Documenti di Didattica
Documenti di Professioni
Documenti di Cultura
Malla de partículas
Muestra cargada
entrecruzadas
en un gel hidratado
Partícula de gel
Molécula de la muestra de tamaño molecular inferior al poro del gel
Molécula de la muestra de tamaño molecular superior al poro del
Un gel es una red tridimensional cuya estructura está entrecruzada al azar. Los geles utilizados
como tamiz molecular son polímeros hidrofílicos e insolubles cuyas cadenas poliméricas se entrecruzan
hasta formar una red tridimensional.
Los geles normalmente utilizados son de tres tipos: dextrano, agarosa y poliacrilamida. En esta
práctica se utilizará el gel dextrano.
El gel de dextrano (polímero ramificado de glucosa, entrecruzado y formado en pequeñas
bolitas) se comercializa con el nombre de SEPHADEX. Existen distintos tipos, según el tamaño de poro,
proporcionando límites de exclusión comprendidos entre 1 y 200 000 daltons. Estos geles se identifican
por una denominación de G-10 hasta G-200, lo que se refiere a la capacidad de retención de agua del
Filtración en gel - 2 (Farmacia)
Log Pm
En esta práctica se emplea una columna rellena con Sephadex G-25 (dextrano de alto
entrecruzamiento, pequeño tamaño de poro), aprovechándose la diferente velocidad de avance de la
hemoglobina frente a los reactivos de pequeño tamaño (ferricianuro y ditionito).
El ferricianuro (Fe[CN]63-) es un agente oxidante, capaz de oxidar el Fe2+ de la oxihemoglobina
(rojo vivo) a Fe 3+, transformándose en ferrocianuro Fe(CN)64- (amarillo). Esta forma de la hemoglobina
se denomina metahemoglobina (marrón). El ditionito (S2O42-) es un agente reductor, capaz de reducir
el Fe3+ de la metahemoglobina a Fe2+. A esta forma de la hemoglobina se le denomina
desoxihemoglobina (rojo pardo). La desoxihemoglobina capta el oxígeno disuelto en el tampón
transformándose en oxihemoglobina (rojo vivo).
Se aplicará a nuestra columna de sephadex G-25 una disolución de ditionito sódico y
posteriormente una muestra de metahemoglobina observándose una serie de bandas en función de las
reacciones que tienen lugar.
2. - MATERIAL Y REACTIVOS
Material
.- Columna de cromatografía
.- Pipetas Pasteur
.- Tubo graduado
.- Vaso o Erlenmeyer
Reactivos
.- Sephadex G-25
.- Tampón fosfato 20 mM, pH = 7.0
.- Ferricianuro potásico
.- Azul dextrano (2 mg/ml)
.- Ditionito sódico (=hidrosulfito sódico, Na2S2O4) (solución recién preparada de10 mg/ml en tampón
fosfato)
.- Muestra: Hemolizado
3. - PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
cm de gel sedimentado se abre la llave permitiendo la salida del exceso de tampón, facilitando de esta
manera el empaquetado. El gel empaquetado debe tener una altura de 10 cm. El lecho del gel debe
quedar perfectamente uniforme y plano.
IMPORTANTE: en todo momento debe evitarse, mediante el control de la llave y la adición de
tampón, que el gel llegue a secarse. La adición a la columna se hará siempre con pipeta Pasteur, con
cuidado y por la pared para evitar distorsionar el lecho del gel.
3.4. - Medida del volumen de exclusión:
.- Dejar fluir el tampón hasta que el menisco alcance el lecho del gel, evitando que éste se seque.
Cerrar la llave.
.- Añadir cuidadosamente con la pipeta Pasteur 2 gotas de la solución de azul de dextrano. Abrir la
llave hasta que la banda de azul dextrano entre completamente en el gel y cerrar de nuevo. Añadir a la
parte superior del gel un poco de tampón (2 mm de altura).
.- Poner un tubo graduado para recoger el líquido que sale de la columna (eluato). Abrir la llave, dejar
entrar la capa de tampón en el gel. Continuar añadiendo más tampón a la columna hasta que la banda
azul salga por abajo. Anotar el volumen recogido cuando salga de la columna el centro de la banda de
azul dextrano. Este es el volumen de exclusión de la columna.
.- Lavar la columna haciendo pasar tampón hasta la completa eliminación del azul dextrano.
4.2. - Anotar y justificar lo que se ha observado durante la cromatografía e indicar en un dibujo las
bandas que han ido apareciendo y a qué molécula corresponden.
Filtración en gel - 5 (Farmacia)