ocorrer quando
os ascos possuem dois ou quatro esporos com mating-types complementares (a/α). No entanto, para
ascos com três esporos, um estará livre para acasalar com outras células haploides de mating-type
complementar, aumentando a heterozigosidade das populações. Mesmo em ascos de quatro esporos,
a linhagem PE2 pode formar esporos inviáveis que provavelmente abrigam genes letais. Esta
característica pode aumentar as chances de ocorrer ascos com três esporos viáveis ficando um esporo
livre para cruzar com células haploides de outras linhagens.

Uma vez que as células reprogramam os seus ciclos de vida para iniciar a meiose, o primeiro passo
após a replicação do DNA é o crossing-over. De acordo com Esposito e Esposito (1974), quando células
de levedura iniciam a meiose e são transferidas da esporulação para um meio rico em açúcar, elas
podem reentrar no ciclo celular mitótico diretamente, enquanto células de levedura, a partir da última
fase da meiose, concluem o processo de esporulação, mesmo se forem transferidas para um meio rico
em açúcar. Este fenômeno é conhecido como “Ponto de Compromisso da Meiose”. Ambas as células
obtêm novas combinações de genes em relação às linhagens parentais. Uma vez que essas linhagens
são heterotálicas, novas combinações de genes e novas linhagens variantes podem surgir da
população, mesmo sem formação de esporos. Segundo Magwene (2014) meioses ocasionais e ciclos
de autocruzamento permitem a levedura se adaptar mais rapidamente a novos ambientes. Além disso,
para Paquin e Adams (1983), mutações adaptativas têm uma maior frequência de fixação em diploides
em vez de populações haploides de S. cerevisiae. Portanto, uma levedura diploide capaz de esporular e
recombinar seus genes pode ter uma vantagem evolutiva em relação a uma linhagem haploide.

O DNA cromossômico está sujeito a recombinação e variações mitóticas e meióticas (CODON;

BENÍTEZ; KORHOLA, 1997). No entanto, a análise do DNA mitocondrial é baseada na acumulação de
mutações ocasionais e recombinação sem segregação mendeliana. Ambas as técnicas têm sido
utilizadas para identificar leveduras de processos industriais com o objetivo de confirmar as suas
origens, se elas são selvagens ou derivadas de leveduras conhecidas, bem como auxiliar no
monitoramento das novas linhagens (VEZINHET; BLONDIN; HALLET, 1990, VEZINHET, et al., 1992 e
LOPEZ et al., 2001). A maioria dos laboratórios têm trabalhado com linhagens haploides ou diploides
de S. cerevisiae enquanto que as linhagens industriais costumam ser diploides, aneuploides,
poliploides e mesmo alopoliploides cujas células contêm cromossomos derivados de duas ou três
espécies diferentes. Rearranjos cromossômicos e aneuploidia na linhagem de levedura industrial (PE2)
foram detectados por Lopes (2000) em amostras de 10 destilarias analisadas durante três safras
consecutivas de produção de etanol.

Em contraste com várias linhagens de S. cerevisiae utilizadas na investigação em escala de laboratório

em todo o mundo e que apresentam um padrão constante de cromossomos, linhagens de leveduras
industriais demonstram um elevado nível de polimorfismos no tamanho e número dos cromossomos.
De acordo com Codón, Benítez e Korhola (1998), análises do conteúdo de DNA em várias leveduras
industriais sugere que as células são aneuploides, enquanto que, o polimorfismo no número e
tamanho dos cromossomos é tão grande que a cariotipagem eletroforética pode identificar
individualmente cada linhagem. Quando a sequência do gene SUC2 foi usada como sonda, os
resultados mostraram uma presença generalizada em linhagens de pão e industriais, sugerindo que a
amplificação dos genes SUC2 nestas linhagens pode ser considerada resultante de mecanismos
adaptativos conferindo melhor desempenho às leveduras em condições industriais específicas.

18
Códon et al (1998) analisaram a constituição genômica de linhagens de leveduras industriais e
demonstraram a ocorrência da reorganização cromossômica após a meiose. As novas linhagens
tinham padrões cromossômicos que eram distintos em comparação com as suas linhagens parentais
usadas como controle. Esse padrão poderia ser explicado pela trissomia de alguns cromossomos, bem
como a segregação dos cromossomos homólogos mas de diferentes tamanhos. Ademais, a presença e
ausência de bandas em relação às linhagens parentais foram atribuídas aos elementos de transposição
(Ty1 e Ty2) em sequências subteloméricas causando recombinações assimétricas entre cromossomos
de tamanhos diferentes. Os elementos de transposição podem estar associados aos principais
rearranjos cromossômicos detectados pela cariotipagem eletroforética. Além disso, os autores
observaram que a reorganização cromossômica frequentemente ocorre quando células entram em
meiose. Resultados semelhantes foram obtidos por Lopes (2000) após esporulação da PE2. Um único
ciclo de meiose e esporulação foi o suficiente para induzir vários rearranjos cromossômicos. Os
mesmos rearranjos (mudança de tamanho, perda e ganho de cromossomos) observados após a
meiose também foram observados em variantes re-isoladas da PE2 de 10 destilarias onde essa
linhagem foi introduzida durante três anos sucessivos. Alguns cromossomos exibiram rearranjos mais
frequentes do que outros, e os rearranjos foram acumulados durante o período de safra da cana de
açúcar. Após quatro rearranjos cromossômicos, a identificação da linhagem da levedura por
cariotipagem eletroforética foi prejudicada, tornando muito difícil distinguir as variantes da PE2 e
contaminantes Saccharomyces selvagens.

Embora a mitose seja menos drástica, ela também dá origem a recombinação cromossômica e outros
erros que poderiam gerar variantes das linhagens industriais. Puig et al. (2000) relataram que as
linhagens nativas de S. cerevisiae são homotálicas, esporulam mal, são frequentemente heterozigotas
e podem ser aneuploides. Estas características podem ser vantajosas para linhagens naturais uma vez
que elas conferem as características adaptáveis a alguns ambientes. Após 30 divisões mitóticas,
rearranjos cromossômicos foram detectados. Os autores demonstraram que rearranjos meióticos não
estavam envolvidos e sugeriram que a recombinação mitótica entre sequências homólogas pode ser
responsável por alterações nos genomas das leveduras starters durante o processo de vinificação.

Pelo fato do DNA mitocondrial não estar sujeito às leis mendelianas como os cromossomos estão, ele
tem sido usado para complementar a cariotipagem. Análises do DNA mitocondrial têm permitido
verificar se algumas linhagens, que surgiram no processo, são variantes relacionadas com as leveduras
selecionadas ou se as mesmas são linhagens contaminantes. A combinação das duas técnicas
moleculares, cariotipagem eletroforética dos cromossomas e polimorfismo do DNA mitocondrial, tem
permitido o monitoramento das leveduras durante a safra além de determinar se as novas linhagens
personalizadas são leveduras selvagens ou variantes diretamente relacionadas com as linhagens
industriais introduzidas na fermentação no início da safra.

Mecanismos de interação, seleção e evolução

Biodiversidade entre e dentro de uma espécie de levedura tem sido um tema de importância
crescente nos últimos anos, em especial depois da Convenção sobre Diversidade Biológica e as Leis
Brasileiras da Biodiversidade. Além disso, há um senso de urgência para estudar os mecanismos de
interação, seleção e evolução de leveduras uma vez que apenas uma pequena fração da
biodiversidade é conhecida (LACHANCE, 2006).

Leveduras industriais podem ser consideradas verdadeiras ilhas de adaptação evolutiva, competição e
seleção de novas linhagens de leveduras. Elas agem como um laboratório em grande escala, onde é

19
possível estudar a evolução, interação entre linhagens de leveduras, diferenciação de populações
durante a safra e mudanças de uma destilaria para outra. Cada destilaria possui sua própria
característica como a composição de mosto de cana, instalações, processos de fermentação,
concentração de etanol no vinho, mudanças de temperatura, tratamento ácido do levedo e vários
outros parâmetros que tornam cada destilaria única, como uma típica ilha. Devido ao fato das células
de levedura serem recicladas centenas de vezes durante a safra, as linhagens personalizadas têm mais
sucesso para sobreviver às condições estressantes, dominando e persistindo no processo industrial de
fermentação alcoólica. Este processo foi descrito por Querol et al. (2003) como “domesticação” da
levedura de vinho. Em particular, as alterações estruturais nos cromossomos da levedura têm sido
relacionadas a evolução adaptativa das leveduras de vinho (PEREZ-ORTÍN et al., 2002).

Além disso, é importante salientar a necessidade de descobrir e descrever a biodiversidade de

leveduras sob uma visão holística das populações, a fim de melhor compreender a distribuição,
ecologia e função dentro dos ecossistemas, bem como os mecanismos de seleção (LACHANCE, 2006 e
VEGA et al., 2012). A seleção natural é um processo contínuo e gradual, onde características
hereditárias tornam-se mais ou menos comuns em uma população devido ao efeito diferencial do
ambiente sobre os membros da população. Traços selecionados se acumulam e são fixados na
população devido a maior taxa de reprodução de indivíduos favorecidos em relação às linhagens
originais. Por exemplo, genes FLO podem ser determinantes para algumas fermentações, por exemplo
na fabricação de cerveja, onde as células de levedura são recicladas por floculação, uma característica
de rápida evolução. No entanto, vários fatores podem afetar a concorrência, dominância e
persistência de leveduras dentro de grandes fermentadores como ocorre com a produção de etanol.

Outro caso muito interessante pode ser observado no vinho xerez, onde a formação de um véu de
células de levedura (espuma) é comum, também chamado de “Levedura Flor”. Este tipo de levedura
tem sido descrito para linhagens isoladas em vinhos da Espanha e outros países europeus. Estas
leveduras são reprodutivamente isoladas mas acumulam mutações e aneuploidias que podem explicar
a adaptação da levedura Flor ao envelhecimento do vinho. Sob altas concentrações de etanol há a
formação de véu ou espuma quando os açúcares são esgotados do meio de fermentação (SANCHO;
HERNANDEZ; RODRIGUES-NAVARRO, 1986). Esta característica das linhagens de leveduras Flor é
atribuída à sua capacidade de se agregar devido às interações hidrofóbicas. A alta hidrofobicidade das
células de leveduras Flor pode ser explicada por modificações na composição de lipídios e expressão
de FLO11, que codifica um GPI em proteína ancorada com uma região central rica em serina e
treonina. Legras, Erny e Charpentier (2014) apresentaram a primeira comparação em grande escala de
todas as linhagens Flor europeias envolvidas no processo de maturação biológica do vinho. Os autores
analisaram a ploidia e a diversidade genotípica de microssatélites de populações de leveduras das
linhagens Flor na Europa e mostraram que quase todas pertencem ao mesmo cluster e são diploides,
com exceção de algumas linhagens na Espanha. Por fim, eles correlacionaram Flo11p com a formação
de um véu fino em um grupo de linhagens. Estes resultados mostraram que combinações de
diferentes mudanças adaptativas podem aumentar a hidrofobicidade de células da levedura e também
afetam a formação do véu em populações muito específicas, geograficamente isoladas.

É importante distinguir entre a seleção natural e a derivação genética (alteração genética aleatória).
Esses processos podem afetar a evolução da levedura e levar ao desenvolvimento de novas linhagens,
a seleção natural funciona de uma maneira não-aleatória, enquanto a derivação genética guia a
evolução aleatoriamente, especialmente em pequenas populações. A seleção natural é guiada em
direção às adaptações hereditárias para as condições ambientais atuais. Quando essas condições se

20
alteram, a direção da seleção também muda. Por outro lado, a derivação genética não tem direção e
resulta da amostragem e erros de oportunidade. Em termos práticos, a seleção natural, ou a seleção
com base no processo, parecem ser os mecanismos dominantes da seleção de linhagens de leveduras
em tanques de fermentação muito grandes que utilizam reciclagem de células. No entanto, a
derivação genética pode ser observada quando microbiologistas trabalham com “culturas puras”,
colônias formadas a partir de uma única célula ou até mesmo por um pequeno número de células. As
variantes podem ocorrer nas progênies da linhagem original e ser selecionadas aleatoriamente para a
propagação ou inoculação. Sob condições artificiais de crescimento das leveduras em laboratório, a
fixação ou perda de alguns genes de tolerância ao estresse podem não ser observados, mas eles se
tornarão evidentes quando a levedura retorna para fermentações industriais ou quando as células
ficarem expostas a condições estressantes.

Müller et al. (2014) relataram um resultado muito interessante que pode ilustrar a derivação genética
e mutualismo em uma única colônia de levedura. Trabalhando com linhagens de leveduras (mutantes
auxotróficos para aminoácidos), os autores demonstraram teoricamente e empiricamente que o
mutualismo seleciona para coexistência e diversidade genética de espécies enquanto a colonização
gera competição e regiões de baixa diversidade devido aos repetidos efeitos fundadores. Isso pode
influenciar a dinâmica das populações de leveduras, bem como interações mutualistas, que poderiam
ser benéficas para ambas as linhagens quanto as fontes de nitrogênio disponíveis para as células. Para
explorar o antagonismo entre mutualismo e derivação genética em relação a aminoácidos, os autores
inocularam duas linhagens auxotróficas de S. cerevisiae num experimento de alimentação cruzada em
para estudar os efeitos durante o crescimento e expansão das colônias sobre a superfície do ágar.
Linhagens auxotróficas trocaram aminoácidos, permitindo-lhes controlar a intensidade do mutualismo
em função da concentração de aminoácidos no meio de crescimento. Os autores demonstraram que
um mutualismo significante é capaz de ofuscar a derivação genética, assegurando diversidade genética
na população. No entanto, um mutualismo fraco é superado pela derivação genética, retardando o
crescimento da levedura e a diversidade genética nas colônias.

Outro assunto promissor na interação e competição de levedura é a epigenética, que é um processo

de regulação dos genes capaz de mudar o comportamento das células de levedura, eventualmente
levando-as a exibir características diferentes das esperadas para uma linhagem. A epigenética
influencia a regulação gênica e expressão fenotípica devido as alterações nos cromossomos ou na
estrutura da cromatina, ao invés de diferenças na sequência de DNA. Os fenômenos epigenéticos
diferem dos clássicos processos genéticos no que eles podem responder diretamente às influências
ambientais e persistindo ao longo de um pequeno número de gerações. Exemplos de regulação
epigenética têm sido relatados em organismos tão diversos quanto a levedura S. cerevisiae e células
de origem humana (HENDRICH; WILLARD, 1995). Além disso, a epigenética torna as linhagens celulares
diferentes umas das outras (TSANKOV et al., 2015). Os mecanismos que causam alterações
hereditárias ao nível de metilação do DNA e modificações de histonas, que resultam na expressão
gênica seletiva ou repressão, têm sido observadas em linhagens de laboratório de S. cerevisiae
(BERNSTEIN et al., 2002). No entanto, poucos casos foram relatados para linhagens de leveduras
industriais e provenientes de processos de reciclagem de um grande número de células.

21
Métodos de seleção: o clássico e o novo
As metodologias para a seleção de novas linhagens de levedura são compostas por duas principais
estratégias adotadas pelos vários laboratórios em todo o mundo para diferentes aplicações (vinho,
cerveja, panificação, bioetanol). A primeira abordagem baseia-se nos métodos tradicionais de
modificação genética, seguida da seleção de novas variantes. Os principais processos são a
mutagênese e a hibridação. A mutagênese pode ser induzida a taxas elevadas por tratamentos físicos
e químicos enquanto a hibridação pode ser realizada pela conjugação de células haploides com
complementares do mating-type, cruzamentos raros, fusão de esferoplastos e cytoduction
(PRETORIUS, 2000).

Procedimentos de hibridação podem afetar grandes regiões cromossômicas ou mesmo os genomas

completos enquanto as mutações isoladas ocorrem em genes específicos, mas sem um controle eficaz
sobre o número de genes que poderiam ser afetados. Esses métodos não introduzem especificamente
novas características de uma forma controlada. Por esta razão, apesar de poder utilizar a mutagênese
e hibridação para criar variabilidade, estratégias de seleção são necessárias para identificar as
melhores linhagens sem perda de características superiores. Por outro lado, há o risco da seleção de
uma linhagem nova com base em certas características e negligenciar outros traços de importância
técnica e econômica. No entanto, métodos tradicionais de hibridação de leveduras podem ser usados
para selecionar novas linhagens, cujas características desejadas são poligênicas (traços quantitativos).
Em contraste, a mutagênese isolada pode ser usada para excluir genes únicos (característica
qualitativa). Porém, novas linhagens mutantes não são facilmente distinguidas em simples triagens
quando a levedura original é diploide, aneuploide ou poliploide. Apenas se a mutação for dominante, o
efeito fenotípico poderia ser detectado sem a necessidade de modificações adicionais. Em caso de
hibridação de linhagens de leveduras haploides de mating-type oposto, a técnica enfrenta obstáculos,
assim como, no caso de linhagens que não podem esporular ou linhagens que são
predominantemente homotálicas, como observado para várias linhagens de vinho (MORTIMER et al.,
1994).

A segunda estratégia para modificar e selecionar novas linhagens de levedura é a engenharia genética,
que nos permite modificar uma característica existente, introduzir um novo gene ou grupo de genes e
eliminar um traço indesejado sem afetar outras propriedades desejáveis. Diversas metodologias para
transformação de leveduras e seleção de linhagens geneticamente modificadas têm sido
desenvolvidas, tais como vetores plasmidiais, cromossomos artificiais, cassetes para expressão de
proteínas heterólogas codificados para S. cerevisiae e outras espécies de leveduras. A principal
vantagem da engenharia genética é a especificidade e a precisão das ferramentas genéticas para fazer
essas modificações em células de levedura independentemente da ploidia e do homotalismo. No
entanto, marcadores auxotróficos que foram usados para selecionar leveduras em laboratório não
estão disponíveis para muitas linhagens industriais.

Outra estratégia que tem sido usada é a evolução adaptativa de linhagens de leveduras ao longo de
sucessivas gerações. Mudanças adaptativas estão frequentemente associadas com alterações
envolvendo elementos móveis (ADAMS; OELLER, 1986) e rearranjos cromossômicos (ADAMS et al.,
1992). S. cerevisiae e outras leveduras foram consideradas um modelo ideal de microrganismo para
experiências de evolução adaptativa em escala de laboratório por causa do seu breve tempo de
geração e também devido a possibilidade de investigar fases haploides e diploides do seu ciclo de vida
(GU; OLIVER, 2009). Tilloy, Ortiz-Julien e Dequin (2014) exploraram essa estratégia para selecionar
novas linhagens de leveduras de vinho. Estes pesquisadores selecionaram novas linhagens de S.

22
cerevisiae após 200 gerações sob alta pressão osmótica, com aumento na produção de glicerol e
menor rendimento de etanol em relação à linhagem original. As leveduras que mantiveram um bom
desempenho na fermentação também apresentaram maior tolerância ao estresse osmótico e
condições de escassez de glicose em comparação com a linhagem original.

Outra abordagem foi descrita por Malière et al. (2011). O modelo operacional adotado foi o regime de
alimentação de pulso condicional que é uma versão simplificada e generalizada de uma metodologia
inicialmente descrita por Brown e Oliver (1982) para isolamento contínuo de leveduras tolerantes ao
etanol. Células bacterianas ou de leveduras são expostas a vários pulsos alternados de alimentação
que permitem o genoma microbiano acumular mutações durante gerações sucessivas. Estas mutações
no genoma podem conferir uma menor exigência de nutrientes essenciais ou uma maior taxa de
sobrevivência quando as células estão sob a condição de escassez de alimento.

Demeke et al. (2015) demonstraram a amplificação de genes exógenos para a fermentação de xilose
através de linhagens de Saccharomyces geneticamente modificadas e relataram que durante o
processo de adaptação evolutiva, um elemento extracromossômico de DNA circular foi criado
espontaneamente pela levedura. O DNA circular tinha um elemento ARS (local onde a DNA polimerase
inicia a replicação do DNA) adjacente ao gene de xilose isomerase. De acordo com os autores, foi a
primeira vez que um plasmídeo de levedura foi criado a partir do DNA genômico na ausência de
sequências flanqueadoras repetitivas.

Atualmente, ferramentas moleculares também têm sido utilizadas para melhorar linhagens industriais
e introduzir novas funcionalidades. Swinnen et al. (2012) desenvolveram a análise de sequências do
genoma inteiro de linhagens segregantes para características poligênicas de traços complexos em
leveduras de interesse industrial, tais como tolerância ao etanol, ao ácido acético e à temperatura,
bem como para a produção de baixas concentrações de glicerol. Os alelos superiores identificados
desta forma em linhagens de leveduras com propriedades superiores podem ser usados para a
melhoria de linhagens industriais.

Seleção dirigida pelo processo: Leveduras Personalizadas®

A seleção dirigida pelo processo é baseada na seleção de leveduras que estão melhor adaptadas às
condições de fermentação de cada destilaria e às alterações no processo industrial durante a safra.
Estas condições de fermentação podem variar de uma destilaria para outra e estão sujeitas a
interferência humana. Há alguns anos, a Usina Ipiranga Mococa estava com a fermentação
subdimensionada em relação à moagem de cana e começou a aumentar a concentração de etanol e
impor uma pressão de seleção durante a fermentação a fim de atender a demanda de mercado para o
etanol. No entanto, as leveduras tradicionais não sobreviveram às condições de estresse impostas pelo
processo industrial e as linhagens contaminantes, mais resistentes, dominaram a população e se
estabeleceram na fermentação. Durante a safra, uma nova levedura foi identificada e sua população
foi monitorada pela técnica de cariotipagem. Esta linhagem (FT859L) foi selecionada, avaliada em
escala de laboratório e usada para iniciar a fermentação na safra seguinte junto com a PE2. Em poucas
semanas a FT859L dominou a população de leveduras e persistiu por 36 semanas de safra (Figura 14).
A destilaria conseguiu aumentar com sucesso o teor de etanol no vinho além de reduzir o tempo de
fermentação. Houve um aumento de produtividade em comparação com o mesmo período da safra
anterior. A cariotipagem e o DNA mitocondrial da FT859L indicam que se trata de uma variante da PE2.
Este exemplo mostra o campo promissor de linhagens personalizadas de leveduras uma vez que o
Brasil possui 360 destilarias, cada uma com suas particularidades.

23
O segundo caso bem-sucedido de Leveduras Personalizadas® foi a seleção de uma linhagem altamente
tolerante para fermentar melaço e água para concentrações alcoólicas acima de 10% (v/v) na Usina
Alta Mogiana (Vicente, 2015). No passado, a destilaria obtinha teores alcoólicos de 7,5% (v/v) no vinho
uma vez que as linhagens tradicionais não eram tolerantes às condições de fermentação e ao melaço
de baixa qualidade. No entanto, a seleção de uma nova linhagem personalizada (FT1255L), melhor
adaptada para fermentar melaço, permitiu um aumento no teor de alcoólico do vinho até alcançar 10-
11% (v/v). É uma das destilarias brasileiras com a maior concentração de etanol no vinho, apesar da
utilização de melaço de baixa qualidade. Apesar de formar mais espuma que as leveduras
selecionadas, esta linhagem apresenta excelentes habilidades fermentativas, com concentrações
muito baixas de açucares residuais no vinho. Além disso, pela primeira vez, essa destilaria obteve
sucesso em manter uma linhagem selecionada de levedura dominante durante toda a safra (Figura
15). Análises realizadas pela cariotipagem e DNA mitocondrial demonstraram que a origem desta
linhagem não está relacionada com outras leveduras industriais.

Outro estudo de caso para ilustrar a seleção dirigida pelo processo foi a detecção de variantes da PE2.
A técnica de cariotipagem e a análise do DNA mitocondrial podem indicar quando ocorre
contaminação por leveduras selvagens ou quando surgem variantes das leveduras introduzidas na
fermentação industrial. As principais leveduras industriais utilizadas pelas destilarias brasileiras são
diploides ou aneuploides com cromossomos homólogos de diferentes tamanhos e rearranjos
cromossômicos são frequentemente detectados pela cariotipagem. Algumas linhagens acumulam
vários rearranjos cromossômicos que dificultam a sua identificação, bem como para saber se a nova
linhagem foi originada de uma levedura industrial ou se é uma selvagem contaminante. Depois de
centenas de análises de cariotipagem, a questão ainda permanecia aberta: se as linhagens variantes
eram derivadas da levedura industrial introduzida na fermentação ou se eram simplesmente linhagens
contaminantes? Sem uma contaminação por Saccharomyces selvagens, poderia o processo industrial
ter gerado novas linhagens? Estas perguntas começaram a ser respondidas quando a análise do DNA
mitocondrial passou a ser usada junto com a cariotipagem.

Em 2011, nós seguimos o processo de fermentação da Usina Colorado onde novas linhagens se
originaram no processo (Figura 16). Inicialmente, estas linhagens foram classificadas como leveduras
contaminantes pela cariotipagem. No entanto, o DNA mitocondrial revelou que essas variantes foram
derivadas ou relacionadas com a PE2. Após algumas semanas, novas análises mostraram que outras
variantes se desenvolveram no processo de fermentação. Estas leveduras variantes estavam mais
próximas das primeiras que surgiram na fermentação do que da própria linhagem original (Figura 17).
Pela sequência das variantes, popularmente falando, seriam “filhas”, “netas” e “bisnetas” da PE2. Nós
interpretamos estas observações considerando que: I) os processos industriais de fermentação
alcoólica podem induzir erros no DNA cromossômico e variabilidade na população de células de
levedura; II) o mesmo processo permite eliminar linhagens menos tolerantes, favorecendo as variantes
mais robustas e adaptadas; III) uma nova linhagem, mais robusta e adaptada ao processo, pode
substituir a linhagem original.

Quando uma nova linhagem ocorre e domina a população de leveduras em fermentadores industriais,
ela tem o potencial para se tornar uma linhagem de levedura personalizada. Considerando um tanque
de fermentação com 1.000 m3 de vinho e 10% (v/v) de células de levedura, o número de células em
um reator é 4 x 1017. Além disso, estas células se multiplicam a uma taxa de 10% por ciclo
fermentativo (6-12 horas). Isto significa que cada ciclo de fermentação gera 2 x 1016 novas células.

24
Levando em consideração uma taxa de mutação ou de rearranjos cromossômicos de 3 x 10-6 para cada
nova célula gerada, podemos esperar 6 x 1010 mutantes espontâneos por ciclo de fermentação para
apenas um tanque. Este valor representa 106 vezes a frequência de mutantes espontâneos que seria
observada para reatores de 1 litro nas mesmas condições de fermentação (Tabela 1). Além disso,
várias destilarias brasileiras possuem seis, sete ou mais tanques de fermentação. Estes dados ilustram
o número de mutações que podem acumular nas populações de leveduras devido ao reciclo de
células, densidade populacional elevada e fermentadores de grandes volumes.

Ademais, outros aspectos devem ser considerados tais como linhagens das leveduras, condições de
fermentação, ambientes estressantes para as células e as regiões de recombinação dos cromossomos.
Gang (2007) demonstrou que a taxa de mutação é resistente à variação durante o ciclo celular. Por
outro lado, a taxa de mutação varia consideravelmente entre as linhagens, ambientes e regiões do
genoma.

Além da robustez, uma levedura personalizada para produção de etanol deve apresentar
características como: alto rendimento fermentativo, alta velocidade de fermentação, baixas
concentrações de açúcares residuais no vinho, baixa formação de espuma, não floculação da célula,
além de outras características de importância industrial. Uma linhagem de levedura que reúne todas
estas características desejadas nas fermentações industriais é algo raro. Geralmente, linhagens
predominantes de S. cerevisiae espumam e floculam. Estas características estão relacionadas com a
hidrofobicidade da parede celular (Figueiredo, 2008) e têm sido observadas consistentemente ano
após ano em várias destilarias que monitoraram as populações de leveduras (Amorim et al., 2011).

Gang (2007) demonstrou que o genoma da levedura contém sequências intergênicas repetidas em
tandem. A maioria destas sequências apresentou variação de comprimento quando diferentes
linhagens de leveduras foram comparadas entre si. Além disso, várias sequências intergênicas
repetidas em tandem foram observadas em genes envolvidos na síntese de proteínas da parede
celular e na manutenção da parede celular. Uma característica observada em especial foi a correlação
entre o número de sequências repetidas em tandem e genes como FLO1, que afetam os fenótipos de
adesão. Quando o número de repetições aumentou, a força de adesão das células também aumentou.

Linhagens personalizadas de leveduras têm sido selecionadas desde 2008. Entre 2008 e 2014, estas
linhagens personalizadas foram introduzidas no processo de fermentação de 12 destilarias brasileiras
(Tabela 2) que produziram aproximadamente quatro bilhões de litros de etanol durante esse tempo.

Todos estes exemplos mostram como as células de levedura podem se adaptar e evoluir em condições
diferentes. O potencial de gerar novas linhagens de leveduras variantes a partir de populações de alta
densidade celular usadas pelas destilarias brasileiras durante centenas de reciclos durante a safra é
enorme em comparação com a variabilidade observada em testes de pequena escala. Um
fermentador de larga escala é uma verdadeira ilha de diversidade para investigação da variabilidade
das leveduras, competição, adaptação e seleção de novas linhagens que sejam mais adaptadas às
condições estressantes de cada destilaria.

25
Tabela 1. Número de mutantes espontâneos que podem surgir em um tanque de fermentação de
grande volume (1.000.000 litros) comparado com um reator de laboratório de pequeno volume (1
litro).

Tanque de
Reator
fermentação
(1L)
(1.000.000 litros)
Biomassa da célula da levedura (% v/v) 10 10

Número total de células 4x1017 4x1011

Taxa de mutação espontânea*

espontânea* 3 x 10-6 3 x 10-6

Multiplicação das leveduras por ciclo (%) 10 10

Número de mutantes espontâneos por ciclo 1,2 x 1011 1,2 x 105

Número de mutantes por gene** 2 x 107 2 x 101

*Mutação por genoma diploide de acordo com Gang (2007)
**Considerando probabilidade igual para todos os genes

Tabela 2.
2 Uso de linhagens personalizadas de leveduras em 12 destilarias brasileiras. Desde 2008, estas
destilarias produziram cerca de quarto bilhões de litros de etanol.

Destilarias 2008 2009 2010 2011 2012 2013 2014

1 Ipiranga Mococa
2 Mandu
3 Alta Mogiana
4 Rio do Cachimbo
5 Água Bonita
6 Colorado
7 CEMorrinhos
8 Tonon – Bioenergia
9 Barrálcool
10 Aroeira
11 UMOE
12 Adecoagro – Angélica
(Fonte: Fermentec)

26
Figura 14. Dominância e persistência da levedura personalizada FT859L derivada ou diretamente
relacionada com a PE2. Monitoramento realizado na Usina Ipiranga Mococa a partir de onde essa
linhagem foi selecionada através da cariotipagem e DNA mitocondrial. (Fonte: Fermentec)

Figura 15. Dominância e persistência da levedura personalizada FT1255L em relação às linhagens

industriais PE2, CAT1 e FT858L na Usina Alta Mogiana. A levedura FT1255L foi selecionada a partir
desta usina e não está relacionada com outras linhagens industriais conforme análises realizadas pela
cariotipagem e DNA mitocondrial. (Fonte: Fermentec)

27
Figura 16. Dominância e persistência de linhagens de Leveduras Personalizadas® derivadas ou
diretamente relacionadas com a PE2 na Usina Colorado a partir de onde as linhagens foram
selecionadas. A linhagens FT1628L, FT1756L e FT1756Lv estão diretamente relacionadas a PE2, e
FT1756Lv é uma variante da FT1756L, como demonstrado através da cariotipagem e DNA
mitocondrial. (Fonte: Fermentec)

A B

Figura 17. Polimorfismos cromossômicos de linhagens de Leveduras Personalizadas® derivadas da PE2

(A) e seus respectivos perfis de DNA mitocondrial (B). Estas variantes surgiram no processo industrial
de fermentação alcoólica da Usina Colorado. As setas vermelhas indicam as principais diferenças nos
perfis de DNA mitocondrial das novas linhagens quando comparadas com a PE2. Perfis semelhantes
foram primeiro observados entre PE2 e FT1628L. Posteriormente, outros perfis similares de DNA
mitocondrial também foram encontrados entre FT1628L e FT1756L, bem como entre FT1756L e
FT1756Lv (Fonte: Fermentec)

28
Tolerância das leveduras industriais ao alumínio
Evidência adicional para a seleção dirigida pelo processo também foi obtida quanto a tolerância ao
alumínio pelas linhagens de leveduras industriais. No Brasil, a maioria das destilarias são anexas às
fábricas de açúcar e usam uma mistura de melaço e caldo ou melaço puro diluído com água para a
fermentação. Em contraste, as destilarias autônomas não produzem açúcar e fermentam apenas caldo
de cana. Temos observado que as destilarias que trabalham com uma mistura de melaço e caldo não
enfrentam problemas de toxicidade de alumínio devido aos efeitos atenuantes dos ácidos orgânicos e
outros compostos no melaço (BASSO et al., 2004). Ma, Ryan e Delhaize (2001) mostraram como os
ácidos orgânicos formam complexos com o alumínio, reduzindo a sua toxicidade. No entanto, o caldo
de cana não possui tais propriedades atenuantes e as concentrações de alumínio podem ser elevadas,
chegando a 130 mg. L-1, sendo tóxicas para as células da levedura (ARANHA, 2002).

Concentrações de alumínio de 300 mg. L-1 já foram observadas em algumas amostras de caldo
analisadas pela Fermentec. Estas altas concentrações de alumínio no caldo de cana de açúcar podem
afetar a viabilidade e morfologia das células da levedura reduzindo a taxa de fermentação,
aumentando o teor de açúcares residuais no vinho e diminuindo a produção de etanol. Por outro lado,
o magnésio tem um efeito protetor contra a toxicidade do alumínio (BASSO et al., 2004). O papel do
magnésio na levedura tem sido bem documentado. O magnésio é essencial para o crescimento da
levedura e do desempenho da fermentação. Além disso, ele apresenta um papel importante nas
funções fisiológicas e estruturais das células da levedura, incluindo tolerância às altas concentrações
de etanol (WALKER, 2000).

Devido às condições de fermentação e o tratamento ácido das células de levedura, os efeitos da

toxicidade do alumínio (Al3+) são suficientemente importantes para afetar a produtividade e o
rendimento industrial. Destilarias autônomas lidam com a inibição da fermentação devido à toxicidade
do alumínio em concentrações acima de 30 mg.L-1 ao passo que fermentações realizadas com melaço
são muito menos afetadas. Uma vez que as células de levedura são submetidas a uma pressão
constante de toxicidade do alumínio em destilarias autônomas, leveduras contaminantes e mais
tolerantes são capazes de sobrepujar as linhagens utilizadas para iniciar a fermentação. Após alguns
ciclos, as leveduras menos tolerantes são substituídas por linhagens mais adaptadas. Observamos que
a levedura de pão é a linhagem mais sensível ao alumínio. A PE2 apresenta tolerância intermediária,
enquanto a CAT1 e a FT858L são as mais tolerantes. A Figura 18 mostra a dominância da linhagem
FT858L em uma fermentação industrial de caldo de cana de açúcar de uma destilaria, onde altas
concentrações de alumínio no caldo ocorrem com frequência.

29
Figura 18. Cariotipagem das células de leveduras de uma destilaria autônoma que apresenta
dominância (100%) da linhagem selecionada (FT858L) em fermentação de caldo de cana de açúcar.
(Fonte: Fermentec)

Levedura personalizada e contaminação bacteriana

Outro aspecto de importância industrial é o efeito das linhagens de Leveduras Personalizadas® na
contaminação bacteriana. A contaminação bacteriana é um problema grave para processos de
fermentação para produção de etanol em grande escala, dado que ela afeta o rendimento e aumenta
os custos devido à necessidade de se usar antibióticos, ácido sulfúrico e outros produtos
antibacterianos. Bactérias competem com células de levedura pelo açúcar e produzem altas
concentrações de ácidos orgânicos, tais como lactato e acetato que afetam a viabilidade celular da
levedura. Por esta razão, linhagens de leveduras tolerantes à acidez são desejáveis para fermentações
industriais. A Fermentec selecionou linhagens personalizadas de leveduras que são mais bem
adaptadas às condições específicas de cada processo de fermentação industrial. Estas linhagens foram
comparadas com a levedura de pão em termos de viabilidade celular, velocidade de fermentação,
população bacteriana e inibição da produção de ácido láctico e ácido acético. As linhagens
personalizadas de leveduras se mostraram mais resistentes à contaminação bacteriana e a acidez em
comparação com a levedura de pão. Após três ciclos de fermentação, a maior diferença em
contaminação bacteriana entre o primeiro e terceiro ciclo de fermentação, foi observada para a
levedura de pão (8,5 x 107 bactérias/mL). Esta contagem bacteriana foi correlacionada com maiores
concentrações de ácido láctico (> 3.000 mg/L) e ácido acético (>1.000 mg/L) no vinho. Por outro lado,
linhagens personalizadas de leveduras apresentaram os melhores resultados quando comparadas com
a levedura de pão, porém, todas as linhagens apresentaram resultados diferentes em relação à
contaminação bacteriana (Figuras 19, 20 e 21). Algumas linhagens foram capazes de inibir a população
bacteriana e também a produção de ácidos lático e acético. Três linhagens apresentaram uma redução
da contaminação bacteriana no terceiro ciclo quando comparadas ao ciclo inicial, além de reduções
nas concentrações de ácido láctico (<500 mg/L) e ácido acético (<200 mg/L). Estes resultados
mostraram que diferentes linhagens de leveduras industriais podem inibir a multiplicação das
bactérias e reduzir os produtos do metabolismo bacteriano em fermentações que simulam condições
industriais. Além disso, todas as linhagens avaliadas foram melhores do que a levedura de pão em

30
termos de contagens de bactérias vivas e redução de ácidos láctico e acético produzidos pelas
bactérias.

A inibição de bactérias por leveduras é atribuída à produção de ácido succínico. Basso, Alves e Amorim
(1997) demonstraram que o ácido succínico e o etanol têm um efeito sinérgico capaz de reduzir a
população bacteriana. Posteriormente, Cherubin (2003) demonstrou que reduzir a viabilidade celular
da levedura de pão aumenta a população bacteriana em fermentações alcoólicas com reciclo de
células, ao passo que a levedura industrial PE2 é capaz de manter sua viabilidade e uma menor
contaminação bacteriana nas mesmas condições de fermentação. Outros pesquisadores também
relataram o efeito da viabilidade celular das leveduras (GOMES, 2009) e ação antibacteriana de
algumas linhagens na fermentação (OLIVA NETO; FERREIRA; YOKOYA, 2004 e MENEGHIN; REIS;
CECCATO-ANTONINI, 2010).

De acordo com Klerk (2010), vários fatores podem afetar a produção de ácido succínico pelas
linhagens de leveduras durante a fermentação alcoólica. Estes incluem herança genética, temperatura,
composição do caldo de cana e melaço, fontes de N metabolicamente disponíveis, ácidos graxos de
cadeia longa insaturados e aeração. No entanto, diferenças de linhagens podem ser um fator
determinante. Recentemente, avaliou-se uma linhagem de levedura personalizada quanto a produção
de ácidos dicarboxílicos (succinato+malato) em fermentações com mosto de melaço de cana de açúcar
diluído em água. Os resultados mostraram que a linhagem personalizada (FT1255L) foi capaz de
produzir quase duas vezes mais ácidos dicarboxílicos em relação a mistura de linhagens de leveduras
selecionadas (Tabela 3). Além disso, uma clara correlação foi observada entre succinato+malato para
levedura e ácido lático pela bactéria (Figura 22). Estes resultados também demonstram como
Leveduras Personalizadas® são capazes de superar as linhagens tradicionais. Leveduras
Personalizadas® são mais eficazes em inibir a contaminação bacteriana. Além disso, por serem mais
robustas e adaptadas prevalecem sobre outras leveduras introduzidas no início da safra como
demonstrado por Vicente (2015).

Figura 19. Inibição da contaminação bacteriana (Lactobacillus fermentum) por linhagens de leveduras
industriais (PE2, FT858L, Fermel) e linhagens de Leveduras Personalizadas® (FT859L, FT1255L,
FT1416L, FT2052L) em comparação com a levedura de panificação. Os resultados são diferenças na
contaminação bacteriana entre o primeiro e o terceiro ciclo de fermentação (Fonte: Fermentec)

31
Figura 20. Inibição da produção de ácido láctico pelo Lactobacillus fermentum por linhagens de
leveduras industriais (PE2, FT858L, Fermel) e linhagens de Leveduras Personalizadas® (FT859L,
FT1255L, FT1416L, FT2052L) em comparação com a levedura de panificação. Os resultados são
diferenças na produção de ácido láctico entre o primeiro e o terceiro ciclo de fermentação. (Fonte:
Fermentec)

Figura 21. Inibição da produção de ácido acético por Lactobacillus fermentum pelas linhagens de
leveduras industriais (PE2, FT858L, Fermel) e linhagens de Leveduras Personalizadas® (FT859L,
FT1255L, FT1416L, FT2052L) em comparação com a levedura de panificação. Os resultados são
diferenças na produção de ácido acético entre o primeiro e o terceiro ciclo de fermentação. (Fonte:
Fermentec)

32
Tabela 3.
3 Comparação de uma linhagem de levedura personalizada e uma mistura de linhagens
industriais no quinto ciclo da fermentação em termos de produção de ácidos dicarboxílicos
(succinato+malato), inibição do crescimento bacteriano e produção de metabólitos. Média de três
repetições.

Linhagem de
Mistura de
levedura
linhagens
personalizada
industriais
(FT1255L)
Succinato + malato (mg.L-1) 753 287

Concentração de etanol no vinho (% v/v) 9,87 9.10

População bacteriana (x 107/mL) < 0,02 16,64

Ácido láctico (mg.L-1) 649 5.886

Ácido acético (mg.L-1) 1.410 6.941

Manitol (mg.L-1) 1.170 6.492

(Fonte: Fermentec)

Figura 22. Correlação negativa entre ácidos dicarboxílicos (succinato+malato) produzidos pela levedura
FT1255L e lactato produzido pela contaminação bacteriana durante fermentações alcoólicas realizadas
em escala de bancada (5 ciclos). (Fonte: Fermentec)

33
Conclusões
Podemos concluir que os processos industriais de fermentação alcoólica para produção de etanol
direcionam a seleção de leveduras porque cada destilaria tem características únicas que impõem uma
pressão seletiva sobre as populações de leveduras. As linhagens mais robustas e adaptadas têm melhores
chances de sobrevivência e são capazes de dominar a população de leveduras nas dornas de fermentação
durante a safra. Estas linhagens são adaptadas para cada destilaria e para cada condição de fermentação
adotada pela destilaria. Leveduras Personalizadas® mostraram maior permanência e dominância durante o
período de safra da cana de açúcar (mais de 30 semanas) quando comparadas com as linhagens
selecionadas e de pão. Em 2013, nove destilarias iniciaram o processo usando linhagens de Leveduras
Personalizadas® e em 2014, outras doze destilarias seguiram o mesmo caminho. Estas Leveduras
Personalizadas® são robustas e resistentes às condições estressantes das fermentações industriais e
representam uma nova oportunidade para as destilarias reduzirem perdas causadas por leveduras
contaminantes. Linhagens personalizadas impedem ou dificultam o estabelecimento de leveduras
selvagens que prejudicam as fermentações industriais. No entanto, uma linhagem que seja bem adaptada
a uma dada destilaria não tem garantia de sucesso em outra destilaria. Assim, a seleção de linhagens de
leveduras dirigida pelo processo é uma nova maneira de selecionar linhagens adaptadas para destilarias
que reciclam o levedo. As Leveduras Personalizadas® serão a próxima plataforma genética para receber
novos genes para aplicações industriais.

Comentários finais
Nós demonstramos como o processo industrial conduz a seleção de linhagens mais robustas e mais bem
adaptadas em relação às leveduras de panificação. No entanto, várias questões permanecem inexploradas,
tais como: por que várias linhagens de leveduras são heterotálicas e aneuploides? Há alguma relação entre
ploidia e tolerância as condições de estresse? Rearranjos cromossômicos são induzidos por recombinação
mitótica ou meiótica? Quais fatores podem interferir na transmissão de cromossomos das células mãe para
filhas? Como estes fatores podem afetar a constituição cromossômica de linhagens de leveduras
industriais? E como esses traços evoluem na população de células?

Outro aspecto a ser explorado nas linhagens de leveduras industriais está relacionado com a expressão dos
genes e alterações fenotípicas. Como uma orquestra, as células de levedura ligam e desligam vários genes
para se adaptar, competir e multiplicar em diferentes condições de fermentação. Estas células estão
sujeitas as condições de estresse e precisam ajustar o seu metabolismo como uma orquestra tocando
Mozart. Quem são os principais maestros? Quantos são e como eles sincronizam a “música” tocada?
Certamente temos feito enormes avanços sobre linhagens em laboratório mas demonstramos aqui como
são distintas as linhagens industriais e selvagens de Saccharomyces das bem conhecidas linhagens de
laboratório ou mesmo da levedura de pão.

Finalmente, uma nova fronteira do conhecimento foi aberta em relação a epigenética de células de
levedura. Tem sido sugerido que a levedura seria um modelo extremamente útil para a investigação
científica. A epigenética de organismos multicelulares foi investigada em vários países, mas a utilização de
organismos simples como uma levedura pode acelerar novas descobertas e explicar diferentes questões
que ainda estão em aberto ou não totalmente compreendidas. A metilação do DNA, alteração da histona e
remodelação da cromatina afetariam a expressão dos genes das leveduras, bem como de pequenas
moléculas de RNA capazes de travar a leitura do DNA. Essas pequenas moléculas de RNA podem persistir
por várias gerações afetando características importantes para o desempenho da levedura e experimentos
sobre a função destes micro RNAs não-codificantes têm ganhado importância entre os pesquisadores de
leveduras. Acreditamos que a expressão gênica e a herança de características genéticas de importância
industrial permanecem um enigma para as linhagens selecionadas para produção de etanol e vão muito
além do que conhecemos atualmente sobre o genoma destas leveduras.

34
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