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GENETICA

UN APPROCCIO MOLECOLARE
Quarta edizione
Peter J. Russell

GENETICA
UN APPROCCIO MOLECOLARE
Quarta edizione

Edizione italiana a cura di:

Carla Cicchini e Alessandra Marchetti


Sapienza Università di Roma
© 2014 Pearson Italia – Milano, Torino

Authorized translation from the English language edition, entitled: IGENETICS: A MOLECULAR APPROACH,
3rd edition, by Peter Russell, published by Pearson Education, Inc, publishing as Benjamin Cummings, Copyright
© 2010.

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Revisione della quarta edizione a cura di: Carla Cicchini, Alessandra Marchetti, Sapienza Università di Roma

Traduzione: Antonio Antoccia, Priscilla Paola Bettini, Paola Castronovo, Gabriella Consonni, Renata Cozzi,
Antonella Sgura, Caterina Tanzarella, Paola Vanda Riva
Realizzazione editoriale: Il Nove – Bologna
Grafica di copertina: Maurizio Garofalo
Stampa: Ecobook – Rho (Mi)

Tutti i marchi citati nel testo sono di proprietà dei loro detentori.

978-88-6518-379-3

Printed in Italy

4a edizione: settembre 2014

Ristampa Anno
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Indice

Prefazione xi Focus sul genoma: Origini di replicazione


nel lievito 49
Capitolo 1 Introduzione alla genetica 1 Enzimi per la replicazione degli eucarioti
Replicazione dell’estremità dei cromosomi
50
50
Genetica classica e moderna 1 L’assemblaggio del nuovo DNA
Genetisti e ricerca genetica 2 nei nucleosomi 52
Le branche della genetica 2 Sommario 53
La ricerca di base e la ricerca applicata 3 Approccio analitico alla soluzione
Le banche dati e le mappe genetiche 4 di problemi di genetica 53
Gli organismi utilizzati nella ricerca genetica 6
Sommario 10 Capitolo 4 La funzione del gene 55
Capitolo 2 DNA: il materiale genetico 11 Controllo genetico della struttura degli enzimi 55
Ipotesi di Garrod sugli errori congeniti
La ricerca del materiale genetico 11 del metabolismo 55
L’esperimento di trasformazione di Griffith 12 L’ipotesi un gene-un enzima 56
L’esperimento di trasformazione di Avery 13 Deficienze enzimatiche su base genetica nell’uomo 60
Gli esperimenti con i batteriofagi Focus sul genoma: Metabolomica intestinale 61
di Hershey e Chase 14 Fenilchetonuria 61
L’RNA come materiale genetico nei virus 16 Albinismo 63
La composizione e la struttura del DNA e dell’RNA 16 Sindrome di Kartagener 63
La doppia elica del DNA 18 Sindrome di Tay-Sachs 64
Differenti strutture del DNA 21 Controllo genetico della struttura delle proteine 64
Il DNA nelle cellule 22 Anemia falciforme 65
Struttura dell’RNA 22 Altre mutazioni dell’emoglobina 67
L’organizzazione del DNA nei cromosomi 22 Fibrosi cistica 67
Cromosomi virali 22 Consulenza genetica 68
Cromosomi procarioti 23 Identificazione dei portatori 69
Cromosomi eucarioti 25 Analisi fetale 69
Focus sul genoma: Dimensione del genoma Sommario 71
e contenuto di DNA ripetuto 27 Approccio analitico alla soluzione
DNA a sequenza unica e a sequenza ripetuta 31 di problemi di genetica 71
Sommario 33
Approccio analitico alla soluzione
di problemi di genetica 33
Capitolo 5 Espressione genica: la trascrizione 73
Espressione genica. Il dogma centrale:
Capitolo 3 La replicazione del DNA 35 schema generale
Il processo della trascrizione
73
74
La replicazione semiconservativa del DNA 35 La trascrizione nei batteri 74
L’esperimento di Meselson e Stahl 35 Inizio della trascrizione: i promotori 75
Le DNA polimerasi, enzimi coinvolti Allungamento della catena di RNA 76
nella replicazione del DNA 38 Terminazione della catena di RNA 78
La DNA polimerasi I 38 La trascrizione negli eucarioti 78
Il ruolo delle DNA polimerasi 38 Le RNA polimerasi eucariote 78
Modello molecolare della replicazione del DNA 40 La trascrizione dei geni che codificano per
Inizio della replicazione 40 proteine da parte dell’RNA polimerasi II 79
Replicazione semidiscontinua del DNA 42 Focus sul genoma: La ricerca dei promotori 80
Replicazione a cerchio rotante 45 La struttura e la produzione degli mRNA eucarioti 81
La replicazione del DNA negli eucarioti 47 Auto-splicing (self-splicing) degli introni 87
Repliconi 48 Correzione (editing) dell’RNA 88
Inizio della replicazione 48 Sommario 89
vi Indice

Approccio analitico alla soluzione Sequenziamento del DNA


di problemi di genetica 89 e analisi delle sequenze 167
Sequenziamento mediante didesossinucleotidi 168
Capitolo 6 Espressione genica: la traduzione 91 Pirosequenziamento
Analisi delle sequenze di DNA
172
173
Le proteine 91 L’assemblaggio delle sequenze di DNA 174
La struttura chimica delle proteine 91 Il sequenziamento del genoma mediante
La struttura molecolare delle proteine 92 l’approccio del sequenziamento casuale diretto 174
La natura del codice genetico 94 Assemblaggio e rifinitura
Il codice genetico è un codice a triplette 95 delle sequenze genomiche 176
La decifrazione del codice genetico 96 Analisi della variazione
Le caratteristiche del codice genetico 97 nelle sequenze genomiche 176
Focus sul genoma: Altri codici genetici 99 Annotazione delle sequenze genomiche 180
La traduzione: il processo di sintesi proteica 99 Identificazione e annotazione
L’RNA transfer (o RNA di trasporto) 100 delle sequenze geniche 180
I ribosomi 101 Focus sul genoma: I veri occhi blu 181
L’inizio della traduzione 104 Conoscenze dall’analisi dei genomi:
L’allungamento della catena polipeptidica 106 dimensioni dei genomi e densità dei geni 185
La fine della traduzione 109 I genomi degli eubatteri 185
Lo smistamento delle proteine nella cellula 110 I genomi degli archeobatteri 186
Sommario 112 I genomi degli eucarioti 186
Approccio analitico alla soluzione Alcuni esempi di genomi sequenziati 188
di problemi di genetica 113 Genomi batterici 188
Genomi di archeobatteri 188
Capitolo 7 Mutazione, riparazione del DNA Genomi di eucarioti
Prospettive future della genomica
189
192
ed elementi trasponibili 115 Aspetti etici, legali e sociali
del sequenziamento del genoma umano 193
Mutazione del DNA 116
Sommario 194
Adattamento versus selezione 116
Approccio analitico alla soluzione
Definizione delle mutazioni 116
di problemi di genetica 195
Mutazioni spontanee o indotte 120
Focus sul genoma: Radioresistenza
nei Bacteria: Conan il batterio 125
Capitolo 9 Genomica funzionale e comparativa 199
Identificazione delle mutazioni 130 Genomica funzionale 200
Le mutazioni dinamiche 131 Ricerca di similarità fra sequenze
Riparazione dei danni al DNA 133 per attribuire funzioni geniche 200
Correzione diretta dei danni al DNA 133 Attribuire una funzione genica attraverso
Riparazione per escissione 134 la sperimentazione 202
Malattie genetiche umane derivanti La descrizione dei profili di espressione genica 210
da mutazioni che interessano i sistemi Genomica comparativa 215
di replicazione e di riparazione del DNA 137 Esempi di studi di genomica comparativa
Elementi trasponibili 138 e delle loro applicazioni 215
Le caratteristiche generali Focus sul genoma: Il progetto genoma
degli elementi trasponibili 138 dell’uomo di Neandertal 217
Gli elementi trasponibili dei batteri 138 Sommario 222
Gli elementi trasponibili degli eucarioti 141 Approccio analitico alla soluzione
Sommario 149 di problemi di genetica 222
Approccio analitico alla soluzione
di problemi di genetica 150 Capitolo 10 La tecnologia del DNA ricombinante 225
Vettori versatili per andare
Capitolo 8 La genomica: la mappatura oltre il semplice clonaggio 225
e il sequenziamento dei genomi 153 Vettori navetta 226
Vettori di espressione 226
Il Progetto Genoma Umano 154 Vettori di clonaggio da PCR 229
Trasformare i genomi in cloni, e i cloni in genomi 154 Vettori trascrivibili 230
Il clonaggio del DNA 155 Vettori non plasmidici 231
Vettori di clonaggio e clonaggio del DNA 159 Clonaggio di un gene specifico 231
Banche genomiche 163 Identificazione di cloni specifici
Banche cromosomiche 167 usando una libreria di DNA 232
Indice vii

Focus sul genoma: Trovare un nuovo gene La genetica mendeliana nell’uomo 283
legato al diabete di tipo 1 232 L’analisi degli alberi genealogici 284
Identificazione di geni in librerie Focus sul genoma: Qualche volta identico
per complementazione di mutazioni 236 non è così simile 285
Identificazione di specifiche sequenze Esempi di caratteri genetici dell’uomo 285
di DNA in librerie mediante l’uso Sommario 287
di sonde eterologhe 236 Approccio analitico alla soluzione
Identificazione di geni o di cDNA in librerie di problemi di genetica 288
mediante l’uso di sonde oligonucleotidiche 237
Analisi molecolari del DNA clonato 237 Capitolo 12 Le basi cromosomiche dell’ereditarietà 291
Analisi mediante Southern blot
di sequenze nel genoma 237 I cromosomi e la riproduzione cellulare 291
Analisi di RNA mediante northern blot 239 I cromosomi eucariotici 291
Altri impieghi della PCR Mitosi 294
nella genetica molecolare 239 Meiosi 297
Vantaggi e limitazioni della PCR 239 Focus sul genoma: I geni coinvolti
Applicazioni della PCR 240 nella segregazione cromosomica in meiosi 303
L’RT-PCR e la quantificazione dell’mRNA 240 La teoria cromosomica dell’ereditarietà 304
Applicazione di tecniche molecolari 242 I cromosomi del sesso 304
Mutagenesi sito-specifica del DNA 242 Ereditarietà legata al sesso 306
Analisi dell’espressione di singoli geni 243 Non-disgiunzione del cromosoma X 309
Analisi delle interazioni proteina-proteina 244 I cromosomi sessuali
Impieghi dei polimorfismi e la determinazione del sesso 312
del DNA nell’analisi genetica 246 Determinazione genotipica del sesso 313
Classi di polimorfismi del DNA 246 Determinazione genica del sesso 317
Test molecolari del DNA L’analisi dei caratteri legati al sesso nell’uomo 317
per le mutazioni associate Ereditarietà recessiva legata al cromosoma X 317
Ereditarietà dominante legata al cromosoma X 318
a malattie genetiche umane 249
Ereditarietà legata al cromosoma Y 319
La tipizzazione del DNA 254
Sommario 320
La terapia genica 258
Approccio analitico alla soluzione
Biotecnologia: prodotti commerciali 259
di problemi di genetica 320
L’ingegneria genetica delle piante 260
La trasformazione delle cellule vegetali 260
Applicazioni dell’ingegneria Capitolo 13 Estensioni e deviazioni dai principi
genetica delle piante 261
Sommario 263
della genetica mendeliana 323
Approccio analitico alla soluzione Alleli multipli 323
di problemi di genetica 265 I gruppi sanguigni AB0 324
Il colore dell’occhio in Drosophila 327
Capitolo 11 La genetica mendeliana 267 Relazione tra alleli multipli
e genetica molecolare 327
Genotipo e fenotipo 267 Modificazioni delle relazioni di dominanza 328
Il piano sperimentale di Mendel 268 La dominanza incompleta 328
Incroci di monoibridi e il principio La codominanza 329
mendeliano della segregazione 269 Confronto tra dominanza completa,
Il principio della segregazione 273 dominanza incompleta e codominanza
La rappresentazione degli incroci a livello molecolare 329
mediante uno schema ramificato 273 Geni essenziali e alleli letali 330
La conferma del principio Espressione genica e ambiente 331
della segregazione: l’uso dei reincroci 275 Penetranza ed espressività 332
Il fenotipo recessivo a livello molecolare 277 L’effetto dell’ambiente 333
Incroci di diibridi e il principio mendeliano Ereditarietà e ambiente 335
dell’assortimento indipendente 277 Effetto materno 336
Il principio dell’assortimento indipendente 277 Determinazione del numero di geni
Lo schema ramificato degli incroci implicati in un profilo di mutazioni
di diibridi 278 con lo stesso fenotipo 337
Incroci di triibridi 280 Interazioni tra geni
La “riscoperta” delle leggi di Mendel 281 e rapporti mendeliani modificati 339
Analisi statistica dei dati genetici: Interazioni geniche che determinano
il test del chi-quadrato 282 nuovi fenotipi 339
viii Indice

L’epistasi 341 Mappatura dei geni nei batteriofagi 393


Focus sul genoma: Rossi del passato 344 Analisi della struttura fine
Interazione genica che coinvolge di un gene di batteriofago 395
geni modificatori 346 Analisi per ricombinazione dei mutanti rII 396
Ereditarietà extranucleare 347 Mappatura per delezione 397
Genomi extranucleari 347 Definizione dei geni mediante
Le leggi dell’ereditarietà extranucleare 347 test di complementazione (cis-trans) 398
Esempi di ereditarietà extranucleare 348 Sommario 401
Sommario 352 Approccio analitico alla soluzione
Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica 401
di problemi di genetica 352
Capitolo 16 Variazioni della struttura
Capitolo 14 Mappe genetiche negli eucarioti 355 e del numero dei cromosomi 405
I primi studi sull’associazione genetica:
Tipi di mutazioni cromosomiche 405
gli esperimenti di Morgan con Drosophila 356
Variazioni della struttura dei cromosomi 406
La ricombinazione genetica e il ruolo
Delezione 407
dello scambio cromosomico 357
Duplicazione 409
Costruire le mappe genetiche 359
Focus sul genoma: Le duplicazioni
Rilevare l’associazione attraverso
e le delezioni geniche nella famiglia
i reincroci di prova (testcross) 359
dell’Androgen-Binding Protein (ABP) 410
Mappatura dei geni mediante
Inversione 410
reincroci di prova a due punti 361
Traslocazione 412
Costruzione di una mappa genetica 362
Mutazioni cromosomiche e tumori
Mappatura dei geni con il reincrocio a tre punti 362
nell’uomo 415
Calcolo accurato delle distanze di mappa 367
Effetto di posizione 416
Confronto tra mappe genetiche e mappe fisiche 368
Siti fragili e rotture cromosomiche 417
Costruzione di mappe genetiche
Variazioni nel numero dei cromosomi 418
di associazione nell’uomo 368
Cambiamenti di uno o pochi cromosomi 418
Studi di associazione nell’uomo 368
Cambiamenti di interi assetti cromosomici 422
Le mappe genetiche umane 369
Sommario 425
Focus sul genoma: Analisi del genoma
Approccio analitico alla soluzione
per la ricerca di geni coinvolti
di problemi di genetica 425
nella sclerosi multipla 372
Sommario 373
Approccio analitico alla soluzione Capitolo 17 Regolazione dell’espressione genica
di problemi di genetica 374
nei batteri e nei batteriofagi 427
Capitolo 15 La genetica dei batteri e dei batteriofagi 377 L’operone lac di E. coli
Focus sul genoma: Modelli di espressione
427

Analisi genetica nei batteri 377 genica 428


Mappatura dei geni nei batteri Il lattosio come fonte di carbonio per E. coli 428
mediante coniugazione 379 Prove sperimentali della regolazione dei geni lac 429
Scoperta della coniugazione in E. coli 379 Modello dell’operone di Jacob e Monod
Il fattore sessuale F 380 per la regolazione dei geni lac 431
Ceppi di E. coli ad alta frequenza Controllo positivo dell’operone lac 436
di ricombinazione 380 Dettagli molecolari della regolazione
Fattori F′ 382 dell’operone lac 437
Uso della coniugazione per mappare L’operone trp di E. coli 439
i geni batterici 383 Organizzazione dei geni
Circolarità della mappa di E. coli 383 per la biosintesi del triptofano 439
Mappatura dei geni nei batteri Regolazione dell’operone trp 440
per trasformazione 385 L’operone ara di E. coli:
Focus sul genoma: Vita artificiale: i genomi controllo positivo e negativo 443
artificiali e il trasferimento di genomi 386 La regolazione dell’espressione
Mappatura dei geni nei batteri genica nel fago lambda 443
mediante trasduzione 388 Eventi precoci nella trascrizione 444
Batteriofagi 388 Il ciclo lisogenico 445
Mappatura del cromosoma batterico Il ciclo litico 446
mediante trasduzione 389 Sommario 447
Indice ix

Approccio analitico alla soluzione Lo sviluppo è determinato da un’espressione


di problemi di genetica 447 genica differenziale 482
Costanza del DNA nel genoma
durante lo sviluppo 482
Capitolo 18 La regolazione dell’espressione genica Esempi di attività genica differenziale
negli eucarioti 449 durante lo sviluppo 484
Eccezione alla costanza del DNA genomico
Livelli di controllo dell’espressione genica durante lo sviluppo: perdita di DNA
negli eucarioti 450 nelle cellule che producono anticorpi 486
Controllo dell’inizio della trascrizione La determinazione del sesso e la compensazione
da parte delle proteine regolatrici 450 di dose nei mammiferi e in Drosophila 489
Regolazione dell’inizio della trascrizione Determinazione del sesso nei mammiferi 489
da parte degli attivatori 451 Focus sul genoma: L’ornitorinco: uno strano
Blocco dell’inizio della trascrizione mammifero con un genoma molto insolito 490
a opera dei repressori 452 Meccanismo di compensazione
Studio di un caso: regolazione positiva di dose per i geni X-linked nei mammiferi 491
e negativa della trascrizione dei geni Determinazione del sesso in Drosophila 492
per l’utilizzo del galattosio nel lievito 453 Compensazione di dose in Drosophila 495
Studio di un caso: regolazione della trascrizione Regolazione genetica dello sviluppo
da parte degli ormoni steroidei negli animali 454 del corpo di Drosophila 496
Regolazione genica di tipo combinatorio: Stadi di sviluppo in Drosophila 496
il controllo della trascrizione mediante Sviluppo embrionale 496
combinazioni di attivatori e repressori 457 Analisi dello sviluppo di Drosophila
Il ruolo della cromatina nella regolazione mediante microarray 503
della trascrizione genica 460 Ruolo dei miRNA nello sviluppo 503
Regolazione negativa della trascrizione Sommario 504
da parte degli istoni 460 Approccio analitico alla soluzione
Controllo dell’espressione genica di problemi di genetica 505
e rimodellamento della cromatina 461
Silenziamento genico e metilazione del DNA
Focus sul genoma: ChIP on chip
463
464 Capitolo 20 La genetica del cancro 507
Imprinting genomico 465 Le relazioni tra il ciclo cellulare,
Silenziamento genico il differenziamento e il cancro 508
in corrispondenza dei telomeri 467 Il controllo molecolare del ciclo cellulare 508
Controllo del processamento dell’RNA: La regolazione della divisione cellulare
poliadenilazione alternativa nelle cellule normali 510
e splicing alternativo 468 Il cancro è una malattia genetica 511
Controllo della traduzione dell’mRNA 469 Geni e cancro 511
Interferenza dell’RNA: silenziamento Oncogeni virali 511
dell’espressione genica a livello Oncogeni cellulari 515
post-trascrizionale mediante I geni soppressori dei tumori o oncosoppressori 518
piccoli RNA regolatori 470 I geni mutatori 524
Il ruolo dei piccoli RNA I geni dei microRNA 524
regolatori nel silenziamento L’accorciamento dei telomeri,
post-trascrizionale dei geni 471 la telomerasi e il cancro umano 525
Regolazione dell’espressione genica a livello La natura multifasica del cancro 526
post-trascrizionale mediante il controllo Progressione tumorale e metastasi 527
della degradazione dell’mRNA Focus sul genoma: Metilazione del DNA
e della degradazione delle proteine 473 e cancro 528
Controllo della degradazione dell’mRNA 473 Sostanze chimiche e radiazioni come cancerogeni 528
Controllo della degradazione delle proteine 474 I cancerogeni chimici 528
Sommario 476 Le radiazioni 529
Approccio analitico alla soluzione Sommario 529
di problemi di genetica 477 Approccio analitico alla soluzione
di problemi di genetica 530
Capitolo 19 Analisi genetica dello sviluppo 479
Eventi base dello sviluppo 479
Capitolo 21 Genetica di popolazioni 531
Organismi modello per l’analisi genetica La struttura genetica delle popolazioni 533
dello sviluppo 480 Frequenze genotipiche 533
x Indice

Frequenze alleliche 533 Metodi statistici 578


La legge di Hardy-Weinberg 536 Campioni e popolazioni 579
Assunzioni della legge di Hardy-Weinberg 537 Distribuzioni 579
Previsioni della legge di Hardy-Weinberg 538 La media 580
Da che cosa deriva la legge di Hardy-Weinberg 538 La varianza e la deviazione standard 580
Applicazione della legge Correlazione 581
di Hardy-Weinberg per loci Regressione 583
con più di due alleli 540 Analisi della varianza 584
Applicazione della legge Analisi genetica quantitativa 585
di Hardy-Weinberg Ereditarietà della lunghezza
per alleli legati al sesso 540 della pannocchia di mais 585
Test statistico delle proporzioni Ereditabilità 586
di Hardy-Weinberg 541 Componenti della varianza fenotipica 586
Utilizzo della legge di Hardy-Weinberg Ereditabilità in senso lato e in senso stretto 589
per la stima delle frequenze alleliche 542 Comprendere l’ereditabilità 589
La variabilità genetica nello spazio e nel tempo 542 Come si calcola l’ereditabilità 591
La variabilità genetica La risposta alla selezione 593
nelle popolazioni naturali 544 La stima della risposta alla selezione 593
Misura della variabilità genetica Correlazioni genetiche 594
a livello proteico 544 Loci per caratteri quantitativi (QTL) 596
Misura della variabilità genetica Focus sul genoma: Analisi dei QTL
a livello del DNA 546 associati al comportamento aggressivo
Focus sul genoma: Il progetto dei 1000 in Drosophila melanogaster 600
genomi 549 Sommario 600
Forze che cambiano le frequenze Approccio analitico alla soluzione
alleliche nelle popolazioni 550 di problemi di genetica 601
Mutazione 551
Deriva genetica casuale
Migrazione
553
559
Capitolo 23 Evoluzione molecolare 603
Selezione naturale 560 Tipi e modalità di sostituzione 604
L’equilibrio tra mutazione e selezione 567 Sostituzioni nucleotidiche
Scostamento dall’incrocio casuale 568 nella sequenza del DNA 604
Inincrocio (inbreeding) 568 Tassi di sostituzione nucleotidica 605
Riassunto degli effetti dei processi evolutivi Variabilità dei tassi evolutivi tra i geni 608
sulla struttura genetica di una popolazione 569 Tassi di evoluzione
Variazioni nelle frequenze alleliche del DNA mitocondriale 610
all’interno di un popolazione 569 Orologi molecolari 611
Aumento e diminuzione della variabilità Filogenesi molecolare 612
genetica entro le popolazioni 570 Alberi filogenetici 613
Gli effetti del crossing-over Metodi di ricostruzione 614
sulla variabilità genetica 570 Focus sul genoma: Il trasferimento
Il ruolo della genetica genico orizzontale 615
nella biologia della conservazione 571 Gli alberi filogenetici su grande scala 619
Speciazione 571 L’acquisizione e l’origine di nuove funzioni 621
Barriere al flusso genico 572 Famiglie multigeniche 621
Le basi genetiche della speciazione 572 Duplicazione e conversione genica 622
Sommario 573 Il genoma di Arabidopsis 623
Approccio analitico alla soluzione Sommario 623
di problemi di genetica 574 Approccio analitico alla soluzione
di problemi di genetica 624
Capitolo 22 Genetica quantitativa 575
La natura dei caratteri continui 575 Appendice Cenni di Probabilità e Statistica
Argomenti studiati in genetica quantitativa 576 di Giorgio Binelli (ONLINE)
La trasmissione ereditaria
dei caratteri continui 576 Glossario 625
L’ipotesi poligenica per l’ereditarietà
Letture consigliate 653
quantitativa 577
L’ipotesi poligenica per il colore Crediti 669
della cariosside di grano 577 Indice analitico 673
Prefazione all’edizione italiana

La nuova edizione del testo Russell è stata concepita al- fico box (Box 8.1) è stato introdotto per descrivere
lo scopo di apportare aggiornamenti rispetto all’edizione l’approccio “storico” del clonaggio posizionale. La
precedente, in un campo come quello scientifico, in cui parte relativa all’organizzazione del genoma umano
le nuove conoscenze, tecnologie e metodiche sono in è stata spostata in questo capitolo dal Capitolo 9. Nel-
continuo divenire. Questa edizione è stata anche integra- l’ambito dei vettori plasmidici è stata descritta la dif-
ta con alcuni contenuti riguardanti maggiormente l’uo- ferenza tra plasmidi ed episomi.
mo e le sue patologie per permettere l’uso del testo anche • Nel capitolo sulla “Genomica funzionale e compara-
a studenti di discipline mediche la cui conoscenza degli tiva” (Capitolo 9) la parte relativa al silenziamento
aspetti biologici, molecolari e biotecnologici della scien- genico è stata ampiamente riorganizzata e aggiornata.
za sono ormai imprescindibili per la loro professione. • La trattazione delle tecnologie del DNA ricombinan-
te (Capitolo 10) è stata riorganizzata e ampliata.
• Nei capitoli sulla genetica mendeliana è stato aggiun-
Cambiamenti rispetto all’edizione precedente to un esercizio svolto, relativo a un albero genealogi-
Tutto il testo è stato revisionato e, ove necessario, ag- co per un carattere autosomico recessivo (Capitolo
giornato sulla base di nuove conoscenze. Una maggiore 11) e una figura relativa a un albero genealogico per
integrazione delle varie parti è stata ottenuta con continui un carattere legato al cromosoma Y (Capitolo 12).
riferimenti tra capitoli per facilitare la consultazione del Altre figure sono state modificate per renderle più fa-
testo. Numerosi paragrafi sono stati rielaborati per ren- cilmente comprensibili.
dere il contenuto più facilmente comprensibile agli stu- • Il capitolo sulle “Estensioni e deviazioni dai principi
denti; inoltre, nella nuova edizione sono stati inseriti della genetica mendeliana” (Capitolo 13) è stato am-
contenuti aggiuntivi. piamente riorganizzato e integrato con diversi esem-
pi di rapporti di dominanza modificati e di interazio-
• La descrizione dell’organizzazione della cromatina e ni geniche (con riferimento anche a patologie uma-
dei suoi livelli di compattazione (Capitolo 2) è stata ne). Una nuova figura relativa alle vie biochimiche
arricchita ed è stata inclusa una figura riassuntiva. La che portano alla produzione del pigmento dell’oc-
parte relativa alla struttura dei telomeri è stata am- chio di Drosophila è stata introdotta per illustrare più
pliata. chiaramente quanto riportato nel testo. Le basi mole-
• La descrizione della replicazione delle estremità telo- colari della dominanza completa, incompleta e codo-
meriche, trattata nel capitolo sulla “Replicazione del minanza sono state descritte in modo più esteso, con
DNA” (Capitolo 3), è stata integrata per sottolineare esempi di comportamenti allelici in malattie umane.
le conseguenze cellulari dell’accorciamento dei telo- La trasmissione non mendeliana dei geni contenuti
meri e l’induzione della senescenza replicativa. nei genomi extranucleari è stata trattata più dettaglia-
• La trattazione delle mutazioni (Capitolo 7) è stata am- tamente, includendo la struttura dei genomi di mito-
pliata aggiungendo un nuovo paragrafo relativo alle condri e cloroplasti e la loro peculiare ereditarietà.
mutazioni dinamiche in cui sono descritti i meccani- • Il capitolo sulle “Mappe genetiche degli eucarioti”
smi che le originano, alcune patologie a esse legate e (Capitolo 14) è stato notevolmente ampliato relativa-
le loro conseguenze in termini di ereditarietà (antici- mente al confronto tra le mappe genetiche e le map-
pazione genetica). In particolare, relativamente alla pe fisiche, e agli studi di associazione nell’uomo (una
sindrome dell’X-fragile, il contenuto relativo è stato nuova figura esplicativa è stata inserita).
ripreso dal Capitolo 16, modificato e ampliato. Nel • Il capitolo sulle “Variazioni della struttura e del nu-
paragrafo sono state incluse due figure esplicative. mero dei cromosomi” (Capitolo 16) è stato aggiorna-
• La trattazione del Progetto Genoma Umano (Capi- to e ampliato. Ora comprende un nuovo Box che de-
tolo 8) è stata riorganizzata dedicando ampio spazio scrive il meccanismo genetico del crossing-over ine-
alla descrizione degli approcci genomici utilizzati guale, responsabile di aberrazioni cromosomiche
per l’assemblaggio di sequenze genomiche (come la (delezioni/duplicazioni) in relazione a patologie
costruzione di Contig, l’uso di STS, etc.). Uno speci- umane. Il paragrafo sui siti fragili è stato focalizzato
xii Prefazione all’edizione italiana

e aggiornato relativamente alla natura dei siti e alla teine e degli enzimi e il ruolo dei geni nell’indirizzamen-
loro probabile origine; sono stati descritti esempi di to e nella regolazione delle vie metaboliche. Per raffor-
correlazione tra i siti fragili e patologie nell’uomo zare la comprensione dei concetti presentati sono de-
(X-fragile, in parte trattato nel Capitolo 7, e tumori). scritti numerosi esempi di malattie genetiche umane do-
È stato introdotto il concetto di disomia uniparentale vute a carenze enzimatiche. La discussione della funzio-
e discusso il mosaicismo genetico relativamente alle ne genica nel Capitolo 4 consente agli studenti di capire
mutazioni cromosomiche. un concetto importante, cioè che i geni codificano per le
• La trattazione del ruolo della cromatina nella regola- proteine e per gli enzimi, preparandoli per i due capitoli
zione dell’espressione genica (Capitolo 18) è stata ri- successivi nei quali è discussa l’espressione genica. Il
organizzata, ampliata e largamente aggiornata, anche Capitolo 5 descrive la trascrizione e il Capitolo 6 tratta la
con l’introduzione di nuove figure esplicative. In par- struttura delle proteine, l’evidenza della natura del codi-
ticolare, è stato evidenziato il ruolo delle modifiche ce genetico e il processo di traduzione nei procarioti e
epigenetiche. negli eucarioti. Nel Capitolo 7 sono poi presentate le mo-
• Nel capitolo sull’“Analisi genetica dello sviluppo” dalità tramite cui il materiale genetico può modificarsi o
(Capitolo 19) è stato introdotto il ruolo delle cellule venire modificato. Gli argomenti presentati comprendo-
staminali adulte e i meccanismi molecolari coinvolti no i processi di mutazione genica (incluse le mutazioni
nel riarrangiamento cromosomico dei loci per le im- dinamiche o di triplette ripetute), alcuni meccanismi di
munoglobuline. riparazione dei danni al DNA, alcuni procedimenti usati
• La trattazione della genetica del cancro (Capitolo 20) per saggiare particolari tipi di mutanti, e le strutture e i
è stata ampliata e aggiornata: è stato analizzato il rap- movimenti degli elementi genetici trasponibili nei proca-
porto tra tumorigenesi e differenziamento cellulare rioti e negli eucarioti.
discutendo le nuove ipotesi riguardo l’origine dei tu- Nei tre capitoli successivi vengono descritte la geno-
mori (introduzione alle cellule staminali tumorali); è mica e la tecnologia del DNA ricombinante. Nel Capito-
stato inserito un nuovo paragrafo sui meccanismi lo 8 vengono presentate una visione d’insieme della map-
molecolari che portano alla progressione dei tumori patura e del sequenziamento dei genomi (incluso il
verso un fenotipo maligno e alla formazione di meta- Progetto Genoma Umano) e un’introduzione alle infor-
stasi, e un Box focalizzato sui meccanismi genetici mazioni ottenute dall’analisi della sequenza genomica.
responsabili della perdita dell’eterozigosi in tumori Quindi, nel Capitolo 9 vengono discusse la genomica
familiari. La descrizione degli oncogeni virali e cel- funzionale, l’analisi globale delle funzioni dei geni e del-
lulari è stata riorganizzata in modo più omogeneo e le sequenze extrageniche dei genomi, e la genomica com-
integrata con meccanismi aggiuntivi per l’attivazione parativa, ovvero il confronto di interi genomi (o di por-
di oncogeni cellulari da parte di virus e mutazioni. zioni di genomi) appartenenti alla stessa specie o a specie
• Nel Capitolo 21 sulla “Genetica di popolazioni” è diverse al fine di aumentare le nostre conoscenze circa le
stato brevemente introdotto il concetto di polimorfi- funzioni dei genomi, comprese le relazioni evolutive.
smo bilanciato. Nel Capitolo 10 sono discusse le applicazioni della
tecnologia del DNA ricombinante per l’analisi dei geni e
di altro DNA, dell’RNA e delle proteine, compresi i vari
Trattazione tipi di polimorfismi del DNA presenti nei genomi, la dia-
Le quattro aree principali della genetica – genetica della gnosi di malattie umane, le scienze forensi (tipizzazione
trasmissione dei caratteri, genetica molecolare, genetica del DNA), la terapia genica, lo sviluppo di prodotti com-
di popolazioni e genetica quantitativa – sono trattate in merciali e l’ingegneria genetica delle piante.
23 capitoli. I Capitoli da 11 a 18 sono capitoli centrali che tratta-
Il Capitolo 1 è un capitolo introduttivo ideato per ri- no i principi dell’analisi della segregazione genica. I
assumere i principali rami della genetica, descrivere ciò Capitoli 11 e 12 presentano i principi di base della gene-
che fanno i genetisti e le loro aree di ricerca e introdurre tica in riferimento alle leggi di Mendel. Il Capitolo 11 si
le banche dati e le mappe genetiche. concentra sui contributi di Mendel alla nostra compren-
I Capitoli dal 2 al 7 sono capitoli centrali che trattano sione dei principi dell’ereditarietà, mentre il Capitolo 12
dei geni e delle loro funzioni. Nel Capitolo 2 sono tratta- tratta della mitosi e della meiosi nel contesto dei cicli vi-
ti la struttura del DNA e i dettagli della struttura e del- tali animali e vegetali, delle prove sperimentali della re-
l’organizzazione del DNA nei cromosomi procariotici lazione tra geni e cromosomi e dei metodi di determina-
ed eucariotici. La replicazione del DNA nei procarioti e zione del sesso. La genetica mendeliana nell’uomo è in-
negli eucarioti e la ricombinazione tra molecole di DNA trodotta nel Capitolo 11 e si concentra sull’analisi degli
sono trattate nel Capitolo 3. Nel Capitolo 4 sono presi in alberi genealogici (pedigree) e dei caratteri autosomici.
esame alcuni aspetti della funzione dei geni, quali il con- Questo argomento continua nel Capitolo 12 con riferi-
trollo genetico della struttura e della funzione delle pro- mento ai geni legati al sesso. Le eccezioni, le estensioni
Prefazione all’edizione italiana xiii

e le deviazioni dai principi mendeliani (come l’esistenza svolgimento del programma di sviluppo corporeo di
di alleli multipli, i cambiamenti dei rapporti di dominan- Drosophila. Successivamente, nel Capitolo 20 viene di-
za, i geni essenziali e gli alleli letali, l’espressione genica scussa la relazione tra il ciclo cellulare e il cancro e i vari
e l’ambiente, l’effetto materno, i test di complementazio- tipi di geni che, se mutati, giocano un ruolo nello svilup-
ne, le interazioni tra geni e i rapporti mendeliani modifi- po dello stesso.
cati e l’eredità extranucleare) sono descritte nel Capitolo Nel Capitolo 21 sono presentati i principi di base del-
13. Nel Capitolo 14 si discute la mappatura dei geni ne- la genetica di popolazioni, che estende gli studi dell’ere-
gli eucarioti, attraverso la descrizione della determina- ditarietà dal singolo organismo a una popolazione di or-
zione dell’ordine e della distanza tra i geni sui cromoso- ganismi. Questo capitolo include anche una discussione
mi eucariotici in esperimenti progettati per quantificare i integrata dell’area in fase di espansione della genetica
crossing-over che si verificano durante la meiosi, e la della conservazione.
sottolineatura delle modalità di costruzione delle mappe Il Capitolo 22 tratta di genetica quantitativa. Viene
genetiche umane. Inoltre, viene trattato il confronto del- presa in considerazione l’ereditarietà dei caratteri che so-
le mappe genetiche con le mappe fisiche e la loro appli- no determinati da numerosi geni simultaneamente in
cazione per studi di associazione nell’uomo. gruppi di individui. In questo capitolo si discute anche il
Nel Capitolo 15 sono discussi i metodi per mappare i concetto di ereditabilità; la misura in cui una caratteristi-
geni nei batteri e nei batteriofagi sfruttando i processi di ca è determinata dai geni o dall’ambiente. Sono compre-
coniugazione, trasformazione e trasduzione. L’analisi se anche discussioni relative all’applicazione di strumen-
della struttura dei geni dei batteriofagi conclude questo ti molecolari in questa area della genetica.
capitolo. Le mutazioni cromosomiche – i cambiamenti Il Capitolo 23 tratta dell’evoluzione a livello moleco-
nella struttura normale dei cromosomi o nel numero dei lare delle sequenze del DNA e delle proteine. Lo studio
cromosomi – sono discusse nel Capitolo 16. Sono evi- dell’evoluzione molecolare utilizza il fondamento teori-
denziate le mutazioni cromosomiche negli eucarioti e le co della genetica di popolazione per affrontare due serie
sindromi umane da esse causate. sostanzialmente diverse di problematiche: come evolvo-
La regolazione genica è trattata nei due capitoli suc- no il DNA e le proteine e come i geni e gli organismi so-
cessivi. Il Capitolo 17 si concentra sulla regolazione del- no correlati a livello evolutivo.
l’espressione genica nei procarioti. In questo capitolo
vengono trattati argomenti quali l’operone come unità di
regolazione genica, i dettagli della regolazione dell’e-
Pearson Learning Solution
spressione genica in operoni batterici in base alle cono- Il volume è corredato da un codice di registrazione che
scenze attuali e la regolazione dei geni nei batteriofagi. Il consente l’accesso per diciotto mesi alla piattaforma
Capitolo 18 si concentra sulla regolazione dell’espres- e-Learning MyLab. Questa nuova piattaforma integra
sione genica negli eucarioti, sottolineando i cambiamen- l’attività di studio con un sistema di tutoring, esercita-
ti molecolari responsabili di essa; in particolare, viene zioni e strumenti per l’autovalutazione. In particolare
discusso il ruolo delle modificazioni epigenetiche. nella piattaforma sono presenti test a risposta multipla,
Il Capitolo 19 tratta dell’analisi genetica dello svilup- domande aperte e problemi di fine capitolo con le rela-
po. Vengono descritti gli eventi di base dello sviluppo e tive soluzioni, animazioni, iAttività e la versione di-
l’evidenza della derivazione dello sviluppo dall’espres- gitale del testo (eText) che contiene un’appendice
sione genica differenziale, per poi illustrare i principi di di “Statistica applicata alla genetica”. Le iAttività e
regolazione genica che operano in casi esemplificativi di le animazioni sono richiamate nel testo tramite
processi di sviluppo ben caratterizzati, in specifico la de-
terminazione del sesso e la compensazione di dose, e lo l’icona .
MyLab
Guida alla lettura
Poiché il campo della genetica è complesso, il suo studio risulta potenzialmente difficile: abbiamo pertanto incluso
numerosi strumenti pedagogici per aiutare gli studenti e per migliorare la comprensione degli argomenti.

Genomica funzionale

Domande chiave
9 e comparativa
Ogni capitolo si apre Come può essere attribuito un ruolo funzionale Come variano i trascritti e i prodotti proteici
a una sequenza di DNA nota? di tutti i geni del genoma in tipi cellulari
con un elenco diversi, o in condizioni differenti?
di domande chiave
Come comprendere la natura genica di una se- Come si possono rendere più efficaci
che preannunciano quenza di DNA nota? le terapie farmacologiche attraverso
agli studenti i concetti gli studi di genomica?
principali che
Come si possono confrontare geni identificati Come si possono ottenere informazioni sui
incontreranno ex novo con quelli studiati in precedenza? rapporti evolutivi fra organismi diversi attraver-
nel capitolo. so il confronto delle loro sequenze genomiche?

g g g
il restante 30% dei geni di lievito candidati non sono sta- Nota chiave
ti trovati omologhi nelle banche dati. Questa classe com-
prende quel 6-7% di geni candidati per i quali è dubbio Nota chiave Nel corso di ogni capitolo,
se siano o meno veri geni; cioè, alcune di queste ORF Per assegnare la funzione genica attraverso l’analisi posizionate strategicamente,
probabilmente non vengono trascritte. Le rimanenti ORF
a funzione ignota sono probabilmente veri geni, ma at-
al computer, la sequenza di un gene sconosciuto di sono inserite le cosiddette
un organismo viene confrontata con le sequenze di
tualmente sono stati identificati solo nel lievito. Questi geni a funzione nota presenti nelle banche dati. Per
“Note chiave”, che richia-
geni sono chiamati geni orfani singoli. Da quando questa il gene sconosciuto, la sequenza confrontata può es- mano le idee principali
analisi è stata effettuata per la prima volta, sono state as-
segnate funzioni a molte delle famiglie di geni orfani e ai
sere la sequenza di DNA o la sequenza amminoaci- e i punti fondamentali,
dica del polipeptide da essa codificato. Una ricerca
geni orfani singoli, ma c’è ancora un numero elevato di di similarità come questa può dare come risultato
consentendo agli studenti
geni di lievito (circa il 14%) che codifica per proteine per una corrispondenza per l’intera sequenza o per par- di verificare man mano
le quali non può essere predetta una funzione. Ciò non
vuol dire che le proteine codificate da questi geni siano
te di essa, indicando in quest’ultimo caso che un do- i loro progressi.
minio del prodotto genico ha una funzione nota.
prive di funzione; si tratta piuttosto di proteine non anco-
ra ben caratterizzate.
Se consideriamo i geni che codificano per proteine
alle quali è stato possibile assegnare una funzione puta-
Attribuire una funzione genica
tiva, ci possiamo chiedere quale percentuale dei geni nel attraverso la sperimentazione
genoma di lievito venga utilizzata per una particolare Un approccio chiave per attribuire una funzione genica
funzione. La Figura 9.2 mostra questo tipo di analisi per in modo sperimentale consiste nell’eliminare la funzio-
i i l di li i P i hi d i i di ld i i bi if i i

Focus sul genoma p

Tutti i capitoli, eccetto


l’introduzione, comprendono Focus sul genoma
rubriche chiamate “Focus sul La ricerca dei promotori
genoma”, scritte dall’esperto I promotori sono ovviamente importanti per la fun- perché si legano meno bene all’apparato della tra-
di genomica Gregg zione genica. Precedentemente in questo capitolo scrizione, o perché altre proteine aiutano l’RNA po-
Jongeward. Questi piccoli abbiamo definito le sequenze consenso per i pro- limerasi a legarsi. Uno dei primi obiettivi della ge-
motori e altre regioni regolatrici a monte, per nomica è stato l’analisi delle sequenze per ricercare
contributi introducono gli esempio le box TATA e CAAT. Le sequenze di questi possibili promotori, al fine di identificare i geni as-
studenti alla genomica grazie elementi, così come la loro distanza relativa l’uno sociati a quelle sequenze. Anche la ricerca di cornici
rispetto all’altro e rispetto al sito d’inizio della tra- di lettura aperte (ORF, Open Reading Frames), de-
alla connessione tra il conte- scrizione, sono importanti dal punto di vista funzio- scritte nel Capitolo 6, e di regioni contenenti i se-
nuto di ogni capitolo e le nale. Non tutti i geni mostrano nei loro promotori gnali di terminazione permettono l’individuazione
una corrispondenza precisa con queste sequenze, o di sequenze geniche nel genoma.
attuali applicazioni in questo
settore all’avanguardia.
Box
Box 3.1 Centrifugazione all’equilibrio in gradiente di densità
In alcuni capitoli sono
Negli esperimenti che implicano la centrifugazione esempio da 1,60 a 1,80 g/cm3. Se il DNA è mescola-
all’equilibrio in gradiente di densità, una soluzione to con il CsCl e tale miscela viene centrifugata, il
presenti dei “box” relativi
concentrata di cloruro di cesio (CsCl) viene centrifu- DNA si metterà in equilibrio nel punto del gradien- ad argomenti speciali,
gata ad alta velocità. Le forze opposte di sedimen- te in cui la sua densità è uguale a quella del CsCl cir- pertinenti alla trattazione
tazione e di diffusione producono un gradiente di costante (vedi Figura box 3.1). Si dice che il DNA ha
concentrazione di CsCl stabile e lineare. Le densità formato una banda nel gradiente. Se sono presenti del capitolo.
di CsCl alle estremità del gradiente sono correlate DNA con differenti densità, come nel caso di DNA
alla concentrazione del CsCl che viene centrifugato. 15N- 15N e DNA 14N- 14N, essi formeranno bande

Per esempio, al fine di esaminare DNA con densità (giungeranno all’equilibrio) in posizioni diverse. Il
di 1,70 g/cm3 (densità tipica del DNA), viene prodot- DNA viene rilevato in base all’assorbimento di rag-
to un gradiente che copre quella densità – per gi UV.

Figura box 3.1


Diagramma schematico che

Densità crescente
illustra la separazione di DNA
con diverse densità mediante DNA in CsCl
DNA 14N-14N
centrifugazione all’equilibrio
in un gradiente di densità di
cloruro di cesio. Viene La centrifugazione per 50-60
DNA 15N-15N
mostrata la separazione ore a 100 000!g dà luogo
di DNA 14N e DNA 15N. alla formazione di un gradiente
di CsCl con bande di DNA

Sommario Sommario
Ogni capitolo si conclude
 Esiste una relazione specifica tra geni ed enzimi, inizial- un individuo deve avere entrambi gli alleli mutati per il ge-
con un “Sommario”, che mente rappresentata dall’ipotesi un gene-un enzima, che ne implicato.
enfatizza ulteriormente i stabilisce che ogni gene controlla la sintesi o l’attività di un  Dallo studio delle alterazioni in proteine diverse dagli enzi-
singolo enzima. Poiché alcuni enzimi sono costituiti da più mi sono state ottenute prove convincenti che i geni control-
punti principali discussi. di un polipeptide, e i geni codificano per catene polipepti- lano la struttura di tutte le proteine, non solo di quelle che
diche individuali, questa relazione fu aggiornata nell’ipote- svolgono una funzione enzimatica.
si un gene-un polipeptide. Oggi sappiamo che non tutti i  La consulenza genetica consiste in un’analisi del rischio
geni codificano per proteine e che alcuni geni eucariotici che i futuri genitori possano generare un bambino con un
che codificano per proteine vengono espressi producendo difetto genetico e nella presentazione ai membri della fami-
più di un polipeptide. glia delle opzioni disponibili per evitare o ridurre al mini-
 Molte malattie genetiche umane sono causate da deficit in mo questi rischi. L’individuazione dei portatori e l’analisi
attività enzimatiche. La maggior parte sono ereditate come fetale permettono una precoce individuazione di una ma-
caratteri recessivi, vale a dire che per sviluppare la malattia lattia genetica.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


A eccezione del Capitolo 1 introduttivo, tutti i capitoli contengono una sezione intitolata
“Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica”. I principi della genetica sono
stati sempre esposti con un approccio mirato alla risoluzione dei problemi. Tuttavia, spesso
gli studenti all’inizio non hanno ancora acquisito l’esperienza necessaria dei concetti di base
per risolvere con metodo
i problemi assegnati.
Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica Tale sezione, in cui
D15.1 In E. coli i seguenti ceppi Hfr donano i geni indicati nel- N vengono risolti passaggio
l’ordine dato: D A
dopo passaggio problemi
B 4 3
Ceppo Hfr Ordine di trasferimento dei geni X
genetici esemplificativi,
1 G E B D N A
E T è stata creata per aiutare
2 P Y L G E B
3 X T J F P Y gli studenti a capire
J
4 B E G L Y P G
1 come affrontarli
+
Tutti i ceppi Hfr sono derivati dallo stesso ceppo F . Qual è L
2
F applicando i principi
l’ordine dei geni nel cromosoma del ceppo F+ originario? Y P fondamentali.
Pearson Learning Solution
La piattaforma MyLab è un ambiente digitale per lo studio, organizzato attorno al libro, che offre risorse
didattiche fruibili in modo autonomo o per assegnazione del docente.
Tra i materiali integrativi e multimediali troverete:

Domande e Problemi
Domande e problemi 15 Le sezioni “Domande e Problemi” di ogni
capitolo, comprendono complessivamente
*15.1 In incroci F+× F–, F–
il ricevente è convertito a ceppo dei ricombinanti h+ strR
che hanno ricevuto alcuni geni dalla
donatore con una frequenza molto alta. Tuttavia in incroci Hfr cellula Hfr. Il grafico del numero di ricombinanti rispetto al circa 750 quesiti con le relative soluzioni.
× F– raramente il ricevente diviene donatore. Spiegate perché. tempo è riportato nella figura.
a. Indicate se ciascuna delle seguenti affermazioni è vera o I casi presentati sono stati progettati per
15.2 La resistenza agli antibiotici nei batteri è un significativo falsa.
probema per la salute. Negli anni cinquanta del secolo scorso, i fornire agli studenti una metodologia nella
h+
medici identificarono pazienti ospedalizzati affetti da diarrea
grave, conseguenza di una dissenteria batterica che non rispon-
100
e+ risoluzione dei problemi di genetica.
% dei ricombinanti h+ strR

deva ad antibiotici precedentemente efficaci. Alcuni ceppi di 75


Shigella, il patogeno che causa la dissenteria batterica, avevano
b+
sviluppato resistenza. Negli anni settanta furono scoperte le ba- 50
si di questa resistenza: plasmidi che contenevano più geni per la g+
resistenza agli antibiotici furono isolati in Shigella. I ricercatori
25
poi scoprirono che gli stessi geni che conferivano resistenza in a+
Shigella erano presenti anche in altri batteri patogeni.
a. In ciascuno dei seguenti incroci, in che ordine dovrebbero 0
0 5 10 15 20 25
essere localizzati i geni che conferiscono resistenza per es- Minuti

Test a risposta multipla


Un ulteriore strumento per l’autovalutazione viene offerto agli studenti con
575 test a risposta multipla, che consentono di esercitarsi e di acquisire fami-
liarità con i temi trattati nei singoli capitoli. La piattaforma MyLab in questo
caso fornirà agli studenti un report costante del percorso di apprendimento e
dell’esito delle attività esercitative.

Animazioni e iAttività
Le iAttività sono state pensate per stimolare la risoluzione interattiva dei problemi introdotti nel corso della
trattazione. I video presentano esercitazioni guidate, alternate a domande di stimolo o di verifica, secondo
un itinerario didattico lineare. Le Animazioni mostrano invece alcuni processi fondamentali nell’ambito
della genetica. Queste risorse sono indicate nel testo con l’icona MyLab.
Negli animali si differenziano molti tipi di cellule, cia-
Attività scuno dei quali svolge una o più funzioni specializzate.
Andate nel sito dedicato agli studenti e, nella Le cellule degli animali non sono esposte a cambiamen-
iAttività Sorting the Signals of Gene Regulation ti rapidi nell’ambiente, come lo
(Scelta dei segnali della regolazione genica), svol- nimazione sono le cellule dei batteri o dei
MyLab gete il ruolo di un ricercatore che analizza alcuni
dei modi usati da una cellula eucariote per la rego-
Regolazione microrganismi eucarioti. Ciò si
lazione sincronizzata dei geni.
della trascrizione verifica perché la maggior parte
da parte degli delle cellule degli animali è
MyLab ormoni steroidei esposta al fluido intercellulare
Regolazione genica di tipo combinatorio: negli animali (che costituisce una sorta di
il controllo della trascrizione mediante “microambiente” per la cellu-
combinazioni di attivatori e repressori la), il cui contenuto di sostanze nutritive, ioni e altre im-
portanti molecole è relativamente costante. Cambiamen-
Negli eucarioti i geni codificanti per proteine contengono
ti del microambiente agiscono da segnali per la risposta
sia elementi del promotore sia enhancer (Capitolo 5). Gli

eText e Appendice
La versione digitale del libro, per tablet e pc,
è dotata di alcuni strumenti che permettono
di evidenziare, commentare e appuntare delle
note nel testo, avendo così la possibilità di
Appendice Cenni di Probabilità
e Statistica
personalizzare la lettura. Nell’eText è disponi-
bile un’appendice aggiuntiva che tratta gli di Giorgio Binelli
aspetti della statistica applicata alla genetica.
1 Introduzione alla genetica
Quali sono le principali branche Chi sono i genetisti e che cosa sono
della genetica? le ricerche genetiche?
Quali sono gli strumenti e i modelli
sperimentali della ricerca genetica?

Benvenuti nello studio della genetica, la scienza dell’e- con animali e piante. Tuttavia, i principi dell’ereditarie-
reditarietà. La genetica si occupa in primo luogo di com- tà non furono compresi fino alla metà del XIX secolo,
prendere le caratteristiche biologiche che vengono tra- quando Gregorio Mendel analizzò dal punto di vista
smesse dai genitori alla propria discendenza. Gli argo- quantitativo i risultati degli incroci di piante di pisello
menti che riguardano la genetica includono l’ereditarie- odoroso le cui caratteristiche differivano in modo facil-
tà, la natura molecolare del materiale genetico, il modo mente osservabile. Sebbene lo scienziato avesse pub-
con cui i geni, che determinano le caratteristiche dell’or- blicato questi risultati, il loro significato non venne
ganismo, controllano le funzioni della vita e la distribu- compreso fino a parecchi anni dopo la sua morte; solo
zione e il comportamento dei geni nelle popolazioni. allora infatti i ricercatori si accorsero che Mendel ave-
La genetica ha un ruolo centrale in biologia, dal mo- va scoperto i principi fondamentali dell’ereditarietà.
mento che l’attività dei geni è alla base di tutti i proces- Attualmente gli studi di Mendel sono considerati le
si vitali, dalla struttura e funzione della cellula fino alla fondamenta della genetica moderna.
riproduzione. Questo volume si propone di spiegare che Dall’inizio del XX secolo la genetica ha costituito
cosa sono i geni, come i geni sono trasmessi di genera- un potente strumento per lo studio dei processi biolo-
zione in generazione, in che modo avviene e come è re- gici. Un importante approccio utilizzato da molti gene-
golata la loro espressione. La rapida e costante acquisi- tisti prevede l’isolamento di mutanti di una cellula o di
zione di nuove informazioni genetiche non consente di un organismo che controllano particolari processi bio-
descrivere tutte le conoscenze del settore. I concetti e i logici, la comprensione dei quali è possibile grazie al-
principi più importanti vengono comunque presentati in la rilevazione delle differenze osservabili nelle cellule
modo accurato e completo; il lettore che volesse appro- o negli organismi mutati rispetto alle forme non muta-
fondire ulteriormente può usufruire di Internet, ricer- te. Queste ricerche si sono sviluppate in numerose di-
cando informazioni tramite Google Scholar o la banca rezioni, quali l’analisi dell’ereditarietà nelle popola-
dati PubMed, supportata dalla National Library of zioni, lo studio dei processi evolutivi, l’identificazione
Medicine e dai National Institutes of Health degli Stati e il posizionamento sul genoma dei geni che controlla-
Uniti d’America (Istituti Nazionali di Sanità, abbreviati no le diverse fasi di un processo, la determinazione dei
in NIH), al sito http://www.pubmed.gov. prodotti genici e l’analisi delle caratteristiche moleco-
Si presuppone che le nozioni apprese nel corso di lari dei geni, inclusa la regolazione dell’espressione
introduzione alla biologia abbiano fornito allo studente genica.
una conoscenza generale della genetica. Questo capito- Le ricerche genetiche subirono una rivoluzione nel
lo fornisce un quadro riassuntivo del contesto nell’am- 1972, allorché Paul Berg ottenne in vitro la prima mo-
bito del quale verrà affrontato lo studio della genetica lecola di DNA ricombinante, e nel 1973, quando Her-
nei successivi capitoli del volume. bert Boyer e Stanley Cohen clonarono per la prima vol-
ta una molecola di DNA ricombinante.
Nel 1986 la messa a punto da parte di Kary Mullis
Genetica classica e moderna della PCR (reazione a catena della polimerasi o
Gli uomini si erano accorti da lungo tempo che i figli Polymerase Chain Reaction), metodica per mezzo del-
tendevano a somigliare ai propri genitori e, per secoli, la quale è possibile amplificare specifici segmenti di
avevano altresì effettuato esperimenti di ibridazione DNA, produsse un’ulteriore rivoluzione. La tecnologia
2 Capitolo 1

del DNA ricombinante, la PCR e altre tecnologie mole- genetici, la McClintock ipotizzò che la comparsa delle
colari rendono ora possibile un numero sempre mag- macchie di colore fosse il risultato del movimento (tra-
giore di esaltanti scoperte, le quali portano a un incre- sposizione) di un segmento di DNA da una parte del
mento della conoscenza delle funzioni biologiche di genoma a un’altra. Soltanto molti anni dopo questi seg-
base, consentendo in tal modo un futuro miglioramento menti di DNA, denominati trasposoni o elementi tra-
nella qualità della vita umana. sponibili, vennero isolati e caratterizzati in dettaglio.
Allo stato attuale è in corso la rivoluzione genomica. (Nel Capitolo 7 è possibile leggere una descrizione più
Il sequenziamento del DNA di parecchi organismi, in- approfondita della storia di questa scoperta e della vita
cluso l’uomo, e di molti virus è stato ormai completato. di Barbara McClintock.) Attualmente è noto che i tra-
L’analisi dei dati sul genoma da parte dei genetisti for- sposoni sono ubiquitari e giocano un ruolo non solo
nisce contributi importanti alla conoscenza di numerose nell’evoluzione delle specie, ma anche nell’insorgenza
aree della biologia. Ovviamente, per noi è naturale che di alcune malattie umane.
la ricerca scientifica si focalizzi in particolare sui risul-
tati ottenuti studiando il genoma umano; per esempio, si
auspica di comprendere la struttura e la funzione di cia-
Le branche della genetica
scun gene che costituisce il nostro genoma. Infatti, una I genetisti spesso dividono la genetica in quattro impor-
tale conoscenza porterebbe indubbiamente a una mi- tanti branche.
gliore comprensione delle malattie genetiche umane e
contribuirebbe in modo significativo alla loro cura. Lo 1. La genetica della trasmissione dei caratteri, defi-
scenario da fantascienza, secondo il quale ogni essere nita talvolta genetica classica, è la branca che si oc-
umano porterà con sé la sequenza del proprio DNA ge- cupa della trasmissione dei geni e dei caratteri gene-
nomico in un “chip”, diventerà rapidamente realtà nel tici da una generazione a quella successiva e della
futuro. Tuttavia, il progresso delle conoscenze relative ricombinazione dei geni (ossia dello scambio di
al genoma umano suscita preoccupazioni sociali ed eti- materiale genetico tra i cromosomi). Alcuni esempi
che che devono essere affrontate con molta attenzione. di studi di genetica della trasmissione sono costitui-
ti dall’analisi della trasmissione dei caratteri in un
Genetisti e ricerca genetica albero genealogico umano e dagli incroci sperimen-
tali tra organismi modello.
Il materiale presentato in questo volume costituisce il 2. La genetica molecolare è la branca che si interessa
risultato dell’enorme numero di ricerche condotte dai della struttura e della funzione dei geni a livello mo-
genetisti nei diversi settori della biologia. I genetisti lecolare. Esempi di studi di genetica molecolare so-
impiegano metodi standardizzati per i loro studi scien- no l’analisi degli eventi molecolari coinvolti nel
tifici; in particolare, essi adottano un metodo di inda- controllo genetico della divisione cellulare e la re-
gine ipotetico-deduttivo, che consiste nel fare osser- golazione delle espressioni dei geni in un genoma.
vazioni, formulare ipotesi in grado di spiegare tali os- La genomica rientra nella genetica molecolare.
servazioni, eseguire esperimenti che consentano di fare 3. La genetica di popolazioni è la branca che studia
previsioni in base alle suddette ipotesi e, infine, saggia- l’ereditarietà dei caratteri determinati da uno o po-
re le proprie ipotesi. Queste prove sperimentali produ- chi geni in gruppi di individui. Un esempio di studio
cono nuove osservazioni, completando in tal modo un di genetica di popolazioni è la determinazione della
ciclo che conduce a un perfezionamento delle ipotesi e, frequenza di un gene che causa una malattia nella
talvolta, all’elaborazione di una teoria che cerca di popolazione umana.
spiegare le osservazioni iniziali. 4. La genetica quantitativa considera anch’essa l’e-
In modo analogo a quanto accade in ogni altra area reditarietà dei caratteri in gruppi di individui, ma i
della ricerca scientifica, non è possibile prevedere in caratteri analizzati vengono determinati da parecchi
modo preciso quale sarà il percorso di un progetto di ri- geni contemporaneamente. Un esempio di studio di
cerca genetica, ed è proprio l’imprevedibilità della ri- genetica quantitativa è quello condotto sulle piante
cerca a renderla eccitante, motivando gli scienziati a in agricoltura e consiste nell’analisi dell’abbondan-
impegnarsi in tali studi. Le scoperte che hanno rivolu- za del raccolto e del peso del frutto.
zionato la genetica non erano state pianificate; infatti,
esse si sono sviluppate nel corso di ricerche in cui si Sebbene questa suddivisione aiuti a pensare ai geni da
studiavano principi genetici di base. A tal proposito, il prospettive differenti, non esistono confini precisi tra le
lavoro di Barbara McClintock sull’ereditarietà delle diverse branche. Per esempio, sempre più di frequente i
macchie di colore presenti sulla cariosside del mais genetisti di popolazioni e quelli che studiano la geneti-
rappresenta un eccellente esempio. Dopo aver accumu- ca quantitativa analizzano i dati molecolari per deter-
lato una grande quantità di dati ottenuti da vari incroci minare le frequenze geniche in ampi gruppi di indivi-
Introduzione alla genetica 3

dui. Storicamente, la genetica della trasmissione dei ca- mazioni acquisite; per esempio, la tecnologia del DNA
ratteri si è sviluppata per prima, seguita dalla genetica ricombinante, una serie di procedure che permettono
di popolazioni, dalla genetica quantitativa e, infine, ai biologi molecolari di inserire un frammento di DNA
dalla genetica molecolare. di un organismo nel genoma di un altro organismo e di
I geni influenzano tutti gli aspetti degli organismi clonare (ossia di produrre numerose copie identiche) la
viventi. La comprensione della genetica della trasmis- nuova molecola di DNA ricombinante, ha influenzato
sione dei caratteri, della genetica di popolazioni e di profondamente sia la ricerca genetica di base sia quella
quella quantitativa potrà aiutare a capire la biologia applicata (vedi Capitoli 8, 9 e 10).
delle popolazioni, l’ecologia, l’evoluzione e il compor- L’esistenza di numerose aziende biotecnologiche si
tamento animale. Analogamente, la conoscenza della deve proprio alla tecnologia del DNA ricombinante;
genetica molecolare è importante per lo studio della esse cercano di clonare e manipolare geni per sviluppa-
neurobiologia, della biologia cellulare, della biologia re prodotti commerciali. Nell’ambito del miglioramen-
dello sviluppo, della fisiologia umana e delle piante, to genetico delle piante la tecnologia del DNA ricom-
dell’immunologia e, naturalmente, della struttura e fun- binante ha reso possibile introdurre nelle specie colti-
zione dei genomi. vate caratteristiche tipiche di specie selvatiche, quali la
resistenza a determinate malattie. Tradizionalmente
questo tipo di miglioramento delle colture veniva rag-
La ricerca di base e la ricerca applicata giunto mediante i consueti esperimenti di ibridazione.
La ricerca genetica, e la ricerca scientifica in generale, Relativamente al miglioramento genetico animale,
può essere di base o applicata. Nella ricerca di base la la tecnologia del DNA ricombinante viene impiegata
realizzazione degli esperimenti si propone di incremen- nell’allevamento dei bovini da carne e da latte e nell’al-
tare la conoscenza dei fenomeni fondamentali, indipen- levamento del pollame, al fine di incrementare, per
dentemente dal fatto che tale conoscenza abbia o meno esempio, la percentuale di carne magra, la quantità di
un’applicazione immediata. La maggior parte delle no- latte e il numero di uova. In medicina i risultati ottenu-
zioni riportate in questo volume si riferisce alla ricerca ti sono egualmente impressionanti; in particolare, la
di base. Per esempio, la regolazione dell’espressione di tecnologia del DNA ricombinante viene utilizzata per
numerosi geni procarioti ed eucarioti è attualmente no- la produzione di molti antibiotici, di ormoni e di altre
ta grazie a ricerche di base condotte su organismi mo- importanti sostanze medicali, quali il fattore di coagu-
dello, quali il batterio Escherichia coli (E. coli) (Figura lazione del sangue e l’insulina umana (Figura 1.2), e
1.1), il lievito Saccharomyces cerevisiae (Figura 1.4a) anche per la diagnosi e il trattamento terapeutico di nu-
e il moscerino della frutta Drosophila melanogaster merose malattie genetiche.
(Figura 1.4b). Le conoscenze ottenute attraverso la ri- In medicina legale la tipizzazione del DNA, definita
cerca di base vengono ampiamente utilizzate per stimo- anche DNA fingerprinting o DNA profiling, viene cor-
lare altra ricerca di base.
Nella ricerca applicata gli esperimenti vengono
eseguiti al fine di trovare la soluzione di specifici pro-
blemi che affliggono la società o di sfruttare le scoper-
te effettuate. In agricoltura la genetica applicata ha
contribuito in modo significativo al miglioramento de-
gli animali e delle piante utilizzati a scopo alimentare,
per esempio riducendo la quantità di grasso nei bovini
e nei suini o aumentando la quantità di proteine nelle
farine di soia. Un certo numero di malattie è causato
da difetti genetici e sono stati compiuti notevoli pro-
gressi nella diagnosi e nella comprensione delle basi
molecolari di alcune di queste patologie; per esempio,
sfruttando le informazioni acquisite dagli studi di ba-
se, la ricerca genetica applicata può impegnarsi nello
sviluppo di test diagnostici rapidi per le malattie gene-
tiche e nell’allestimento di nuovi farmaci per la cura di
queste ultime. Figura 1.1
Non esiste una demarcazione netta tra ricerca gene- In questa microfotografia, colorata e ottenuta
al microscopio elettronico, è possibile osservare
tica di base e ricerca genetica applicata. Infatti, in en- Escherichia coli, un batterio di forma bastoncellare
trambi i casi i ricercatori utilizzano tecniche simili e che si ritrova comunemente nell’intestino dell’uomo
formulano ipotesi in base a una certa quantità di infor- e di altri animali.
4 Capitolo 1

tando in modo critico i risultati ottenuti. Tuttavia, è pos-


sibile consultare un insieme di banche dati genetiche
estremamente importanti e utili presso il sito web del
National Center for Biotechnology Information, NCBI
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov). L’NCBI venne creato
nel 1988 negli Stati Uniti come risorsa nazionale di in-
Figura 1.2
formazioni di biologia molecolare. Il suo ruolo è “crea-
Esempio di un prodotto commerciale
sviluppato grazie all’impiego re banche dati pubbliche, condurre ricerche di bioinfor-
della tecnologia del DNA ricombinante. matica, sviluppare programmi informatici in grado di
Humulin, insulina umana per soggetti analizzare i dati sul genoma e rendere disponibili infor-
diabetici insulina-dipendenti. mazioni di interesse biomedico; l’obiettivo di tali attivi-
tà è il miglioramento della comprensione dei processi
molecolari relativi alla salute e alle malattie dell’uomo”.
rentemente utilizzata per l’accertamento di paternità, per Di seguito si elencano alcuni degli strumenti di ri-
la soluzione di casi criminali e negli studi antropologici. cerca disponibili al sito dell’NCBI.
In breve, la scienza della genetica si trova attualmente in
una fase di crescita importante ed entusiasmante, e le l PubMed è una banca dati che consente l’accesso a
scoperte da effettuare sono ancora numerose. citazioni bibliografiche e a riassunti di pubblicazio-
ni e fornisce collegamenti a siti contenenti articoli
di riviste scientifiche in forma elettronica. Questi
Nota chiave articoli possono essere letti liberamente oppure pos-
La genetica può essere suddivisa in quattro principa- sono essere richiesti con un pagamento una tantum
li branche: la genetica della trasmissione dei caratte- o la sottoscrizione di un abbonamento gratuito. Le
ri, la genetica molecolare, la genetica di popolazioni ricerche su PubMed possono essere effettuate per
e la genetica quantitativa. La ricerca genetica è con- parola chiave, nome degli autori o titolo delle rivi-
siderata di base o applicata, a seconda che l’obiettivo ste. È altamente raccomandato l’utilizzo di PubMed
sia la comprensione dei fenomeni genetici fonda- per trovare articoli relativi a ricerche genetiche.
mentali o lo sfruttamento delle scoperte realizzate. l OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man, os-
sia un database online sull’“eredità mendeliana del-
l’uomo”) è una banca dati di geni umani e di malat-
tie genetiche preparata e curata dal Dr. Victor A.
Le banche dati e le mappe genetiche
McKusick e dai suoi collaboratori. Le ricerche su
Due importanti risorse per la ricerca genetica sono le OMIM si effettuano introducendo termini in una fi-
banche dati genetiche e le mappe genetiche. Le banche nestra di ricerca; il risultato è un elenco di pagine
dati genetiche sono diventate molto più sofisticate ed collegate, ognuna con un numero specifico di “en-
estese da quando sono stati sviluppati strumenti infor- trata” OMIM. Le pagine offrono informazioni det-
matici di analisi computerizzata e l’accesso alle banche tagliate sul gene o sulla malattia genetica indicati
dati attraverso Internet è diventato un’operazione di nella ricerca iniziale; tali informazioni includono
routine. La costruzione di mappe genetiche fa parte dati genetici, biomedici e molecolari e una lista ag-
dell’analisi genetica da circa 100 anni. giornata di citazioni bibliografiche. In questo volu-
me verranno riportati riferimenti a voci di entrata
Le banche dati genetiche La quantità di informazioni OMIM ogniqualvolta si discuteranno un gene o
genetiche è aumentata in modo stupefacente. Non è più una malattia genetica umana.
necessario recarsi in una biblioteca universitaria per ac- l GenBank è la banca dati contenente le sequenze ge-
quisire conoscenze in ambito genetico. A tal proposito, netiche dei National Institutes of Health (NIH) degli
attualmente i computer svolgono un ruolo fondamenta- Stati Uniti. In particolare, questa banca dati è una
le; per esempio, un metodo efficace per ottenere infor- collezione annotata delle decine di miliardi di se-
mazioni genetiche tramite Internet consiste nell’intro- quenze di DNA disponibili pubblicamente. Le ricer-
durre parole chiave in motori di ricerca quali Google che su GenBank si effettuano introducendo termini
(http://www.google.com), i quali rispondono presen- in una finestra di ricerca. Per esempio, nel caso in
tando un elenco di siti web, alcuni dei quali possono es- cui interessi la malattia umana nota come fibrosi ci-
sere utili alla ricerca. stica, sarà sufficiente introdurre le parole “cystic fi-
L’elevato numero di banche dati genetiche non con- brosis” nella finestra di ricerca; in tal modo verran-
sente di riportarne un elenco in questo paragrafo. no trovate tutte le sequenze che sono state deposita-
Ognuno deve svolgere personalmente la ricerca, valu- te in GenBank e annotate con quelle due parole.
Introduzione alla genetica 5

l BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) è uno ossia la percentuale delle volte in cui nella progenie av-
strumento usato per comparare una sequenza nu- viene uno scambio fra i geni dei due cromosomi dei ge-
cleotidica o proteica con tutte le sequenze presenti nitori (vedi Capitolo 14). L’obiettivo della costruzione
nella banca dati, al fine di verificare eventuali corri- di una mappa genetica è la comprensione dell’organiz-
spondenze. Tale strumento risulta utile, per esem- zazione dei geni nei cromosomi (per esempio, può esse-
pio, quando si dispone della sequenza di un nuovo re importante sapere se geni con funzioni analoghe si
gene e si desidera sapere se qualcosa di simile è sta- trovano sullo stesso cromosoma e se sono vicini l’uno
to sequenziato in precedenza. Inoltre, attraverso all’altro). Le mappe genetiche si sono dimostrate utili
questa banca dati è possibile ottenere un elenco dei anche nello sforzo di clonare e sequenziare geni di par-
geni con funzioni analoghe, il che consente di foca- ticolare interesse e, più recentemente, nell’ambito di
lizzare la propria ricerca sulla funzione del gene og- progetti di genomica, hanno contribuito, insieme alle
getto di studio.
l Entrez è un sistema che permette di effettuare una ri-
cerca su diverse banche dati collegate. Le banche da- Distanze dei geni
(unità di mappa)
ti disponibili includono: PubMed; Nucleotide, per le
0,0
banche dati relative alle sequenze di DNA e RNA di
GenBank; Protein, per le sequenze amminoacidiche
delle proteine; Structure, per le strutture tridimensio-
nali delle macromolecole; Genome, per insiemi di
13,0 dumpy ali
genomi completi; RefSeq, per una lista di geni, tra-
scritti e proteine derivanti da tali trascritti; OMIM, la
banca dati di geni umani; PopSet, per dati derivanti
da studi di popolazioni. Le banche dati possono esse-
re scelte dai “link” maggiormente utilizzati o dal me-
nu a tendina presente sulla pagina principale di En-
trez. Per esempio, qualora interessino le sequenze nu-
cleotidiche correlate alla fibrosi cistica, si selezionerà
“Nucleotide” nel menu a tendina e si introdurranno le 44,0 ancon ali
parole “cystic fibrosis” nella finestra di ricerca; appa- 48,5 black corpo
rirà in tal modo un elenco di sequenze importanti. 53,2 tuft setole
l Books è una raccolta di libri di interesse biomedico 54,0 spiny zampe
54,5 purple occhi
su cui è possibile effettuare ricerche. In particolare, 55,2 apterous (senza ali)
in tale raccolta è possibile trovare libri di genetica, 55,5 tufted testa
di biologia molecolare e di biologia sperimentale. 57,5 cinnabar occhi
60,1 arctus oculus occhi

Una caratteristica particolarmente efficace delle ban- 72,0 lobe occhi


che dati dell’NCBI è quella di essere collegate fra loro, 75,5 curved ali
consentendo all’utilizzatore di integrare in modo rela-
tivamente rapido le conoscenze ottenute da ciascuna di
esse. Per esempio, una citazione bibliografica trovata
in PubMed potrà avere collegamenti (“link”) con le se-
quenze nelle banche dati nucleotidiche e proteiche. 91,5 smooth addome

Le mappe genetiche Sin dal 1902 è stato compiuto un 104,5 brown occhi
grande sforzo per costruire mappe genetiche (Figura 107,0
orange occhi
1.3) degli organismi più utilizzati nella sperimentazio-
ne genetica. Analogamente alle mappe stradali, che ri-
Figura 1.3
portano le posizioni delle città lungo una strada, la Esempio di mappa genetica che illustra alcuni geni localizzati
mappa genetica illustra la disposizione dei geni lungo sul cromosoma 2 del moscerino della frutta Drosophila me-
un cromosoma e la distanza genetica tra i geni. La posi- lanogaster. I numeri rappresentano le distanze dei geni
zione di un gene sulla mappa viene definita semplice- dall’estremità del cromosoma (in alto) misurate in unità
di mappa (um, vedi Capitolo 14). Le distanze di mappa sono
mente locus oppure locus genico.
calcolate sulla base della frequenza di ricombinazione e sono
Le distanze genetiche tra i geni localizzati sullo stes- additive (ciò permette di ottenere valori superiori a 50 um
so cromosoma vengono determinate in base ai risultati pur essendo la frequenza massima di ricombinazione fra due
di incroci, calcolando la frequenza di ricombinazione, loci pari al 50%).
6 Capitolo 1

mappe fisiche (in cui la posizione del gene non è ottenu- Nella ricerca genetica vengono impiegati sia organismi
ta mediante incroci; vedi Capitolo 8) al sequenziamento eucarioti sia organismi procarioti. Gli eucarioti (termine
completo dei genomi di numerosi organismi. che deriva dal greco antico e che significa “nucleo per-
fetto”) sono organismi che hanno cellule nelle quali il
materiale genetico, il DNA, è localizzato nel nucleo,
una struttura cellulare distinta circondata da una mem-
Nota chiave brana. Gli organismi eucarioti possono essere unicellu-
Due importanti risorse per la ricerca genetica sono lari o pluricellulari. Gran parte della ricerca genetica at-
le banche dati genetiche e le mappe genetiche. Le tuale viene condotta su questi sei organismi eucarioti
banche dati forniscono gli strumenti per la ricerca (Figura 1.4a-f): Saccharomyces cerevisiae (lievito di
di specifiche informazioni su un gene (la sua se- birra), Drosophila melanogaster (moscerino della frut-
quenza, la sua funzione e la sua posizione nel ge- ta), Caenorhabditis elegans (nematode), Arabidopsis
noma), come le pubblicazioni scientifiche e altri thaliana (specie erbacea della famiglia delle Bras-
dettagli in merito al prodotto codificato da quel sicaceae), Mus musculus (topo) e Homo sapiens (uomo).
particolare gene. Le mappe genetiche indicano la Sebbene non possieda le caratteristiche degli organismi
posizione dei geni lungo i cromosomi; esse si sono adatti agli esperimenti genetici, la specie umana viene
rivelate utili per clonare i geni e per il sequenzia- inclusa in questo elenco perché l’interesse primario del-
mento dei genomi. la ricerca genetica è l’ottenimento del maggior numero
possibile di informazioni sui geni umani e le loro funzio-
ni. Tali conoscenze renderanno possibile combattere le
Gli organismi utilizzati malattie genetiche e acquisire conoscenze fondamentali
circa lo sviluppo e l’evoluzione della nostra specie.
nella ricerca genetica Negli ultimi anni anche i seguenti sette organismi eu-
Il principio dell’ereditarietà fu stabilito per la prima carioti hanno contribuito in modo significativo alla com-
volta nel XIX secolo con gli esperimenti sulle piante di prensione della genetica (Figura 1.4g-m): Neurospora
pisello odoroso effettuati da Gregorio Mendel. Dopo crassa (la muffa del pane), Tetrahymena (protozoo),
Mendel, molti altri organismi sono stati utilizzati negli Paramecium (protozoo), Chlamydomonas reinhardtii
esperimenti genetici. In generale, l’obiettivo della ri- (alga verde), Pisum sativum (pisello odoroso), Zea mays
cerca genetica è stato la comprensione della struttura e (mais) e Danio rerio (pesce zebra). Fra questi, Tetrahy-
della funzione dei geni. Grazie al grado elevato di con- mena, Paramecium, Chlamydomonas e Saccharomyces
servazione delle funzioni dei geni nel corso dell’evolu- sono unicellulari, mentre gli altri sono pluricellulari.
zione, gli scienziati hanno compreso che i risultati otte- Molte caratteristiche delle cellule eucariote sono
nuti da studi condotti su particolari organismi avrebbe- state probabilmente apprese nel corso di introduzione
ro potuto essere applicati a tutti gli organismi. Tra le ca- alla biologia. La Figura 1.5 mostra le rappresentazioni
ratteristiche che hanno reso un particolare organismo schematiche di una tipica cellula vegetale e di una tipi-
un modello per la sperimentazione in genetica vi sono ca cellula animale. In entrambe le tipologie cellulari è
le seguenti: presente una membrana lipidica, denominata membra-
na plasmatica, che delimita il citoplasma. Le cellule
l l’organismo deve avere un ciclo vitale breve, in mo- vegetali, a differenza di quelle animali, presentano una
do che sia possibile ottenere numerose generazioni parete cellulare rigida all’esterno della membrana pla-
in un tempo relativamente rapido. Il moscerino del- smatica. Il nucleo delle cellule eucariote contiene il
la frutta, per esempio, produce una generazione DNA complessato con proteine e organizzato in un cer-
ogni 10-14 giorni; to numero di strutture lineari chiamate cromosomi. Il
l la progenie prodotta da un accoppiamento deve es- nucleo è separato dal resto della cellula, costituito dal
sere numerosa; citoplasma e dagli organelli associati, tramite una dop-
l l’organismo deve essere facile da gestire sperimen- pia membrana che costituisce l’involucro nucleare.
talmente. Per esempio, centinaia di moscerini della Tale membrana è dotata di permeabilità selettiva e pos-
frutta possono essere facilmente contenuti in picco- siede pori di diametro compreso tra i 20 e gli 80 nm (1
le bottiglie; nm = nanometro = 10–9 metri) che consentono il pas-
l l’aspetto più importante è che ci sia variabilità ge- saggio di materiale tra nucleo e citoplasma. Per esem-
netica tra gli individui della popolazione studiata o pio, l’RNA messaggero, deputato alla produzione di
che tale variabilità venga prodotta nella popolazio- polipeptidi a livello citoplasmatico, viene sintetizzato
ne inducendo l’insorgenza di mutazioni, in modo nel nucleo e transita attraverso i pori per raggiungere il
tale che sia possibile studiare la trasmissione eredi- citoplasma. In direzione opposta, gli enzimi coinvolti
taria dei caratteri. nella replicazione, nella riparazione e nella trascrizione
Introduzione alla genetica 7

a) Saccharomyces cerevisiae b) Drosophila melanogaster


(lievito di birra) (moscerino della frutta) c) Caenorhabditis elegans (nematode)

d) Arabidopsis thaliana (pianta e) Mus musculus (topo) f) Homo sapiens (uomo)


erbacea appartenente alla
famiglia delle Brassicaceae)

g) Neurospora crassa h) Tetrahymena i) Paramecium (protozoo) j) Chlamydomonas


(muffa rosa del pane) (protozoo) reinhardtii
(alga verde)

k) Pisum sativum l) Zea mays (mais) m) Danio rerio (pesce zebra)


(pisello
odoroso)

Figura 1.4
Organismi eucarioti che hanno contribuito in modo significativo alla conoscenza della genetica.
8 Capitolo 1

a) Cellula vegetale b) Cellula animale

Citoscheletro
Grande Perossisoma
vacuolo
centrale Mitocondri

Ribosomi
Membrana
nucleare

Poro nucleare

Cromatina

Centrioli

Nucleolo
Reticolo
endo-
plasmatico
rugoso
Nucleo
Reticolo
Tonoplasto endoplasmatico
liscio
Cloroplasto Apparato
Plasmodesmi del Golgi
Lisosoma
Parete
cellulare Citoplasma

Membrana
plasmatica
Figura 1.5
Le cellule eucariote. Schemi di sezioni trasversali e gli organelli principali di (a) una tipica cellula vegetale
che illustrano le caratteristiche di organizzazione e (b) una tipica cellula animale.

del DNA, nonché le proteine che si associano al DNA che gli conferiscono il caratteristico aspetto rugoso.
costituendo il cromosoma, vengono sintetizzati nel ci- Questi ribosomi sintetizzano proteine che sono secrete
toplasma ed entrano nel nucleo attraverso i pori. dalle cellule o devono essere localizzate nella membra-
Il citoplasma delle cellule eucariote contiene orga- na plasmatica o in particolari organelli intracellulari.
nelli e molti materiali di diverso tipo. Per i genetisti le La sintesi delle altre proteine viene realizzata dai ribo-
strutture intracellulari di particolare interesse sono i somi liberi nel citoplasma.
centrioli, il reticolo endoplasmatico (RE), i ribosomi, i I mitocondri (vedi Figura 1.5) sono grandi organel-
mitocondri e i cloroplasti. li circondati da una doppia membrana (la membrana in-
I centrioli, definiti anche corpi basali, si ritrovano terna è altamente circonvoluta). Questi organelli gioca-
nel citoplasma di quasi tutte le cellule animali (vedi no un ruolo cruciale nei processi energetici cellulari e
Figura 1.5b), mentre non sono presenti nelle cellule ve- contengono DNA che codifica alcune delle proteine ne-
getali. Nelle cellule animali una coppia di centrioli è lo- cessarie al funzionamento del mitocondrio e alcune
calizzata al centro del centrosoma, una regione citopla- componenti del macchinario necessario alla sintesi del-
smatica indifferenziata che organizza le fibre del fuso, le proteine mitocondriali.
strutture coinvolte nella segregazione cromosomica du- Molte cellule vegetali contengono i cloroplasti,
rante le fasi della mitosi e della meiosi (processi discus- grandi organelli avvolti da una tripla membrana che
si nel Capitolo 12). contengono clorofilla e sono coinvolti nella fotosintesi
Il reticolo endoplasmatico è una struttura a doppia (vedi Figura 1.5a). Analogamente ai mitocondri, questi
membrana che fa parte del sistema di endomembrane e organelli contengono DNA che codifica alcune protei-
si trova in continuità con la membrana nucleare. A dif- ne che svolgono precise funzioni nel cloroplasto e alcu-
ferenza di quello liscio, il reticolo endoplasmatico ru- ne componenti del macchinario di sintesi proteica del
goso presenta sulla sua superficie i ribosomi attaccati, cloroplasto.
Introduzione alla genetica 9

I procarioti (termine che deriva dal Capsula


greco antico e significa “prenucleari”)
non presentano una membrana nu-
Membrana
cleare che circonda il materiale gene- esterna
tico (Figura 1.6); questa è la caratteri-
stica principale che li contraddistin-
gue. A questo gruppo di organismi ap- Parete cellulare
partengono tutti i batteri, che possono
assumere forma sferica, a bastoncello
Membrana
o a spirale. La forma del batterio è plasmatica
mantenuta da una parete cellulare rigi-
da collocata esternamente alla mem- Regione
brana cellulare. È possibile suddivide- del nucleoide (DNA)
re i procarioti in due gruppi evolutiva-
Ribosomi
mente distinti: i Bacteria (batteri) e gli
Archaea. I batteri si trovano comune-
mente negli organismi viventi (natu-
Pili
ralmente o tramite infezione), nel suo-
lo e nell’acqua. Gli Archaea sono pro-
carioti che vivono spesso in condizio-
ni ambientali molto inospitali, quali
l’acqua calda, le saline ricche di meta-
no o le profondità oceaniche, dove i
batteri non riescono a proliferare.
Inoltre, gli Archaea sono stati trovati
in particolari condizioni anche nel
suolo e nell’acqua. I batteri hanno
un diametro che varia dai 100 nm ai
Flagelli
10 µm. La specie di maggiori dimen-
sioni, la Thiomargarita namibiensis,
di forma sferica, può raggiungere un
Figura 1.6
diametro pari a 3/4 di millimetro, di- Schema della sezione trasversale di una tipica cellula procariote.
venendo in tal caso visibile a occhio
nudo (circa la dimensione di un oc-
chio di Drosophila melanogaster).
Nella maggior parte dei casi i procarioti studiati dai
genetisti sono batteri; in particolare, quello più studiato
è Escherichia coli (Figura 1.1), un batterio di forma ba- Nota chiave
stoncellare che si ritrova comunemente nell’intestino Gli eucarioti sono organismi nelle cui cellule il ma-
dell’uomo e di altri animali. Gli studi condotti su tale teriale genetico è localizzato in un nucleo provvi-
batterio hanno contribuito in modo significativo all’au- sto di membrana. Il materiale genetico è organiz-
mento della comprensione della regolazione dell’e- zato in numerosi cromosomi lineari. I procarioti, al
spressione genica e allo sviluppo della biologia mole- contrario, non possiedono un nucleo provvisto di
colare. Attualmente E. coli viene ampiamente utilizza- membrana.
to anche negli esperimenti di DNA ricombinante.
10 Capitolo 1

Sommario
l La genetica spesso viene suddivisa in quattro principali tici fondamentali, o “applicata”, quando l’obiettivo è lo
branche: la genetica della trasmissione dei caratteri, che sfruttamento delle scoperte genetiche.
si occupa della trasmissione dei geni da una generazione l Le banche dati genetiche forniscono strumenti per ricer-
all’altra; la genetica molecolare, che si interessa della care specifiche informazioni che riguardano un gene e i
struttura e della funzione dei geni a livello molecolare; la suoi prodotti. Le mappe genetiche illustrano la disposi-
genetica di popolazioni, che studia l’ereditarietà dei ca- zione dei geni sui cromosomi.
ratteri determinati da uno o pochi geni in gruppi di indi- l Gli eucarioti sono organismi che hanno cellule nelle
vidui; la genetica quantitativa, che considera l’ereditarie- quali il materiale genetico è localizzato in un nucleo
tà dei caratteri determinati da numerosi geni contempo- provvisto di membrana. Il materiale genetico è organiz-
raneamente in gruppi di individui. zato in cromosomi lineari. Al contrario, i procarioti non
l La ricerca genetica si definisce “di base”, quando si pro- possiedono un nucleo provvisto di membrana.
pone di incrementare la conoscenza dei fenomeni gene-
2 DNA: il materiale genetico
Qual è la natura molecolare del materiale In che modo è organizzato il DNA
genetico? nei cromosomi?

Qual è la struttura molecolare del DNA


e dell’RNA?

Attività molecolare mediante il quale avviene la trasmissione


Immaginate di tenere fra le mani una scato- dell’informazione genetica di generazione in genera-
la nera proveniente dal mare all’interno della zione. Saranno spiegate la struttura del gene e le moda-
quale sia contenuto il segreto della vita. Immagi- lità attraverso cui i geni esprimono il loro messaggio.
nate inoltre che l’identificazione della composi-
La trattazione del presente capitolo inizierà illu-
zione chimica, della struttura molecolare e della
funzione del contenuto della suddetta scatola
strando gli avvenimenti che condussero gli scienziati
possa consentire di salvare vite umane, fornire alla scoperta della natura e della struttura del materia-
nutrimento agli affamati, risolvere crimini e, addi- le genetico. Tali scoperte portarono a un’esplosione
rittura, creare nuove forme di vita. Che cosa con- delle conoscenze relative agli aspetti molecolari della
tiene la scatola? Quali strumenti e quali tecniche biologia.
potrebbero essere impiegate per scoprirlo?
In questo capitolo scoprirete in che modo gli
scienziati hanno identificato il contenuto di que- La ricerca del materiale genetico
sta “scatola nera”, rivelando così il “segreto della Molto tempo prima della scoperta del ruolo del DNA e
vita”. Più avanti nel presente capitolo sarà possi- dell’RNA come portatori delle informazioni genetiche,
bile applicare quanto appreso attraverso la
gli scienziati avevano intuito che gli organismi viventi
iAttività, nella quale verranno impiegati numerosi
strumenti e tecniche utili alla determinazione del-
dovevano contenere una sostanza responsabile della
la natura genetica di un virus capace di devastare trasmissione delle informazioni dai genitori ai figli. I
le piante di riso. genetisti si erano convinti che il materiale responsabile
delle informazioni ereditarie dovesse presentare tre ca-
ratteristiche essenziali, ossia:
Una semplice osservazione appare in grado di evidenzia-
re l’esistenza di enormi differenze tra individui di una 1. contenere, in forma stabile, le informazioni concer-
stessa specie. Per esempio, nonostante tutti gli uomini nenti la struttura, la funzione, lo sviluppo e la ripro-
appartengano alla specie Homo sapiens, i diversi indivi- duzione delle cellule di un organismo;
dui di tale specie differiscono per altezza, colore degli 2. essere in grado di replicare accuratamente le infor-
occhi, della pelle e dei capelli. La variabilità intraspecifi- mazioni, in modo che le cellule della progenie possa-
ca e interspecifica rappresenta principalmente il risultato no avere le stesse informazioni genetiche di quelle
delle differenze che intercorrono a livello delle sequenze dei genitori;
di DNA dei geni che costituiscono il genoma degli esse- 3. essere capace di cambiare. Infatti, l’assenza di va-
ri viventi. L’informazione genetica codificata nel DNA è riabilità genetica impedisce agli organismi di diffe-
ampiamente responsabile della struttura, della funzione e renziarsi e di adattarsi, rendendo impossibile l’evo-
dello sviluppo delle cellule in ogni organismo. luzione.
Nei prossimi capitoli verranno analizzate la struttu-
ra molecolare e la funzione del materiale genetico (sia Il biochimico svizzero Friedrich Miescher è noto per la
dell’acido desossiribonucleico – DNA – sia dell’acido scoperta, nel 1869, dell’acido nucleico. Egli isolò una
ribonucleico – RNA) e verrà esaminato il meccanismo sostanza dai leucociti contenuti nel pus presente sulle
12 Capitolo 2

bende dei feriti di guerra. Sebbene in un primo momen- una mutazione che impedisce la formazione dell’involu-
to lo scienziato avesse immaginato che tale sostanza cro polisaccaridico. La mutazione è un cambiamento
fosse costituita da una proteina, alcuni test chimici di- ereditario nel materiale genetico (vedi Capitolo 7). In
mostrarono che essa conteneva carbonio, idrogeno, os- questo caso la mutazione del gene pregiudica la capaci-
sigeno, azoto e fosforo; all’epoca era già noto che que- tà del batterio di formare la capsula alterando, di conse-
st’ultimo elemento non rappresenta un costituente delle guenza, lo stato di virulenza del batterio stesso.
proteine. Analizzando materiale di diversa provenienza, Esistono diverse varianti del ceppo S, ciascuna ca-
Miescher osservò la medesima sostanza nel nucleo di ratterizzata da una distinta composizione chimica del-
tutti i campioni esaminati, e la definì pertanto “nuclei- l’involucro polisaccaridico. Griffith condusse i suoi
na”; in quel momento erano sconosciute sia la sua esat- studi utilizzando i ceppi IIS e IIIS, che presentavano ri-
ta posizione nelle cellule sia la sua funzione. spettivamente un involucro di tipo II e III; le cellule di
All’inizio del Novecento fu dimostrato sperimental- tipo S possono mutare in cellule di tipo R e viceversa.
mente che i cromosomi, strutture filamentose presenti Le mutazioni sono tipo-specifiche nel senso che, se una
nei nuclei delle cellule, erano portatori di informazione cellula del tipo IIS muta in una cellula di tipo R, que-
genetica. Nel corso dei successivi quarant’anni le anali- st’ultima può retromutare unicamente nel tipo IIS e non
si chimiche rivelarono che i cromosomi sono costituiti nel tipo IIIS.
da proteine e acidi nucleici; questi ultimi rappresentano Griffith iniettò differenti ceppi batterici nei topi e ne
una classe di composti che include DNA e RNA. osservò gli effetti (Figura 2.2). I topi iniettati con batteri
In un primo momento molti scienziati ritennero che del ceppo IIR (ossia batteri derivanti da mutazioni del
le proteine nei cromosomi costituissero il materiale ceppo IIS) sopravvivevano, mentre i topi iniettati con
ereditario. Essi pensavano che le proteine avessero una batteri vivi del ceppo IIIS morivano e dal loro sangue era
grande capacità di immagazzinare informazioni, poi- possibile isolare batteri vivi di tipo IIIS. Tuttavia, se i
ché erano composte da 20 differenti amminoacidi.*
Invece, il DNA, costituito da quattro nucleotidi, era ri- a) Fotografia al microscopio elettronico che mostra singoli batteri.
tenuto una molecola troppo semplice e, pertanto, ina-
datta a contenere le informazioni responsabili delle
differenze che è possibile rilevare nei diversi organi-
smi viventi. Tuttavia, a partire dalla fine degli anni
venti del Novecento, una serie di esperimenti condus-
se alla definitiva identificazione del DNA quale mate-
riale genetico.

L’esperimento di trasformazione
di Griffith
Nel 1928 Frederick Griffith, un ufficiale medico inglese,
era impegnato nello studio di Streptococcus pneumoniae
(chiamato anche pneumococco), un batterio in grado di
b) Colonie di batteri c) Colonie di batteri
causare la polmonite (Figura 2.1a). Griffith utilizzava del ceppo S (liscio). del ceppo R (rugoso).
due ceppi del batterio: il ceppo S (Smooth), che produce
una colonia liscia e lucente ed è virulento (ovvero alta-
mente infettivo) (Figura 2.1b), e il ceppo R (Rough), che
dà origine a colonie rugose e non è virulento (non è in-
fettivo) (Figura 2.1c). La differenza molecolare tra i due
ceppi non era ancora nota a quel tempo; oggi sappiamo
che la virulenza del ceppo S è dovuta alla presenza di un
involucro polisaccaridico, o capsula, che avvolge ogni
cellula. La presenza di tale involucro determina inoltre
la lucentezza e l’aspetto liscio delle colonie del ceppo S.
Il ceppo R si differenzia da un punto di vista genetico dal
ceppo S esclusivamente per il fatto che esso contiene

* A quel tempo erano noti 20 amminoacidi. Un ventunesimo am- Figura 2.1


minoacido fu identificato nel 1970, un ventiduesimo nel 2002. Il batterio Streptococcus pneumoniae.
DNA: il materiale genetico 13

Batteri Calore Calore


con capsula
polisaccaridica

Tipo IIR: Tipo IIIS: Tipo IIIS: uccisi Tipo IIR vivi, Tipo IIIS: uccisi
vivi, non virulenti vivi, virulenti con il calore, non virulenti
+ con il calore,
non virulenti non virulenti

Iniettare il topo Iniettare il topo Iniettare il topo Iniettare il topo

Sopravvive: Muore: Sopravvive: Muore:


non si si trovano non si si trovano
trovano batteri trovano batteri
batteri virulenti batteri virulenti
di tipo IIIS di tipo IIIS

Figura 2.2
L’esperimento di trasformazione di Griffith. Topi a cui del tipo IIIS uccisi con il calore sopravvivevano. Tuttavia,
erano stati iniettati pneumococchi del tipo IIIS morivano, se iniettati con una miscela di batteri di tipo IIR vivi e di tipo
mentre topi iniettati o con batteri del tipo IIR o con batteri IIIS uccisi con il calore, i topi morivano.

batteri IIIS venivano uccisi al calore prima dell’infezio- importanza che viene impiegata negli esperimenti di in-
ne, i topi vivevano. Tali esperimenti dimostrarono che i gegneria genetica; vedi Capitolo 8.)
batteri dovevano essere vivi e possedere la capsula poli-
saccaridica per essere virulenti e uccidere i topi.
Nei suoi esperimenti fondamentali Griffith infettò i
L’esperimento di trasformazione di Avery
topi con una miscela di batteri IIR vivi e IIIS uccisi con Negli anni trenta e quaranta del Novecento il biologo
il calore. I topi morirono e il batterio del tipo IIIS fu iso- americano Oswald T. Avery, insieme ai colleghi Colin
lato dal loro sangue. Questi batteri non potevano deriva- M. MacLeod e Maclyn McCarty, tentò di identificare il
re da una mutazione dei batteri del tipo R, dal momento “principio trasformante” di Griffith studiando in provetta
che la mutazione avrebbe prodotto solo batteri del tipo la trasformazione dei batteri da tipo R a tipo S.
IIS. Pertanto, Griffith concluse che alcuni batteri di tipo I ricercatori sottoposero a lisi le cellule di tipo IIIS,
IIR si erano trasformati, con un meccanismo allora sco- utilizzando un detergente, e separarono mediante centri-
nosciuto, in batteri lisci e virulenti a seguito di un’inte- fugazione le differenti componenti cellulari, cioè l’e-
razione con i batteri morti del tipo IIIS. stratto cellulare, dai detriti cellulari o débris. Successiva-
Il materiale genetico dei batteri morti del tipo IIIS mente incubarono l’estratto con una coltura di batteri vi-
era stato mescolato al materiale genetico dei batteri vivi vi di tipo IIR e piastrarono questi ultimi su un terreno di
del tipo IIR. Griffith riteneva che l’agente sconosciuto coltura in una capsula di Petri. Colonie di batteri del tipo
responsabile dello scambio del materiale genetico fosse IIIS comparvero sulla piastra; tale circostanza dimostrò
costituito da una proteina; tale ipotesi era solo un’intui- che l’estratto conteneva il “principio trasformante”, os-
zione e non si dimostrò esatta. Lo scienziato non dispo- sia che il materiale genetico proveniente dai batteri di ti-
neva di evidenze sperimentali che dimostrassero la na- po IIIS era in grado di trasformare un batterio di tipo IIR
tura del materiale che agiva come intermediario nel sud- in uno IIIS. Avery e i suoi colleghi sapevano che una del-
detto scambio di materiale genetico. Griffith definì que- le componenti macromolecolari presenti nell’estratto
sto agente il principio trasformante. (Vedi Capitolo 15 (polisaccaridi, proteine, RNA o DNA) doveva costituire
per una discussione relativa alla trasformazione batteri- il “principio trasformante”. Al fine di determinare quale
ca. Appare opportuno sottolineare che la trasformazione componente corrispondesse al “principio trasformante”,
rappresenta attualmente una tecnica di fondamentale i ricercatori sottoposero l’estratto cellulare a trattamenti
14 Capitolo 2

Figura 2.3
L’esperimento che dimostrò
che il principio trasformante
Aggiunta
è il DNA e non l’RNA. Quando del DNA Piastramento
una miscela di DNA e RNA veniva Trattamento ai batteri su terreno
trattata con ribonucleasi (RNasi) con RNasi di tipo IIR di crescita
e, successivamente, posta in
contatto con batteri vivi di tipo IIR,
si ottenevano trasformanti IIIS.
Miscela di DNA e Rimane solo Produzione
Tuttavia, quando la miscela RNA provenienti il DNA di trasformanti IIIS
di DNA e RNA veniva trattata da batteri
con desossiribonucleasi (DNasi) di tipo IIIS
e successivamente posta
Aggiunta
in contatto con batteri vivi IIR, dell’RNA Piastramento
non si ottenevano trasformanti IIIS. Trattamento ai batteri su terreno
(In entrambe le piastre rappre- con DNasi di tipo IIR di crescita
sentate nella figura sono presenti
colonie IIR, ma per maggior
chiarezza queste ultime non sono
state disegnate.) Miscela di DNA e Rimane solo Assenza
RNA provenienti l’RNA di trasformanti IIIS
da batteri
di tipo IIIS

enzimatici per degradare, una alla volta, le diverse com- Sebbene avessero svolto un ottimo lavoro, Avery e col-
ponenti, verificando dopo ogni trattamento se la trasfor- leghi vennero criticati dagli scienziati del tempo, secon-
mazione avvenisse ancora. Essi osservarono che la tra- do i quali il materiale genetico era costituito dalle protei-
sformazione non avveniva solo quando veniva degrada- ne. Questi ultimi sottolinearono che i vari enzimi utiliz-
to il DNA, nonostante la presenza di tutte le altre macro- zati negli esperimenti erano stati purificati grossolana-
molecole. Viceversa, il principio trasformante continua- mente, rendendo impossibile escludere la presenza di
va a essere presente fino a che non si usava un enzima in contaminanti. Qualora le proteine avessero costituito il
grado di degradare il DNA. Questi risultati dimostrarono materiale genetico, tali molecole sarebbero potute sfug-
che il DNA, e solo il DNA, doveva essere il principio tra- gire alla digestione da parte di enzimi proteolitici, men-
sformante (il materiale genetico). In altri termini, la ri- tre il trattamento con DNasi avrebbe potuto degradarle
mozione del DNA dall’estratto cellulare rappresentava accidentalmente.
l’unico modo con cui si poteva sopprimere la capacità
dell’estratto di fornire al batterio di tipo IIR il materiale
genetico.
Gli esperimenti con i batteriofagi
La Figura 2.3 mostra una versione moderna di una di Hershey e Chase
parte dell’esperimento di trasformazione di Avery, al fi- Nel 1953 Alfred D. Hershey e Martha Chase pubblica-
ne di illustrarne l’approccio generale. Il punto di parten- rono i risultati di alcuni studi sperimentali che dimostra-
za è rappresentato dalla miscela di DNA e RNA purifica- vano che il DNA è il materiale genetico. Essi studiaro-
ti estratta dalle cellule di tipo IIIS. Campioni della misce- no il batteriofago chiamato T2 (Figura 2.4). I batterio-
la sono trattati separatamente con due tipi di nucleasi, fagi (o fagi) sono virus che infettano i batteri. Come tut-
enzimi che degradano gli acidi nucleici. Successivamen- ti i virus, il fago T2 si deve riprodurre in una cellula vi-
te i campioni vengono testati per saggiare la loro capaci- vente. In particolare, T2 si riproduce infettando le cellu-
tà di trasformare i batteri da tipo IIR a tipo IIIS.
Nella miscela trattata con ribonucleasi
(RNasi), un enzima in grado di degradare 65 nm
esclusivamente l’RNA, il DNA rimane inalte-
rato e la trasformazione avviene. Diversa-
mente, nella miscela trattata con desossiribo- DNA 100 nm
Testa
nucleasi (DNasi), enzima che degrada il DNA,
l’RNA rimane inalterato e la trasformazione Corpo
non avviene. Tali risultati dimostrano che il centrale Guaina
100 nm
DNA costituisce il “principio trasformante”.

Figura 2.4
Fibre
Fotografia al microscopio elettronico e schema della Piastra
del batteriofago T2 (1 nm = 10–9 m). coda basale
DNA: il materiale genetico 15

1 Il fago si fissa su E. coli e inietta


il suo cromosoma fagico

6 Rilascio della progenie


in seguito a lisi della parete 2 Degradazione del cromosoma
batterica batterico provocata dagli enzimi
specifici del fago

Cromosoma Cromosoma
fagico batterico (ospite)

Cellula ospite
di E. coli Cromosoma
fagico Cromosoma
batterico
completamente
degradato

Cromosomi fagici
Testa del fago in fase Guaina,
di assemblaggio piastra basale
5 Assemblaggio
delle particelle e fibre della coda
della progenie fagica

3 Replicazione del cromosoma


fagico, usando materiale
4 Espressione dei geni del fago batterico ed enzimi codificati
Figura 2.5 per la produzione delle componenti dal fago
Ciclo litico di un fago virulento, come T2. strutturali del virus

le di Escherichia coli (E. coli) e utilizzandone il mate- tenente l’isotopo 35S incorporavano tale isotopo in tutte
riale molecolare per fabbricare numerose copie virali le proteine. I due scienziati infettarono le colture batte-
(Figura 2.5). Queste ultime vengono assemblate all’in- riche con il fago T2 e raccolsero la progenie fagica.
terno del batterio; successivamente la cellula ospite si A questo punto essi disponevano di due gruppi di
rompe, rilasciando 100-200 copie del fago. fagi T2: uno con il DNA marcato radioattivamente con
Viene definito ciclo litico il processo mediante il 32P, l’altro con le proteine marcate radioattivamente

quale un fago infetta un batterio producendo una proge- con 35S.


nie che viene rilasciata in seguito alla rottura della cel- Gli studiosi infettarono quindi due colture di E. co-
lula infettata; la sospensione costituita dalla progenie li con l’uno o l’altro gruppo di fagi T2 marcati radioat-
fagica rilasciata nel mezzo esterno viene denominata li- tivamente (Figura 2.6b). Nel caso in cui il fago infettan-
sato fagico. te era marcato con 32P, la maggior parte della radioatti-
Hershey e Chase sapevano che T2 era costituito vità fu rilevata all’interno dei batteri subito dopo l’infe-
esclusivamente da DNA e proteine ed era in grado di zione. Solo una quantità esigua di radioattività venne
utilizzare le cellule batteriche per produrre nuovi fagi. rilevata sulla superficie delle cellule. Dopo il completa-
Essi non sapevano, però, quale componente fagica mento del ciclo litico, una certa quantità di 32P venne
(DNA o proteine) ne costituisse il materiale genetico, trovata nella progenie. Al contrario, dopo l’infezione di
responsabile di tale processo. (Si noti che il fago infet- E. coli con il fago T2 marcato con 35S, la radioattività
ta un batterio iniettando il proprio materiale genetico non era praticamente presente nella cellula batterica in-
all’interno della cellula ospite, mentre l’involucro fettata o nella progenie fagica, mentre la maggior parte
esterno, detto capside o ombra fagica, rimane all’e- di essa venne rilevata nelle ombre fagiche.
sterno del batterio.) Dal momento che era il DNA, e non le proteine, a
Al fine di dimostrare che il materiale genetico del fa- essere entrato nella cellula batterica, come dimostrato
go era il DNA e non le proteine, Hershey e Chase colti- dalla presenza di 32P e dall’assenza di 35S nelle cellule
varono cellule di E. coli in un terreno che conteneva o batteriche dopo che il fago aveva dato inizio all’infe-
un isotopo radioattivo del fosforo (32P) o un isotopo ra- zione iniettando il proprio materiale genetico, Hershey
dioattivo dello zolfo (35S) (Figura 2.6a). Questi due iso- e Chase dedussero che il DNA dovesse essere il mate-
topi vennero impiegati in virtù del fatto che il DNA con- riale responsabile della funzione e della riproduzione
tiene fosforo ma non zolfo, mentre le proteine contengo- del fago T2. Pertanto, il DNA doveva costituire il mate-
no zolfo ma non fosforo. I batteri cresciuti su terreno riale genetico del fago T2. Nella riproduzione del fago
contenente l’isotopo 32P incorporavano tale isotopo ne- solo il materiale genetico (il DNA) viene trasferito dai
gli acidi nucleici, mentre quelli cresciuti sul terreno con- progenitori virali alla progenie, mentre non avviene
16 Capitolo 2

Figura 2.6 a) Preparazione dei batteriofagi T2 marcati radioattivamente


L’esperimento di Hershey
1 Fagi con DNA marcato con 32P Progenie fagica
e Chase. con DNA
Involucro proteico
marcato con 32P
Infettare E. coli e far
DNA crescere in un terreno
nessun coinvolgimento del di coltura contenente
32P Lisi
materiale strutturale (le pro-
teine) del virus.
Nel 1969 Alfred Hershey E. coli
Fago T2
fu uno dei vincitori del Pre-
mio Nobel per la Fisiologia o Progenie fagica
2 Fagi con proteine marcate con 35S con proteine
Medicina per le sue “scoperte marcate con 35S
Infettare E. coli
relative alla struttura genetica con fagi e far crescere
dei virus”. in un terreno di coltura
contenente 35S Lisi

L’RNA come materiale E. coli


genetico nei virus
Il materiale genetico di tutti b) L’esperimento che dimostrò che il DNA è il materiale genetico di T2
gli organismi e della maggior 1 E. coli infettati con fagi T2 marcati con 32P
parte dei virus esaminati in Ombre
fagiche
questo volume (quali l’uo- DNA marcato
con 32P Omogeneizzare
mo, Drosophila, il lievito, E. brevemente La radioattività
si ritrova nell’ospite
coli e il batteriofago T2) è e viene trasferita
alla progenie fagica
costituito dal DNA. Tuttavia,
in alcuni virus batterici (per
esempio MS2 e Qβ), virus
2 E. coli infettati con fagi T2 marcati con 35S
animali (come quelli della
Proteine marcate
poliomielite e dell’immuno- con 35S
deficienza umana – HIV) e Omogeneizzare
brevemente La radioattività
in un certo numero di virus si ritrova nelle ombre
delle piante (come per esem- fagiche e non viene
trasferita alla progenie
pio il virus del mosaico del fagica
tabacco e il virus del nani-
smo giallo dell’orzo) il mate-
riale genetico è costituito dall’RNA. Al contrario, non definite monomeri. I monomeri che costituiscono il
si conoscono organismi eucarioti e procarioti che ab- DNA e l’RNA sono denominati nucleotidi. Ogni nu-
biano l’RNA come materiale genetico. cleotide è costituito da un pentoso (zucchero a cinque
atomi di carbonio), da una base azotata (molecola con-
tenente azoto e abitualmente denominata semplicemen-
te base) e da un gruppo fosfato.
Nota chiave Nel DNA il pentoso è il desossiribosio, mentre
Una serie di esperimenti ha dimostrato che il mate- nell’RNA è il ribosio (Figura 2.7). I due zuccheri diffe-
riale genetico consiste di uno dei due acidi nucleici: riscono l’uno dall’altro solo per i gruppi chimici legati
DNA o RNA. Tra le due molecole, il DNA costituisce all’atomo di carbonio 2′: un atomo di idrogeno (H) nel
il materiale genetico di tutti gli organismi viventi e
di alcuni virus, mentre l’RNA rappresenta il mate-
5„ 5„
riale genetico dei rimanenti virus. HOCH2 O OH HOCH2 O OH
4„C H H C 1„ 4„C H H C 1„
3„ 2„ 3„ 2„
H C C H H C C H
La composizione e la struttura
OH H OH OH
del DNA e dell’RNA Desossiribosio Ribosio
Figura 2.7
Qual è la struttura molecolare del DNA? Il DNA e Le strutture del desossiribosio e del ribosio, gli zuccheri
l’RNA sono polimeri, grandi molecole costituite dal le- pentosi del DNA e dell’RNA, rispettivamente. Sono eviden-
game di numerose molecole più piccole simili tra loro, ziati i gruppi chimici che differiscono nelle due molecole.
DNA: il materiale genetico 17

Figura 2.8 NH2 O


La struttura delle basi azotate nel DNA H
e nell’RNA. I composti progenitori sono C N C N C N
6 6 6
le purine (in alto a sinistra) e le pirimidine N1 5C 7 N1 5C 7 HN 1 5 C 7

(in basso a sinistra). Le differenze tra le basi 8 CH 8 CH 8 CH


HC 2 4C 9 HC 2 4C 9 H2N C2 4 C 9
sono evidenziate. 3
N
3
N
3
N
N N N
H H H
Purina Adenina (A) Guanina (G)
(composto progenitore)
desossiribosio e un gruppo idrossilico
NH2 O O
(OH) nel ribosio. (Gli atomi di carbonio
H
nei pentosi sono numerati da 1′ a 5′ per C C C C CH3
4 4 4 4
distinguerli dagli atomi di carbonio e N3 5CH N3 5 CH HN 3 5 CH HN 3 5C
azoto negli anelli delle basi.) HC 2 1 6CH C 2 1 6 CH C 2 1 6 CH C 2 1 6 CH
Le basi azotate si distinguono in due N O N O N O N
classi: le purine, strutture a doppio anel- H H H

lo formate da nove atomi, e le pirimidi- Pirimidina Citosina (C) Uracile (U) Timina (T)
(composto (nell’RNA) (nel DNA)
ne, strutture ad anello singolo costituite progenitore)
da sei atomi. Negli acidi nucleici sono
presenti due purine: adenina (A) e guanina (G), e tre sina; invece, la timina è contenuta soltanto nel DNA e
differenti pirimidine: timina (T), citosina (C) e uraci- l’uracile esclusivamente nell’RNA.
le (U). Le strutture chimiche delle cinque basi sono il- Nel DNA e nell’RNA le basi sono unite all’atomo di
lustrate nella Figura 2.8 (gli atomi di carbonio e di azo- carbonio 1′ del pentoso mediante un legame covalente.
to degli anelli delle purine sono numerati da 1 a 9, men- Le purine sono legate mediante l’atomo di azoto 9,
tre quelli delle pirimidine sono numerati da 1 a 6). Sia mentre le pirimidine si legano mediante l’atomo di azo-
il DNA sia l’RNA contengono adenina, guanina e cito- to 1. La combinazione di uno zucchero e di una base
viene denominata nucleoside. L’ag-
giunta di un gruppo fosfato (PO4) a
a) Nucleotidi del DNA e dell’RNA b) Catena polinucleotidica di DNA
un nucleoside dà luogo a un nucleo-
Nucleotide del DNA Base (adenina) Estremità 5„
O – side fosfato o nucleotide. Il gruppo
NH2
–O P O fosfato è legato all’atomo di carbonio
Gruppo N C 5′ dello zucchero sia nel DNA sia
fosfato C N O
O –
Zucchero HC nell’RNA. Nella Figura 2.9a vengono
C CH 5„ CH A
– O P O CH
2
N N
2
O
illustrati due esempi di un nucleotide
O O del DNA (desossiribonucleotide) e
H
3„
H di un nucleotide dell’RNA (ribonu-
H H H H
H H cleotide). La lista completa dei nomi
O H
OH H delle basi, dei nucleosidi e dei nu-
–O P O
Legame cleotidi è riportata nella Tabella 2.1.
Nucleoside (zucchero + base) O
desossiadenosina
fosfodiesterico Per la formazione dei polinucleo-
5„ CH2 tidi di DNA e di RNA, i nucleotidi
G
Nucleotide (zucchero + base + gruppo fosfato) O
sono uniti da un legame covalente tra
desossiadenosina 5„-monofosfato
H H
il gruppo fosfato di un nucleotide e
H 3„ H
Nucleotide dell’RNA Base (uracile)
O O H
Figura 2.9
C –O P O
Gruppo La struttura chimica del DNA e dell’RNA.
fosfato HC NH Legame
fosfodiesterico O (a) Strutture fondamentali dei nucleosidi
O– Zucchero
HC C 5„ CH
T
(zucchero + base) e dei nucleotidi
O 2
–O P O CH2 N O (zucchero + base + gruppi fosfato)
O del DNA e dell’RNA. I gruppi fosfato
O
H
3„
H sono colorati in giallo, gli zuccheri
H H H H
H in rosa e le basi in marroncino.
H
OH H (b) Un segmento di una catena
OH OH
Estremità 3„
polinucleotidica che forma un singolo
Nucleoside (zucchero + base) filamento di DNA. Le molecole
uridina di desossiribosio sono legate mediante
legami fosfodiesterici tra il carbonio 3’
Nucleotide (zucchero + base + gruppo fosfato) di uno zucchero e il carbonio 5’
uridina 5„-monofosfato o acido uridilico
dello zucchero successivo.
18 Capitolo 2

Tabella 2.1 Nomenclatura delle basi, dei nucleosidi e dei nucleotidi che costituiscono il DNA e l’RNA

Basi: purine (Pu) Basi: pirimidine (Py)

Timina (T) Uracile (U)


Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) (solo con (solo con
il desossiribosio) il ribosio)

DNA Nucleoside: Desossiadenosina Desossiguanosina Desossicitidina Desossitimidina


desossiribosio (dA) (dG) (dC) (dT)
+ base

Nucleotide: Acido desossiade- Acido desossigua- Acido desossiciti- Acido desossiti-


desossiribosio nilico o desossia- nilico o desossi- dilico o desossici- midilico o desos-
+ base + denosina mono- guanosina mono- tidina monofo- sitimidina mono-
gruppo fosfato fosfato (dAMP) fosfato (dGMP) sfato (dCMP) fosfato (dTMP)

RNA Nucleoside: Adenosina (A) Guanosina (G) Citidina (C) Uridina (U)
ribosio + base

Nucleotide: Acido adenilico o Acido guanilico o Acido citidilico o Acido uridilico o


ribosio + base adenosina mono- guanosina mono- citidina monofo- uridina monofo-
+ gruppo fosfato (AMP) fosfato (GMP) sfato (CMP) sfato (UMP)
fosfato

l’atomo di carbonio 3′ del pentoso di un altro nucleoti- molecola del DNA. Questi scienziati proposero l’ormai
de. Questo tipo di legame fosfato 5′-3′ viene definito le- famosa struttura a doppia elica del DNA, che forniva
game fosfodiesterico. I legami fosfodiesterici sono re- una spiegazione comune a tutti i dati sino allora cono-
lativamente forti e, di conseguenza, la struttura ripetuta sciuti circa la composizione della molecola dell’acido
zucchero-fosfato-zucchero-fosfato, che costituisce l’os- desossiribonucleico. La determinazione della struttura
satura del DNA e dell’RNA, è molto stabile. Nella del DNA costituì indubbiamente uno dei momenti di
Figura 2.9b viene riportata la rappresentazione schema- maggiore importanza in biologia; infatti, tale scoperta
tica di una breve catena polinucleotidica. ha reso possibile l’attuale comprensione della scienza
La catena polinucleotidica presenta una polarità, della vita.
ovvero le due estremità della molecola sono differenti All’epoca della scoperta di Watson e Crick si sape-
(Figura 2.9b); in particolare, un’estremità del polinu- va che il DNA era formato da nucleotidi. Tuttavia, non
cleotide presenta un atomo di carbonio 5′ (che porta un erano note le modalità con cui i nucleotidi si associano
gruppo fosfato), mentre l’altra estremità è caratterizzata dando luogo alla struttura del DNA. Watson e Crick in-
da un atomo di carbonio 3′ (che porta un gruppo idrossi- tuirono che la determinazione della struttura del DNA
lico). Le due estremità del polinucleotide sono comune- avrebbe consentito di comprendere il modo in cui il
mente denominate 5′ e 3′. DNA funge da base genetica degli organismi viventi. I
dati che utilizzarono per generare il loro modello pro-
venivano principalmente dagli studi sulla composizio-
Nota chiave ne in basi del DNA condotti da Erwin Chargaff e dagli
Il DNA e l’RNA si trovano in natura come macromo- studi sulla diffrazione dei raggi X condotti da Rosalind
lecole composte da subunità più piccole denomina- Franklin e Maurice H.F. Wilkins.
te nucleotidi. Ogni nucleotide è costituito da uno
zucchero a cinque atomi di carbonio (desossiribo- Studi sulla composizione in basi Erwin Chargaff ave-
sio nel DNA e ribosio nell’RNA) a cui sono legati un va idrolizzato, mediante trattamenti chimici, il DNA di
gruppo fosfato e una delle quattro basi azotate: numerosi organismi, quantificando successivamente le
adenina, guanina, citosina e timina nel DNA, oppu- purine e le pirimidine presenti nella soluzione. I suoi
re adenina, guanina, citosina e uracile nell’RNA. studi dimostrarono che il 50% delle basi era costituito
da purine e il restante 50% da pirimidine e, ancora più
importante, che in tutti i DNA analizzati la quantità di
adenina (A) era uguale a quella di timina (T), mentre la
La doppia elica del DNA quantità di guanina (G) era uguale a quella di citosina
Nel 1953 James D. Watson e Francis H.C. Crick propo- (C). Tali equivalenze sono note come regole di Char-
sero un modello per la struttura fisica e chimica della gaff. Paragonando i DNA di differenti organismi, è pos-
DNA: il materiale genetico 19

Tabella 2.2 Composizione in basi del DNA proveniente da differenti organismi

Origine del DNA Percentuali delle diverse basi nel DNA Rapporti

A T G C A/T G/C (A + T)/(G + C)

Sperma umano 31,0 31,5 19,1 18,4 0,98 1,03 1,67

Mais (Zea mays) 25,6 25,3 24,5 24,6 1,01 1,00 1,04

Drosophila 27,3 27,6 22,5 22,5 0,99 1,00 1,22

Nucleo di Euglena 22,6 24,4 27,7 25,8 0,93 1,07 0,88

Escherichia coli 26,1 23,9 24,9 25,1 1,09 0,99 1,00

sibile osservare che il rapporto A/T e G/C è sempre pa- molecola; in particolare giunse alla conclusione che il
ri a uno, mentre il rapporto (A + T)/(G + C) (indicato DNA possiede una struttura elicoidale, caratterizzata
generalmente come % di GC) varia. Inoltre, dal mo- da due distinte periodicità di 0,34 nm e 3,4 nm lungo
mento che la quantità di purine è uguale a quella di piri- l’asse della molecola (1 nanometro, nm = 10–9 metri =
midine, il rapporto (A + G)/(C + T) è uguale a uno (ve- 10 ångstrom, Å; 1 Å = 10–10 metri).
di Tabella 2.2).
Il modello di Watson e Crick Watson e Crick usaro-
Studi sulla diffrazione dei raggi X Rosalind Frank- no alcuni dati ottenuti dalla Franklin e alcune intelli-
lin, lavorando insieme con Maurice H.F. Wilkins, ave- genti deduzioni derivanti dai loro lavori per costruire
va studiato fibre sottili di DNA usando la tecnica della modelli tridimensionali della struttura del DNA. La
diffrazione dei raggi X, mediante la quale un fascio Figura 2.11a mostra un modello tridimensionale della
parallelo di raggi X viene diretto contro le molecole. Il molecola del DNA, mentre la Figura 2.11b riporta un
fascio viene diffratto dagli atomi secondo uno schema diagramma stilizzato della stessa molecola in cui sono
caratteristico che dipende dal peso atomico e dall’orga- visibili l’ossatura zucchero-fosfato e le coppie di basi.
nizzazione spaziale della molecola. I raggi X diffratti La Figura 2.11c illustra la struttura chimica del DNA a
possono impressionare una lastra fotografica (Figura doppia elica.
2.10). Il modello a doppia elica proposto da Watson e Crick
Analizzando le fotografie ottenute, la Franklin rica- e basato sui dati della cristallografia a raggi X presenta
vò informazioni riguardanti la struttura atomica della le seguenti principali caratteristiche.

Metodo di diffrazione dei raggi X Spettro di diffrazione dei raggi X

Lastra
fotografica

Campione
di DNA
Sorgente di raggi X

Figura 2.10 modello a doppia elica. Le aree scure che formano una X
Analisi del DNA mediante diffrazione dei raggi X. al centro della fotografia indicano la natura elicoidale
Lo spettro del DNA ottenuto dalla diffrazione dei raggi X del DNA. Le mezze lune scure in alto e in basso nella foto-
che Watson e Crick utilizzarono per sviluppare il loro grafia indicano la distanza di 0,34 nm tra le coppie di basi.
20 Capitolo 2

a) Modello molecolare b) Diagramma stilizzato c) Struttura chimica

Asse dell’elica 3„
5„
O A =T
0,34 nm O H O
T= A –O P O
P
1 nm O
CßG T A CH2
O
H Coppie H2C
O
O
di basi G ßC
(C e N) –O P O
T =A
O H H O
A =T
–O P O

O
Solco GßC CH2
G T
O
O
minore H2C
C CßG
O

Solco –O
minore T =A P O
O H H O
A =T
–O
3,4 nm P O

O
CßG CH2
T A
O
O
H2C
Solco G ßC
O
Solco maggiore
–O
maggiore GßC P O
O H H O
A=T –O P O

O
A C
O CH2
Coppie Coppie H2C
O
di basi di basi
O

Ossatura –O P O
zucchero-fosfato Ossatura
O H O
zucchero-fosfato
Figura 2.11
Struttura molecolare del DNA. 5„
3„

1. La molecola di DNA consiste di due catene polinu- a)—Coppia di basi adenina-timina


(si appaiano mediante la formazione
cleotidiche avvolte l’una intorno all’altra a formare di due legami idrogeno)
una doppia elica destrorsa; in altre parole le due eli-
Timina Adenina
che, osservate lungo il loro asse, si avvolgono in sen- H
H
so orario l’una sull’altra. CH3 O H N N
2. Le due catene sono antiparallele (hanno polarità op- C
C C C C
posta), ovvero sono orientate in direzioni opposte; in
particolare, un filamento è orientato in direzione 5′- H C N H N C N

3′, mentre l’altro in direzione 3′-5′. Con parole sem- N C C N


plici, considerando l’estremità 5′ come la “testa” e Desossiribosio
O H
l’estremità 3′ come la “coda”, il termine antiparalle-
Desossiribosio
la indica che la “testa” di una catena è posizionata in
corrispondenza della “coda” dell’altra.
b)—Coppia di basi guanina-citosina
3. Le impalcature di zucchero-fosfato sono posizionate (si appaiano mediante la formazione
all’esterno della doppia elica, mentre le basi sono di tre legami idrogeno)
orientate verso l’asse centrale (vedi Figura 2.11). Le Citosina H Guanina
basi di entrambe le catene hanno una struttura plana- H
H N H O N
re orientata perpendicolarmente all’asse lungitudina- C
le del DNA; tali basi sono impilate come monetine C C C C
l’una sull’altra e, in tal modo, assecondano la torsio- H C N H N C N
ne dell’elica.
N C C N
4. Le basi dei due filamenti polinucleotidici sono tenute Desossiribosio
insieme da legami idrogeno, legami chimici relativa- O H N
Desossiribosio
mente deboli. È possibile osservare due tipi di appaia- H
mento e, in particolare, A si appaia con T (mediante
Figura 2.12
due legami idrogeno; vedi Figura 2.12a) e G si appaia Strutture delle coppie di basi complementari nel DNA.
con C (con tre legami idrogeno; vedi Figura 2.12b). In entrambi i casi una pirimidina (a sinistra) si appaia
I legami idrogeno rendono agevole la separazione con una purina (a destra).
DNA: il materiale genetico 21

delle due catene del DNA, per esempio mediante ri- Medicina. Quale fu il contributo di Rosalind Franklin
scaldamento. Le coppie di basi A-T e G-C sono le alle suddette scoperte? Vi è stato un grande dibattito re-
uniche compatibili con le dimensioni del modello a lativo a tale questione e probabilmente non sarà possibi-
elica e la loro organizzazione si accorda perfettamen- le stabilire se la studiosa avrebbe meritato di condivide-
te con le regole di Chargaff. Le coppie specifiche A- re il premio. Infatti, la Franklin morì nel 1962 e non è
T e G-C vengono definite coppie di basi comple- prevista l’assegnazione postuma dei Premi Nobel.
mentari, e mediante il loro appaiamento la sequenza
dei nucleotidi in un filamento determina la sequenza
dell’altro. Per esempio, se una catena ha la sequenza
Differenti strutture del DNA
5′-TATTCCGA-3′, la catena opposta, antiparallela, I ricercatori hanno dimostrato l’esistenza di diverse for-
deve possedere la sequenza 3′-ATAAGGCT-5′. me di DNA, tra cui le più note sono la A, la B e la Z
5. Le coppie di basi nell’elica del DNA sono alla di- (Figura 2.13).
stanza di 0,34 nm. Un giro completo dell’elica
(360°) è lungo 3,4 nm; pertanto, vi sono 10 coppie di A-DNA e B-DNA Le prime analisi condotte sulle fibre
basi (bp) per ogni giro. Il diametro esterno dell’elica del DNA utilizzando la cristallografia con raggi X iden-
è pari a 2 nm. tificarono l’A-DNA e il B-DNA; tali forme del DNA
6. A causa del tipo di legame che unisce le basi, le im- sono caratterizzate entrambe da una struttura a doppia
palcature zucchero-fosfato della doppia elica non elica destrorsa e presentano rispettivamente 11 e 10 bp
presentano sempre eguale distanza lungo l’asse del- (coppie di basi) per ogni giro d’elica. L’A-DNA è pre-
l’elica stessa. Questa spaziatura ineguale si traduce sente solo in condizioni di bassa umidità. La doppia eli-
nella formazione di solchi di diverse dimensioni lun- ca dell’A-DNA è corta e larga (diametro 2,2 nm), con il
go l’asse del DNA; nello specifico, si possono di- solco maggiore stretto e molto profondo e il solco mino-
stinguere un solco maggiore e un solco minore (ve- re largo e poco profondo. (Si pensi a questa descrizione
di Figura 2.11a). I margini delle coppie di basi si tro- come se si riferisse a un canyon: i termini “stretto” e
vano esposti nei solchi e questi ultimi sono entrambi “largo” indicano la distanza tra le pareti, mentre “pro-
abbastanza ampi da poter ospitare particolari mole- fondo” e “poco profondo” si riferiscono all’altezza del
cole proteiche che prendono contatto con le basi del canyon.) Il B-DNA si forma in condizioni di elevata
DNA. umidità e rappresenta la struttura che somiglia maggior-
mente al DNA presente nelle cellule. La doppia elica di
Per le loro “scoperte riguardanti la struttura molecolare B-DNA, a parità di coppie di basi, è più stretta e più lun-
degli acidi nucleici e il significato di tali molecole nel ga di quella dell’A-DNA e presenta un ampio solco
trasferimento dell’informazione nel materiale vivente” maggiore e uno stretto solco minore; entrambi i solchi
venne conferito nel 1962 a Francis Crick, James Watson hanno profondità simile. Il B-DNA è caratterizzato da
e Maurice Wilkins il Premio Nobel per la Fisiologia o un diametro di 2 nm.

a) A-DNA b) B-DNA c) Z-DNA

Figura 2.13
Modelli spaziali di differenti forme di DNA.
22 Capitolo 2

Z-DNA Il DNA che presenta un’alternanza tra basi Le molecole di RNA a singola o a doppia elica costitui-
puriniche e pirimidiniche può organizzarsi in eliche si- scono i genomi di alcuni virus. L’RNA a doppia elica
nistrorse o destrorse. Le eliche sinistrorse sono dotate ha una struttura simile a quella del DNA a doppio fila-
di un’ossatura zucchero-fosfato con andamento a zig mento, con eliche antiparallele, ossatura zucchero-fo-
zag e, per tale ragione, vengono definite Z-DNA. Lo Z- sfato all’esterno dell’elica e coppie di basi complemen-
DNA possiede 12 bp per ogni giro completo dell’elica. tari unite da legami idrogeno nella porzione interna del-
L’elica dello Z-DNA, sottile e allungata, dà luogo a un la doppia elica.
solco minore profondo, mentre il solco maggiore si tro-
va talmente vicino alla superficie dell’elica da risultare
poco evidente. Lo Z-DNA è caratterizzato da un diame- Nota chiave
tro di 1,8 nm. La molecola di DNA consiste di due catene polinu-
cleotidiche unite a formare una doppia elica grazie
Attività alla formazione di legami idrogeno fra le basi A e T
Determinate la composizione molecolare e fra le basi G e C. I tre principali tipi di DNA, iden-
e la struttura di un virus che infetta le colture tificati tramite l’analisi in vitro di fibre e cristalli di
di riso in Asia. Visitate la iAttività Cracking a Viral tale acido nucleico, sono i destrorsi A-DNA e B-DNA
MyLab
Code (Decifrazione del codice virale) sul sito web e il sinistrorso Z-DNA. La forma più comune del
per gli studenti. DNA contenuto nelle cellule ha una struttura mol-
to simile a quella del B-DNA.
Dal punto di vista molecolare l’RNA è simile al
Il DNA nelle cellule DNA; tuttavia, l’acido ribonucleico si presenta tipi-
camente come singola elica.
Il DNA nelle cellule è in soluzione, cioè in uno stato dif-
ferente rispetto all’acido desossiribonucleico utilizzato
negli esperimenti di cristallografia a raggi X. Gli esperi-
menti hanno dimostrato che il DNA in soluzione possie- L’organizzazione del DNA
de 10,5 coppie di basi per giro di elica, ossia è legger- nei cromosomi
mente meno avvolto del B-DNA. Da un punto di vista
strutturale, il DNA delle cellule assomiglia al B-DNA e Un genoma è l’intero materiale genetico rinvenuto in un
la maggior parte del genoma si presenta in tale forma. virus, in un procariote, in un organello eucariote, o in un
Tuttavia, in alcuni complessi DNA-proteine l’acido de- set aploide di cromosomi di un organismo.
sossiribonucleico assume la struttura dell’A-DNA. Nei virus il genoma può essere costituito da DNA o
L’esistenza dello Z-DNA nelle cellule costituisce moti- da RNA. Nei procarioti il genoma è rappresentato gene-
vo di acceso dibattito tra gli scienziati. Il significato fi- ralmente, ma non sempre, da un singolo cromosoma cir-
siologico dello Z-DNA risulta sconosciuto anche in que- colare di DNA. Negli eucarioti i mitocondri (presenti in
gli organismi nei quali ne è stata dimostrata la presenza. tutti gli eucarioti) e i cloroplasti (contenuti soltanto al-
l’interno delle cellule vegetali) possiedono un proprio
genoma costituito da DNA. Il genoma degli eucarioti è
Struttura dell’RNA tipicamente organizzato in un set di cromosomi contenu-
La struttura molecolare dell’RNA è simile a quella del to nel nucleo della cellula.
DNA; nello specifico, le uniche differenze dell’RNA ri- Le cellule eucariote aploidi hanno una copia del ge-
spetto all’acido desossiribonucleico risiedono nella pre- noma, mentre le cellule eucariote diploidi ne hanno
senza dello zucchero ribosio (che sostituisce il desossi- due. Al fine di comprendere il processo mediante il
ribosio) e della base uracile (U) al posto della timina. quale le informazioni contenute nei geni divengono ac-
Nella cellula le forme funzionali dell’RNA, quali cessibili (vedi Capitolo 5), è importante conoscere l’or-
l’RNA messaggero (mRNA), l’RNA transfer (tRNA), ganizzazione del DNA nei cromosomi. Nei paragrafi
l’RNA ribosomale (rRNA), il piccolo RNA nucleare seguenti verrà discussa l’organizzazione delle moleco-
(snRNA) e il microRNA (miRNA), sono molecole a eli- le del DNA nei cromosomi dei virus, dei procarioti e
ca singola. Tuttavia, tali molecole non sono bastoncini ri- degli eucarioti.
gidi e lineari; al contrario, ogni volta che due basi posso-
no appaiarsi, lo fanno. Di conseguenza, una molecola di
RNA a singola elica si ripiegherà su se stessa formando
Cromosomi virali
regioni di RNA a doppia elica separate da regioni di A seconda del tipo di virus, il materiale genetico può
RNA a singolo filamento. Questo tipo di configurazione essere costituito da DNA a doppia o a singola elica op-
viene denominato struttura molecolare secondaria. pure da RNA a doppia o a singola elica; inoltre, il cro-
DNA: il materiale genetico 23

mosoma virale può essere circolare o lineare. I genomi l’organizzazione del cromosoma varia, sebbene non sia-
di alcuni virus sono organizzati in un singolo cromoso- no stati ancora ritrovati cromosomi lineari. Per esempio,
ma, mentre altri virus hanno un genoma segmentato, il Methanococcus jannaschii ha un cromosoma circola-
ossia organizzato in un determinato numero di moleco- re di 1,66 Mb e plasmidi circolari di 58 e 16 kb (1 kb =
le di DNA. 1 kilobase = 1000 coppie di basi); l’Archaeoglobus ful-
I batteriofagi T2, T4 e T6 (noti come batteriofagi T- gidus ha un unico cromosoma circolare di 2,2 Mb.
pari), gli herpesvirus e il virus Gemini rappresentano Nei batteri e negli Archaea il cromosoma è organiz-
esempi di virus con genomi costituiti da DNA a doppia zato nella cellula in una densa struttura denominata nu-
elica. Diversamente, il parvovirus B19, che causa infe- cleoide. A differenza degli eucarioti non si osserva l’in-
zioni nei bambini, il parvovirus canino, agente causale terposizione di una membrana fra la regione del nucleoi-
nei cani di malattie altamente infettive che risultano de e il resto della cellula.
spesso mortali per i cuccioli, e il fago virulento ΦX174 Il genoma di E. coli consta di una molecola di DNA
sono esempi di virus con genomi a DNA a singola eli- circolare a doppio filamento di 4,6 Mb e lunga approssi-
ca. I parvovirus hanno genomi lineari, mentre il fago mativamente 1100 μm (1000 volte la lunghezza della
ΦX174 possiede un genoma circolare. Tutti questi vi- cellula batterica). Il DNA riesce ad adattarsi all’interno
rus, a eccezione del virus Gemini, presentano un singo- della regione del nucleoide poiché l’acido nucleico in
lo cromosoma; il genoma del virus Gemini può consi- parte è superavvolto; in altri termini, la doppia elica è
stere, a seconda del genere, sia in una sia in due mole- avvolta nello spazio attorno al proprio asse. L’avvolgi-
cole di DNA. I reovirus, uno dei quali è responsabile mento del cromosoma di E. coli può essere osservato
nell’uomo di lievi infezioni delle alte vie respiratorie, dopo aver indotto una lisi blanda della cellula batterica,
sono esempi di virus con genomi a RNA a doppia elica. processo in seguito al quale il DNA viene rilasciato al-
I picornavirus (che includono il poliovirus) e i virus in- l’esterno della cellula (Figura 2.14).
fluenzali costituiscono invece esempi di virus con ge- Per comprendere il grado di superavvolgimento, si
nomi a RNA a singola elica. Il genoma dei picornavirus consideri un tratto lineare di DNA che presenti 20 giri
consiste in una molecola singola di RNA, mentre i ge- di elica e le due estremità libere (Figura 2.15a). Unendo
nomi degli altri virus a RNA menzionati sono segmen- semplicemente le due estremità, si ottiene una moleco-
tati. Tale condizione spiega in parte la variabilità gene- la di DNA circolare definita rilassata (Figura 2.15b).
tica dei virus influenzali che richiede un adeguamento Diversamente, se prima si srotola un’estremità della
continuo dei vaccini prodotti e desta preoccupazioni molecola lineare di DNA per due giri (Figura 2.15c),
dal punto di vita epidemiologico per la possibile genesi unendo successivamente le due estremità la molecola
di virus killer. di DNA circolare prodotta avrà 18 giri di elica e una
piccola regione non avvolta (Figura 2.15d). Tale strut-
tura non è favorita dal punto di vista energetico e presto
Cromosomi procarioti si trasformerà in un’altra con 20 giri d’elica e 2 giri di
La maggior parte dei procarioti contiene un singolo cro- superelica, una forma superavvolta del DNA (Figura
mosoma costituito da una molecola di DNA circolare e 2.15e).
a doppia elica. Gli altri procarioti possiedono genomi
costituiti da uno o più cromosomi circolari o lineari. In
quest’ultimo caso il genoma consta tipicamente di un
cromosoma principale e di uno o più cromosomi di di-
mensioni inferiori. I cromosomi più piccoli si replicano
in modo autonomo rispetto al cromosoma principale e
possono essere o non essere essenziali per la vita della
cellula. Quando non sono essenziali per la vita della cel-
lula, tali cromosomi vengono chiamati plasmidi (vedi
anche Capitolo 8). Per esempio, tra i batteri, Borrelia
burgdorferi, l’agente patogeno che causa nella specie
umana la malattia di Lyme, ha un cromosoma lineare di
0,91 Mb (1 Mb = 1 megabase = 1 milione di coppie di
basi ) e almeno 17 piccoli plasmidi, alcuni lineari e altri
circolari, che hanno una dimensione totale di 0,53 Mb.
Il Rhizobium radiobacter (chiamato anche Agrobacte-
rium tumefaciens), l’agente eziologico del tumore del
colletto in alcune piante, ha un cromosoma circolare di Figura 2.14
3,0 Mb e uno lineare di 2,1 Mb. Anche tra gli Archaea Cromosoma rilasciato da una cellula lisata di E. coli.
24 Capitolo 2

a) DNA lineare con 20 giri b)

DNA
circolare
con 20 giri

c) DNA lineare con 20 giri di cui due non avvolti d)


DNA circolare
con 18 giri
e una
corta regione
non avvolta

Figura 2.15
Rappresentazione del superavvolgimento del DNA. (a) DNA lineare in forma
B con 20 giri dell’elica. (b) DNA circolare in forma rilassata prodotto e)
dall’unione delle due estremità della molecola lineare definita in a.
(c) La molecola lineare definita in a nella quale a un’estremità sono svolti due
giri dell’elica. (d) Possibile molecola di DNA circolare prodotta dall’unione
delle due estremità della molecola lineare mostrata in c. Questa molecola
presenta 18 giri di elica e una piccola regione non avvolta. (e) DNA
DNA superavvolto
superavvolto con 20 giri di elica e 2 giri di superelica, che rappresenta con 20 giri di elica
la forma di d energeticamente più favorevole. e 2 giri di superelica

Il superavvolgimento produce tensione nella molecola Sia l’uno sia l’altro tipo di superavvolgimento rendono il
del DNA. Pertanto, se viene introdotta una rottura a sin- DNA più compatto. La quantità e il tipo di superavvolgi-
golo filamento (o “nick”) nell’ossatura zucchero-fosfato mento del DNA sono controllati dalle topoisomerasi, en-
di un filamento di DNA circolare superavvolto, la mole- zimi presenti in tutti gli organismi.
cola si svolge spontaneamente divenendo una molecola
di DNA circolare rilassato. Il superavvolgimento può a) Molecola di DNA rilassata
verificarsi anche in una molecola di DNA lineare.
Attorcigliando una corda a una estremità senza tene-
re ferma l’altra estremità, la corda girerà liberamente nel-
l’aria e rimarrà lineare (rilassata). Diversamente, nel ca-
so in cui venisse effettuata la stessa operazione su una
grande molecola di DNA lineare, il superavvolgimento
si produrrebbe in regioni specifiche e l’estremità si com-
porterebbe come se fosse fissata.
La Figura 2.16 mostra la molecola del DNA circola-
re in forma rilassata e superavvolta, a dimostrazione di
quanto una molecola superavvolta sia più compatta ri-
spetto a una molecola in forma rilassata. Esistono due ti-
pi di superavvolgimenti: negativo e positivo. Per visua- b) Molecola di DNA superavvolta

lizzare il superavvolgimento, si immagini la doppia elica


del DNA come una scala a chiocciola che gira in senso
orario. Se la scala a chiocciola viene svolta per un giro
completo, il numero di gradini da salire sarà lo stesso
ma si avrà un giro di 360° in meno da fare; in tal caso si
parla di superavvolgimento negativo. Al contrario, av-
Figura 2.16
volgendo la scala a chiocciola per più di un giro comple-
Fotografie al microscopio elettronico di una molecola
to, il numero di gradini da salire sarà lo stesso ma si di DNA circolare che illustrano: (a) una molecola rilassata
avrà un giro di 360° in più da fare; in questo caso si par- e (b) una molecola superavvolta. (Entrambe le molecole
la di superavvolgimento positivo. sono mostrate allo stesso ingrandimento.)
DNA: il materiale genetico 25

Il DNA dei cromosomi batterici risulta compattato, an-


che in virtù del fatto che è organizzato in domini ad ansa
(Figura 2.17), il cui numero varia tra le specie e dipende
dalle dimensioni del genoma. In E. coli vi sono circa 400
domini di DNA con superavvolgimento negativo per
ogni cromosoma e ogni dominio ha una grandezza varia-
bile. Il dibattito in merito a quali molecole si leghino al Ansa di DNA
DNA per produrre il dominio è aperto; senza dubbio tale
processo coinvolge diverse proteine e, probabilmente,
anche qualche molecola di RNA. Il grado di compatta- Le anse
mento che viene raggiunto attraverso l’organizzazione sono ancorate
alla base secondo
del DNA in domini ad ansa risulta circa dieci volte supe- una modalità
sconosciuta
riore rispetto al caso in cui tale disposizione sia assente.

Figura 2.17
Nota chiave Modello della struttura di un cromosoma batterico.
Il cromosoma è organizzato in domini ad ansa, le cui basi
I genomi virali possono essere costituiti da DNA (a sono ancorate secondo una modalità sconosciuta.
doppio o a singolo filamento) o da RNA (a doppio
o a singolo filamento). Essi possono essere sia circo-
lari sia lineari. I genomi di alcuni virus sono orga- La Tabella 2.3 elenca i valori C relativi ad alcune specie
nizzati in un singolo cromosoma, mentre altri virus selezionate. Tali valori C dimostrano che la quantità di
hanno un genoma suddiviso in segmenti. Il mate- DNA nei diversi organismi varia sensibilmente e che ta-
riale genetico dei batteri e degli Archaea è costitui- li variazioni possono esistere anche tra organismi corre-
to da DNA a doppio filamento localizzato in uno o lati. Per esempio, mammiferi, uccelli e rettili mostrano
pochi cromosomi. Il cromosoma di E. coli è circola- una variabilità modesta, mentre gli anfibi, gli insetti e le
re ed è organizzato in circa 400 domini ad ansa in- piante presentano variazioni in un ampio intervallo,
dipendenti di DNA superavvolto. spesso di dieci volte o più. Inoltre, non esiste una relazio-
ne diretta tra il valore C e la complessità strutturale od
organizzativa degli organismi – situazione indicata come
il paradosso del valore C. (Per esempio, l’ameba ha una
Cromosomi eucarioti quantità di DNA quasi cento volte superiore a quella del-
Il genoma degli eucarioti è tipicamente distribuito fra di- la specie umana.) L’assenza della sopraindicata relazio-
versi cromosomi lineari, il cui numero è caratteristico ne diretta può essere spiegata considerando la variazione
per ogni specie. L’uomo, per esempio, che è un organi- della quantità di sequenze ripetute nel genoma (trattata
smo diploide (2N), ha 46 cromosomi nella maggior par- nel Focus sul genoma di questo capitolo).
te delle cellule tranne nei gameti aploidi (N), uova e Come verrà spiegato nel Capitolo 12, le cellule euca-
spermatozoi, in cui il numero di cromosomi è 23. (I 46 riote si dividono attraverso un processo denominato ciclo
cromosomi sono costituiti da coppie di cromosomi omo- cellulare, costituito da quattro fasi: G1, S, G2 e M. Duran-
loghi, uno di derivazione materna, l’altro di derivazione te la fase G1, ogni cromosoma è costituito da una singola
paterna.) molecola lineare di DNA a doppia elica. Durante la fase
Oltre al DNA nucleare, il genoma degli eucarioti è S, il cromosoma duplica se stesso dando origine a due
costituito dal DNA di organelli come i mitocondri e i cromatidi fratelli uniti dal centromero. Questa condizio-
cloroplasti, aventi replicazione autonoma (derivano per ne permane durante la fase G2. Successivamente, nella
semplice scissione da organelli preesistenti) e specializ- fase M di divisione cellulare, i centromeri si separano e i
zati per la respirazione cellulare (i mitocondri) o per la cromatidi fratelli diventano nuove copie di cromosomi.
fotosintesi (cloroplasti). Ognuno di questi organelli con- Negli eucarioti, ogni cromosoma è associato a protei-
tiene un proprio DNA, generalmente circolare a doppia ne il cui peso è circa il doppio del proprio. Il complesso
elica, che codifica per alcuni RNA e per un certo nume- tra il DNA e le proteine, chiamato cromatina, è speri-
ro di proteine, sintetizzate direttamente negli stessi orga- mentalmente visualizzabile all’interno del nucleo me-
nelli dove rimangono a svolgere funzioni specifiche (ve- diante coloranti specifici ed ha una struttura essenzial-
di Capitolo 13). mente identica in tutti gli eucarioti.
La quantità complessiva di DNA che costituisce il Le proteine che costituiscono la cromatina sono asso-
genoma aploide di una specie viene definita come il suo ciate al DNA direttamente, attraverso la formazione di
valore C, dove la lettera “C” sta per costante, espresso complessi, oppure indirettamente, costituendo un sup-
in coppie di basi (bp). porto strutturale per il cromosoma. Il loro ruolo è essen-
26 Capitolo 2

ziale per la struttura fisica e per la funzione del cromoso- La struttura della cromatina La cromatina è costi-
ma stesso; esse, infatti, permettono la condensazione e la tuita da due principali tipi di proteine associate al DNA:
segregazione dei cromosomi nella divisione cellulare e gli istoni e le proteine non istoniche.
contribuiscono alla regolazione dell’espressione genica. Entrambi i tipi di proteine giocano un ruolo importan-
te nel determinare la struttura fisica del cromosoma. Gli
Tabella 2.3 Contenuto di DNA aploide, o valore C, istoni, le proteine più abbondanti nella cromatina, sono
in alcune specie piccole proteine basiche con una carica netta positiva che
agevola il loro legame con il DNA carico negativamente.
Specie Valori C (bp) Cinque tipi di istoni sono associati al DNA del nucleo eu-
Virus e fagi
cariote: H1, H2A, H2B, H3 e H4. Stechiometricamente,
Batteriofago lambda (λ) 48 502(a) nella cromatina vi è eguale quantità di DNA e di proteine
Batteriofago T4 168 904(a) istoniche. Le sequenze degli amminoacidi che costitui-
Virus della leucemia felina scono gli istoni H2A, H2B, H3 e H4 si sono altamente
(virus del gatto) 8448(a) conservate nel corso dell’evoluzione, anche tra specie re-
Simian virus 40 (SV40) 5243(a)
Virus dell’immunodeficienza umana-
lativamente distanti. La conservazione di queste sequen-
1 (HIV-1, agente che causa l’AIDS) 9750(a) ze nell’evoluzione indica che nell’organizzazione del
Virus del morbillo (virus dell’uomo) 15 984(a) DNA di tutti i cromosomi eucarioti gli istoni svolgono il
medesimo ruolo di base. Gli istoni giocano un ruolo cru-
Batteri ciale nell’impacchettamento del DNA nella cromatina.
Bacillus subtilis 4 214 814(a)
Borrelia burgdorferi (spirocheta della
Una cellula umana diploide, per esempio, contiene una
malattia di Lyme) 910 724(a) quantità di DNA 1400 volte superiore a quella presente
Carsonella ruddii 159 662(a) in una cellula di E. coli. Senza il compattamento delle
Escherichia coli 4 639 221(a) 6 × 109 bp di DNA nelle cellule diploidi, il DNA cromo-
Helicobacter pylori (batterio che cau- somico rilassato di una singola cellula umana sarebbe
sa l’ulcera gastrica) 1 667 867(a)
Neisseria meningitidis 2 272 351(a)
lungo oltre 2 metri. Differenti livelli di impacchettamen-
Mycoplasma genitalium 580 076(a) to consentono ai cromosomi, lunghi parecchi millimetri
o perfino centimetri, di essere contenuti all’interno di un
Archaea nucleo il cui diametro è pari a pochi micron.
Methanococcus jannaschii 1 664 970(a) Le proteine non istoniche sono tutte le proteine asso-
Eukarya
ciate al DNA diverse dagli istoni. Tali molecole sono
Saccharomyces cerevisiae (lievito molto meno abbondanti rispetto agli istoni. Molte pro-
gemmante, lievito di birra) 13 105 020(a) teine non istoniche sono proteine acide dotate di carica
Schizosaccharomices pombe (lievito) 12 590 810(a) netta negativa. Questo gruppo di molecole comprende le
Plasmodium falciparum (parassita proteine che giocano un ruolo nella duplicazione, ripara-
della malaria) 22 859 790(a)
Lilium formosanum (giglio) 36 000 000 000
zione, trascrizione (inclusa la regolazione dell’espres-
Zea mays (mais, granoturco) 5 000 000 000 sione genica) e ricombinazione del DNA. Ogni cellula
Oryza sativa (riso) 370 792 000(a) eucariote contiene molte proteine non istoniche diffe-
Amoeba proteus (ameba) 290 000 000 000 renti nel nucleo, ma, al contrario degli istoni, queste ul-
Aedes aegypti time differiscono profondamente sia in numero sia in ti-
(zanzara tigre egiziana) 1 310 900 000(a)
Drosophila melanogaster (moscerino
pologia fra un tipo cellulare e un altro all’interno di un
della frutta) 132 576 936(a) organismo, in momenti diversi nello stesso tipo cellula-
Caenorhabditis elegans (nematode) 100 289 800(a) re e tra organismi diversi.
Danio rerio (zebrafish) 1 527 000 581(a) Con il microscopio elettronico è possibile apprezzare
Xenopus laevis (rospo africano) 3 100 000 000 differenti strutture della cromatina. Le strutture di com-
Mus musculus (topo) 3 420 842 930(a)
Rattus rattus (ratto) 2 719 924 000(a)
plessità inferiore possono essere osservate nel corso della
Loxodonta africana ricostituzione in vitro del DNA purificato e degli istoni,
(elefante africano) 3 000 000 000 mentre quelle di complessità maggiore riflettono l’alto
Canis familiaris (cane) 2 443 707 000(a) grado di impacchettamento necessario al compattamento
Equus caballus (cavallo) 3 311 000 000 del DNA in vivo. La forma meno compatta è la fibra cro-
Macaca mulatta (macaco rhesus) 3 097 179 900(a)
Pan troglodytes (scimpanzè) 3 350 417 645(a)
matinica da 10 nm, che presenta una caratteristica mor-
Homo sapiens (uomo) 3 243 037 807(a) fologia a “filo di perle”; le “perle” hanno un diametro di
circa 10 nm (Figure 2.18b e 2.22b) e sono nucleosomi, le
I valori contrassegnati con l’annotazione (a) derivano dal sequen- unità strutturali di base della cromatina eucariote. Ogni
ziamento completo del genoma; tutti gli altri sono stati determi-
nati con metodi di misura diversi.
nucleosoma ha un diametro di circa 11 nm e un nucleo
che consiste di otto proteine istoniche, due per ciascuno
DNA: il materiale genetico 27

Focus sul genoma


Dimensione del genoma e contenuto di DNA ripetuto
Allorché volsero la loro attenzione sulle dimensio- vesse essere direttamente proporzionale al grado
ni dei genomi degli organismi aploidi (valore C), i di complessità degli organismi sembrò in conflitto
biologi notarono che queste ultime tendevano a con le reali osservazioni relative alle dimensioni
essere molto piccole nei virus e progressivamente dei genomi. Studiando il contenuto dei genomi, il
più grandi nei procarioti e negli eucarioti. Tuttavia, problema è stato parzialmente risolto.
essi rimasero sorpresi nel constatare che la dimen- Le dimensioni del genoma sono determinate pre-
sione del genoma variava in modo sostanziale en- valentemente dal DNA ripetuto. Le ripetizioni nel
tro il medesimo gruppo di organismi; fu difficile genoma hanno come conseguenza l’aumento del
comprendere il motivo per cui particolari organi- valore C. Organismi con genomi di grandi dimen-
smi avevano genomi molto piccoli o molto grandi. sioni hanno una quantità elevata di DNA ripetuto
Per esempio, nell’ambito dei genomi animali cono- e, invece, il numero di geni è relativamente poco
sciuti, quelli più grandi hanno dimensioni 6000 vol- correlato alla dimensione del genoma. I virus e i
te superiori rispetto a quelle dei più piccoli; inoltre, batteri contengono quantità ridotte di DNA ripe-
secondo una stima delle variazioni nel materiale tuto, mentre negli eucarioti quest’ultimo può va-
genetico eucariote, le dimensioni dei genomi real- riare da un minimo del 15% nel pesce palla, Taki-
mente più grandi sarebbero da 40 000 a 200 000 fugu, fino a costituire la parte predominante del
volte superiori a quelle dei più piccoli. Il genoma genoma. Note oggi le diverse sequenze del geno-
umano non è né grande né piccolo, bensì di di- ma di vari organismi (vedi Capitolo 8), è chiaro che
mensioni medie. Ancora, sorprendentemente, i ge- il numero di geni, pur crescendo in linea di massi-
nomi degli animali sono più piccoli rispetto a quelli ma nella scala evolutiva degli organismi considera-
di altri organismi; per esempio, i più grandi geno- ti, non sempre spiega la complessità biologica, co-
mi animali sono notevolmente più piccoli dei ge- me nel caso dell'uomo. Molto, infatti, resta ancora
nomi della maggior parte dei protisti e delle pian- da capire sulla regolazione dei geni e sul ruolo del-
te. L’iniziale convinzione che il numero di geni do- le sequenze ripetute contenute nel genoma.

dei seguenti tipi: H2A, H2B, H3 e H4 (Figura 2.18a). metro di circa 30 nm definita fibra cromatinica da 30
Attorno a tale nucleo è avvolto circa 1,65 volte un seg- nm (Figure 2.19 e 2.22c). Uno dei modelli proposti per
mento di 147 bp di DNA (Figura 2.18b). In questa confi- tale fibra cromatinica, il modello a solenoide, prevede
gurazione il DNA è compattato circa di un fattore sei. che i nucleosomi si avvolgano formando un’elica (Figu-
I singoli nucleosomi sono connessi fra loro tramite ra 2.19). Un altro modello, più recente, propone che la fi-
DNA linker (vedi Figura 2.18b). La lunghezza del lin-
ker è variabile sia all’interno di un singolo organismo
b) Struttura di base dei nucleosomi nella cromatina a “filo di perle”
sia fra diversi organismi; per esempio, i DNA linker
nell’uomo sono lunghi da 38 a 53 bp. largo 11 nm ⫻
spesso 5,7 nm
Il successivo livello di compattamento della cromati-
na è dovuto all’istone H1. Una singola molecola di H1 si
lega sia al filamento linker a una estremità del nucleoso-
ma, sia al centro della sequenza di DNA avvolta intorno DNA linker
al “core” istonico. Il legame di H1 induce il DNA nu-
Nucleosoma
cleosomico ad assumere una forma più regolare con un
andamento a zig zag (Figura 2.18c). Successivamente, i H1
nucleosomi stessi si compattano in una struttura dal dia-
c) Condensazione della cromatina mediante il legame di H1
a) Nucleo istonico
H2A
H2B

H4
H3
Figura 2.18
Struttura di base del cromosoma eucariote.
28 Capitolo 2

Cromatidi
fratelli

Figura 2.19 Centromero


La fibra cromatinica da 30 nm. Modello a solenoide per
l’impacchettamento dei nucleosomi nella fibra di cromatina
da 30 nm (H1 non è mostrato).

bra da 30 nm sia un filamento irregolare di nucleosomi


con andamento a zig zag.
Figura 2.20
Il compattamento della cromatina oltre il filamento
Fotografia al microscopio elettronico di un cromosoma
da 30 nm, che è necessario per spiegare la condensazio- metafasico privato degli istoni. Il cromosoma privo di istoni
ne dei cromosomi nella metafase della divisione cellula- mantiene la sua morfologia generale attraverso
re (vedi Capitolo 12), è assai meno noto. I modelli cor- un’impalcatura di proteine non istoniche (scaffold)
renti sono basati su fotografie d’epoca, risalenti agli anni dalla quale si protendono le anse di DNA.
settanta del XX secolo, di cromosomi metafasici osser-
vati al microscopio elettronico previa rimozione della lo- Il metodo più semplice consiste nel raffigurare queste an-
ro componente istonica (Figura 2.20). (I cromosomi me- se organizzate in forma di spirale intorno all’impalcatura
tafasici sono i cromosomi duplicati di una cellula che cromosomica centrale (Figura 2.21b). In sezione trasver-
non ha subito ancora la divisione, osservabili in metafa- sale le anse sembrerebbero disposte come i petali di un
se, nel momento di massima condensazione.) Tali foto fiore. Il diametro della cromatina ad ansa è di circa 300
mostrano la caratteristica forma a X della coppia di cro- nm, per questo si parla di fibra cromatinica da 300 nm.
matidi fratelli, costituita da anse di DNA di 30-90 kb at- In un cromosoma mitotico gli stessi domini ad ansa si
taccate a una “impalcatura” proteica. Se gli istoni non avvolgono, secondo modalità non ancora completamente
vengono rimossi, è possibile osservare come la fibra da note, determinando un ulteriore compattamento della
30 nm formi domini ad ansa, simili a quelli trovati nei cromatina che porta alla formazione del cromosoma me-
cromosomi procariotici superavvolti. Un cromosoma tafasico, il quale rappresenta il maggior livello di con-
umano di medie dimensioni presenta approssimativa- densazione. Lo spessore di un cromatidio è infatti pari a
mente 2000 domini ad ansa. 700 nm. Il ripiegamento segue un processo estremamen-
Ogni dominio ad ansa è ancorato alla base da protei- te preciso e i diversi geni sono sempre posizionati allo
ne non istoniche che costituiscono l’impalcatura cromo- stesso punto del cromosoma metafasico (la Figura 2.22
somica (scaffold) (Figura 2.21a). Particolari regioni del riassume i vari livelli di condensazione della cromatina).
DNA, le SAR (Scaffold Associated Regions, “regioni as- I cromosomi eucarioti non sono organizzati in struttu-
sociate alla impalcatura”), si legano alle proteine non re rigide; infatti, la maggior parte delle regioni del cromo-
istoniche per rendere possibile la formazione delle anse. soma ha strutture dinamiche che si srotolano quando il
Figura 2.21
a) Domini ad ansa di fibre di cromatina I domini ad ansa dei cromosomi
da 30 nm ancorate all’impalcatura
metafasici. (a) Anse di fibre da 30 nm
cromosomica formano la fibra di 300 nm
attaccate alle regioni associate all’im-
palcatura dei cromosomi (scaffold)
b) Modello di una sezione per mezzo di proteine non istoniche
del cromosoma metafasico
formano fibre di 300 nm di diametro.
(b) Schema di una sezione del cromo-
soma metafasico. Viene mostrata
la disposizione a spirale dei domini
ad ansa. Per semplicità, sono illustrati
Ansa otto domini ad ansa per giro; una più
Altre componenti del DNA accurata stima lascia pensare che si arrivi
non istoniche a 15 per giro. Con un tale numero
dell’impalcatura
di domini ad ansa per giro, si stima che
Impalcatura il diametro di un braccio di un croma-
cromosomica tidio possa raggiungere i 700 nm.
DNA: il materiale genetico 29

(a) Nucleosoma, 11 nm (b) Collana di perle

Proteine istoniche
Fibra da
10 nm

Ottameri
istonici
146 paia di basi
di DNA avvolte Fibra da
intorno al core 10 nm
Istone H1
istonico
DNA linker
Duplex di DNA, 2 nm
DNA core

(c)

Solenoide
Nucleosoma
(34 nm),
fibra da
30 nm
Istone H1

Vista laterale del solenoide


Vista dall’estremità del solenoide
Solenoide
(34 nm),
fibra da
30 nm

Cromatina
estesa,
300 nm

Proteina
di collegamento
(e) (impalcatura) (d)
Cromatidi
Braccio di
Centromero cromosoma
Cromatina spiralizzato,
condensata, 700 nm
1400 nm

Figura 2.22
Condensazione del materiale nucleare. Organizzazione gerarchica della cromatina e del cromosoma.

gene è attivo e si compattano di nuovo quando il gene ces- scrizione genica. Durante l’interfase (complessivamente
sa la sua attività. Tale regolazione viene realizzata “local- le fasi G1-S-G2), infatti, le regioni contenenti geni tra-
mente” mediante modifiche epigenetiche sul DNA e sugli scrizionalmente attivi hanno un minor grado di conden-
istoni da parte di specifici enzimi (vedi Capitolo 18). sazione della cromatina rispetto a regioni inattive.
Sulla base della colorabilità del cromosoma si definisco-
Eucromatina ed eterocromatina Il grado di impac- no due forme di cromatina.
chettamento del DNA cambia nel corso del ciclo cellula- L’eucromatina rappresenta quelle regioni cromoso-
re. La fase di minor compattamento corrisponde all’ini- miche che mostrano la normale condensazione e decon-
zio della fase S, quando i cromosomi sono in procinto di densazione durante il ciclo cellulare. Visivamente l’eu-
duplicarsi, mentre durante la fase M si osserva il mag- cromatina mostra una variazione nell’intensità della co-
gior grado di impacchettamento. La condensazione della lorazione, da più scura in metafase a più chiara nella fase
cromatina varia però anche da una regione all’altra del S. La maggior parte del genoma di una cellula attiva è eu-
cromosoma, in modo direttamente correlabile alla tra- cromatica. L’eucromatina è tipicamente: (1) trascritta in
30 Capitolo 2

modo attivo in maniera tale che i geni in essa contenuti


possano essere espressi, e (2) priva di sequenze ripetute. Nota chiave
L’eterocromatina, al contrario, rappresenta cromo- I cromosomi contenuti nei nuclei delle cellule euca-
somi o regioni cromosomiche che usualmente rimango- riote sono complessi costituiti da DNA, proteine isto-
no allo stato condensato e che, nel corso dell’intero ciclo niche e non istoniche. Ogni cromosoma consiste di
cellulare, si colorano in modo più scuro dell’eucromati- una molecola di DNA lineare a doppio filamento
na, anche in interfase. L’eterocromatina spesso replica in ininterrotto, che si estende per tutta la lunghezza
ritardo nella fase S rispetto al resto del DNA. I geni che del cromosoma. Vi sono cinque tipi principali di isto-
si trovano all’interno dell’eterocromatina sono trascrizio- ni (H1, H2A, H2B, H3 e H4) costanti in tutte le cellu-
nalmente inattivi. Vi sono due tipi di eterocromatina. le di un organismo. Le proteine non istoniche, delle
L’eterocromatina costitutiva è presente in tutte le cellu- quali esistono diversi tipi, variano in maniera signifi-
le nella identica posizione su entrambi i cromosomi omo- cativa a seconda della tipologia cellulare, sia all’in-
loghi di una coppia; questa forma di eterocromatina con- terno di un organismo sia tra organismi differenti,
siste per la maggior parte di sequenze di DNA ripetuto ed come pure entro lo stesso tipo cellulare con il varia-
è esemplificata dalle regioni centromeriche e telomeri- re del tempo. La grande quantità di DNA presente
che. L’eterocromatina facoltativa, al contrario, varia di nel cromosoma eucariote è resa compatta dall’asso-
condizione nei differenti tipi cellulari, nei diversi stadi di ciazione con gli istoni nei nucleosomi e da livelli su-
sviluppo o, talvolta, da un cromosoma omologo all’altro. periori di ripiegamento dei nucleosomi nelle fibre di
Questa forma di eterocromatina rappresenta segmenti di cromatina.
eucromatina condensati e perciò inattivi. Il corpo di Ogni cromosoma contiene un elevato numero di do-
Barr, un cromosoma X inattivo presente nelle cellule so- mini ad ansa delle fibre di cromatina da 30 nm anco-
matiche delle femmine dei mammiferi, costituisce un rati all’impalcatura proteica. Lo stato funzionale del
esempio di eterocromatina facoltativa (vedi Capitolo 12). cromosoma è in relazione al grado di condensazio-
ne: le regioni contenenti geni attivi sono meno con-
DNA centromerico e telomerico Il centromero e il te- densate rispetto alle regioni contenenti geni inattivi.
lomero sono due regioni specializzate dei cromosomi
eucarioti.
Il centromero è la regione di un cromosoma conte- centromerico o CDE; Figura 2.23). Il dominio CDEII,
nente sequenze di DNA a livello del quale si localizza- una regione di 78-86 bp con più del 90% di coppie di ba-
no le strutture proteiche dette cinetocori che permetto- si A-T, rappresenta il dominio più esteso. Lo affiancano
no l’ancoraggio delle fibre del fuso mitotico e meiotico da una parte il CDEI, che ha una sequenza di 8 bp
e l’accurata separazione dei cromosomi e dei cromatidi (RTCACRTG, dove R è una purina, A o G), e dall’altro
fratelli nelle cellule figlie durante la divisione cellulare lato il CDEIII, dominio costituito da una sequenza di 26
(vedi Capitolo 12). Al microscopio il centromero di un bp ricca in A-T. Le sequenze dei centromeri sono state
cromosoma metafasico (Figure 2.20 e 2.22e) appare determinate per un certo numero di altri organismi e dif-
come una restrizione del cromosoma. feriscono sia da quelle del lievito sia fra di loro. Per
Le sequenze dei centromeri sono state analizzate det- esempio, i centromeri di un altro lievito Schizosaccharo-
tagliatamente in pochi organismi, fra cui il lievito Sac- myces pombe sono lunghi 40-80 kb e presentano un’or-
charomyces cerevisiae. Tali sequenze nel lievito sono ganizzazione complessa di parecchie sequenze ripetute. I
chiamate sequenze CEN (da centromero). Sebbene ogni centromeri umani sono addirittura più lunghi, con una
centromero di lievito svolga la stessa funzione, le regio- dimensione che varia da 240 kb a parecchi milioni di
ni CEN sono molto simili tra loro relativamente a se- coppie di basi; il centromero più lungo possiede dimen-
quenza nucleotidica e organizzazione, ma non sono sioni maggiori rispetto a quelle di alcuni genomi batteri-
identiche. In ogni cromosoma di lievito la regione del ci! Pertanto, sebbene i centromeri esplichino le stesse
centromero consiste di 112-120 bp che possono essere funzioni in tutti gli eucarioti, non esiste una sequenza
distinte in tre domini di sequenze (elementi del DNA unica responsabile di tale funzione.

Regione CDE: I II III


RTCACRTG 7 8 – 8 6 b p ( > 9 0 % AT ) tGttTttG–tTTCCGAA––––aaaaa
8 bp 26 bp

Figura 2.23 scole. Le coppie di basi (bp) presenti in 10-13 dei 16


Sequenza consenso dei centromeri del lievito Saccharomyces centromeri sono conservate e sono indicate con lettere
cerevisiae. Le coppie di basi presenti in 15 dei 16 centromeri minuscole. Le posizioni non conservate sono indicate
sono altamente conservate e sono indicate con lettere maiu- con trattini. (R = purina.)
DNA: il materiale genetico 31

Il telomero è costituito da una sequenza specifica posi- gli eucarioti contengono sequenze corte, semplici e ripe-
zionata alla fine di un cromosoma lineare, stabilizza il tute, i telomeri di Drosophila sono strutturalmente molto
cromosoma e svolge una precisa funzione durante la re- differenti. In particolare, questi ultimi sono costituiti da
plicazione (vedi Capitolo 3). Ogni cromatidio presenta trasposoni, sequenze di DNA che possono spostarsi in
due estremità e, pertanto, due telomeri. Nella maggior altri punti del genoma (vedi Capitolo 7).
parte degli organismi studiati i telomeri sono posizionati
all’interno della membrana nucleare e spesso sono asso-
ciati gli uni agli altri e alla membrana nucleare stessa. DNA a sequenza unica e a sequenza ripetuta
Tutti i telomeri di una specie presentano una stessa Dopo aver compreso la struttura di base e l’organizza-
sequenza, ma le sequenze telomeriche differiscono tra le zione del DNA nei cromosomi, è possibile discutere in
diverse specie. È possibile suddividere gran parte delle merito alla distribuzione di alcune sequenze nei genomi
sequenze telomeriche in due tipi. dei procarioti e degli eucarioti. I risultati di analisi mo-
lecolari hanno permesso ai genetisti di scoprire che al-
1. Le sequenze telomeriche semplici sono situate alle cune sequenze sono presenti una sola volta nei genomi,
estremità del DNA cromosomico. A seconda degli or- mentre altre sequenze sono ripetute. Per comodità, que-
ganismi e del loro stadio di sviluppo esistono copie di ste sequenze sono raggruppate in tre categorie: DNA a
tali sequenze che si ripetono dalle 100 alle 1000 volte. sequenza unica (sequenze presenti da una a poche co-
Queste sono componenti funzionali essenziali della pie nel genoma), DNA moderatamente ripetuto (se-
regione telomerica, in quanto sono sufficienti a garan- quenze presenti da poche fino a 105 copie) e DNA alta-
tire la stabilità delle estremità cromosomiche, e consi- mente ripetuto (sequenze presenti da 105 a 107 copie
stono in una serie di semplici sequenze di DNA ripe- nel genoma).
tute una dopo l’altra (definite sequenze di DNA ripetu- Nei procarioti, con l’eccezione dei geni per l’RNA ri-
te in tandem). Per esempio, nel ciliato Tetrahymena, bosomale, dei geni per l’RNA transfer e di poche altre se-
leggendo la sequenza in direzione della fine di un fila- quenze, tutto il genoma è presente come DNA a sequen-
mento di DNA, la sequenza ripetuta è 5′-TTGGGG- za unica. Il genoma degli eucarioti, al contrario, è costi-
3′, mentre nell’uomo e negli altri vertebrati la sequen- tuito sia da DNA a sequenza unica sia da DNA a sequen-
za ripetuta è 5′-TTAGGG-3′ (Figura 2.24a). Dif- ze ripetute, queste ultime molto complesse per numero di
ferenti ricercatori possono descrivere la sequenza te- tipi, numero di copie e distribuzione. Allo stato attuale si
lomerica ripetuta nell’uomo e negli altri vertebrati co- dispone di informazioni approssimative sulla distribuzio-
me 5′-GGTTAG-3′ o come 5′-GGGTTA-3′, a secon- ne delle varie classi di sequenze nel genoma. Tuttavia,
da del punto di inizio della lettura. Si noti che il DNA man mano che saranno determinate le sequenze del DNA
telomerico localizzato alla fine del cromosoma non è
a doppio filamento. Secondo un modello, il DNA te- a) Sequenze telomeriche semplici ripetute
in un cromosoma umano
lomerico è ripiegato all’indietro su se stesso, forman-
do un t-loop (Figura 2.24b). L’estremità a singolo fila- T T A G G G T T A G G G T T A G G G OH 3„

mento invade le sequenze telomeriche a doppio fila- A A T C C C 5„


La lunghezza della
mento, determinando la formazione di un D-loop (dis- sporgenza varia
placement loop). b) Modello a t-loop nei telomeri
2. Le sequenze associate ai telomeri sono regioni inter- t-loop
ne alle sequenze telomeriche semplici. Tali regioni
contengono spesso sequenze ripetute complesse che
si estendono per parecchie migliaia di coppie di basi a
partire dall’estremità del cromosoma. Il significato di
queste sequenze non è ancora noto.

Il DNA telomerico a singolo e doppio filamento è legato D-loop


5„
da proteine, come le TRF (Telomeric Repeat binding 5„ ...
Factor), a loro volta associate a complessi proteici con 3„ ...
3„
funzione strutturale e regolativa. I telomeri di mammife-
ro contengono anche nucleosomi e mostrano regioni for- Figura 2.24
temente eterocromatiche. Tuttavia, il telomero è una Telomeri. (a) Sequenze telomeriche semplici ripetute alle
struttura dinamica che può cambiare conformazione per estremità di un cromosoma umano. (b) Modello della strut-
tura di un telomero in cui il DNA telomerico si avvolge all’in-
permettere l’accesso sul DNA all’enzima telomerasi, re- dietro formando un’ansa (t-loop). L’estremità a singolo fila-
sponsabile del mantenimento delle estremità telomeriche mento si insinua tra le sequenze telomeriche a doppio fila-
(vedi Capitolo 3). Mentre i telomeri della gran parte de- mento formando un D-loop (displacement loop).
32 Capitolo 2

di un numero sempre maggiore di genomi eucarioti, ver- Le famiglie SINE si trovano in diverse specie di euca-
rà acquisita una conoscenza precisa dell’organizzazione rioti, compresi i mammiferi, gli anfibi e il riccio di ma-
molecolare del DNA a sequenza unica e ripetuta. re. Ogni specie con SINE ha la sua caratteristica distri-
buzione di famiglie SINE. Una famiglia SINE ben stu-
DNA a sequenza unica Le sequenze uniche, talvolta diata è la famiglia Alu di alcuni primati. Quest’ultima
denominate sequenze a singola copia, sono presenti nel deriva la propria denominazione dal sito di taglio per
genoma in copia unica. (Se ne trovano quindi due copie l’enzima di restrizione Alu1, che si ritrova tipicamente
in ogni cellula diploide.) Nell’uso corrente il termine si nelle sequenze ripetute. Nell’uomo la Alu costituisce la
applica alle sequenze che sono presenti nel genoma in famiglia di tipo SINE più abbondante del genoma; essa
una o poche copie. La maggior parte dei geni conosciuti, consiste di sequenze di 200-300 bp, ripetute fino a un
ovvero i geni che codificano per le proteine della cellula, milione di volte, che costituiscono fino al 9% del DNA
rientra nella classe dei DNA a sequenza unica. Si stima aploide. In media nel genoma una ripetizione Alu si tro-
che nell’uomo le sequenze uniche rappresentino circa il va ogni 5000 bp.
55-60% del genoma. Anche le SINE sono trasposoni, ma tali sequenze
non codificano gli enzimi necessari al loro movimento;
DNA a sequenza ripetuta Entrambe le sequenze clas- tuttavia, esse possono muoversi qualora gli enzimi ven-
sificate come DNA moderatamente ripetuto e altamente gano forniti da un trasposone LINE attivo.
ripetuto sono presenti numerose volte nel genoma. Tali Le sequenze di DNA ripetuto in tandem sono dispo-
sequenze possono essere organizzate nel genoma in due ste l’una dopo l’altra nel genoma in un’organizzazione
modi: distribuite a intervalli irregolari (conosciute come testa-coda. Il DNA ripetuto in tandem è comune nei ge-
DNA ripetuto disperso oppure DNA ripetuto inter- nomi degli eucarioti. In alcuni casi questo tipo di DNA
sperso) o raggruppate insieme in “cluster”, disposizione è organizzato in corte sequenze della lunghezza di 1-10
in cui le sequenze si ripetono molte volte una dopo l’al- bp, mentre in altri casi le sequenze ripetute sono asso-
tra lungo il filamento (DNA ripetuto in tandem). ciate a geni e sono molto più lunghe.
Le sequenze di DNA ripetuto disperso consistono di Le sequenze telomeriche ripetute in tandem mostra-
famiglie di sequenze ripetute sparse nel genoma insieme te nella Figura 2.24a non sono geni, mentre i geni per
a DNA a sequenza unica. Ogni famiglia consiste di una l’RNA ribosomale (vedi Capitolo 6) sono geni ripetuti
serie di sequenze correlate caratteristiche della famiglia in tandem, spesso organizzati in uno o più raggruppa-
stessa. Spesso poche famiglie presentano un numero di menti (cluster) nella maggior parte degli eucarioti. La
copie molto elevato e costituiscono la maggior parte del- quantità maggiore di DNA ripetuto in tandem è associa-
le sequenze ripetute disperse nel genoma. ta ai centromeri e ai telomeri. In ogni centromero si tro-
Si conoscono due tipi di sequenze disperse: (1) lun- vano da centinaia a migliaia di copie di sequenze sem-
ghe sequenze ripetute intersperse (LINE, Long Inter- plici, corte e ripetute in tandem (sequenze altamente ri-
spersed Elements), caratterizzate da una lunghezza di petute). Infatti, una significativa proporzione del geno-
circa 1000-7000 bp, e (2) corte sequenze ripetute in- ma degli eucarioti può essere costituita dalle sequenze
tersperse (SINE, Short Interspersed Elements), lun- altamente ripetute presenti in corrispondenza dei centro-
ghe approssimativamente da 100 a 400 bp. Tutti gli eu- meri: 8% nel topo, circa 50% nel topo canguro e appros-
carioti hanno sia SINE sia LINE, con grandi variazioni simativamente 5-10% nell’uomo. (Si rimanda al Capi-
nelle proporzioni dei due tipi di sequenze. L’uomo e le tolo 9 per la descrizione di quanto appreso dal sequen-
rane, per esempio, hanno prevalentemente SINE, men- ziamento del genoma in merito all’organizzazione dei
tre Drosophila e gli uccelli hanno soprattutto LINE. Le geni e delle sequenze ripetute nel genoma umano, e al
LINE e le SINE rappresentano una proporzione signifi- Capitolo 10 per una discussione più dettagliata sul DNA
cativa di tutto il DNA moderatamente ripetuto presente non codificante ripetuto in tandem.)
nel genoma.
I genomi dei mammiferi diploidi possiedono circa
500 000 copie della famiglia LINE-1 (L1), che rappresen-
ta circa il 15% del genoma. Possono essere presenti anche Nota chiave
altre famiglie LINE, ma in misura notevolmente minore I genomi dei procarioti consistono principalmente
rispetto alla L1. La lunghezza completa delle sequenze di DNA a sequenza unica, con solo poche sequenze
della famiglia LINE-1 è pari a 6-7 kb, sebbene la maggior e geni ripetuti. Gli eucarioti hanno nel genoma se-
parte di queste ultime sia costituita da elementi tronchi di quenze sia uniche sia ripetute, con un ampio e com-
circa 1-2 kb. Gli elementi completi della famiglia LINE- plesso spettro delle sequenze di DNA ripetute tra le
1 sono trasposoni, ovvero segmenti di DNA che si posso- diverse specie. Alcune delle sequenze ripetute sono
no spostare da un posto all’altro del genoma e che codifi- geni, ma la maggior parte non lo sono.
cano per gli enzimi necessari al loro stesso movimento.
DNA: il materiale genetico 33

Sommario
l Gli organismi contengono materiale genetico che controlla l Il cromosoma dei batteri è compattato in una regione defini-
le caratteristiche di un individuo e viene trasmesso dai geni- ta nucleoide, mediante il superavvolgimento dell’elica del
tori alla progenie. DNA e la formazione di domini ad ansa del DNA superav-
l L’acido desossiribonucleico (DNA) costituisce il materiale volto.
genetico di tutti gli organismi e di molti virus. Soltanto in al- l Il genoma degli eucarioti è distribuito in un certo numero di
cuni virus l’acido ribonucleico (RNA) è il materiale geneti- cromosomi lineari costituiti da complessi di DNA e protei-
co. Nei procarioti e negli eucarioti il DNA è sempre a dop- ne istoniche e non istoniche detti cromatina. Ogni cromoso-
pio filamento, mentre nei virus il materiale genetico può es- ma non duplicato consta di una molecola di DNA a doppio
sere DNA o RNA a singolo o doppio filamento, a seconda filamento, lineare e ininterrotta, che si estende per tutta la
del tipo di virus. sua lunghezza; il DNA è avvolto e immagazzinato in vari
l Il DNA e l’RNA sono macromolecole composte da mono- modi. Le proteine istoniche sono uguali e costanti in tutte le
meri chiamati nucleotidi. Ogni nucleotide consiste di uno cellule di un organismo, mentre le proteine non istoniche
zucchero a cinque atomi di carbonio (desossiribosio nel variano significativamente fra i differenti tipi cellulari.
DNA, ribosio nell’RNA) al quale sono legati una base azo- l Gran parte del DNA presente nei cromosomi eucarioti è re-
tata e un gruppo fosfato. Nel DNA le quattro possibili basi so compatto dall’associazione con proteine istoniche nei
azotate sono l’adenina (A), la guanina (G), la citosina (C) e nucleosomi e da livelli superiori di ripiegamento dei nu-
la timina (T), mentre nell’RNA sono l’adenina, la guanina, cleosomi nelle fibre di cromatina. Ciascun cromosoma nel-
la citosina e l’uracile (U). la sua forma altamente condensata è composto da un eleva-
l Secondo il modello di Watson e Crick, la molecola di DNA to numero di domini ad ansa di fibre di cromatina da 30 nm
consiste di due catene polinucleotidiche (polimeri di nu- ancorate con un andamento a spirale a un’impalcatura pro-
cleotidi) unite da legami idrogeno che si instaurano fra pre- teica. Maggiore è il grado di condensazione di una regione
cise coppie di basi – adenina (A) con timina (T) e guanina cromosomica, minore sarà la probabilità che i geni di quel-
(G) con citosina (C) – per formare una doppia elica. la regione siano attivi.
l I tre tipi di DNA individuati analizzando le sue molecole al l La regione del centromero del cromosoma eucariote è re-
di fuori delle cellule sono l’A-DNA (destrorso), il B-DNA sponsabile dell’accurata segregazione dei cromosomi du-
(destrorso) e lo Z-DNA (sinistrorso). La forma più comune plicati nelle cellule figlie durante la mitosi e la meiosi. Le
presente nelle cellule è strutturalmente molto simile al B- sequenze del DNA dei centromeri variano poco nell’ambi-
DNA. L’A-DNA si trova nelle cellule a livello di particola- to di uno stesso organismo, mentre presentano un’elevata
ri complessi DNA-proteine. Lo Z-DNA può essere ritrova- variabilità tra un organismo e l’altro.
to in ambiente intracellulare, ma il suo significato fisiologi- l I telomeri, posizionati nella parte terminale dei cromosomi
co non è stato ancora chiarito. eucarioti, sono spesso associati gli uni agli altri e alla mem-
l A seconda del tipo di virus, il materiale genetico può essere brana nucleare. I telomeri consistono di semplici e corte se-
costituito da DNA a doppio filamento, DNA a singolo fila- quenze ripetute in tandem che sono specie-specifiche.
mento, RNA a doppio filamento o RNA a singolo filamen- l I genomi dei procarioti constano prevalentemente di se-
to; inoltre, l’acido nucleico dei virus può essere circolare o quenze uniche di DNA; essi presentano solo alcune se-
lineare. I genomi di alcuni virus sono organizzati in un sin- quenze e alcuni geni ripetuti. I genomi degli eucarioti con-
golo cromosoma, mentre altri possiedono un genoma seg- tengono sequenze sia uniche sia ripetute. Le sequenze ripe-
mentato. tute disperse sono localizzate tra le sequenze uniche, men-
l Il materiale genetico dei procarioti è formato da DNA a tre il DNA ripetuto in tandem consiste di sequenze ripetute
doppio filamento organizzato in uno o pochi cromosomi. una dopo l’altra nel cromosoma. La complessità delle se-
Tipicamente, i cromosomi procarioti sono circolari, seb- quenze di DNA ripetuto negli eucarioti è notevole. Alcune
bene in alcune specie sia possibile trovare cromosomi li- sequenze ripetute sono trasposoni, elementi in grado di
neari. spostarsi da un posto all’altro all’interno del genoma.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


Il sistema più pratico per fissare i principi della genetica con- D2.1 Il cromosoma lineare del fago T2 è lungo 52 μm. Il cro-
siste nel risolvere i problemi. In questo e in tutti i capitoli se- mosoma consiste di DNA a doppio filamento, con 0,34 nm tra
guenti discuteremo di come affrontare i problemi di genetica ogni coppia di basi. Quante coppie di basi contiene un cromo-
presentando esempi e discutendo le relative risposte. I proble- soma di T2?
mi utilizzano esempi familiari e poco familiari e pongono do-
mande finalizzate allo scopo di insegnare a pensare in modo R2.1 Questa domanda implica una accurata conversione delle
analitico. differenti unità di misura. Il primo passo consiste nell’esprimere
34 Capitolo 2

le lunghezze nelle stesse unità: 52 μm sono 52 milionesimi di c. Nel filamento complementare quali saranno le frequenze di
metro, ovvero 52 000 × 10–9 m, pari a 52 000 nm. Una base oc- ogni specie di base vicino a T in direzione 5′?
cupa 0,34 nm nella doppia elica, così il numero di coppie di basi d. Perché la percentuale di A non è uguale alla percentuale di T
in un cromosoma di T2 è 52 000 diviso 0,34 ovvero 152 941 cop- (e la percentuale di C non è uguale alla percentuale di G) tra
pie. Il genoma umano contiene 3 × 109 bp di DNA, per una lun- i vicini di A in 3′ nel filamento 5′-3′ di DNA descritto?
ghezza totale di circa un metro, distribuita tra 23 cromosomi. La
lunghezza media di una doppia elica in un cromosoma umano è R2.3
3,8 cm, che è 3,8 centesimi di metro, ovvero 38 milioni di nm, a. Non si può rispondere a questa domanda senza ulteriori infor-
molto più della lunghezza del cromosoma di T2! Vi sono più di mazioni. Sebbene noi sappiamo che a ogni A che ha come vi-
111,7 milioni di coppie di basi nel cromosoma medio umano. cino T nel filamento originale corrisponderà A vicino a T nel
filamento complementare, vi saranno sicuramente nel fila-
D2.2 La tabella seguente elenca la percentuale relativa delle mento complementare ulteriori A di cui non sappiamo nulla.
basi degli acidi nucleici isolate nelle differenti specie. Per ogni b. A questa domanda non si può dare risposta. A tutte le A nel
specie che tipo di acido nucleico è coinvolto? È a filamento uni- filamento originale corrispondono T nel filamento comple-
co o doppio? Spiegate la vostra risposta. mentare, ma noi conosciamo solo i vicini 5′ di queste T e non
i vicini 3′.
Specie Adenina Guanina Timina Citosina Uracile
c. Sul filamento originale il 35% era 5′-AG-3′ di modo che, sul
(i) 21 29 21 29 0 filamento complementare, il 35% delle sequenze sarà 3′-TC-
(ii) 29 21 29 21 0 5′. Così il 35% delle basi vicino a T in direzione 5′ sarà C. Si-
milmente, sul filamento originale, il 30% era 5′-AT-3′, il
(iii) 21 21 29 29 0
25% era 5′-AC-3′ e il 10% era 5′-AA-3′; il che significa che
(iv) 21 29 0 29 21
sul filamento complementare il 30% delle sequenze sarà 3′-
(v) 21 29 0 21 29 TA-5′, il 25% sarà 3′-TG-5′ e il 10% sarà 3′-TT-5′. Così il
30% delle basi vicino a T in direzione 5′ sarà A, il 25% sarà
G e il 10% sarà T.
R2.2 Questa domanda si focalizza sul ruolo delle coppie di ba- d. Le regole A-T e G-C si applicano solo quando si considerano
si e sulle differenze tra DNA e RNA. Analizzando i dati forniti entrambi i filamenti di un DNA a doppio filamento. In questo
determineremo per prima cosa se l’acido nucleico è un DNA o caso noi stiamo considerando solo il filamento originale.
un RNA e poi se è a filamento doppio o singolo. Se l’acido nu-
cleico contiene timina allora è un DNA; se contiene uracile al- D2.4 Quando il DNA a doppio filamento è riscaldato a 100 °C
lora è un RNA. Così le specie (i), (ii) e (iii) devono avere DNA i due filamenti si separano, poiché il legame idrogeno tra i fila-
come loro materiale genetico e le specie (iv) e (v) devono avere menti si rompe. A certe condizioni, quando la soluzione si raf-
RNA come loro materiale genetico. fredda, i due filamenti possono ritrovarsi e riformare la doppia
Successivamente dobbiamo analizzare i dati che si riferiscono al elica; il processo è chiamato rinaturazione. Considerate la se-
tipo di filamento. Il DNA a doppio filamento deve avere una guente elica di DNA:
eguale percentuale di A e di T nonché di G e C. Similmente un
RNA a doppia elica deve avere una eguale percentuale di A e di G CG CG CG CG CG CG C
U nonché di G e C. Pertanto le specie (i) e (ii) hanno DNA a dop- CG CG CG CG CG CG CG
pio filamento, mentre la specie (iii) deve avere DNA a singolo fi-
lamento, dal momento che le regole di appaiamento delle basi so- Se questo DNA è riscaldato a 100 °C e quindi raffreddato, qua-
no violate in quanto A è diverso da T e G è diverso da C. Per quel le potrebbe essere la struttura del singolo filamento se i due fila-
che riguarda le specie contenenti RNA, la specie (iv) contiene menti non si ricongiungono?
RNA a doppio filamento, dal momento che A = U e G = C, e la
specie (v) deve contenere RNA a filamento singolo. R2.4 Questa domanda ha due scopi. Innanzitutto ripropone al-
cune informazioni circa il DNA a doppio filamento; seconda-
D2.3 Di seguito sono elencate quattro caratteristiche di un fi- riamente pone un problema che può essere risolto solo con la
lamento 5′-3′ appartenente a una molecola di DNA a doppio logica. Possiamo analizzare le sequenze di basi per vedere se vi
filamento particolarmente lunga: è qualcosa da segnalare su di esse ed evitare una risposta del ti-
I. il 35 % dei nucleotidi contenenti adenina (A) ha come vici- po “non succede niente di significativo”. Il DNA è un segmen-
no, in direzione 3′, un nucleotide contenente guanina (G); to di 14 bp di G-C e C-G che si alternano. Esaminando solo un
II. il 30% di A ha T come proprio vicino al 3′; filamento, si può notare a metà di esso un asse di simmetria tale
III. il 25% di A ha G come proprio vicino al 3′; che è possibile per un singolo filamento formare una molecola
IV. il 10% di A ha A come proprio vicino al 3′. di DNA a doppio filamento semplicemente ripiegandosi su se
Usate le precedenti informazioni per rispondere alle seguenti stesso e appaiando le basi. Il risultato è una struttura a forcina a
domande nel modo più completo possibile, spiegando per ogni doppio filamento, come mostrato nel seguente diagramma (rica-
risposta il vostro ragionamento. vato dal filamento superiore; l’altro filamento formerà egual-
a. Sul filamento di DNA complementare quali saranno le fre- mente una struttura a forcina).
quenze delle varie basi situate vicino ad A in direzione 3′?
b. Sul filamento complementare quali saranno le frequenze G CG CG CG
delle varie basi vicino a T in direzione 3′? CG CG CG C
3 La replicazione del DNA
Come si replica il DNA? Come si replicano i cromosomi circolari
dei procarioti e dei virus?

In che modo la DNA polimerasi sintetizza Qual è la sequenza temporale della replicazione
una nuova catena di DNA? del genoma di un organismo eucariote?

Come avviene la replicazione e si organizza Come si replicano le estremità dei cromosomi


il cromosoma a livello molecolare? degli eucarioti?

Attività del DNA sarebbe stata semplice. Vale a dire, se la mo-


Una proprietà fondamentale del materiale lecola di DNA fosse stata srotolata e le due eliche sepa-
genetico è la sua capacità di replicarsi in modo tale rate, ogni elica avrebbe potuto essere lo stampo per la
che l’informazione genetica codificata dai nucleoti- sintesi di un nuovo filamento complementare di DNA.
di possa essere trasmessa da ciascuna cellula alla
Questo modello di replicazione del DNA è noto come
sua discendenza. James Watson e Francis Crick
modello semiconservativo, poiché ogni molecola figlia
compresero che la complementarità tra i filamenti
del DNA era probabilmente alla base della replica- conserva una delle due eliche parentali (Figura 3.1a).
zione del DNA. Tuttavia, cinque anni dopo la pre- A quei tempi erano stati proposti altri due modelli
sentazione del modello di Watson e Crick, una vol- per la replicazione del DNA, il modello conservativo
ta che gli scienziati confermarono questa ipotesi, (Figura 3.1b) e il modello dispersivo (Figura 3.1c). Nel
molte domande circa il meccanismo con cui si repli- modello conservativo, le due eliche di DNA parentali ri-
ca il DNA rimanevano ancora senza risposta. In mangono insieme o si riassociano dopo la replicazione e
questo capitolo sono descritti le fasi e gli enzimi nell’insieme funzionano da stampo per la sintesi di nuo-
coinvolti nella replicazione delle molecole di DNA ve doppie eliche di DNA figlie. Così, una delle due mo-
nei procarioti e negli eucarioti. Quindi, nella lecole di DNA figlie è in realtà la doppia elica parenta-
iAttività viene offerta l’opportunità di analizzare le
le, mentre l’altra è costituita interamente di nuovo mate-
caratteristiche della replicazione del DNA di E. coli.
riale. Nel modello dispersivo, la doppia elica parentale
viene tagliata in segmenti di DNA a doppia elica che
La replicazione del DNA è essenziale per la trasmissio- funzionano da stampo per la sintesi di nuovi segmenti di
ne del genoma e dei geni in esso contenuti da una gene- DNA. In qualche modo, i segmenti si riassociano in
razione cellulare a un’altra e da una generazione di or- doppie eliche complete di DNA, con segmenti parentali
ganismi alla successiva. L’obiettivo di questo capitolo e segmenti figli mescolati. In questo modo, sebbene le
consiste nella comprensione dei meccanismi di replica- due molecole figlie di DNA siano identiche relativa-
zione del DNA nei batteri e negli eucarioti, e nella co- mente alla loro sequenza di coppie di basi, il DNA pa-
noscenza di alcune delle proteine e degli enzimi neces- rentale a doppio filamento viene disperso in entrambe le
sari alla replicazione. Alcuni di questi enzimi sono co- molecole figlie. È difficile immaginare come le sequen-
involti anche nella riparazione dei danni al DNA, che ze di DNA dei cromosomi possano essere mantenute
verranno discussi nel Capitolo 7, e sono utilizzati per inalterate con un meccanismo del genere. Questo mo-
applicazioni biotecnologiche che saranno discusse nel dello è stato tuttavia incluso nella trattazione per com-
Capitolo 10. pletezza storica.

La replicazione semiconservativa L’esperimento di Meselson e Stahl


del DNA Nel 1958, Matthew Mesel- nimazione
Quando Watson e Crick nel 1953 proposero il loro mo- son e Frank Stahl ottennero
dello a doppia elica del DNA, capirono che, se la loro la prova sperimentale che il L’esperimento di
MyLab
ipotesi fosse stata corretta, la modalità di replicazione modello di replicazione se- Meselson e Stahl
36 Capitolo 3

a) Modello semiconservativo b) Modello conservativo c) Modello dispersivo

Parentale Parentale Parentale

Dopo Dopo Dopo


il primo ciclo il primo ciclo il primo ciclo
di replicazione di replicazione di replicazione

Dopo Dopo Dopo


il secondo il secondo il secondo
ciclo di ciclo di ciclo di
replicazione replicazione replicazione

Figura 3.1
Tre modelli per la replicazione del DNA. I filamenti parentali sono
mostrati in rosso e quelli neosintetizzati sono mostrati in blu.

miconservativo era quello corretto. Meselson e Stahl fe- Come passaggio successivo, i batteri marcati 15N veniva-
cero crescere il batterio Escherichia coli in un terreno no trasferiti in un terreno contenente azoto nella forma
minimo in cui la sola fonte di azoto era 15NH4Cl (cloru- normale 14N e lasciati replicare nelle nuove condizioni per
ro di ammonio) (Figura 3.2). In questo composto il nor- molte generazioni. Tutto il nuovo DNA sintetizzato dopo
male isotopo dell’azoto, 14N, è sostituito dall’isotopo il trasferimento era marcato con 14N. Quando i batteri ini-
pesante, 15N. (Nota: la densità è il peso diviso per il vo- ziarono a riprodursi nel terreno contenente 14N, campioni
lume, per cui 15N, con un neutrone supplementare nel di E. coli vennero prelevati in tempi successivi, e il DNA
suo nucleo, è 1/14 più denso di 14N.) Come risultato, tut- venne estratto e analizzato per determinarne la densità
te le molecole batteriche contenenti azoto, incluso il (Figura 3.2). La tecnica usata era la centrifugazione all’e-
DNA, contenevano 15N invece di 14N. quilibrio in gradiente di densità (descritta nel Box 3.1).

Box 3.1 Centrifugazione all’equilibrio in gradiente di densità


Negli esperimenti che implicano la centrifugazione esempio da 1,60 a 1,80 g/cm3. Se il DNA è mescola-
all’equilibrio in gradiente di densità, una soluzione to con il CsCl e tale miscela viene centrifugata, il
concentrata di cloruro di cesio (CsCl) viene centrifu- DNA si metterà in equilibrio nel punto del gradien-
gata ad alta velocità. Le forze opposte di sedimen- te in cui la sua densità è uguale a quella del CsCl cir-
tazione e di diffusione producono un gradiente di costante (vedi Figura box 3.1). Si dice che il DNA ha
concentrazione di CsCl stabile e lineare. Le densità formato una banda nel gradiente. Se sono presenti
di CsCl alle estremità del gradiente sono correlate DNA con differenti densità, come nel caso di DNA
alla concentrazione del CsCl che viene centrifugato. 15N- 15N e DNA 14N- 14N, essi formeranno bande

Per esempio, al fine di esaminare DNA con densità (giungeranno all’equilibrio) in posizioni diverse. Il
di 1,70 g/cm3 (densità tipica del DNA), viene prodot- DNA viene rilevato in base all’assorbimento di rag-
to un gradiente che copre quella densità – per gi UV.

Figura box 3.1


Diagramma schematico che
Densità crescente

illustra la separazione di DNA


con diverse densità mediante DNA in CsCl
DNA 14N-14N
centrifugazione all’equilibrio
in un gradiente di densità di
cloruro di cesio. Viene La centrifugazione per 50-60
DNA 15N-15N
mostrata la separazione ore a 100 000!g dà luogo
di DNA 14N e DNA 15N. alla formazione di un gradiente
di CsCl con bande di DNA
La replicazione del DNA 37
Coltura DNA in gradiente Composizione Fotografia delle Misurazione
di E. coli di CsCl del DNA bande di DNA densitometrica
Inizio
DNA pesante
(15N-15N)
Terreno
contenente 15N
Proseguimento
della crescita per
una generazione
in terreno 14N
Primo ciclo
di replicazione
DNA di densità
intermedia
(ibrido 15N-14N)

Proseguimento
della crescita

Secondo ciclo
di replicazione
DNA leggero DNA di densità
(14N-14N) intermedia
(15N-14N)

Proseguimento
della crescita

Terzo ciclo
di replicazione

14N-14N 14N-14N 14N-14N 15N-14N


14 N-

15 N-

15 N-

14 N-

15 N-

15 N-
Figura 3.2
14 N

14 N

15 N

14 N

14 N

15 N
L’esperimento di Meselson e Stahl. Dimostrazione della replicazione
semiconservativa in E. coli. Le cellule erano fatte crescere in terreno
DNA
DNA eggero
DNA brido)

DNA
DNA eggero
DNA brido)
contenente 15N per numerosi cicli di replicazione e poi trasferite in terreno
(l
(i
(pes

(l
(i
(pes
contenente 14N. In tempi successivi, per molti cicli di replicazione, venivano
ante

ante
prelevati dei campioni; il DNA veniva estratto e analizzato mediante
)

)
centrifugazione all’equilibrio in gradiente di CsCl. L’interpretazione schematica
)

)
della composizione del DNA a diverse generazioni, le fotografie delle bande
di DNA e un’analisi densitometrica delle bande sono mostrate in figura.

In breve in questa tecnica, mediante centrifugazione ad cessivi cicli di replicazione erano esattamente quelle
alta velocità, una soluzione di cloruro di cesio (CsCl) previste dal modello semiconservativo.
forma un gradiente di densità, con il materiale più leg- Se il modello conservativo di replicazione del DNA
gero in alto nella provetta e il materiale più denso in bas- fosse stato corretto, dopo un ciclo di replicazione si sa-
so. Il DNA presente nella soluzione durante la centrifu- rebbero dovute vedere due bande di DNA: una banda di
gazione si depositerà formando una banda in corrispon- DNA 15N-15N nella posizione di densità pesante del gra-
denza della posizione in cui la sua densità è la stessa del diente, in quanto contenente le molecole di DNA paren-
cloruro di cesio circostante. DNA marcato 15N (15N-15N tali; l’altra banda, di DNA 14N-14N, nella posizione di
DNA) e DNA marcato 14N (14N-14N DNA) formano densità leggera, in quanto contenente le molecole di
bande in posizioni distinte in un gradiente CsCl, come DNA di nuova sintesi con entrambe le eliche marcate
illustrato nel Box 3.1. con 14N (Figura 3.1b). La banda parentale pesante si sa-
Dopo un ciclo di replicazione (una generazione) in rebbe dovuta vedere a ogni ciclo successivo di replica-
terreno contenente 14N, tutto il DNA aveva una densità zione nella quantità trovata all’inizio dell’esperimento.
esattamente intermedia fra quella del DNA 15N e quella Tutte le nuove molecole di DNA avrebbero dovuto ave-
del DNA 14N. Dopo due cicli di replicazione, metà del re entrambe le eliche con solo 14N. Di conseguenza, la
DNA era ancora di densità intermedia mentre l’altra quantità di DNA 14N-14N nella posizione di densità leg-
metà era della densità del DNA 14N. Queste osservazio- gera sarebbe dovuta aumentare a ogni ciclo di replica-
ni, presentate nella Figura 3.2, e quelle ottenute dai suc- zione. Secondo il modello conservativo di replicazione
38 Capitolo 3

del DNA, la previsione più significativa era che in nes- La DNA polimerasi I
sun momento si sarebbe dovuto trovare DNA di densità L’approccio di Kornberg fu biochimico; in particolare,
intermedia. Il fatto che si sia trovato DNA di densità in- egli si propose di identificare tutti gli ingredienti necessa-
termedia escludeva il modello conservativo. ri per la sintesi in vitro del DNA di E. coli. La prima sin-
Se il modello dispersivo di replicazione del DNA tesi di DNA fu ottenuta con successo in una miscela di
fosse stato corretto, tutto il DNA presente nel terreno reazione contenente frammenti di DNA – una miscela di
contenente 14N dopo un ciclo di replicazione sarebbe quattro precursori desossiribonucleosidi 5′-trifosfati
stato di densità intermedia (14N-15N) (vedi Figura 3.1c), (dATP, dGTP, dCTP e dTTP, indicati collettivamente
circostanza effettivamente rilevata nell’esperimento di con l’abbreviazione dNTP, per deoxyribo-Nucleoside
Meselson e Stahl. Il modello dispersivo prevedeva che, TriPhosfate) – e un lisato di cellule di E. coli (cellule bat-
dopo un secondo ciclo di replicazione nello stesso ter- teriche danneggiate allo scopo di far rilasciare il loro
reno, i segmenti di DNA della prima generazione sa- contenuto). Per poter misurare la piccolissima quantità di
rebbero stati dispersi nelle doppie eliche di DNA pro- DNA attesa come prodotto di sintesi nella reazione,
dotte. Quindi, i segmenti di DNA 15N-15N, dispersi nel Kornberg usò dNTP marcati con isotopi radioattivi.
nuovo DNA 14N-14N dopo un ciclo di replicazione, Kornberg analizzò il lisato e isolò un enzima respon-
avrebbero dovuto distribuirsi nel doppio di molecole di sabile della sintesi di DNA. Questo enzima fu dapprima
DNA dopo due cicli di replicazione. Come risultato, le chiamato enzima di Kornberg, mentre ora è più comu-
molecole di DNA si sarebbero dovute trovare in una nemente definito DNA polimerasi I (DNA Pol I). (Per
banda situata a metà fra la posizione della banda a den- definizione, gli enzimi che catalizzano la sintesi di
sità intermedia 15N-14N e quella della banda a densità DNA si chiamano DNA polimerasi.)
leggera 14N-14N. Con cicli di replicazione successivi, Con l’isolamento della DNA Pol I fu possibile otte-
sarebbe stata presente un’unica banda che sarebbe do- nere informazioni più dettagliate sulla sintesi di DNA. I
vuta diventare sempre più leggera come densità a ogni ricercatori trovarono che erano indispensabili cinque
ciclo di replicazione. I risultati ottenuti da Meselson e componenti per avere sintesi di DNA in vitro. La sinte-
Stahl non si adattavano a queste previsioni e, quindi, il si di DNA, infatti, non avveniva in assenza di uno qual-
modello dispersivo venne escluso. siasi dei seguenti elementi:
Successivamente, esperimenti di altri ricercatori di-
mostrarono che anche negli eucarioti la replicazione del 1. tutti i quattro dNTP (in mancanza di un qualsiasi
DNA è semiconservativa. dNTP non avviene sintesi). Queste molecole sono i
precursori dei blocchi nucleotidici (fosfato-zucche-
ro-base) per la costruzione del DNA, descritti nel
Capitolo 2;
Nota chiave 2. la DNA Pol I;
La replicazione in E. coli e in altri procarioti, così co- 3. un frammento di DNA di E. coli che funga da stam-
me negli eucarioti, avviene con un meccanismo se- po, cioè una molecola utilizzata per produrre una
miconservativo nel quale i filamenti del DNA a molecola complementare di DNA nella reazione;
doppia elica si separano e nuovi filamenti comple- 4. un frammento di DNA come innesco (“primer”). Un
mentari vengono sintetizzati sui due filamenti pa- innesco è una corta catena di DNA necessaria per in-
rentali (che funzionano da stampo). La replicazio- nescare la reazione di sintesi del DNA discussa più
ne semiconservativa dà origine a due molecole di in dettaglio successivamente. Come inneschi,
DNA a doppio filamento, ognuna delle quali ha un Kornberg utilizzò corti frammenti di DNA prodotti
filamento parentale e l’altro di nuova sintesi. dalla digestione del DNA di E. coli con DNasi;
5. ioni magnesio (Mg2+), necessari per la funzionalità
ottimale della DNA polimerasi I.
Le DNA polimerasi, enzimi coinvolti
nella replicazione del DNA Il ruolo delle DNA polimerasi
Tutte le DNA polimerasi dei procarioti e degli eucarioti
Nel 1955, Arthur Kornberg e colleghi furono i primi a (descritte più avanti) catalizzano la polimerizzazione di
identificare gli enzimi necessari per la replicazione del precursori nucleotidici (dNTP) in una catena di DNA
DNA. Il loro lavoro si concentrò sui batteri, presuppo- (Figura 3.3a). La stessa rea-
nendo che il meccanismo di replicazione in essi fosse zione in una rappresentazio-
nimazione
meno complesso che negli eucarioti. Kornberg nel 1959 ne schematica è mostrata La biosintesi del
condivise il Premio Nobel per la Fisiologia o Medicina nella Figura 3.3b. La reazio- DNA: come è
per la sua “scoperta dei meccanismi della sintesi biologi- fatta una nuova MyLab
ne ha tre caratteristiche prin-
ca dell’acido desossiribonucleico”. cipali. elica di DNA
La replicazione del DNA 39

1. All’estremità in crescita della catena, la DNA poli- 2. A ogni tappa dell’allungamento della nuova catena
merasi catalizza la formazione di un legame fosfo- di DNA, la polimerasi trova il precursore (dNTP)
diesterico fra il gruppo 3′-OH del desossiribosio del- giusto che può formare una coppia di basi comple-
l’ultimo nucleotide e il fosfato in 5′ del dNTP pre- mentari con il nucleotide sull’elica stampo.
cursore. L’energia per la formazione del legame fo- I nucleotidi vengono aggiunti rapidamente – per
sfodiesterico deriva dalla liberazione di due dei tre esempio, 850 al secondo in E. coli e 60-90 al secon-
fosfati dal dNTP. Il concetto importante è che la ca- do nelle cellule umane in coltura. Il processo non
tena di DNA in allungamento funziona nella reazio- avviene con una precisione del 100%, ma la proba-
ne come innesco (primer) – una catena polinucleoti- bilità di errore è molto bassa (grazie anche a un
dica preesistente, a cui può essere aggiunto un nuo- meccanismo di correzione di bozze descritto più
vo nucleotide all’estremità 3′-OH libera. avanti).

a) Meccanismo di allungamento del DNA


Nuovo filamento Filamento stampo

5¢ 3¢ 5¢ 3¢
O H O O H O
–O P O –O P O

O O
O T CH2 O T CH2
H2C A O H 2C A O
O O

O P O– O P O–
O H H O O H H O
–O P O –O P O
DNA po-
O O
O limerasi O
+ –O P O P OH
H 2C
O G C O CH2
H2C
O G C O CH2
O O O– O–

Formazione O P O– O P O–
di un legame OH H H O O H H O
fosfodiesterico –O
3¢ P O
O O O O
–O P O P O P O CH2 O T A O CH2 O T A O CH2
H2 C
O O
O– O– O–
O P O– O P O–
OH H H O OH H H O

Nuova aggiunta
di desossiribonucleoside trifosfato
T O CH2 T O CH2
O O
Direzione di crescita
O P O– O P O–
della catena da 5¢ a 3¢
H O H O

C O CH2 C O CH2
O O

O P O– O P O–

O O

5¢ 5¢
b) Rappresentazione schematica dell’allungamento del DNA
5¢ 5¢


P P P P P P P 3¢
P P P P P P P
Filamento
stampo
A C A T C A C A T C

T G T T G T
DNA polimerasi
3¢ 3¢ 3¢
P P OH OH P P P OH + P P Figura 3.3
5¢ P 5¢
Allungamento di una catena di DNA catalizzato
P dalla DNA polimerasi. (a) Meccanismo a livello
P molecolare. (b) Lo stesso meccanismo, usando
Crescita della catena un sistema abbreviato per rappresentare il DNA.
40 Capitolo 3

3. La direzione della sintesi della nuova catena di DNA La DNA Pol I ha anche un’attività esonucleasica da 5′ a
è solo da 5′ a 3′. 3′ e può rimuovere nucleotidi dall’estremità 5′ di un fi-
lamento di DNA o RNA. Questa attività è importante
Uno dei sistemi di replicazione del DNA meglio cono- nella replicazione del DNA e sarà esaminata più oltre
sciuti è quello di E. coli. Per molti anni dopo la scoper- nel capitolo.
ta della DNA polimerasi I, gli scienziati credettero che Nel Box 3.2 viene descritto come i primi studi gene-
questo enzima fosse l’unico enzima replicativo di E. co- tici rivelarono che le cellule di E. coli contenevano
li. Tuttavia studi genetici smentirono tale ipotesi. Gli DNA polimerasi diverse dalla DNA Pol I.
scienziati hanno identificato finora un totale di cinque
DNA polimerasi, DNA Pol I, II, III, IV e V. Dal punto Modello molecolare
di vista funzionale, DNA Pol I e DNA Pol III sono poli-
merasi necessarie per la replicazione, mentre DNA Pol
della replicazione del DNA
I, DNA Pol II, DNA Pol IV e DNA Pol V sono polime- La Tabella 3.1 presenta le funzioni di alcuni dei geni del-
rasi coinvolte nella riparazione del DNA. la replicazione di E. coli e delle sequenze chiave di DNA
Le DNA polimerasi coinvolte nella replicazione so- coinvolte nella replicazione. Un certo numero di geni è
no strutturalmente differenti. DNA Pol I è codificata da stato individuato mediante l’analisi di mutanti. In questo
un singolo gene (polA) e consiste in un polipeptide. paragrafo, verrà discusso un modello molecolare di re-
La parte centrale della DNA polimerasi III contiene le plicazione del DNA che prevede il coinvolgimento di
funzioni catalitiche dell’enzima e consiste di tre polipep- questi geni e di queste sequenze.
tidi: α (alfa, codificato dal gene dnaE), ε (epsilon, codifi-
cato dal gene dnaQ) e ␪ (theta, codificato dal gene holE).
L’enzima completo DNA Pol III, chiamato anche oloen-
Inizio della replicazione
zima Pol III, contiene ulteriori sei differenti polipeptidi. L’inizio della replicazione avviene in un punto specifi-
Sia DNA Pol I sia DNA Pol III replicano il DNA co, corrispondente a una sequenza di DNA che viene in-
nella direzione da 5′ a 3′. Entrambi gli enzimi hanno an- dicata come origine di replicazione, la regione specifi-
che attività esonucleasica da 3′ a 5′; in altri termini, essi ca in cui la doppia elica di DNA viene denaturata in sin-
possono rimuovere nucleotidi dall’estremità 3′ della ca- goli filamenti e a livello della quale inizia la replicazio-
tena di DNA. ne. Il segmento di DNA denaturato localmente è deno-
Questa attività enzimatica è utilizzata nel meccani- minato bolla di replicazione. I segmenti delle singole
smo di correzione di bozze (proofreading); nello spe- eliche srotolate su cui vengono sintetizzate le nuove eli-
cifico, se la DNA polimerasi inserisce una base non cor- che (in accordo con la legge dell’appaiamento delle ba-
retta (un evento che si verifica con una frequenza di 10–6 si complementari) sono chiamati filamenti stampo.
sia per la DNA Pol I sia per la DNA Pol III, il che signi- Quando una molecola di DNA si srotola per esporre i
fica che una base su un milione non è corretta), in molti due filamenti stampo a singola elica per la replicazione
casi l’errore è riconosciuto immediatamente dall’enzi- del DNA, si forma una struttura a forma di Y, chiamata
ma. Con un processo simile al tasto “indietro” o “can- forca replicativa (o forca di replicazione). Una forca re-
cella” sulla tastiera di un computer, l’attività esonuclea- plicativa si muove nella direzione dello srotolamento del
sica dell’enzima rimuove il nucleotide errato dal nuovo DNA. Quando il DNA si srotola nel mezzo di una mole-
filamento. Quindi, la DNA polimerasi riprende il cam- cola di DNA, come nel caso di un cromosoma circolare o
mino in avanti e inserisce il nucleotide corretto. dell’inizio di replicazione di un cromosoma lineare, ci so-
Mediante questo sistema di correzione di bozze la fre- no due forche di replicazione – come due lettere Y unite
quenza degli errori attribuibili a DNA Pol I o III duran- insieme nella loro parte superiore. In molti casi (ma non
te la replicazione è ridotta a meno di 10–9. in tutti) ogni forca di replicazione è attiva, cosicché la re-
plicazione del DNA procede in modo bidirezionale.
Uno schema dell’inizio della replicazione in E. coli
Nota chiave è rappresentato nella Figura 3.4. L’origine di replicazio-
Gli enzimi che catalizzano la sintesi del DNA sono ne di E. coli è oriC, che si estende per 245 coppie di ba-
chiamati DNA polimerasi. Tutte le DNA polimerasi si e contiene un cluster di tre copie di una sequenza di 13
conosciute sintetizzano il DNA nella direzione da 5’ coppie di basi ricca in AT e quattro copie di una sequen-
a 3’. Le polimerasi possono anche avere altre attività; za di 9 coppie di basi. Perché la replicazione abbia ini-
per esempio, possono rimuovere nucleotidi da un fi- zio, una proteina iniziatrice (o più proteine) deve lega-
lamento nella direzione da 3’ a 5’ (attività nota come re l’origine di replicazione e indurre la denaturazione lo-
“correzione di bozze”), oppure possono rimuovere cale della regione ricca in AT.
nucleotidi da un filamento nella direzione da 5’ a 3’. La proteina iniziatrice in E. coli è la DnaA (gene
dnaA), che si lega in molte copie alle regioni di 9 coppie
La replicazione del DNA 41

Box 3.2 Mutanti di DNA polimerasi di E. coli


Un modo per studiare l’azione di un enzima in vivo Per studiare le conseguenze di mutazioni in geni co-
consiste nell’indurre mutazioni nel gene codificante dificanti per proteine ed enzimi essenziali, i genetisti
per quel particolare enzima. In questo modo, il fe- trovano più facile lavorare con mutanti termosensi-
notipo dei mutanti può essere confrontato con il fe- bili – mutanti che funzionano normalmente fino a
notipo selvatico. Il primo mutante nel gene per la che la temperatura non viene innalzata oltre un livel-
DNA Pol I, polA1, fu isolato nel 1969 da Paula lo soglia, dopo il quale si manifesta il difetto funzio-
DeLucia e John Cairns (il mutante è stato così chia- nale. Alla normale temperatura di crescita di E. coli,
mato grazie all’utilizzo di una allitterazione fra 37 °C, i ceppi mutanti polAex1 termosensibili produ-
“Paula” e “polA”) . Questo mutante è caratterizza- cono DNA Pol I con normale attività catalitica. Studi
to da meno dell’1% della normale attività polimera- con la DNA Pol I del ceppo mutante, in vitro a 37 °C,
sica e da un’attività esonucleasica 5’→3’ (la progres- mostrarono che l’enzima aveva una normale attività
siva rimozione dei nucleotidi da una estremità 5’ li- polimerasica, ma decresceva l’attività esonucleasica
bera a una 3’) quasi normale. Era atteso che la DNA da 5’ a 3’. In vitro a 42 °C, tuttavia, la DNA Pol I ter-
polimerasi fosse essenziale al funzionamento cellu- mosensibile ha attività polimerasica quasi normale,
lare e che, quindi, una mutazione nel gene codifi- ma l’attività 5’→3’ esonucleasica è fortemente inibi-
cante per tale enzima fosse letale o almeno delete- ta. A 42 °C mutanti termosensibili polAex1 muoiono
ria. Inaspettatamente, invece, cellule di E. coli con la (la mutazione è letale), mostrando che l’attività eso-
mutazione polA1 crescevano e si dividevano nor- nucleasica 5’→3’ della DNA Pol I è essenziale per la
malmente. Tuttavia, i mutanti polA1 mostravano un replicazione del DNA. Nell’insieme, i risultati degli
elevato tasso di mutazione se esposti a luce ultravio- studi sui mutanti polA1 e polAex1 indicarono da una
letta (UV) e a mutageni chimici, proprietà, questa, parte che nella cellula dovevano esserci altri enzimi
spiegata attribuendo alla DNA polimerasi I una fun- che polimerizzano il DNA e, dall’altra, evidenziarono
zione importante nella riparazione del DNA dan- l’importanza dell’attività esonucleasica per una repli-
neggiato (modificato chimicamente). cazione fedele del DNA.

Tabella 3.1 Le funzioni di alcuni geni e sequenze di DNA coinvolti nella replicazione del DNA in E. coli

Prodotto genico e/o funzione Gene

DNA polimerasi I polA

DNA polimerasi III dnaE, dnaQ, dnaX, dnaN, dnaD, holA→E

Proteina iniziatrice; si lega a oriC dnaA

Proteina IHF (proteina che lega il DNA); si lega a oriC himA

Proteina FIS (proteina che lega il DNA); si lega a oriC fis

Elicasi e attivatore di primasi dnaB

Si complessa con la proteina DnaB e la guida sul DNA dnaC

Primasi; forma il primer di RNA per l’allungamento da parte


dnaG
della DNA polimerasi III

Proteine che legano il DNA a singolo filamento (SSB); si legano ai bracci a sin-
ssb
gola elica delle forche replicative

DNA ligasi; salda le interruzioni a singolo filamento lig

Girasi (topoisomerasi di tipo II); perno che fa ruotare i prodotti di replicazione


gyrA, gyrB
per evitare che il DNA si aggrovigli durante l’avanzamento della forca replicativa

Origine della replicazione cromosomica oriC

Terminazione della replicazione cromosomica ter

TBP (proteina che lega ter); blocca le forche replicative tus


42 Capitolo 3

Ripetizioni Ripetizioni
di 13 bp di 9 bp




Nota chiave
A DnaA L’inizio della sintesi del DNA, in corrispondenza di
3¢ un’origine di replicazione, coinvolge prima la dena-

A A AA
DNA elicasi turazione del doppio filamento di DNA catalizzata
(DnaB) dalla DNA elicasi. Successivamente, la DNA primasi
DNA elicasi 3¢
5¢ si lega all’elicasi e al DNA denaturato, e sintetizza
loader
un corto primer di RNA. Il primer di RNA viene allun-
(DnaC) 3¢
A
A AA
5¢ gato dalla DNA polimerasi nel corso della sintesi del
nuovo DNA e, in seguito, verrà rimosso.

Replicazione semidiscontinua del DNA


Elicasi attivate
La discussione precedente


AAA A


sull’inizio della replicazio-
nimazione
ne prendeva in considera- Modello
Figura 3.4 molecolare
zione la produzione di due
Inizio della replicazione in E. coli. La proteina iniziatrice
DnaA si lega a oriC e provoca la denaturazione del DNA. forche replicative in segui- della replicazione MyLab
Vengono reclutate la DNA elicasi DnaB e la DNA elicasi to a denaturazione del del DNA
loader, che iniziano a svolgere il DNA per formare due DNA in corrispondenza di
forche replicative in configurazione testa a testa. un’origine. Gli eventi della replicazione sono identici a li-
vello di ogni forca, per cui l’attenzione verrà rivolta a una
di basi, determinando la denaturazione della regione sola forca (Figura 3.5). Per illustrare chiaramente questa
con le sequenze di 13 coppie di basi. Le DNA elicasi complicata serie di eventi, la discussione seguente la
(DnaB, codificate dal gene dnaB) sono reclutate e cari- semplifica, considerando separatamente gli enzimi che
cate sul DNA mediante proteine “DNA helicase loader” sintetizzano i due differenti nuovi filamenti. Nella realtà,
(DnaC, codificate dal gene dnaC). Le elicasi comincia- i due set di enzimi lavorano insieme in un complesso; ciò
no a srotolare il DNA in entrambe le direzioni a partire sarà discusso più dettagliatamente in seguito (Figura 3.8).
dall’origine di replicazione, rompendo il legame idroge- La forca replicativa viene generata quando le elicasi
no fra le basi. L’energia necessaria allo srotolamento srotolano il DNA per dare origine a due singoli filamen-
deriva dall’idrolisi dell’ATP. ti che funzionano da stampo. Il processo di separazione
Successivamente, ogni DNA elicasi recluta l’enzima di una molecola di DNA a doppio filamento in due fila-
DNA primasi (un prodotto del gene dnaG), formando menti singoli è chiamato denaturazione del DNA o dis-
un complesso detto primosoma. La DNA primasi è im- sociazione (melting) del DNA. Proteine SSB (Single-
portante nella replicazione del DNA, poiché nessuna Strand Binding) si legano a ognuno dei singoli filamen-
delle DNA polimerasi può iniziare la sintesi di un fila- ti di DNA, stabilizzandoli (Figura 3.5) ed evitando che
mento di DNA; esse possono solo aggiungere nucleoti- essi formino di nuovo DNA a doppio filamento median-
di a un filamento preesistente. La DNA primasi (che te l’appaiamento delle coppie di basi (processo chiamato
consiste in una RNA polimerasi modificata) sintetizza riassociazione, o reannealing). Il primer di RNA sinte-
un corto filamento di RNA primer (innesco; circa 5-10 tizzato dalla DNA primasi si trova a livello dell’estremi-
nucleotidi), al quale possono essere aggiunti dalla DNA tà 5′ del nuovo filamento da sintetizzare alla fine del fila-
polimerasi nuovi nucleotidi. Il primer di RNA viene mento stampo (Figura 3.5, fase 1).
successivamente rimosso e rimpiazzato con DNA; que- La DNA primasi che si trova alla forca replicativa
sto evento sarà discusso più avanti. A questo punto, la sintetizza un altro primer di RNA, nella parte alta del fi-
replicazione bidirezionale del DNA è appena iniziata. lamento stampo (Figura 3.5, fase 1). Ogni primer di
È necessario fare una chiara distinzione fra primer e RNA viene allungato dalla DNA polimerasi III median-
stampo rispetto alla replicazione del DNA. Il filamento te l’aggiunta di desossiribonucleotidi di DNA (Figura
stampo è quello su cui viene sintetizzata la nuova elica, 3.5, fase 1). Le polimerasi spostano le proteine SSB
seguendo le leggi dell’appaiamento delle basi comple- quando si muovono lungo il filamento stampo.
mentari. Un primer è un corto segmento di nucleotidi le- I nuovi DNA sintetizzati sono complementari al fila-
gato al filamento stampo. Il primer serve come substra- mento stampo.
to per l’azione della DNA polimerasi, che allunga il pri- Si ricordi che le DNA polimerasi possono sintetizza-
mer e sintetizza una nuova elica di DNA, la cui sequen- re DNA solo nella direzione 5′→3′, e ancora che i due
za è complementare al filamento stampo. filamenti di DNA sono di polarità opposte.
La replicazione del DNA 43

Polimerasi III SSB (proteine che legano DNA a singola elica)


Elica in ritardo Primer di RNA per il 2° frammento di Okazaki sintetizzato dalla DNA primasi
1 Inizio; il primer 5¢
Movimento DNA elicasi
di RNA sintetizzato 5¢
della forca 3¢
dalla DNA primasi 1° frammento 5¢
incomincia la replicazione di Okazaki
Polimerasi III
del filamento in ritardo 5¢
Elica guida 3¢ DNA sintetizzato dalla DNA polimerasi III
con sintesi del 1°
frammento di Okazaki Primer di RNA sintetizzato dalla primasi

La polimerasi III si dissocia


La sintesi discontinua prosegue su questo filamento
5¢ 5¢
2 Ulteriore srotolamento 3¢ Primer di RNA per il 3° frammento di Okazaki
e allungamento di nuovi 5¢
1° frammento 3¢
filamenti di DNA; viene di Okazaki Allungamento del 2° 5¢
allungato il 2° frammento frammento di Okazaki
di Okazaki Continuo srotolamento e movimento della forca

La polimerasi III si dissocia

5¢ 5¢
3 Il processo continua; 3¢

il 2° frammento di Okazaki 3¢
è terminato, il 3° viene sintetizzato; 3° frammento 5¢
la DNA primasi inizia di Okazaki
il 4° frammento 5¢

Posizione dell’interruzione a singolo filamento


5¢ 5¢
4 Il primer è rimosso 3¢
5¢ 5¢
dalla DNA polimerasi I; 3¢
rimane un’interruzione La DNA polimerasi I sostituisce 4° frammento 5¢
a singolo filamento il primer di RNA con DNA di Okazaki
(filamento rosso) 5¢

Primer di RNA che viene sostituito con DNA


dalla DNA polimerasi I


5 Giunzione di frammenti 5¢ 5¢ 5¢
di DNA adiacenti a opera 3¢
della DNA ligasi L’interruzione viene saldata dalla DNA ligasi 5° frammento 5¢
di Okazaki

Figura 3.5
Modello degli eventi che avvengono attorno a una singola forca replicativa
del cromosoma di E. coli. Verde = RNA; blu = DNA parentale; rosso = nuovo DNA.

Per mantenere la polarità 5′→3′ della sintesi del DNA (Figura 3.5, fase 2). La DNA girasi (una forma di topoi-
su ogni filamento stampo e una sola direzione di movi- somerasi) allenta la tensione prodotta nel DNA, nella par-
mento della forca replicativa, il DNA viene sintetizzato te anteriore della forca replicativa. Questa tensione è con-
in direzioni opposte sulle due eliche stampo (Figura 3.5, siderevole poiché la forca replicativa ruota a circa 3000
fase 1). giri al minuto.
Il nuovo filamento sintetizzato nella stessa direzione Sullo stampo leading (il filamento inferiore nella
del movimento della forca replicativa è l’elica guida Figura 3.5) il nuovo filamento viene sintetizzato dalla
(leading strand) (il suo filamento stampo – il filamento DNA polimerasi III in maniera continua nella direzione
inferiore nella Figura 3.5 – è il filamento stampo guida), della forca di replicazione. Dal momento che, tuttavia, la
mentre il nuovo filamento che viene sintetizzato nella sintesi del DNA avviene nella direzione 5′→3′, la sinte-
direzione opposta al movimento della forca replicativa è si del filamento in ritardo può procedere solo fino a un
detto elica in ritardo (lagging strand) (il suo filamento certo punto. Per poter continuare la sintesi del DNA sul
stampo – il filamento superiore nella Figura 3.5 – è il fi- filamento stampo, è necessario un nuovo inizio di sintesi
lamento stampo in ritardo). L’elica guida necessita solo del DNA; un primer di RNA è sintetizzato dalla DNA
di un primer di RNA per essere sintetizzata, mentre l’e- primasi nella forca di replicazione (Figura 3.5, fase 2).
lica in ritardo richiede una serie di primer di RNA. La DNA polimerasi III aggiunge DNA al primer di RNA
L’elicasi srotola ulteriore DNA, causando un avanza- per sintetizzare un nuovo segmento di DNA. Dato che
mento della forca di replicazione lungo il cromosoma l’elica leading viene sintetizzata in modo continuo, men-
44 Capitolo 3

tre il filamento lagging è sintetizzato segmento dopo seg- un nuovo primer di RNA. Infine, i frammenti di Okazaki
mento, vale a dire in maniera discontinua, la replicazio- sono legati insieme per costituire un filamento continuo.
ne del DNA nel suo insieme procede con modalità semi- La loro saldatura richiede l’attività di due enzimi, DNA
discontinua. polimerasi I e DNA ligasi. Se si considerano due fram-
I frammenti del filamento lagging fabbricati in modo menti di Okazaki adiacenti, l’estremità 3′ del nuovo seg-
semidiscontinuo sono chiamati frammenti di Okazaki, mento è adiacente ma non legata all’estremità 5′ del
dai loro scopritori, Reiji e Tuneko Okazaki e colleghi. frammento del primer sintetizzato in precedenza. La
Sperimentalmente gli Okazaki aggiunsero alle colture DNA polimerasi III lascia il segmento più nuovo e la
di E. coli un precursore radioattivo del DNA (3H-timidi- DNA polimerasi I si lega.
na) per lo 0,5% del tempo di una generazione. In seguito, La DNA polimerasi I allo stesso tempo digerisce il
aggiunsero una grande quantità di timidina non radioatti- primer di RNA anteriormente e allunga il DNA poste-
va per prevenire l’incorporazione di ulteriore radioattivi- riormente (Figura 3.5, fase 4 e Figura 3.6). La digestio-
tà nel DNA. Estrassero il DNA a tempi variabili (fino al ne dell’RNA implica l’attività 5′→3′ esonucleasica de-
10% del tempo di una generazione) e determinarono le gli enzimi necessari a rimuovere i nucleotidi dall’estre-
dimensioni delle molecole marcate di recente. mità 5′ del primer, e inoltre espone i nucleotidi che fun-
Nei tempi vicini al periodo di marcatura, gran parte zionano da stampo. L’allungamento del filamento di
della radioattività era presente nel DNA a basso peso DNA implica l’attività 5′→3′ polimerasica degli enzimi
molecolare che conteneva da 100 a 1000 nucleotidi. per aggiungere nucleotidi all’estremità 3′ del filamento
Con l’aumentare del tempo, una proporzione sempre di DNA, la cui sequenza è guidata dai nucleotidi stampo
maggiore di molecole marcate fu trovata nel DNA ad al- esposti.
to peso molecolare. Questi risultati indicavano che la re- Quando la DNA polimerasi I ha sostituito tutti i ri-
plicazione del DNA normalmente coinvolge la sintesi di bonucleotidi del primer di RNA con desossiribonucleo-
brevi frammenti – i frammenti di Okazaki – che succes- tidi, rimane un’interruzione a singolo filamento fra i nu-
sivamente sono legati insieme. cleotidi adiacenti dei due frammenti dell’elica (un pun-
Il processo di replicazione continua allo stesso modo to nel quale la struttura portante zucchero-fosfato tra i
(Figura 3.5, fase 3): l’elicasi continua a srotolare il DNA, due nucleotidi adiacenti è interrotta). I frammenti sono
che viene sintetizzato in modo continuo sul filamento uniti dalla DNA ligasi per formare un’elica di DNA più
stampo leading e in modo discontinuo sul filamento lunga (Figura 3.5, fase 5). La reazione catalitica della
stampo lagging; ogni frammento di Okazaki riparte con DNA ligasi è schematizzata nella Figura 3.7. L’intera

Figura 3.6
Saldatura dei frammenti di Okazaki. Posizione dove il primer di RNA Origine della regione
del frammento di Okazaki terminale 3¢ del nuovo
Dettaglio della sostituzione del primer frammento di Okazaki
precedente termina e il DNA inizia
di RNA con il DNA.
DNA polimerasi III Stampo del filamento lagging
5¢ 3¢
1 La DNA polimerasi III si allontana.
La regione terminale 3¢ del nuovo frammento 3¢ 5¢
di Okazaki è vicina alla terminazione 5¢ Precedente 5¢ 3¢ Nuovo frammento di Okazaki
del precedente frammento di Okazaki. frammento Primer
di Okazaki di RNA

2 La DNA polimerasi I lega e contemporaneamente DNA polimerasi I


rimuove il primer di RNA dal precedente frammento 5¢ 3¢
di Okazaki e sintetizza DNA per sostituirlo. 3¢ 5¢
L’attività esonucleasica allontana L’attività polimerasica allunga
il primer da 5¢ a 3¢ il DNA da 5¢ a 3¢

DNA polimerasi I
3 Quando il primer di RNA è completamente rimosso,
la DNA polimerasi I si allontana. Rimane 5¢ 3¢
un’interruzione fra i due frammenti. 3¢ 5¢
Interruzione a singolo
filamento dopo
l’allontanamento del primer
DNA ligasi
5¢ 3¢
4 La DNA ligasi salda l’interruzione e quindi si allontana. 3¢ 5¢

Interruzione saldata
dalla DNA ligasi
La replicazione del DNA 45

3¢ A T T C C G A T C G A T 5¢ 3¢ A T T C C G A T C G A T 5¢ tente. Analogamente, poiché la DNA polimerasi dell’e-


5¢ T A A G G C TOH pA G C T A 3¢ 5¢ T A A G G C T A G C T A 3¢
lica lagging è complessata alle altre proteine replicative
DNA ligasi a livello della forca, questo enzima può continuamente
essere riutilizzato nella stessa forca replicativa, con sin-
Interruzione a singolo filamento Interruzione saldata tesi di una serie di frammenti di Okazaki mentre si spo-
Figura 3.7 sta insieme al resto della macchina replicativa.
Azione della DNA ligasi nella saldatura delle interruzioni tra
frammenti di DNA adiacenti (per esempio, frammenti di Oka-
In sostanza, il complesso di proteine replicative che
zaki) con formazione di una catena covalentemente continua si forma alla forca replicativa si muove essenzialmente
più lunga. La DNA ligasi catalizza la formazione di un lega- come un’unità lungo il DNA e rende possibile la sintesi
me fosfodiesterico fra il gruppo 3’-OH e il gruppo 5’-fosfato di nuovo DNA in modo efficiente, sia sullo stampo del-
ai due lati dell’interruzione, saldando l’interruzione stessa. l’elica leading sia su quello dell’elica lagging.
La discussione si è focalizzata su una singola forca
sequenza di eventi si ripete finché non viene replicata di replicazione, mentre in realtà nella bolla di replica-
l’intera molecola di DNA. zione ne sono coinvolte due. La Figura 3.9 mostra come
La Figura 3.5 mostra la replicazione del DNA in for- il filamento leading e il filamento lagging sono sintetiz-
ma semplificata. In realtà, le proteine chiave sono stret- zati nei primi stadi della replicazione bidirezionale. La
tamente associate in modo da formare un macchinario Figura 3.10 mostra la replicazione bidirezionale di un
chiamato replisoma, a livello della forca replicativa. cromosoma circolare, come quello di E. coli.
La Figura 3.8 mostra il filamento lagging di DNA,
avvolto in modo tale che la DNA polimerasi III formi un Attività
complesso con la DNA polimerasi che opera sul fila- Identificate alcuni degli specifici elementi e
mento leading. Queste sono due copie della regione cen- processi necessari per la replicazione del DNA nel-
trale (core) dell’enzima descritto in precedenza, tenute la iAttività Unraveling DNA Replication (Svelare la MyLab
insieme da sei altri polipeptidi per formare l’oloenzima replicazione del DNA) nel sito web degli studenti.
DNA Pol III. Per semplicità, nella figura sono rappre-
sentati solo i nuclei degli enzimi. Il ripiegamento dello
stampo del filamento lagging porta l’estremità 3′ di ogni Replicazione a cerchio rotante
frammento di Okazaki completo in prossimità del punto
in cui inizierà il successivo frammento di Okazaki. Il DNA circolare a doppia elica di alcuni virus, tra cui il
La primasi si trova vicino alla forca di replicazione, batteriofago λ, si replica producendo un DNA lineare; il
sintetizzando nuovi primer di RNA in modo intermit- processo è chiamato replicazione a cerchio rotante

Primer DNA polimerasi III


di RNA Elica
lagging
Frammento di Okazaki
DNA
stampo 3¢

Proteina 5¢ Figura 3.8


SSB Modello della “macchina replicativa” (re-
DNA primasi 5¢ DNA parentale plisoma), il complesso delle proteine chia-
3¢ 3¢ DNA
DNA elicasi ve della replicazione, con il DNA a livello
Direzione del movimento della forca della forca replicativa. La DNA polimerasi


III sullo stampo dell’elica lagging (parte
DNA polimerasi III in alto della figura) sta terminando
DNA la sintesi di un frammento di Okazaki.
stampo Elica
leading

Origine di replicazione

IIII I IIIIIIII
III II
II II
5¢ 3¢ II

II

II

Movimento Movimento
I

della forca
II
Filamento Filamento 3¢ II della forca
leading lagging
II
5¢ 3¢ 3¢

3¢ 5¢ 3¢ 5¢
II
Filamento Filamento
II
3¢ lagging leading
II
Figura 3.9
I
II

II

Sintesi dei filamenti leading e lagging 5¢ I


3¢ 5¢ II
nelle due forche di una bolla di replicazione II
III I II
durante la replicazione bidirezionale del DNA. IIII I IIIIIIII
46 Capitolo 3

(Figura 3.11). Il primo passo nella replicazione a cer- cerchio in direzione dell’estremità del DNA dislocato.
chio rotante è la generazione di una incisione specifica Con un ulteriore spostamento viene sintetizzato nuovo
su uno dei due filamenti in corrispondenza dell’origine DNA, iniziando dal cerchio e procedendo lungo il fila-
di replicazione (Figura 3.11, fase 1). mento di DNA spostato (Figura 3.11, fase 4). Quindi, la
Nella molecola circolare l’estremità 5′ del filamento sintesi di questo filamento avviene in modo disconti-
inciso è quindi dislocata in modo da formare una forca nuo; vale a dire, il filamento dislocato è lo stampo del-
replicativa (Figura 3.11, fase 2). L’estremità 3′ del fila- l’elica in ritardo (come in Figura 3.5). Man mano che la
mento inciso agisce da primer per la DNA polimerasi “lingua” a singola elica si srotola al di fuori, la sintesi di
nella sintesi del nuovo DNA, utilizzando la regione del DNA continua sullo stampo circolare.
DNA circolare a filamento singolo come stampo (Figura Poiché il cerchio di DNA parentale può continuare a
3.11, fase 3). ruotare, è possibile generare una molecola lineare di
L’estremità 5′ del filamento di DNA dislocato è sro- DNA a doppia elica più lunga della circonferenza del cer-
tolata esternamente come una “lingua” libera che au- chio. Si consideri il meccanismo della replicazione del
menta in lunghezza man mano che la replicazione pro- DNA nel contesto del ciclo vitale del fago λ. (Una descri-
cede. Il nuovo DNA è sintetizzato dalla DNA polimera- zione completa del ciclo vitale del fago λ è riportata nel
si sul DNA dislocato nella direzione 5′→3′, ovvero dal Capitolo 15 ed è schematizzata nella Figura 15.12.) Il fa-
go λ ha un cromosoma di DNA lineare,
per la maggior parte a doppio filamento
Origine della con le estremità, della lunghezza di 12
replicazione
nucleotidi, a singolo filamento
(Figura 3.12). Le due estremità
hanno sequenze complementari
– esse sono dette coesive poi-
ché possono appaiarsi l’u-
Forche
na con l’altra.
replicative 1 Viene fatto
un taglio
Quando il fago λ
nell’elica + infetta E. coli, il cro-
3¢ della doppia
O elica parentale
mosoma lineare

(O = origine) viene iniettato nel-
la cellula e le
estremità comple-
Rotazione
2 L’estremità 5¢ mentari si appaia-
intorno all’asse
viene spostata no. Il cromosoma
e coperta
da proteine SSB circolare del fa-
O
go, per produrre
le copie del cro-
3 La polimerizza-
zione all’estremità mosoma da im-

3¢ aggiunge nuovi pacchettare co-
desossiribonu-
cleotidi me progenie fa-
Proteine gica, si replica
SSB 5¢
mediante il mec-
canismo del cer-
O chio rotante. Il ri-
4 Attacco
Replisoma del replisoma sultato è una mole-
e formazione cola molto lunga,
di frammenti
di Okazaki costituita da copie
del cromosoma di λ
Primer
di RNA legate tra di loro dall’u-
nione tra la testa e la coda
Vecchio frammento
di Okazaki di due genomi successivi.
Frammento di Okazaki
appena iniziato
Figura 3.11
Figura 3.10 Il processo di replicazione di molecole di DNA circolare a doppia elica me-
Replicazione bidirezionale di molecole diante il meccanismo del cerchio rotante. La forza attiva che svolge la coda
di DNA circolare. al 5’ è il movimento del replisoma spinto dalla sua componente elicasica.
La replicazione del DNA 47

Questa molecola, costituita da una serie ripetuta di mo- nucleico tagliando in determinate posizioni centrali del-
nomeri, è chiamata concatamero. Da questo concatame- la molecola, e non alle estremità). Questa endonucleasi
ro sono prodotti i cromosomi unitari di λ nel modo se- riconosce la sequenza cos (Figura 3.12b) e produce un
guente: nel cromosoma di λ c’è il gene ter (da terminus taglio asimmetrico in corrispondenza di ciascun sito
generating activity, “attività di produzione delle termi- cos. In questo modo sono prodotti cromosomi λ lineari
nazioni”; Figura 3.12b), il cui prodotto è una DNA en- con le corrette estremità complementari coesive a singo-
donucleasi (un enzima che digerisce una catena di acido la elica, lunghe 12 bp. I singoli cromosomi sono poi im-
pacchettati nelle teste del fago λ.

Nota chiave La replicazione del DNA


Durante la replicazione viene sintetizzato nuovo
DNA nella direzione da 5’ a 3’. In tal modo, la cresci-
negli eucarioti
ta è continua su un filamento e discontinua sull’al- La biochimica e la biologia molecolare della replicazio-
tro (cioè a segmenti congiunti successivamente). ne del DNA sono simili in eucarioti e procarioti.
Questo modello discontinuo è applicabile a parec- Tuttavia, la complicazione addizionale negli eucarioti è
chi altri sistemi di replicazione dei procarioti, ognu- che il DNA non si trova in un solo cromosoma, ma è
no dei quali differisce nel numero e nelle proprietà distribuito in molti cromosomi. In questa parte del capi-
degli enzimi e delle proteine necessari. tolo verranno riassunti alcuni aspetti importanti della re-
plicazione del DNA negli eucarioti.

Sequenza cos
a) Il cromosoma lineare di l (~ 48 000 bp) forma il cromosoma circolare di l
C GG C G A C
Interruzione G
... G C G C CGC T G

C AG
C

C A A T GC G
5¢ G G G C G G C G A C C T C G C G G G T G T T A C G 3¢

G
T
C
G T T A CG

CGCGGG
3¢ G C G C C C A ... C A A T G C C C C G C C G C T GG A 5¢

CGCCC T
Interruzione
L’infezione della cellula
ospite determina

A
Terminazioni complementari a singola elica la circolarizzazione
del cromosoma

Le interruzioni sono
chiuse dalla DNA ligasi

b) La produzione di cromosomi l figli dai concatameri (copie multiple legate una di seguito all’altra mediante estremità complementari)

Sequenza cos Sequenza cos

Parte ...
5¢ G T T A C G G G G C G G C G AC C T C G C G G G T G T T A C G G G G CG G C G A C C T C G C G G G T 3¢
della molecola
concatamerica 3¢ C A A T G C C C C G C C G C TG G A G C G C C C A ... C A A T G C C C C GC C G C T G G A G C G C C C A 5¢

Enzima ter Punto di taglio


L’enzima ter produce un cromosoma di l con le terminazioni
complementari a singola elica mediante un taglio asimmetrico
( ) in corrispondenza delle sequenze cos

3¢ 5¢ ... 3¢ 5¢
G T T A CG GGGCGGCG ACC T C G C G G G T GT TA CG GGGCGGCGAC C T C G C G G G T
C A A T G C CCC G CCGC TGG A GC GCC CA ... C A A T G C CC CG C CGC TGG A 5¢ 3¢ G C G C C C A
5¢ 3¢

Terminazioni complementari a singola elica

Il cromosoma di l è ritagliato dalla molecola concatamerica


Figura 3.12
La struttura del cromosoma di l varia in funzione degli stadi Durante la replicazione del cromosoma di λ, si forma una gi-
del ciclo vitale del fago in E. coli. (a) Parti del cromosoma gantesca molecola concatamerica di DNA; questa molecola
di λ che mostrano la sequenza nucleotidica delle due contiene una serie di genomi di λ ripetuti in tandem uno
terminazioni coesive a singola elica complementari tra loro di seguito all’altro. Lo schema mostra la giunzione di due
e la circolarizzazione del cromosoma dopo l’infezione, cromosomi di λ adiacenti e l’estensione della sequenza cos.
dovuta all’appaiamento delle terminazioni e alla saldatura La sequenza cos è riconosciuta dal prodotto del gene ter,
delle interruzioni a singola elica con produzione di una una endonucleasi che fa due tagli in corrispondenza dei siti
molecola circolare chiusa covalentemente. (b) La produzione indicati dalle frecce. Questi tagli producono un cromosoma
di terminazioni coesive nel DNA di λ durante la replicazione. di λ completo dal concatamero.
48 Capitolo 3

a) Microfotografia (al microscopio elettronico) che mostra forca di replicazione adiacente, che ha avuto inizio in
le unità di replicazione (repliconi)
un’origine di replicazione attigua.
Negli eucarioti, il tratto di DNA compreso fra un’o-
Unità di replicazione
rigine di replicazione e le due terminazioni della replica-
zione (dove le forche di replicazione adiacenti si fondo-
no) a ciascun lato dell’origine si chiama replicone o
unità di replicazione (Figura 3.13).
Il genoma di E. coli consiste di un unico replicone,
della dimensione di 4,6 Mb (milioni di coppie di basi, la
dimensione dell’intero genoma), con un tasso di avanza-
mento della forca di replicazione di circa 1000 bp al se-
condo; per la replicazione dell’intero cromosoma sono
necessari 42 minuti. Al contrario, i repliconi degli euca-
b) Interpretazione della fotografia al microscopio elettronico
rioti sono più piccoli. Per esempio, si stima ci siano da
Unità di replicazione
10 000 a 100 000 repliconi nell’uomo, per una media di
30-300 kb; il tasso di movimento della forca di replica-
zione è di circa 100 bp per secondo. Per la replicazione
dell’intero genoma occorrono otto ore, ma ogni replico-
ne viene replicato solo per una parte di questo tempo.
Vi è una specifica sequenza temporale per l’inizio
della replicazione alle varie origini di replicazione. La
Figura 3.14 mostra un segmento (teorico) di un cromo-
soma nel quale tre repliconi iniziano a replicarsi in tem-
pi differenti. Quando le forche di replicazione si fondo-
no ai margini dei repliconi adiacenti, il cromosoma si è
Figura 3.13 replicato in due cromatidi fratelli.
DNA di Drosophila melanogaster durante la replicazione.

Inizio della replicazione


Repliconi Le sequenze di inizio della replicazione sono meno ben
Ogni cromosoma di un eucariote consiste di un DNA li- definite negli eucarioti che nei procarioti. Nel lievito
neare a doppia elica. Per esempio, il genoma aploide Saccharomyces cerevisiae sono sequenze di circa 100 bp
umano (23 cromosomi) consiste di circa tre miliardi di chiamate sequenze autonome di replicazione (ARS,
coppie di basi di DNA e ogni cromosoma è lungo media- Autonomously Replicating Sequences). Le sequenze di
mente circa 108 bp, circa 25 volte più lungo del cromoso- origine di replicazione negli organismi multicellulari più
ma di E. coli. Il movimento della forca di replicazione è complessi sono ancora meno caratterizzate. Nel Focus sul
molto più lento negli eucarioti che in E. coli; pertanto, se genoma di questo capitolo si descrive un approccio geno-
ci fosse una unica origine di replicazione per cromosoma, mico per identificare le origini di replicazione nel lievito.
la replicazione di ogni cromosoma ri-
chiederebbe parecchi giorni. Tempo Origini di replicazione
In effetti i cromosomi degli euca-
rioti si replicano in modo efficiente e DNA stampo (blu)
relativamente veloce poiché la replica-
zione del DNA viene iniziata nel ge-
noma in parecchi punti contempora- Nuovo DNA (rosso)

neamente. In ogni punto di origine, co-


me in E. coli, il DNA si srotola in fila-
menti singoli e la replicazione procede
in modo bidirezionale; infine, ogni
forca di replicazione corre verso la DNA stampo (blu)

Figura 3.14
Sequenza temporale degli eventi di inizio
della replicazione del DNA nelle unità Nuovo DNA (rosso)
replicative dei cromosomi eucariotici.
La replicazione del DNA 49

Focus sul genoma


Origini di replicazione nel lievito
Gli scienziati trovarono per la prima volta l’origine disposizione il DNA delle cellule che avevano appe-
di replicazione nel lievito (Saccharomyces cerevi- na iniziato la replicazione. Successivamente, essi
siae) osservando frammenti di DNA che davano ini- coltivarono le cellule di lievito in presenza di isoto-
zio alla replicazione dei plasmidi di lievito. Le origi- pi pesanti, in modo da avere DNA più denso.
ni contengono una regione ACS (una sequenza au- Trasferirono le cellule in un mezzo di coltura con
tonoma di replicazione con sequenza di consenso) isotopi normali più leggeri e consentirono alle cel-
di 200 bp, alla quale si lega un gruppo di polipepti- lule di dare inizio alla replicazione. Dopo pochi mi-
di (il complesso di riconoscimento dell’origine o nuti essi estrassero il DNA da queste cellule. Il DNA
ORC) non appena inizia la replicazione. Usando di nuova costruzione conteneva un filamento con
l’approccio molecolare tradizionale, gli scienziati isotopi leggeri e un altro con isotopi pesanti, ma il
trovarono solo circa il 10% delle origini (30 su circa DNA non replicato conteneva solo isotopi pesanti
400) previste affinché il genoma del lievito possa (ciò è simile a una parte dell’esperimento di
funzionare. Meselson-Stahl). Essi tagliarono il DNA in piccoli
La genomica consentì di catalogare in maniera pezzi e separarono il DNA meno denso (replicato);
esaustiva le origini nel lievito. Quando fu sequen- dal momento che esso era stato sicuramente repli-
ziato l’intero genoma del lievito furono trovate cir- cato doveva trovarsi vicino all’origine. I ricercatori
ca 12 000 regioni ACS, molto più delle 400 previste. marcarono questo DNA con sostanze fluorescenti,
Chiaramente occorre più di una ACS per identifica- lo denaturarono per ridurlo a filamento singolo e
re un’origine. Molti ricercatori hanno usato mi- lo posero sul DNA di un microarray.
croarray a DNA (Capitolo 8) per analizzare parec- Il DNA fluorescente potrebbe appaiarsi al DNA de-
chie sequenze di DNA simultaneamente. Per creare positato sul microarray qualora le due sequenze di
un microarray a DNA, milioni di copie di sequenze DNA fossero complementari. L’appaiamento speri-
di DNA identiche a filamento singolo sono immobi- mentale di due filamenti di DNA è chiamato ibrida-
lizzate su una unica ben nota posizione di un vetri- zione. Le sonde di DNA fluorescente si legano a
no (creando così uno “spot” di molte copie di que- qualche sequenza sul DNA del microarray e ignora-
sta sequenza). Migliaia di sequenze differenti, che no le altre. I ricercatori utilizzarono il laser per rive-
rappresentano regioni di geni e non geni, possono lare la localizzazione delle marcature fluorescenti.
essere deposte come “spot” unici su un singolo ve- Poiché conoscevano le sequenze esatte depositate
trino (creando così una grande griglia di piccoli sul microarray, i ricercatori a questo punto erano in
spot individuali che viene definita microarray). grado di conoscere quali sequenze erano presenti
Gli scienziati depositarono a caso sequenze del ge- nel genoma ibridizzato dal DNA (replicato) con
noma del lievito sul vetrino. Alcuni di questi spot quello marcato con fluorescenza. In tal modo, que-
contenevano le origini o sequenze vicine, ma la sti studiosi individuarono 332 regioni candidate a
gran parte non le conteneva, e i ricercatori avevano essere considerate origini.
bisogno di identificare sul microarray le sequenze Queste e altre tecniche alla fine consentirono agli
corrispondenti alle origini o quelle a esse vicine. Di scienziati di clonare 228 origini di replicazione di S.
seguito verrà spiegato come trovarono queste se- cerevisiae. Ciascuna di queste ultime mostrò di esse-
quenze. Per prima cosa avevano bisogno di avere a re funzionale nelle cellule di lievito.

La proteina di inizio negli eucarioti è il complesso di ri- la quale la cellula si prepara per la replicazione del
conoscimento dell’origine (ORC, Origin Recognition DNA; fase S, durante la quale avviene la replicazione;
Complex). L’origine di replicazione del lievito, per fase G2, durante la quale la cellula si prepara per la divi-
esempio, si estende per circa 100 bp. L’ORC si lega in sione cellulare; fase M, durante la quale avviene la divi-
due differenti regioni a una estremità dell’origine di re- sione cellulare attraverso la mitosi. Per la corretta dupli-
plicazione e recluta altre proteine di replicazione, tra le cazione del cromosoma, ogni origine di replicazione de-
quali vi è la proteina necessaria per srotolare il DNA in ve essere usata solo una volta nel ciclo cellulare. Ciò si
una terza regione vicina all’altra estremità. L’origine di realizza attraverso una complicata serie di eventi. In sin-
replicazione è tra le prime due regioni e la terza. tesi, l’inizio della replicazione avviene in due fasi sepa-
La replicazione del DNA avviene in uno specifico rate temporalmente. L’inizio consiste nella selezione
stadio del ciclo di divisione cellulare. Il ciclo cellulare si dell’origine di replicazione, in cui l’ORC si lega a ogni
compone di quattro stadi (Figura 12.4): fase G1, durante origine nella fase G1 e recluta altre proteine per formare
50 Capitolo 3

il complesso prereplicativo (pre-RCs). Lo srotolamento Le cellule eucariote hanno 15 o più DNA polimerasi.
del DNA non avviene quando un iniziatore si lega a una Tre di queste sono necessarie alla replicazione del
origine di replicazione, al contrario di quanto si verifica DNA nucleare: Pol α/primasi, Pol δ e Pol ε. La Pol
nei batteri. Piuttosto, i pre-RC vengono attivati quando α/primasi inizia la replicazione dei nuovi filamenti me-
la cellula passa dalla fase G1 alla fase S e ha inizio la re- diante la primasi sintetizzando circa 10 nucleotidi di un
plicazione. primer di RNA, allungato dalla Pol α di circa 10-20 nu-
L’inizio della replicazione nella fase S è controllato cleotidi di DNA. Pol ε sintetizza il DNA del filamento
da una proteina chiamata licensing factor. Questa pro- leading e Pol δ il DNA del filamento lagging. Le altre
teina viene sintetizzata solo nella fase G1 e poi si muove DNA polimerasi eucariote replicano il DNA mitocon-
verso il nucleo, dove sono presenti le prime proteine che driale o il DNA del cloroplasto, oppure sono implicate
si legano all’ORC per formare i pre-RC. Sono quindi re- in specifici processi di riparazione del DNA.
clutate altre proteine, e l’intero complesso inizia a sroto- Come nei procarioti, la giunzione dei frammenti di
lare il doppio filamento del DNA. A questo punto le Okazaki sul filamento lagging che funziona da stampo
proteine licensing factor sono estromesse dal complesso coinvolge la rimozione del primer dal frammento di
e sono inattivate, sia mediante degradazione sia median- Okazaki più vecchio e la sostituzione con DNA median-
te la loro espulsione dal nucleo, a seconda dell’organi- te l’estensione del frammento di Okazaki più recente.
smo. Complessivamente, la combinazione della sintesi La rimozione del primer non coinvolge la progressiva
dei licensing factor solo in G1 con il loro funzionamen- rimozione dei nucleotidi, come nel caso dei procarioti.
to all’interno dei pre-RC e la loro inattivazione guidata Pol δ continua l’estensione del nuovo frammento di
serve a limitare l’inizio della replicazione di ogni origi- Okazaki e questa attività sposta l’RNA/DNA davanti al-
ne a una volta sola per ciclo cellulare. l’enzima, producendo un lembo che viene rimosso dalle
nucleasi. I due frammenti di Okazaki vengono infine le-
gati insieme dalla DNA ligasi eucariote.
Enzimi per la replicazione degli eucarioti
Sono stati identificati molti degli enzimi e proteine
coinvolti nella sintesi del DNA dei procarioti, mentre le
Replicazione dell’estremità dei cromosomi
conoscenze sono minori circa gli enzimi e le proteine Poiché la DNA polimerasi può catalizzare nuovo DNA
coinvolti nella replicazione del DNA degli eucarioti. soltanto estendendo un primer, la replicazione delle
estremità dei cromosomi eucariotici – i telomeri – pone
a) Diagramma schematico di una molecola parentale di DNA a dop- dei problemi (Figura 3.15).
pia elica rappresentante l’intera lunghezza di un cromosoma
5¢ 3¢ Un cromosoma parentale (Figura 3.15a) viene repli-
3¢ 5¢ cato, generando due nuove molecole di DNA, ciascuna
b) Dopo la replicazione semiconservativa, nuovi segmenti di DNA delle quali ha un primer di RNA all’estremità 5′ nella re-
uniti da ponti idrogeno all’elica stampo hanno primer di RNA gione del telomero di ciascuna elica di nuova sintesi
all’estremità 5¢
(Figura 3.15b). Al contrario, i numerosi primer di RNA
5¢ 3¢ in ogni filamento lagging sono stati sostituiti dal DNA
3¢ 5¢ durante le normali fasi della replicazione (Figura 3.6).
Primer di RNA Si noti che il frammento 5′ di Okazaki è esteso nella di-
e
Nuovo DNA rezione 5′→3′ per rimpiazzare il primer di RNA.
Primer di RNA
Dal momento che non ci sono frammenti di Okazaki
5¢ 3¢
alle estremità 5′ del primer, la rimozione dell’RNA alle
3¢ 5¢
estremità 5′ dei nuovi filamenti di DNA lascia un pezzo
c) I primer di RNA sono rimossi, la DNA polimerasi riempie le di filamento singolo di DNA parentale che si estende ol-
interruzioni risultanti e la DNA ligasi congiunge i frammenti tre l’estremità 5′ di ogni nuovo filamento. La DNA po-
adiacenti. Tuttavia, in corrispondenza dei telomeri si trovano
ancora interruzioni alle estremità 5¢ del nuovo DNA, derivanti limerasi non può riempire questa parte sporgente all’e-
dalla rimozione dei primer di RNA, perché nessuna sintesi ha stremità del cromosoma. Se queste sporgenze non ve-
potuto riempirle
5¢ 3¢ nissero in qualche modo risolte, i cromosomi divente-
3¢ rebbero sempre più corti a ogni ciclo di replicazione.

Invece, vi è uno speciale meccanismo per replicare
e Interruzione lasciata
Interruzione le estremità dei cromosomi. La maggior parte dei cro-
dopo la rimozione
del primer
mosomi eucariotici ha semplici sequenze specie-speci-
3¢ 5¢ fiche ripetute in tandem ai telomeri (Capitolo 2). Eli-
Figura 3.15 zabeth Blackburn e Carol W. Greider hanno dimostrato
Il problema della replicazione completa di un cromosoma che un enzima chiamato telomerasi mantiene la lun-
lineare negli eucarioti. ghezza dei cromosomi aggiungendo ripetizioni telome-
La replicazione del DNA 51

riche a un filamento (quello che ha un’estremità 3′), che a) Punto di inizio: estremità cromosomica con interruzione
in 5¢ lasciata dalla rimozione del primer
serve da stampo per la replicazione del DNA a ciascuna Estremità sporgente dopo l’allontanamento del primer
estremità del cromosoma lineare.
La Figura 3.16 mostra uno schema semplificato del 5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢

meccanismo usato per l’aggiunta delle ripetizioni telome- 3¢ A A T C C C 5¢


riche all’estremità di un cromosoma umano. Nell’uomo e b) Legame della telomerasi alla ripetizione telomerica
in tutti gli altri vertebrati la sequenza ripetuta è 5′- sporgente alla fine del cromosoma

TTAGGG-3′, leggendola sull’elica superiore nella figura,


5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢
in direzione della fine del DNA. La reale estremità 3′ è va- Telomerasi

riabile da cromosoma a cromosoma; qui viene mostrata la 3¢ A A T C C C 5¢ CA AUCCCA A UC

sequenza terminale più frequente. La telomerasi agisce al- RNA telomerasi


lo stadio mostrato nella Figura 3.15c, cioè dove una estre- 3¢ 5¢
Stampo a RNA per il
mità del cromosoma è stata sintetizzata dopo la rimozione nuovo DNA telomerico
del primer con formazione di una sporgenza che si esten- c) Sintesi di un segmento di DNA all’estremità del cromosoma,
de oltre l’estremità 5′ del nuovo DNA (Figura 3.16a). usando l’RNA stampo della telomerasi.
La telomerasi è un enzima ribonucleoproteico, cioè Nuovo DNA

costituito sia da proteine sia da RNA. La componente 5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢


di RNA (lunga nell’uomo 451 basi) comprende una se- 3¢ A A T C C C 5¢ CA AUCCCA A UC
quenza di 11 basi che funziona da stampo e che è uti-
lizzata per la sintesi delle nuove sequenze ripetute di
3¢ 5¢
DNA telomerico. La telomerasi si lega in modo speci-
d) La telomerasi si muove verso la regione terminale 3¢
fico alle sporgenze telomeriche sul filamento con l’e- del DNA telomerico neosintetizzato
stremità 3′ del cromosoma (Figura 3.16b). L’estremità
3′ della sequenza di RNA che funziona da stampo nel- 5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢

la telomerasi (3′-CAAUC-5′) si appaia con la sequen- 3¢ A A T C C C 5¢ CA AUCCCA A UC


za 5′-GTTAG-3′ all’estremità del filamento di DNA
sporgente. A questo punto, la telomerasi catalizza l’ag- 3¢ 5¢
giunta di nuovi nucleotidi all’estremità 3′ del DNA
e) Sintesi di nuovo DNA telomerico
(5′-GGGTTAG-3′) utilizzando l’RNA telomerasi co- Nuovo DNA
me stampo (Figura 3.16c). 5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢
La telomerasi scivola quindi verso la fine del cromo-
3¢ A A T C C C 5¢ CA AUCCCA A UC
soma, in modo che la sequenza all’estremità 3′ (3′-
CAAUC-5′) dell’RNA stampo si appai ora con il DNA
di nuova sintesi (Figura 3.16d). Quindi, come prima, la 3¢ 5¢
telomerasi sintetizza il DNA telomerico allungando la f) Regioni terminali del cromosoma dopo che la telomerasi
si è dissociata
sporgenza (Figura 3.16e). Se la telomerasi si allontana
ora dal DNA, il cromosoma si sarà allungato di due ri- 5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢
petizioni telomeriche (Figura 3.16f). Ma il processo può 3¢ A A T C C C 5¢ DNA sintetizzato dopo due cicli
continuare aggiungendo più ripetizioni telomeriche. di attività della telomerasi

Così il cromosoma si può allungare aggiungendo un g) Nuova regione terminale del cromosoma
dopo la replicazione e la rimozione del primer
certo numero di ripetizioni telomeriche. Estremità sporgente dopo l’allontanamento del primer
Allora, quando il cromosoma è replicato usando il fi-
5¢ T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G G G T T A G 3¢
lamento allungato come stampo e il primer del nuovo fi-
lamento di DNA è rimosso, ci sarà ancora una sporgenza, 3¢ A A T C C C A A T C C C A A T C C C 5¢
Allungamento 5¢ del cromosoma
ma qualunque accorciamento del cromosoma sarà stato dovuto all’attività telomerasica
più che compensato dall’azione della telomerasi (Figura Figura 3.16
3.16g). Nella maggior parte delle cellule il DNA dei telo- Sintesi di DNA telomerico da parte della telomerasi.
meri si avvolge su sé stesso all’indietro per formare un t- L’esempio è riferito ai telomeri dell’uomo. Il processo
loop, con una parte finale a singolo filamento che invade è descritto in maniera semplificata.
le sequenze telomeriche ripetute a doppio filamento in
modo da formare un D-loop (Capitolo 2 e Figura 2.24). Altre trascrittasi inverse sono usate in applicazioni bio-
La sintesi del DNA a partire dallo stampo di RNA è tecnologiche, come la reverse transcription-PCR o RT-
chiamata trascrizione inversa; pertanto, la telomerasi è PCR, descritta nel Capitolo 10.)
un esempio di enzima definito trascrittasi inversa. (La La lunghezza dei telomeri, pur non essendo identica in
telomerasi trascrittasi inversa è abbreviata in TERT. tutti i cromosomi, ha tuttavia una regolazione che ne sta-
52 Capitolo 3

bilisce la lunghezza media a livello di organismo e di tipo di divisioni che la cellula può fare (detto limite di Hayflick
cellulare. Nel lievito, per esempio, le semplici sequenze dal nome dello scienziato che lo ha dimostrato in cellule
telomeriche (TG1-3, una sequenza ripetuta costituita da in coltura). Oggi sappiamo che l’accorciamento dei telo-
una T seguita da una fino a tre G) coprono in media 300 meri segnala alla cellula di dover smettere di dividersi,
bp mentre in tutti i vertebrati, compreso l’uomo, le se- uscire dal ciclo cellulare ed entrare in uno stato noto co-
quenze telomeriche (TTAGGG) si estendono per parec- me senescenza replicativa. In questo stato (caratterizza-
chie migliaia di basi. L’analisi di mutanti nel lievito ha di- to da un metabolismo ridotto, una ridotta sintesi proteica,
mostrato che la lunghezza dei telomeri è regolata geneti- una perdita delle funzioni cellulari differenziate e produ-
camente. Se, per esempio, il gene TLC1 (che codifica per zione di fattori specifici) la cellula permane per un tempo
l’RNA della telomerasi) è deleto, oppure se il gene EST1 anche lungo fino a quando muore.
(Ever Shorter Telomeres, che codifica per la componente
proteica della telomerasi di lievito) è mutato, i telomeri si
accorciano sempre più, finché la cellula muore. Questo Nota chiave
fenotipo fornisce la prova che l’attività della telomerasi è Enzimi specifici – le telomerasi – replicano le estre-
necessaria per la vitalità a lungo termine delle cellule. mità dei cromosomi negli eucarioti. La telomerasi è
Prove recenti suggeriscono l’esistenza di più livelli di un complesso di proteine e di RNA. L’enzima utiliz-
regolazione dell’attività e della lunghezza dei telomeri. Si za l’RNA come stampo per la sintesi delle ripetizio-
sta prestando attenzione, per esempio, all’osservazione ni telomeriche complementari del cromosoma; per
che l’attività telomerasica nei mammiferi è limitata alle questo è funzionalmente definita trascrittasi inver-
cellule immortali (come le cellule tumorali) e a molte cel- sa. L’assenza di attività telomerasica provoca accor-
lule che proliferano (come le cellule embrionali, alcune ciamento progressivo dei telomeri e induce sene-
cellule staminali e le cellule germinali). L’assenza di atti- scenza cellulare, riducendo a lungo termine la vita-
vità telomerasica negli altri tipi cellulari causa il progres- lità delle cellule.
sivo accorciamento delle estremità dei cromosomi duran-
te le divisioni successive e stabilisce un limite al numero
L’assemblaggio del nuovo DNA
nei nucleosomi
Il DNA degli eucarioti è complessato con istoni in strut-
ture nucleosomiche, che sono le unità di base dei cromo-
somi (Capitolo 2). Si ricordi
Istoni vecchi: H2A H2B H3 H4
che nel nucleosoma vi sono
otto istoni, due copie ciascu-
Istoni nuovi: H2A H2B H3 H4 no di H2A, H2B, H3 e H4.
Perciò, quando il DNA viene
Direzione della replicato, il complemento
replicazione del DNA Nucleosoma istonico deve venire raddop-
parentale
piato, in modo che tutti i nu-
Macchinario cleosomi siano duplicati.
Dimero H2A-H2B della replicazione
del DNA
Questa duplicazione coinvolge
due processi: la sintesi di nuove
proteine istoniche e l’assemblaggio
di nuovi nucleosomi.
La maggior parte della sintesi degli istoni avviene du-
rante la fase S del ciclo cellulare, ed è coordinata con la
sintesi del DNA. Affinché la replicazione proceda, i nu-
cleosomi devono dissociarsi durante il breve tempo del
passaggio della forca replicativa; il DNA di nuova repli-
cazione viene assemblato nei nucleosomi quasi immedia-

Dimero H2A-H2B
Figura 3.17
Dimero H2A-H2B Assemblaggio di nuovi nucleosomi a livello della forca repli-
cativa. I nuovi nucleosomi vengono assemblati dapprima
usando un tetramero H3-H4 parentale o uno nuovo e poi
completando la struttura con una coppia di dimeri H2A-H2B.
La replicazione del DNA 53

tamente. I nuovi nucleosomi vengono assemblati nel mo- È anche presente un pool di nuovi tetrameri; uno di que-
do seguente (Figura 3.17): ogni nucleo istonico parentale sti tetrameri inizia l’assemblaggio del nucleosoma sul-
di un nucleosoma si separa in un tetramero H3-H4 (due l’altra doppia elica di DNA dopo il passaggio della forca
copie ciascuno di H3 e H4) e in due copie di un dimero replicativa. La restante parte dei nuovi nucleosomi viene
H2A-H2B. Il tetramero H3-H4 viene trasferito diretta- assemblata da dimeri H2A-H2B parentali o nuovi. Ne de-
mente a una delle due doppie eliche replicate dopo il pas- riva che un nuovo nucleosoma avrà un tetramero sia pa-
saggio della forca replicativa, il che segna l’inizio dell’as- rentale sia nuovo e una coppia di dimeri H2A-H2B che
semblaggio del nucleosoma. I dimeri H2A-H2B vengono possono essere parentali-parentali, parentali-nuovi o nuo-
rilasciati e raggiungono il pool di dimeri H2A-H2B sinte- vi-nuovi. Le proteine chaperonine istoniche nel nucleo
tizzati ex novo e assemblati. dirigono il processo di assemblaggio del nucleosoma.

Sommario
l La replicazione del DNA nei procarioti e negli eucarioti l Nei procarioti la replicazione del DNA inizia in un punto
avviene con un meccanismo semiconservativo nel quale i singolo e procede in modo bidirezionale. Negli eucarioti la
due filamenti di DNA a doppia elica sono separati e un replicazione del DNA inizia contemporaneamente in pa-
nuovo filamento complementare di DNA viene sintetizza- recchi punti lungo ogni cromosoma e procede in modo bi-
to nella direzione da 5′ a 3′ su ognuno dei filamenti paren- direzionale a partire da ogni punto di origine.
tali, che funzionano da stampo. Questo meccanismo assi- l Enzimi speciali (telomerasi) replicano le estremità dei cro-
cura che l’informazione genetica sia copiata accuratamen- mosomi in parecchie cellule eucariote. Una telomerasi è un
te a ogni divisione cellulare. complesso di proteine e RNA. L’RNA agisce da stampo
l Gli enzimi chiamati DNA polimerasi catalizzano la sinte- per la sintesi delle ripetizioni telomeriche complementari
si del DNA. Usando il precursore desossiribonucleoside di un cromosoma. Nei mammiferi l’attività della telomera-
5′-trifosfato (dNTP), tutte le polimerasi fabbricano nuovi si è limitata alle cellule immortali (come le staminali, le
filamenti nella direzione da 5′ a 3′. cellule germinali e quelle tumorali). L’assenza dell’attività
l Le DNA polimerasi non possono iniziare la sintesi di un della telomerasi produce un progressivo accorciamento
nuovo filamento di DNA. I DNA neosintetizzati usano co- della parte finale del cromosoma a ogni divisione cellulare
me innesco l’RNA, la cui sintesi è catalizzata dall’enzima e, in questo modo, viene limitato il numero di divisioni del-
DNA primasi. le cellule somatiche che, a lungo termine, vanno incontro a
l La replicazione in E. coli richiede due DNA polimerasi e senescenza e poi a morte.
parecchi altri enzimi e proteine. Sia nei procarioti sia negli l L’organizzazione nucleosomica del cromosoma eucariote
eucarioti, la sintesi del DNA è continua su un filamento e deve essere duplicata man mano che la forca di replicazio-
discontinua sull’altro filamento, che funzionano entrambi ne avanza. I nucleosomi devono dissociarsi per permette-
da stampo; questo processo è chiamato replicazione semi- re alla forca di replicazione di passare; successivamente,
discontinua. nuovi nucleosomi sono assemblati non appena la forca di
l Negli eucarioti la replicazione del DNA avviene nella replicazione è passata. L’assemblaggio del nucleosoma è
fase S del ciclo cellulare ed è simile alla replicazione nei un processo ordinato diretto dalle proteine chaperonine
procarioti da un punto di vista biochimico e molecolare. istoniche.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


D3.1 Quando il DNA a doppia elica è scaldato a 100 °C, le due
a. Meselson e Stahl usarono DNA marcato con 15N per di- eliche si separano in seguito alla rottura dei legami idroge-
mostrare che la replicazione del DNA è semiconservativa. no – processo chiamato denaturazione del DNA. Quando la
Il metodo di analisi era la centrifugazione all’equilibrio in soluzione contenente il DNA è raffreddata lentamente, cia-
gradiente di densità di cloruro di cesio, in cui il DNA bat- scuna delle due eliche complementari trova l’altra elica e ri-
terico marcato su tutte e due le eliche con 15N (l’isotopo forma la doppia elica – processo detto rinaturazione. Se la
pesante dell’azoto) forma una banda in una posizione del miscela di DNA contenente 14N e 15N è riscaldata a 100 °C
gradiente diversa da quella di un DNA marcato su entram- e poi raffreddata lentamente prima della centrifugazione, il
be le eliche con 14N (l’isotopo normale dell’azoto). risultato è diverso rispetto a quello indicato in precedenza.
Partendo da una miscela di DNA contenente 14N e DNA Si osservano due bande esattamente nelle posizioni prece-
contenente 15N, dopo la centrifugazione in gradiente di denti e una terza banda a metà strada fra le due. Dalla sua
CsCl si ottengono due bande. posizione rispetto alle altre due bande, la nuova banda appa-
54 Capitolo 3

re di densità intermedia fra le altre due. Spiegate l’esistenza R3.2 Quando i geni sono deleti, la funzione codificata da quei
di tre bande nel gradiente. geni va perduta. Tutti i geni elencati nella domanda sono coin-
b. DNA di E. coli contenente 15N in entrambe le eliche viene volti nella replicazione del DNA in E. coli, e le loro funzioni so-
mescolato con DNA di un’altra specie batterica, il Ba- no descritte brevemente nella Tabella 3.1 e ulteriormente di-
cillus subtilis, contenente 14N in entrambe le eliche. Si os- scusse nel testo.
servano due bande dopo centrifugazione in gradiente di a. dnaE codifica una subunità della DNA polimerasi III, la
CsCl. Se i due DNA mescolati sono riscaldati a 100 °C, DNA polimerasi principale in E. coli, responsabile dell’al-
raffreddati lentamente e poi centrifugati, si osservano solo lungamento delle catene di DNA. Una delezione del gene
due bande. Le bande sono situate esattamente nelle stesse dnaE causerebbe senza dubbio una perdita della funzionali-
posizioni dell’esperimento con DNA non riscaldato. Spie- tà della DNA polimerasi III. In assenza di DNA polimerasi
gate questi risultati. III, non si possono sintetizzare filamenti di DNA dai primer
di RNA; quindi, nuovi filamenti di DNA non potrebbero es-
R3.1 sere sintetizzati e non vi sarebbe replicazione cromosomica.
a. Quando il DNA è riscaldato a 100 °C, viene denaturato in b. polA codifica la DNA polimerasi I, che è usata nella sintesi
singoli filamenti. Se il DNA denaturato viene fatto raf- di DNA per allungare catene di DNA sintetizzate dalla DNA
freddare lentamente, le eliche complementari si riassocia- polimerasi III, rimuovendo contemporaneamente i primer di
no a formare di nuovo doppie eliche. Perciò, quando RNA con l’attività esonucleasica 5′→3′. Come discusso nel
DNA 15N-15N e 14N-14N della stessa specie, denaturati e testo, la replicazione del DNA avviene ancora in mutanti
miscelati, vengono raffreddati lentamente, le singole eli- mancanti della DNA polimerasi originalmente studiata – la
che si appaiano a caso durante la rinaturazione generando DNA polimerasi I. Quindi, i cromosomi replicherebbero
doppie eliche di DNA 15N-15N, 14N-14N e 14N-15N. normalmente in un ceppo di E. coli portatore di una delezio-
Quest’ultimo DNA ha una densità intermedia rispetto agli ne di polA.
altri due tipi di DNA e giustifica la terza banda. c. dnaG codifica la DNA primasi, l’enzima che sintetizza il pri-
Teoricamente, se tutti i filamenti di DNA si appaiassero a mer di RNA sullo stampo di DNA. Senza la sintesi del corto
caso, ci dovrebbe essere una distribuzione 1:2:1 di DNA primer di RNA, la DNA polimerasi III non può iniziare la
15N-15N, 14N-15N, 14N-14N, e questo rapporto si dovrebbe sintesi di DNA e perciò non può avvenire la replicazione del
riflettere nelle intensità relative delle bande. DNA.
b. I DNA di specie differenti hanno sequenze diverse. In altre d. lig codifica la DNA ligasi, l’enzima che catalizza la giunzio-
parole, il DNA di una specie generalmente non è comple- ne dei frammenti di Okazaki. In un ceppo portatore di una
mentare a quello di un’altra specie. Perciò si osserveranno delezione di lig, si avrebbe sintesi di DNA, ma non si otter-
solo due bande, perché solo le due eliche di DNA di E. coli rebbero cromosomi figli stabili, perché i frammenti di
possono rinaturare e formare DNA 15N-15N e solo le due eli- Okazaki non potrebbero essere legati insieme; quindi, l’elica
che di DNA di B. subtilis possono rinaturare e formare DNA lagging sintetizzata in modo discontinuo sul filamento stam-
14N-14N. Non si può formare DNA 14N-15N e quindi in que- po lagging sarebbe costituita da frammenti.
sto caso non vi sarà una banda di densità intermedia. e. ssb codifica le proteine che legano e stabilizzano le regioni
di DNA a singola elica prodotte dallo svolgimento del DNA
D3.2 Quale sarebbe in un ceppo di E. coli l’effetto sulla repli- alla forca replicativa. In assenza delle proteine SSB, la repli-
cazione cromosomica di delezioni dei seguenti geni? cazione del DNA sarebbe ostacolata o assente, perché la bol-
a. dnaE la replicativa non potrebbe essere mantenuta aperta.
b. polA f. oriC è la regione dell’origine di replicazione in E. coli, cioè
c. dnaG il punto in cui inizia la replicazione cromosomica. Senza l’o-
d. lig rigine, la proteina iniziatrice non può legarsi, non si può for-
e. ssb mare la bolla di replicazione e perciò non può avvenire la re-
f. oriC plicazione cromosomica.
4 La funzione del gene
Qual è la relazione tra i geni e gli enzimi? Quale relazione esiste tra i geni e le proteine
non enzimatiche?

In che modo i geni controllano Come si possono individuare le mutazioni


le vie biochimiche? che causano malattie genetiche?

Attività Controllo genetico della struttura


Entro i primi minuti di vita, la maggior par-
te dei neonati negli Stati Uniti viene sottoposta a
degli enzimi
una serie di test: sono valutati, per esempio, i ri- Ipotesi di Garrod sugli errori congeniti
flessi e la respirazione, rilevato il colore della pel-
le e prelevati campioni di sangue che vengono
del metabolismo
inviati rapidamente in laboratorio. Le prove sui
Nel 1902 Archibald Garrod, un medico inglese, e il gene-
campioni di sangue aiutano i medici a determina-
tista William Bateson studiarono l’alcaptonuria (OMIM,
re se il bimbo ha una malattia genetica debilitan-
te o addirittura letale. Che cosa sono le malattie Online Mendelian Inheritance in Man, http://www.
genetiche? Quali sono le relazioni tra geni, enzi- ncbi.nlm.nih.gov/omim, annotazione 203500), una ma-
mi e malattie genetiche? In che modo compren- lattia dell’uomo caratterizzata dal fatto che le urine diven-
dere la funzione di un gene può aiutare a preve- tano scure dopo l’esposizione all’aria e dalla tendenza a
nire o minimizzare il rischio di tali malattie? sviluppare artrite in tarda età. Il difetto è facilmente iden-
Che cosa hanno in comune la muffa del pane e tificabile poco dopo la nascita a causa del tipico colore
certe malattie genetiche umane? Nella iAttività dell’urina. La trasmissibilità del difetto e il tipo di eredi-
di questo capitolo imparerete a utilizzare le pro- tarietà suggerivano che l’alcaptonuria fosse un carattere
cedure sperimentali di Beadle e Tatum per poter controllato geneticamente causato da un allele recessivo,
rispondere a questa domanda.
come dimostrato nel 1908 da Garrod. (Molte malattie ge-
netiche umane sono recessive – il che significa che, per
In questo capitolo esaminiamo la funzione del gene pre- sviluppare la malattia, un individuo deve ereditare da
sentando alcune delle prove classiche che i geni codifica- ogni genitore un allele mutato per il gene responsabile
no per gli enzimi e le proteine non enzimatiche. Attra- della malattia, risultando quindi omozigote per questo al-
verso l’esame del controllo genetico delle vie biochimi- lele; l’argomento è ripreso e ampliato nel Capitolo 11).
che si vedrà che i geni non funzionano in modo isolato, Garrod scoprì che individui con l’alcaptonuria elimi-
ma in cooperazione con altri geni per assicurare il buon nano con l’urina acido omogentisico (HA), mentre gli in-
funzionamento delle cellule. La comprensione del fun- dividui senza la malattia non lo fanno; è l’HA presente
zionamento dei geni e di come i geni sono regolati è lo nelle urine che diventa scuro a contatto con l’aria.
scopo fondamentale per i genetisti. Questo risultato indicò a Garrod che, mentre gli indivi-
Sotto il profilo storico, gli esperimenti descritti in dui normali sono capaci di metabolizzare l’HA, quelli af-
questo capitolo rappresentano gli inizi della genetica fetti da alcaptonuria non ne sono capaci. Detto nei termi-
molecolare, in quanto il loro scopo era comprendere me- ni di Garrod, questa malattia è un esempio di errore con-
glio un gene a livello molecolare. genito del metabolismo, cioè l’alcaptonuria è una ma-
Nei capitoli successivi sarà approfondita la nostra lattia genetica causata dall’assenza di un particolare en-
moderna comprensione della struttura del gene e della zima necessario per il metabolismo dell’HA. La Figura
sua espressione. 4.1 mostra parte della catena metabolica della fenilalani-
56 Capitolo 4

na-tirosina: il passaggio da HA ad acido maleilacetoace- Isolamento di mutanti nutrizionali in Neurospora


tico non ha luogo negli alcaptonurici. La mutazione re- Per comprendere gli esperimenti di Beadle e Tatum, oc-
sponsabile dell’alcaptonuria comporta quindi una perdi- corre prima comprendere il ciclo di crescita di Neuro-
ta di funzione del gene coinvolto e risulta perciò recessi- spora crassa, la muffa del pane (Figura 4.2). Neurospo-
va (vedi Capitolo 11): solo le persone omozigoti per que- ra crassa è un fungo miceliale, il che significa che si dif-
sto gene mutante manifestano il difetto. Analisi successi- fonde nel terreno di coltura a formare una massa di fila-
ve hanno localizzato il gene sul cromosoma 3. Il lavoro menti intrecciati (Figura 1.4g). Il micelio produce spore
di Garrod ha fornito la prima prova della relazione tra ge- asessuali chiamate conidi, di un colore arancione respon-
ni ed enzimi. sabile del nome comune del fungo. Neurospora possiede
Un’importante conseguenza dell’analisi di Garrod proprietà importanti che la rendono utile per gli studi di
dell’alcaptonuria, e di altre malattie genetiche umane che genetica e biochimica, tra le quali il fatto di essere un or-
coinvolgono processi biochimici, fu la comprensione del ganismo aploide, cosicché l’effetto delle mutazioni può
fatto che la posizione di un blocco in una via metabolica essere visto direttamente, e di avere un ciclo vitale breve,
può essere determinata dall’accumulo del composto chi- il che facilita lo studio della segregazione di difetti gene-
mico (HA, nel caso dell’alcaptonuria) che precede il pas- tici.
saggio laddove la catena metabolica è bloccata. Tuttavia, Neurospora può essere propagata vegetativamente
l’importanza del lavoro di Garrod non venne colta dai (asessualmente), inoculando frammenti di micelio o le
suoi contemporanei. spore asessuali (conidi) in un terreno di coltura per dare
origine a un nuovo micelio. Neurospora crassa può an-
che riprodursi in modo sessuato. Vi sono due tipi sessua-
L’ipotesi un gene-un enzima li (due “sessi” in senso lato), chiamati A e a. Entrambi i
Nel 1942, George Beadle ed Edward Tatum diedero ini- tipi sessuali hanno identico aspetto e possono essere di-
zio alla genetica biochimica, una branca della genetica stinti solo sulla base del fatto che i ceppi di tipo A non si
che utilizza la biochimica per spiegare la natura moleco- incrociano con altri ceppi A, e i ceppi a non si incrociano
lare di una catena metabolica. I risultati degli studi com- con altri a. Il ciclo sessuale viene iniziato mescolando i
piuti con il fungo aploide Neurospora crassa (la muffa tipi A e a in un terreno povero di azoto. In queste condi-
del pane) indicarono che vi era una relazione diretta fra zioni le cellule dei due tipi sessuali si fondono, con suc-
geni ed enzimi e portarono alla formulazione dell’ipote- cessiva fusione dei due nuclei aploidi a produrre un nu-
si un gene-un enzima, una pietra miliare nella storia del- cleo diploide A/a, che è il solo stadio diploide del ciclo di
la genetica. Beadle e Tatum condivisero il Premio crescita. Il nucleo diploide va immediatamente incontro
Nobel per la Fisiologia o Me- a meiosi e produce quattro nuclei aploidi (due A e due a)
nimazione dicina nel 1958 per la loro all’interno di un sacco allungato chiamato asco. Una
L’ipotesi un “scoperta che i geni agiscono successiva divisione mitotica porta a otto i nuclei aploidi
MyLab gene-un enzima regolando determinati eventi allineati, attorno ai quali si formano le pareti della spora
chimici”. a produrre otto ascospore sessuali (quattro A e quattro a).

Proteine
della dieta Tiroxina

Fenilalanina Tirosina DOPA


PKU Albinismo

Acido p-idrossifenil-piruvato
fenilpiruvico
Melanina

2,5-diidrossifenil-piruvato

Acido omogentisico (HA)


Figura 4.1
Alcaptonuria Via metabolica della fenilalanina-tirosina. Gli individui af-
fetti da alcaptonuria non possono metabolizzare l’acido
Acido maleilacetoacetico omogentisico (HA) in acido maleilacetoacetico e quindi
lo accumulano. Gli affetti da fenilchetonuria (PKU) non pos-
sono trasformare la fenilalanina in tirosina e di conseguenza
accumulano acido fenilpiruvico. Individui affetti da albini-
CO 2 +H 2 O smo non possono sintetizzare la melanina dalla tirosina.
La funzione del gene 57
Ascospore Figura 4.2
(4 A : 4 a) Asco Ciclo vitale del fungo miceliale aploide
N Neurospora crassa. (Non in scala.)

Ascospora aploide, Ascospora aploide,


tipo sessuale A Divisione mitotica tipo sessuale a
e maturazione
delle spore

2ª divisione

Germinazione Meiosi Germinazione

1ª divisione
Conidi
(spore asessuali)

N
N
Comincia
Nucleo a formarsi
2N l’asco

A/a
Conidio
in germinazione
Micelio Fusione Micelio
vegetativo, nucleare vegetativo,
tipo sessuale A tipo sessuale a

Le cellule di tipo
sessuale opposto
Nucleo A Nucleo a si fondono
Fusione cellulare a formare cellule
binucleate

Ogni asco, quindi, contiene tutti i prodotti della singola nimo e che richiedevano ulteriori elementi nutrizionali.
meiosi iniziale. Numerosi aschi si sviluppano all’interno Beadle e Tatum isolarono e caratterizzarono i mutanti
di un corpo fruttifero. Quando l’asco è maturo, le asco- auxotrofi; per isolarli, trattarono i conidi con i raggi X,
spore (spore sessuali) vengono scagliate fuori da esso e che sono mutageni (generatori di mutazioni). Incrocia-
dal corpo fruttifero per essere disperse dal vento. La ger- rono i mutanti ottenuti con il ceppo prototrofo (tipo sel-
minazione di un’ascospora dà origine a un nuovo mice- vatico) di tipo sessuale opposto (Figura 4.3). Incrociando
lio aploide. le spore mutate con quelle selvatiche essi si assicuravano
Particolarmente importante per gli esperimenti di che, qualsiasi mutante auxotrofo avessero isolato, questo
Beadle e Tatum è il fatto che Neurospora ha esigenze segregasse nell’incrocio e quindi avesse una base geneti-
nutrizionali semplici. Neurospora selvatica può crescere ca, piuttosto che una non genetica, per la sua richiesta
in un terreno minimo, che contiene solo sali inorganici nutrizionale.
(tra i quali una fonte di azoto), una fonte di carbonio or- Per ogni asco una sola progenie di questi incroci fu
ganico (per esempio, glucosio o saccarosio) e la vitami- fatta germinare in un terreno nutrizionalmente comple-
na biotina. Un ceppo che può vivere in un terreno mini- to, che conteneva tutti gli amminoacidi, purine, pirimi-
mo è chiamato ceppo prototrofo o semplicemente pro- dine e vitamine in aggiunta a saccarosio, sali e biotina
totrofo; Beadle e Tatum si resero conto che Neurospora che si trovano normalmente in un terreno minimo.
sintetizza le altre molecole necessarie per la crescita (per Qualsiasi ceppo che non fosse capace di sintetizzare
esempio amminoacidi, nucleotidi, vitamine, acidi nu- amminoacidi, purine, pirimidine o vitamine, partendo
cleici, proteine) a partire dai composti chimici semplici dagli ingredienti di base presenti nel terreno minimo,
presenti nel terreno minimo di coltura. Neurospora sel- poteva crescere utilizzando i composti forniti nel terre-
vatica può crescere anche su terreno minimo al quale no di coltura completo. Ogni coltura cresciuta in terreno
vengano aggiunti altri elementi nutrizionali quali ammi- completo venne quindi analizzata durante la crescita in
noacidi o vitamine. Beadle e Tatum quindi capirono che un terreno minimo. I ceppi che non crescevano erano
doveva essere possibile isolare dei mutanti nutriziona- mutanti auxotrofi. Questi mutanti, a loro volta, vennero
li (chiamati anche mutanti auxotrofi o solo auxotrofi) analizzati individualmente per la capacità di crescere su
di Neurospora, che non potevano crescere su terreno mi- terreni minimi con l’aggiunta di amminoacidi o vitami-
58 Capitolo 4

Ascospore trasferite Figura 4.3


Incrociato con ceppo separatamente in provette
selvatico di tipo Metodo utilizzato da Beadle
di coltura
Selvatico sessuale opposto e Tatum per isolare mutazioni
Raggi X auxotrofe in Neurospora.
In questo caso il ceppo
Corpi fruttiferi mutante isolato è auxotrofo
per il triptofano.

Conidi mutagenizzati

Centinaia di provette Terreno


contenenti terreno completo
completo inoculate
con singole ascospore

Conidi (spore asessuali) Terreno


di ciascuna coltura minimo
analizzate in terreno
minimo

L’assenza di crescita in terreno


minimo è indice di un mutante
nutrizionale

Conidi delle colture


che non crescono Minimo Minimo Minimo Completo
su terreno minimo (controllo) + ammino- + vitamine (controllo)
analizzati in terreni acidi
diversamente integrati
Glicina

Alanina

Leucina

Isoleucina

Valina

Metionina

Fenilalanina

Tirosina

Triptofano

Prolina

Arginina

Lisina

Istidina

Acido glutammico

Acido aspartico

Glutammina

Asparagina

Serina

Treonina

Cisteina

I 20
amminoacidi

ne. In teoria, un mutante auxotrofo per un amminoacido chiesto da quel ceppo per poter crescere, il ceppo viene
– un ceppo mutante che ha perduto la capacità di sinte- analizzato in 20 provette, ciascuna contenente terreno
tizzare un dato amminoacido – dovrebbe crescere in un minimo al quale sia stato aggiunto uno dei 20 amminoa-
terreno minimo che contiene amminoacidi, ma non in cidi. Nell’esempio della Figura 4.3 viene identificato un
un terreno minimo che contiene vitamine, o in un terre- auxotrofo per il triptofano, perché capace di crescere so-
no minimo senza aggiunte. Analogamente, i mutanti au- lo nella provetta che contiene terreno minimo addiziona-
xotrofi per una vitamina crescono solo in un terreno mi- to con triptofano.
nimo contenente vitamine.
Immaginiamo di identificare un auxotrofo per un Caratterizzazione genetica di una catena biochimica
amminoacido. Per trovare quale dei 20 amminoacidi è ri- Una volta che Beadle e Tatum ebbero isolato e identifica-
La funzione del gene 59

to i mutanti nutrizionali, essi analizzarono le catene bio- blocco, maggiore è il numero degli intermedi successivi
chimiche alterate. Ipotizzarono che le cellule di Neuro- che possono dare origine al prodotto finale. Quindi, in
spora, come tutte le cellule, funzionassero per interazione questa analisi, non solo viene individuata una via biochi-
dei prodotti di un gran numero di geni. Inoltre essi imma- mica, ma ne viene anche determinato ogni singolo pas-
ginarono che Neurospora selvatica convertisse i costi- saggio controllato da un gene. Inoltre, un blocco geneti-
tuenti del terreno minimo in amminoacidi e altre sostanze co in una via biochimica può portare all’accumulo del-
mediante una serie di reazioni organizzate in catene bio- l’intermedio immediatamente precedente al passaggio
chimiche. Quindi la sintesi dei componenti cellulari avve- bloccato.
niva in seguito a una serie di piccoli passaggi, ciascuno Come viene mostrato nella Tabella 4.1, il ceppo mu-
catalizzato da un enzima. Come esempio dell’approccio tante met-8 cresce quando il terreno viene addizionato
analitico usato da Beadle e Tatum, che portò alla com- con metionina, ma non quando lo è con uno qualsiasi de-
prensione della relazione tra geni ed enzimi, consideria- gli intermedi della catena metabolica. Ciò indica che il
mo la dissezione genetica della catena biosintetica del- gene met-8 controlla l’ultimo passaggio della catena che
l’amminoacido metionina in Neurospora crassa. porta alla formazione della metionina. Il ceppo mutante
Partendo da una serie di mutanti auxotrofi per metio- met-2 cresce in un terreno al quale viene aggiunta metio-
nina – che richiedono l’aggiunta di metionina al terreno nina o omocisteina, quindi l’omocisteina deve precedere
minimo per crescere – l’analisi genetica (test di comple- immediatamente la metionina nella catena metabolica e
mentazione; vedi Capitolo 13 e Figura 13.13) identifica il gene met-2 deve controllare la sintesi dell’omocisteina
quattro geni: met-2+, met-3+, met-5+ e met-8+. Una muta- a partire da un altro composto. Il mutante met-3 cresce in
zione in uno di questi geni dà origine ad auxotrofia per un terreno addizionato con metionina, omocisteina o ci-
metionina. (È da notare che il numero associato a ogni stationina, quindi la cistationina deve precedere l’omoci-
gene non è in relazione con la posizione del prodotto co- steina e il gene met-3 deve controllare la sintesi della ci-
dificato dal gene nella propria catena metabolica.) In se- stationina da un altro composto. Il ceppo met-5 cresce in
guito, le caratteristiche di crescita dei quattro ceppi mu- terreni supplementati con metionina, omocisteina, cista-
tanti vengono determinate in terreni addizionati con i tionina o O-acetilomoserina. Quindi, l’O-acetilomoseri-
presunti precursori della metionina – O-acetilomoserina, na deve precedere la cistationina nella catena biochimica
cistationina e omocisteina. I risultati vengono mostrati e il gene met-5 deve controllare la sintesi dell’O-acetilo-
nella Tabella 4.1. Per definizione, tutti i quattro ceppi moserina a partire da un altro composto. La catena bio-
possono crescere in presenza di metionina, mentre nes- sintetica della metionina della quale si parla in questo
suno cresce su terreno minimo non supplementato. paragrafo (che è parte di una catena più lunga) è illustra-
La sequenza di passaggi nella via biochimica può es- ta nella Figura 4.4. Il gene met-5+ codifica per l’enzima
sere dedotta dalla crescita con le diverse aggiunte. che converte l’omoserina in O-acetilomoserina, quindi
L’analisi si basa su alcuni principi fondamentali. Quanto un mutante per questo gene può crescere in un terreno
più a valle un ceppo mutante viene bloccato in una cate- minimo addizionato di O-acetilomoserina, cistationina,
na biochimica, minore sarà il numero di composti inter- omocisteina o metionina. Il gene met-3+ codifica per
medi necessari che ne permetteranno la crescita. Se un l’enzima che converte l’O-acetilomoserina in cistationi-
mutante blocca un passaggio precoce, un gran numero di na, quindi il mutante met-3 può crescere su un terreno
intermedi sarà in grado di permettere la crescita del cep- addizionato di cistationina, omocisteina o metionina, e
po. Infatti ognuno degli intermedi successivi al passag- così via.
gio bloccato potrà essere processato dagli enzimi presen- Con esperimenti di questo genere, Beadle e Tatum
ti nella catena dopo il blocco, con il risultato della produ- proposero che uno specifico gene codifichi per un deter-
zione del prodotto finale. Dunque, più in alto si trova il minato enzima. Questa ipotesi che un gene codifichi per

Tabella 4.1 Crescita di mutanti auxotrofi per metionina

Crescita in terreno minimo addizionato con

Ceppi mutanti nessuna aggiunta O-acetilomoserina cistationina omocisteina metionina

Selvatico + + + + +

met-5 – + + + +

met-3 – – + + +

met-2 – – – + +

met-8 – – – – +
60 Capitolo 4

Figura 4.4
Via di biosintesi della metionina che mostra i quattro geni che codificano per gli en-
zimi che catalizzano ciascuna reazione in Neurospora crassa. (I geni met-5 e met-2
sono sullo stesso cromosoma; met-3 e met-8 sono su altri due cromosomi.)

Geni:
met-5+ met-3+ met-2+ met-8+

Enzimi: Omoserina Cistationina- Cistationasi II Metiltetraidrofolato


transacetilasi γ-sintasi omocisteina transmetilasi

Reazioni: Omoserina O-acetilomo- Cistationina Omocisteina Metionina


serina
Cisteina Metiltetraidrofolato

un enzima che catalizza una data reazione in una catena L’insieme di tutte le piccole sostanze chimiche che rap-
metabolica è detta ipotesi un gene-un enzima. Mutazio- presentano intermedi o prodotti delle vie metaboliche è
ni geniche che determinano la perdita della funzione ca- definito metaboloma, e lo studio del metaboloma è chia-
talitica di un enzima portano all’accumulo dei precurso- mato metabolomica. Il Focus sul genoma di questo capi-
ri nella catena biochimica (e a possibili reazioni collate- tolo presenta i risultati di una ricerca metabolomica che
rali) e all’assenza del prodotto finale della catena. Con riguarda i procarioti presenti nell’intestino dei mammife-
l’approccio descritto è quindi possibile dissezionare ge- ri e che dimostra come essi siano capaci di regolarne la
neticamente una catena biochimica; attraverso lo studio funzionalità.
dei mutanti e dei loro effetti si può determinare la se-
quenza dei passaggi di una catena e correlare ciascun
passaggio a uno o più specifici geni. Nota chiave
Tuttavia, in seguito i ricercatori hanno scoperto che Una specifica correlazione tra i geni e gli enzimi era
più di un gene può controllare ogni fase di una via bio- insita nell’ipotesi un gene-un enzima di Beadle e
chimica. Vale a dire che un enzima* può possedere due Tatum, che stabiliva che ogni gene controllasse la
o più catene polipeptidiche, ognuna delle quali è codifi- sintesi o l’attività di un singolo enzima. Ma un enzi-
cata da uno specifico gene. Un esempio è l’enzima DNA ma può essere formato da più di un polipeptide,
polimerasi III di E. coli, che ha numerose subunità ognuno codificato da un gene differente. A causa di
(Tabella 3.1). In tal caso, più di un gene codifica per que- ciò, storicamente, l’ipotesi fu modificata nell’ipotesi
sto enzima e, in questo modo, partecipa a definire quel un gene-un polipeptide. Le attuali conoscenze indi-
passaggio del percorso biochimico. Perciò l’ipotesi un cano che vi sono eccezioni a questa ipotesi.
gene-un enzima venne trasformata nell’ipotesi un gene-
un polipeptide. Questa ipotesi non è completamente
corroborata dalle attuali conoscenze. Alcuni geni infatti Attività
non codificano per proteine. E negli eucarioti l’espres- Utilizzate la procedura sperimentale di
sione di geni che codificano per particolari proteine può Beadle e Tatum per identificare un mutante nutri-
risultare in più di un polipeptide. Alcuni esempi descritti zionale nella iAttività Pathways to Inherited MyLab
verranno forniti più oltre nel testo. Enzyme Deficiencies (Vie metaboliche dei deficit
enzimatici ereditari) nel sito web degli studenti.
Le catene biochimiche sono cruciali per le funzioni
delle cellule e il metabolismo di tutti gli organismi. Al-
cune sintetizzano composti necessari per le cellule (per Deficienze enzimatiche
esempio amminoacidi, purine, pirimidine, grassi, lipidi e
vitamine), mentre altre degradano i composti in moleco-
su base genetica nell’uomo
le più semplici, riciclando così DNA, RNA o proteine, o Molte malattie genetiche nell’uomo sono causate da una
regolando la digestione del cibo. Dal momento che le vie mutazione di un singolo gene che altera la funzione di un
biochimiche sono controllate da enzimi, esse sono sotto enzima il quale, tipicamente, agisce in una via metaboli-
il controllo genico. Ma, a causa delle differenze geneti- ca (Tabella 4.2). In genere, una deficienza enzimatica
che, i percorsi biochimici non coincidono in tutti gli or- causata da una mutazione può avere conseguenze sem-
ganismi. plici o pleiotropiche (a largo raggio). Gli studi di queste
malattie hanno fornito ulteriori dimostrazioni che alcuni
* Si vedrà più avanti nel volume che alcuni enzimi sono moleco- geni codificano per enzimi. Alcuni di questi difetti gene-
le di RNA, e non proteine (vedi Capitolo 5). tici saranno discussi nei prossimi paragrafi.
La funzione del gene 61

Focus sul genoma


Metabolomica intestinale
Parecchie specie di batteri e alcune di Archaea vivo- I ricercatori aspettarono parecchi giorni allo scopo
no nell’intestino dei mammiferi. L’unico Archaea di far colonizzare il colon dalle cellule, e alimenta-
abbondante è il Methanobrevibacter smithii che rono i topi con una dieta ricca di fruttani, una spe-
svolge un ruolo chiave nel metabolismo. I mammi- cifica classe di fibre non digeribili. La comunità in-
feri non possono digerire i carboidrati complessi testinale Bt/Ms degradò i fruttani in modo più effi-
della dieta (le fibre), ma alcuni organismi della co- ciente di quanto fece la comunità intestinale di
munità batterica intestinale lo possono fare (me- controllo. Le analisi del trascrittoma mostrarono
diante fermentazione). Come prodotto finale della che, rispetto al controllo, B. thetaiotaomicron nella
fermentazione i batteri rilasciano un certo numero comunità Bt/Ms aveva incrementato la trascrizione
di acidi grassi a catena corta (SCFA), che i mammife- dei geni coinvolti nella degradazione del fruttano
ri ospiti possono assorbire e metabolizzare. Gli e diminuito la trascrizione dei geni per la degrada-
SCFA costituiscono fino al 10% delle calorie assorbi- zione degli altri carboidrati complessi. B. thetaio-
te dall’ospite. Consumando molti dei prodotti finali taomicron aveva inoltre incrementato la produzio-
della fermentazione batterica, inclusi l’idrogeno e il ne di acetato (un SCFA). I modelli basati sulla tra-
formiato, M. smithii fa in modo che la comunità scrizione suggerivano che si sarebbe dovuto pro-
batterica funzioni più efficientemente e incrementi durre anche più formiato, ma ciò non venne osser-
il tasso di produzione degli SCFA. vato. Il motivo per cui il livello del formiato non au-
M. smithii e il batterio Bacteriodes thetaiotaomi- mentava venne rilevato quando fu caratterizzata
cron cambiano il loro stato trascrizionale e metabo- la trascrizione di M. smithii. Quando M. smithii si
lico quando sono presenti entrambi nell’intestino, e trova in un topo Bt/Ms, esso incrementa la trascri-
questi cambiamenti migliorano la digestione delle zione dei geni che codificano per enzimi della via
fibre e forniscono più calorie all’ospite. Ciò è stato biochimica del metabolismo del formiato.
dimostrato sperimentalmente mediante analisi ge- Presumibilmente, l’aumento della produzione
nomiche, come la trascrittomica e la metabolomica del formiato da parte di B. thetaiotaomicron viene
(vedi Capitolo 9). In breve, la trascrittomica è lo stu- bilanciato dall’incremento del suo consumo da par-
dio dell’espressione dei geni a livello dell’intero ge- te di M. smithii. Tutto considerato, l’intestino Bt/Ms
noma. Il trascrittoma è tutto l’RNA espresso in una metabolizzava i fruttani in modo più efficiente,
particolare condizione ed è perciò una misura di poiché entrambe le specie avevano subìto cambia-
quali geni sono trascritti e quali proteine possono menti nell’espressione dei geni e nel metabolismo
essere prodotte. La metabolomica è lo studio di per lavorare insieme nel catabolismo di questi
tutte le molecole che sono intermedi o prodotti carboidrati.
delle vie metaboliche. L’insieme di queste sostanze I topi beneficiarono di tutta questa attività? La ri-
chimiche cellulari o extracellulari costituisce il meta- sposta è sì. I topi colonizzati recuperarono più calo-
boloma. Gli studi metabolomici usano tecniche chi- rie dal cibo dal momento che assorbirono gli SCFA
miche per determinare l’identità delle piccole mo- rilasciati da B. thetaiotaomicron. Inoltre i ricercatori
lecole organiche presenti nelle cellule o nell’am- trovarono un incremento dei livelli di acetato nel
biente extracellulare in cui esse vengono a trovarsi. sangue dei topi Bt/Ms (l’acetato è uno degli SCFA
Lo scopo finale è la comprensione della funzione rilasciati da B. thetaiotaomicron). Questi topi Bt/Ms
degli enzimi cellulari e delle loro vie metaboliche. avevano anche più lipidi nel loro fegato e nei loro
Ciò è indispensabile per la ricerca farmacologica. depositi adiposi. Altri studi hanno suggerito che la
Per studiare l’interazione fra questi organismi e i presenza di una grande colonia di M. smithii nel-
loro ospiti, i ricercatori hanno inoculato colture di l’intestino può predisporre i topi (e presumibilmen-
procarioti nel colon di topi germ-free. Ad alcuni te anche l’uomo) all’obesità. Perciò gli scienziati
topi furono somministrati sia B. thetaiotaomicron studiano il genoma di M. smithii nella speranza di
sia M. smithii (Bt/Ms), mentre ad altri di controllo trovare i geni che potrebbero essere bersaglio di
furono date colture che mancavano di M. smithii. farmaci appropriati per il trattamento dell’obesità.

Fenilchetonuria tosoma – cioè un cromosoma diverso da un cromosoma


La fenilchetonuria (PKU; OMIM 261600) ha una fre- sessuale). La mutazione è localizzata nel gene per la fe-
quenza di circa 1 su 12 000 nati di razza caucasica. Essa nilalanina idrossilasi. L’assenza dell’attività di questo
è più comunemente causata da una mutazione recessiva enzima previene la conversione dell’amminoacido feni-
di un gene nel braccio lungo del cromosoma 12 (un au- lalanina nell’amminoacido tirosina (vedi Figura 4.1). La
62 Capitolo 4

Tabella 4.2 Alcune malattie genetiche umane con la deficienza enzimatica dimostrata

Difetto genetico Locus Deficienza enzimatica Numero accesso OMIM

Alcaptonuria 3q21-q23 Acido omogentisico ossidasi 203500


Regolatore del trasporto transmem-
Fibrosi cistica 7q31.2 602421
brana della fibrosi cistica (CFTR)
Cataratta 17q24 Galattochinasi 230200

Citrullinemiaa 9q34 Argininosuccinato sintetasi 215700

Intolleranza I ai disaccaridi 3q25-q26 Invertasi 222900

Intolleranza al fruttosio 9q22.3 Fruttosio-1-fosfato aldolasi 229600


Galattosio-1-fosfato uridil transfe-
Galattosemiaa 9p13 230400
rasi
Malattia di Gauchera 1q21 Glucocerebrosidasi 230800

Deficienza della G6PD (favismo)a Xq28 Glucosio-6-fosfato deidrogenasi 305900

Malattia da accumulo di glicogeno I 17q21 Glucosio-6-fosfatasi 232200

Malattia da accumulo di glicogeno IIa 17q25.2-q25.3 α-1,4-glucosidasi 232300

Malattia da accumulo di glicogeno IIIa 1p21 Amilo-1, β-glucosidasi 232400


Enzima di ramificazione del glico-
Malattia da accumulo di glicogeno IVa 3p12 232500
geno
Glutatione perossidasi o glutatione
3p21.1, 8p21.1, 138320, 138300,
Anemia emoliticaa reduttasi o glutatione sintetasi o
20q11.2, 1q21 231900, 266200
esochinasi o piruvato chinasi
Deficienza della lattasi intestinale
Lattasi 223000
(adulto)
Succinil CoA:3-chetoacido CoA-
Chetoacidosia 5p13 245050
transferasi
Ipoxantina guanina fosforibosil-
Sindrome di Lesch-Nyhana Xq26-q27.2 308000
transferasi
Malattia delle urine a sciroppo d’ace-
19q13.1-q13.2 Chetoacido decarbossilasi 248600
ro, tipo IAa
Fenilchetonuriaa 12q24.1 Fenilalanina idrossilasi 261600

Porfiria, congenita eritropoieticaa 10q25.2-q26.3 Uroporfirinogeno III sintasi 263700

Enfisema polmonare 14q32.1 α-1-antitripsina 107400

Rachitismo, dipendente da vitamina D 25-idrossicolecalciferolo 1-idrossilasi 277420

Sindrome di Tay-Sachsa 15q23-q24 Esosamminidasi A 272800

Tirosinemia, tipo III 12q24-qter ρ-idrossifenilpiruvato ossidasi 276710


a Diagnosi prenatale possibile.

fenilalanina è uno degli amminoacidi essenziali, cioè si grave ritardo mentale, crescita ridotta e morte prematura.
tratta di un amminoacido che deve essere incluso nella (I bambini affetti da PKU non ne presentano i sintomi
dieta in quanto l’uomo non è in grado di sintetizzarlo. La prima della nascita, perché l’eccesso di fenilalanina che
fenilalanina è richiesta per la sintesi delle proteine; tutta- si accumula viene metabolizzato dagli enzimi materni.)
via un eccesso di questo amminoacido è dannoso e viene La PKU ha effetti pleiotropici. Un fenilchetonurico
convertito in tirosina per essere quindi ulteriormente tra- non può sintetizzare la tirosina, un amminoacido richiesto
sformato. I bambini affetti da PKU accumulano la feni- per la sintesi proteica e per la produzione degli ormoni ti-
lalanina ingerita perché non sono in grado di metaboliz- roxina e adrenalina e del pigmento della pelle melanina.
zarla. La fenilalanina accumulata viene convertita in aci- Questo aspetto del fenotipo non è molto grave, dato che la
do fenilpiruvico, che danneggia gravemente le cellule tirosina può essere fornita dal cibo. Tuttavia il cibo non ne
del sistema nervoso centrale e produce gravi sintomi: contiene normalmente una grande quantità. Di conse-
La funzione del gene 63

guenza, le persone affette da PKU hanno relativamente rizzato a livello molecolare. Sono state identificate oltre
poca melanina e quindi tendono ad avere la pelle molto 400 mutazioni nel gene responsabili della perdita delle
chiara e gli occhi chiari (dal momento che la melanina attività enzimatiche della proteina negli individui con
contribuisce alla colorazione dell’iride). Inoltre gli indivi- PKU. Tali mutazioni includono quelle che alterano un
dui fenilchetonurici hanno livelli relativamente bassi di amminoacido nella proteina, quelle che danno come ri-
adrenalina, un ormone che viene prodotto da una via bio- sultato una proteina tronca e quelle che alterano lo spli-
chimica che deriva dalla tirosina. cing dell’mRNA trascritto dal gene (vedi Capitolo 5).
I sintomi più gravi della PKU dipendono dalla quan-
tità di acido fenilpiruvico che viene prodotto dall’accu-
mulo di fenilalanina. Quindi la malattia può essere gesti-
Albinismo
ta attraverso il controllo della quantità della fenilalanina La forma classica di albinismo (vedi Figura 11.18a;
assunta attraverso la dieta. Una miscela di singoli ammi- OMIM 203100) è causata da una mutazione autosomica
noacidi con una quantità controllata di fenilalanina viene recessiva di un gene nel braccio lungo del cromosoma
utilizzata come sostituto delle proteine nella dieta degli 11. Circa 1 su 33 000 caucasici e 1 su 28 000 afroameri-
individui con PKU. La dieta deve conservare un livello cani negli Stati Uniti sono affetti da albinismo. Negli in-
di fenilalanalina nel sangue che sia abbastanza elevato da dividui con albinismo il gene mutato è quello che codifi-
facilitare il normale sviluppo del sistema nervoso, ma ca per la tirosinasi. La tirosinasi è un enzima usato nella
abbastanza basso da prevenire il ritardo mentale. Il trat- conversione della tirosina in DOPA, dalla quale deriva il
tamento deve iniziare a 1 o 2 mesi dalla nascita, o il cer- pigmento bruno chiamato melanina (vedi Figura 4.1). La
vello sarà danneggiato e il trattamento risulterà ineffica- melanina assorbe la luce nel campo ultravioletto (UV) e
ce. La dieta per la PKU è costosa, oltre 5000 dollari al- protegge la pelle dalle radiazioni nocive UV provenienti
l’anno. Esistono opinioni diverse quanto alla necessità dal sole. Le persone affette da albinismo non producono
che la dieta venga continuata per tutta la vita o alla pos- melanina. Pertanto esse hanno pelle bianca e capelli
sibilità di interromperla intorno ai 10 anni di età, senza bianchi, e occhi con iride che appare rossa (a causa della
che si sviluppino in seguito danni mentali o comporta- mancanza di pigmento) ed è altamente sensibile alla lu-
mentali. Inoltre, le donne fenilchetonuriche sono invitate ce. (Questa forma di albinismo è detta albinismo oculo-
a proseguire la dieta per tutto il periodo riproduttivo e so- cutaneo di tipo 1, o OCA1.)
prattutto durante la gravidanza per evitare potenziali Vi sono almeno due altri tipi di albinismo (albinismo
danni per lo sviluppo del feto. Infatti, gli alti livelli di fe- oculocutaneo di tipo 2 o OCA2, OMIM 203200 e albini-
nilalanina presenti nel sangue materno passano nel feto smo oculocutaneo di tipo 3 o OCA3, OMIM 203290),
attraverso la placenta e ne impediscono il normale svi- causati da mutazioni in altri geni che bloccano diversi
luppo del sistema nervoso, indipendentemente dal suo passaggi biochimici necessari per la biosintesi della me-
genotipo. lanina. Se due genitori con albinismo sono entrambi
Data la gravità di questa malattia, se non trattata, ne- omozigoti per una mutazione in un gene differente nella
gli Stati Uniti tutti i neonati vengono controllati per la via biochimica, essi possono generare un bambino nor-
PKU. Il test di Guthrie viene eseguito con una goccia di male. (Questo è un esempio di complementazione geni-
sangue posta su un filtro, che viene depositato su una ca, discussa nel Capitolo 15.)
piastra di terreno solido che contiene il batterio Bacillus
subtilis e β-2-tienilalanina. La β-2-tienilalanina inibisce
la crescita del batterio. L’inibizione è impedita in presen-
Sindrome di Kartagener
za di fenilalanina. Quindi, la crescita del batterio indica Come nell’albinismo, parecchi geni possono essere mu-
la presenza di alti livelli di fenilalanina nel sangue e sug- tati per causare una rara malattia chiamata sindrome di
gerisce la necessità di ulteriori accertamenti per determi- Kartagener (OMIM 244400), una forma di discinesia ci-
nare se il bambino sia affetto da PKU. liare primaria. Questa malattia autosomica recessiva, che
Alcuni cibi e bevande che contengono il dolcificante ha una frequenza di circa 1 su 32 000 nati vivi, è caratte-
sintetico aspartame riportano l’avvertenza che individui rizzata da anormalità dei seni paranasali e dei polmoni,
affetti da PKU non devono assumerli. L’aspartame è un da sterilità e, in qualche caso, da destrocardia – una con-
dipeptide, composto dagli amminoacidi acido aspartico e dizione nella quale il cuore è spostato a destra invece che
fenilalanina. Questa combinazione segnala ai recettori a sinistra del centro toracico. Superficialmente, senza
del gusto che la sostanza è dolce (ma non si tratta di uno una comprensione a livello molecolare dei geni coinvol-
zucchero e non fornisce quindi le calorie di uno zucche- ti, questi sintomi pleiotropici sono difficilmente correla-
ro). Una volta ingerito, l’aspartame viene scisso in acido bili. Uno dei geni trovati mutati in questi individui codi-
aspartico e fenilalanina, quindi può dare problemi ai fe- fica per una proteina che costituisce il “motore” dei fla-
nilchetonurici. gelli e delle ciglia, la dineina. I motori proteici basati sul-
Il gene per la fenilalanina idrossilasi è stato caratte- la dineina fanno scivolare i microtubuli dei flagelli e del-
64 Capitolo 4

le ciglia l’uno sull’altro per produrre il movimento di


queste strutture. Senza una dineina funzionante, né i fla-
gelli né le ciglia possono muoversi in modo appropriato.
Come risultato, le infezioni dei seni paranasali e dei pol-
moni sono comuni negli individui con la sindrome di
Kartagener, poiché essi hanno delle ciglia difettose sulla
superficie delle loro vie respiratorie e, pertanto, non pos-
sono rimuovere in modo efficiente batteri e spore dal lo-
ro sistema respiratorio. La sterilità dei maschi deriva dal
fatto che gli spermatozoi non riescono a muoversi; la ste-
rilità nelle femmine deriva dal fatto che le ciglia che do-
vrebbero trasportare gli oociti nel tratto riproduttivo non Figura 4.5
sono in condizione di farlo. Bambino affetto da malattia di Tay-Sachs.
Le cause della destrocardia furono meno ovvie fino a
quando non venne sviluppato un modello murino con di- sato nei neuroni. Ciò causa diversi sintomi clinici. Di so-
fetti nel gene. I topi che portavano alcune mutazioni del lito il primo sintomo riconoscibile è un’insolita reazione
gene sviluppavano un insieme di difetti simili, e lo studio a suoni improvvisi. Un punto color ciliegia sulla retina,
degli embrioni di questi topi alle prime fasi dello svilup- circondato da un alone bianco, aiuta a effettuare una dia-
po definì le cause della destrocardia. Nell’embrione in gnosi precoce della malattia. Circa un anno dopo la na-
fase di sviluppo, i ricercatori videro che le ciglia su una scita si verifica una rapida degenerazione neurologica al-
struttura chiamata nodo ruotavano in senso orario e ge- lorché il ganglioside non processato si accumula e il cer-
neravano un flusso extraembrionale in senso sinistrorso. vello comincia a perdere il controllo delle normali fun-
Questo flusso può essere “sentito” dalle cellule circo- zioni e attività. Questa degenerazione produce paralisi
stanti, che rispondono muovendosi a destra o a sinistra, generalizzata, cecità, perdita progressiva dell’udito e se-
una risposta che determina i loro futuri sviluppi. Nella ri problemi di alimentazione. A 2 anni di età i bambini
sindrome di Kartagener, in assenza di flusso, i tessuti si sono praticamente immobili e la morte segue a circa 3 o
muovono in modo casuale a sinistra o a destra. 4 anni, spesso per infezione respiratoria. Non è nota una
cura per la sindrome di Tay-Sachs, ma, dato che possono
essere identificati i portatori (eterozigoti, che hanno un
Sindrome di Tay-Sachs allele del gene normale e uno mutato), l’incidenza di
La sindrome di Tay-Sachs (Figura 4.5; OMIM 272800), questa malattia può essere controllata.
chiamata anche idiozia amaurotica infantile, è causata
da omozigosi per una rara mutazione recessiva di un ge-
ne sul braccio lungo del cromosoma 15. Sebbene la sin- Nota chiave
drome di Tay-Sachs sia rara nella popolazione generale, Numerose malattie genetiche umane sono causate
essa ha un’incidenza più elevata negli ebrei Ashkenazi da deficit di attività enzimatiche. Queste malattie
originari dell’Europa centrale, tra i quali circa 1 bambino sono per la maggior parte ereditate come caratteri
su 3600 ha questa malattia. recessivi. Per sviluppare la malattia, un individuo
Il gene difettivo negli individui con la malattia di deve ereditare da ciascun genitore un allele mutato
Tay-Sachs codifica per un enzima lisosomiale. I lisosomi per il gene responsabile della malattia, risultando
sono organelli circondati da membrana che si trovano omozigote per questo allele.
nelle cellule; essi contengono 40 o più differenti enzimi
digestivi che catalizzano la degradazione di acidi nuclei-
ci, proteine, polisaccaridi e lipidi. Quando un enzima del
lisosoma non funziona, o funziona solo parzialmente, la Controllo genetico
normale degradazione del substrato di quell’enzima non della struttura delle proteine
può verificarsi. Il gene che risulta mutato negli individui
con la sindrome di Tay-Sachs è HEXA, che codifica per Anche se gli enzimi sono per la maggior parte proteine,
l’enzima N-acetil-esosamminidasi A (Hex A). Questo non tutte le proteine sono enzimi. Per comprendere pie-
enzima elimina il gruppo terminale N-acetilgalattosam- namente come funzionano i geni, considereremo di se-
mina da un ganglioside cerebrale (Figura 4.6). (Un gan- guito le evidenze sperimentali che dimostrano che i geni
glioside fa parte di un gruppo di glicolipidi complessi sono responsabili anche della struttura delle proteine non
che si trova soprattutto nelle membrane dei nervi.) Nei enzimatiche, come l’emoglobina. Spesso le proteine non
bambini affetti da malattia di Tay-Sachs l’enzima è inat- enzimatiche sono più facili da studiare degli enzimi. Ciò
tivo e quindi vi è accumulo del ganglioside non proces- avviene perché di solito gli enzimi sono presenti in pic-
La funzione del gene 65

a) Via metabolica normale b) Via metabolica in individui con la malattia di Tay-Sachs

Ceramide Ceramide

GalNAc Gal Glc GalNAc Gal Glc

NAN NAN
Ganglioside GM2 Ganglioside GM2 Il ganglioside GM2 si accumula
e provoca la malattia di Tay-Sachs
Enzima Enzima Hex A
N-acetilesosam- disfunzionale
minidasi A
(Hex A)

Ceramide

Gal Glc + GalNAc GalNAc = N-acetil-D-galattosammina


Gal = galattosio
Glc = glucosio
NAN NAN = acido N-acetilneuramminico
Ceramide = un amminoalcol legato a un acido grasso
Ganglioside GM3

Figura 4.6
Schema del passaggio biochimico per la conversione del ganglioside cerebrale GM2
in ganglioside GM3, catalizzata dall’enzima N-acetilesosamminidasi A (Hex A).

cole quantità nella cellula, mentre si possono trovare ta alla presenza di un singolo allele mutante, in forma
grandi quantità di proteine non enzimatiche, cosa che le omozigote negli individui affetti e in eterozigosi negli in-
rende più facili da isolare e purificare. dividui portatori (che presentano una forma più lieve di
malattia, come vedremo più avanti). Nello stesso anno,
Linus Pauling e i suoi collaboratori dimostrarono che l’e-
Anemia falciforme moglobina dei soggetti normali, di quelli affetti da ane-
L’anemia falciforme (o SCA, Sickle-Cell Anemia; OMIM mia falciforme e dei portatori si comportava diversamen-
603903) è una malattia genetica che è causata da altera- te in elettroforesi – una tecnica che separa le molecole in
zioni dell’emoglobina, la proteina che trasporta l’ossige- base alla loro carica elettrica e/o massa. Nelle condizioni
no nei globuli rossi. L’anemia falciforme fu descritta per elettroforetiche utilizzate, entrambe le forme di emoglo-
la prima volta nel 1910 da J. Herrick. Egli scoprì che, a bina si comportavano da cationi (molecole cariche posi-
bassa tensione di ossigeno, i globuli rossi di individui af- tivamente) e migravano verso il polo negativo. L’emo-
fetti dalla malattia perdevano la loro caratteristica forma globina di individui normali (chiamata Hb-A) migrava
discoidale per assumere quella di una falce (Figura 4.7). più lentamente di quella di individui affetti da anemia
I globuli rossi falciformi
nimazione sono fragili e tendono a rom-
Controllo persi facilmente, il che deter-
genetico della mina anemia. Inoltre, le cellu-
MyLab struttura e della le falciformi non sono così
funzione delle flessibili come quelle normali
proteine e quindi tendono a bloccarsi
nei capillari piuttosto che a
sgusciarvi attraverso. Di conseguenza, la circolazione del
sangue viene rallentata e i tessuti risultano in deficit di
ossigeno. Benché la deprivazione di ossigeno avvenga
particolarmente a livello delle estremità, anche il cuore, i
polmoni, il cervello, i reni, il tratto gastrointestinale, i
muscoli e le articolazioni possono essere danneggiati dal-
la scarsità di ossigeno. Un individuo con anemia falcifor-
me può quindi soffrire di una varietà di problemi clinici,
che includono insufficienza cardiaca, polmonite, paralisi,
insufficienza renale, dolori addominali e reumatismi. Figura 4.7
Nel 1949 E.A. Beet e J.V. Neel ipotizzarono in modo Fotografia al microscopio elettronico di tre globuli rossi
indipendente che la causa della forma a falce fosse dovu- normali e di uno falciforme.
66 Capitolo 4

Gruppi eme
Genotipi
b AbA bAbS bSbS
(normale) (portatori di (anemia
anemia falciforme)
falciforme) Polipeptide a Polipeptide b
Campione
caricato

Direzione Emoglobina A
dell’elettroforesi (Hb-A)
Emoglobina S
(Hb-S)

Polipeptide b Polipeptide a

Gruppi eme
Figura 4.8 Figura 4.9
Elettroforesi di varianti dell’emoglobina. Emoglobina La molecola dell’emoglobina. Il disegno mostra i due poli-
di individui normali βAβA (a sinistra), individui βAβS portatori peptidi α e i due β, ciascuno associato a un gruppo eme.
di anemia falciforme (al centro) e individui βSβS affetti Ciascun polipeptide α è in contatto con ambedue i β, ma vi
da anemia falciforme (a destra). I due tipi di emoglobina è un contatto molto debole fra i due polipeptidi α o fra i
migrano con diversa velocità nel campo elettrico a conferma due polipeptidi β.
di una differente struttura proteica.

falciforme (chiamata Hb-S; Figura 4.8). L’emoglobina sono ricchi di emoglobina. L’emoglobina con la versio-
di individui portatori di anemia falciforme era una mi- ne mutante del polipeptide β si aggrega facilmente, pre-
scela 1:1 di Hb-A e Hb-S, indicando che gli eterozigoti cipitando e determinando l’aspetto falciforme dei globu-
producono entrambi i tipi di emoglobina. Pauling con- li rossi, più marcato negli individui affetti da anemia e
cluse che l’anemia falciforme è dovuta a una mutazione più lieve nei portatori.
che altera la struttura chimica della molecola di emoglo- La genetica e i prodotti dei geni coinvolti sono i se-
bina. Questo esperimento fu una delle prime rigorose di- guenti. βS è l’allele mutante del polipeptide β nelle cel-
mostrazioni che la struttura delle proteine è controllata lule con anemia falciforme, mentre l’allele normale è
dai geni. βA. Gli individui omozigoti βAβA producono l’emoglo-
L’emoglobina, la molecola che è alterata nell’anemia bina Hb-A normale con due normali catene α codificate
falciforme, è costituita da quattro catene polipeptidiche – dal gene di tipo selvatico dell’α-globina e due catene
due globine α e due β – ciascuna delle quali è associata normali β codificate dall’allele βA del gene normale del-
a un gruppo eme (un gruppo chimico non proteico coin- la β-globina. Gli individui omozigoti βSβS producono
volto nel legame dell’ossigeno e aggiunto a ogni poli- l’emoglobina difettiva Hb-S, con due catene normali α
peptide dopo che questo è stato sintetizzato; Figura 4.9). specificate dai geni di tipo selvatico dell’α-globina e
Nel 1956 V.M. Ingram analizzò alcune sequenze di am- due catene β anormali specificate dall’allele βS del gene
minoacidi di Hb-A e Hb-S e trovò che il difetto moleco- mutante della β-globina: questi individui sono affetti da
lare nell’Hb-S consiste nella sostituzione dell’acido glu- anemia falciforme. Gli eterozigoti βAβS producono sia
tammico (Glu, idrofilico con carica elettrica negativa) in Hb-A sia Hb-S e sono portatori dall’anemia falciforme.
sesta posizione dall’estremità N-terminale del polipepti- In condizioni normali, gli individui portatori di anemia
de β con l’amminoacido neutro valina (Val, idrofobico falciforme mostrano usualmente pochi segni della ma-
senza carica elettrica; Figura 4.10). Questa specifica so- lattia. Tuttavia, dopo una brusca caduta della tensione di
stituzione determina un diverso ripiegamento del poli- ossigeno (durante la salita nell’atmosfera a bordo di un
peptide β. (Nel Capitolo 6 verrà precisato che la foma tri- aereo non pressurizzato, in alta montagna o dopo un
dimensionale di un polipeptide è determinata dalla se- esercizio fisico intenso), i globuli rossi potrebbero assu-
quenza dei suoi amminoacidi.) I globuli rossi del sangue mere la forma a falce, con la conseguenza della manife-

Figura 4.10
Polipeptide b 1 2 3 4 5 6 7
I primi sette amminoacidi N-terminali nei polipeptidi b
normale, Hb-A H 3 N + Val His Leu Thr Pro Glu Glu
dell’emoglobina normale e di quella falciforme. Nel po-
Cambia in lipeptide dell’emoglobina falciforme vi è una singola
Polipeptide b sostituzione, da acido glutammico a valina, in sesta
falciforme, Hb-S H 3 N + Val His Leu Thr Pro Val Glu posizione.
La funzione del gene 67

stazione di alcuni sintomi simili a quelli degli individui a) Catena a Posizione degli amminoacidi
con una grave anemia. 1 2 16 30 57 68 141
L’ipotesi un gene-un polipeptide è coerente con l’e- Normale Val Leu Lys Glu Gly Asn Arg

sempio dell’emoglobina appena descritto poiché le pro- Varianti Hb:


teine, come gli enzimi, possono essere costituite da più HbI Val Leu Asp Glu Gly Asn Arg
di una catena polipeptidica. Tuttavia, negli eucarioti, un Hb-G Honolulu Val Leu Lys Gln Gly Asn Arg
processo conosciuto come splicing alternativo (vedi
Hb Norfolk Val Leu Lys Glu Asp Asn Arg
Capitolo 18) può dare come risultato la produzione di
Hb-G Philadelphia Val Leu Lys Glu Gly Lys Arg
diversi polipeptidi a partire da un unico gene, il che ren-
de anche l’ipotesi un gene-un polipeptide una semplifi-
cazione.
b) Catena b Posizione degli amminoacidi
1 2 6 26 63 121 146
Altre mutazioni dell’emoglobina Normale Val His Glu Glu His Glu His
Durante valutazioni epidemiologiche nelle quali l’emo- Varianti Hb:
globina estratta dai globuli rossi di soggetti della popola- Hb-S Val His Val Glu His Glu His
zione generale è stata sottoposta a elettroforesi per con- Hb-C Val His Lys Glu His Glu His
frontarne la mobilità con quella della forma normale, so-
Hb-E Val His Glu Lys His Glu His
no state identificate più di 200 forme mutanti. La Figura
Hb-M Saskatoon Val His Glu Glu Tyr Glu His
4.11 elenca alcuni di questi mutanti assieme alle sostitu-
zioni degli amminoacidi che sono state identificate. Hb Zurich Val His Glu Glu Arg Glu His
Alcune mutazioni riguardano la catena α, altre la catena Hb-D b Punjab Val His Glu Glu His Gln His
β, e vi è una grande varietà di tipi di sostituzioni. Dal- Figura 4.11
l’analisi dei codoni del DNA che si presume siano re- Esempi di sostituzioni amminoacidiche ritrovate (a) nei 141
sponsabili delle sostituzioni, è evidente che in ciascun ca- amminoacidi del polipeptide della globina a e (b) nei 146
so è coinvolta la variazione di una singola coppia di basi. amminoacidi del polipeptide della globina b, in più varianti
I mutanti dell’emoglobina identificati hanno effetti dell’emoglobina umana.
diversi, a seconda del tipo di amminoacido coinvolto e
della sua collocazione nella catena polipeptidica. Molti La fibrosi cistica è causata dall’omozigosi di una muta-
hanno effetti meno drastici del mutante falciforme. Per zione autosomica recessiva localizzata sul braccio lungo
esempio, nella molecola dell’emoglobina Hb-C lo stesso del cromosoma 7 ed è la più comune malattia autosomi-
acido glutammico del polipeptide β alterato nell’anemia ca recessiva letale nei caucasici, con una frequenza di 1
falciforme è sostituito dalla lisina. Se paragonata alle su 2000 nati. Si stima che circa 1 individuo caucasico su
conseguenze della mutazione nell’emoglobina Hb-S, 23 sia un eterozigote. Nella popolazione afroamericana,
questa sostituzione non induce un difetto altrettanto gra- circa 1 su 17 000 nati è affetto da fibrosi cistica e negli
ve, dato che entrambi gli amminoacidi sono idrofilici e asiatici la frequenza è di 1 su 31 000 nati.
quindi la conformazione dell’emoglobina non risulta Il prodotto genico difettivo nei pazienti affetti da fi-
drasticamente alterata. Quindi gli individui omozigoti brosi cistica non è stato identificato mediante analisi bio-
per la mutazione βC soffrono solo di una lieve forma di chimica, come nel caso della fenilchetonuria e di altre
anemia. malattie, ma attraverso una combinazione di tecniche ge-
netiche e di biologia molecolare. Il gene è stato localiz-
zato sul cromosoma 7 e quindi clonato. Nei pazienti che
Fibrosi cistica presentano una grave forma di fibrosi cistica, la mutazio-
La fibrosi cistica (CF o mucoviscidosi; OMIM 219700 e ne più comune – ΔF508 (Δ = delta, “delezione”) – è una
602421) è una malattia che causa disfunzioni al pancreas, delezione di tre coppie consecutive di basi. Dato che
ai polmoni e all’apparato digerente in bambini e giovani. ogni amminoacido in una proteina è codificato da tre
Tipica di questa malattia è la presenza di muco molto vi- coppie di basi nel DNA, ciò indica che nei pazienti affet-
schioso. In alcuni maschi i vasi deferenti (parte del siste- ti da fibrosi cistica manca un amminoacido, in questo ca-
ma riproduttivo maschile) non si formano correttamente, so la fenilalanina in posizione 508. Qual è la funzione
causando sterilità. La fibrosi cistica viene tenuta sotto della proteina che, quando è mutata, determina la com-
controllo battendo sul torace per facilitare l’eliminazione parsa della malattia? Data la sequenza del DNA del ge-
delle secrezioni che si accumulano nei polmoni e curan- ne, i ricercatori hanno prima dedotto la sequenza ammi-
do con gli antibiotici le infezioni che si sviluppano. La fi- noacidica e quindi previsto la tipologia e la struttura tri-
brosi cistica è una malattia con esito infausto: con le cure dimensionale della proteina. L’analisi ha indicato che la
attuali, l’aspettativa di vita è di circa 40 anni. proteina, lunga 1480 amminoacidi, è associata alle mem-
68 Capitolo 4

Segmenti idrofobici
che attraversano la membrana
Figura 4.12
Struttura proposta per il regolatore
del trasporto transmembrana (CFTR)
della fibrosi cistica. La proteina
Esterno ha due segmenti idrofobici che attra-
versano la membrana e dopo ciascun
Membrana segmento possiedono una regione
plasmatica Nucleotide-Binding Fold (NBF) che
lega ATP. La posizione della
Interno
Dominio Dominio delezione di un amminoacido,
che lega che lega causata dalla delezione di tre coppie
NH2 NBF ATP NBF ATP di basi nel gene della fibrosi cistica,
che si ritrova più frequentemente in
Sito della pazienti affetti da una forma grave
COOH della malattia, si trova nel primo
mutazione
DF508 NBF (verso l’estremità ammino-
Sito fosforilato dalla
proteina chinasi C terminale); si tratta della mutazione
Sito fosforilato dalla ΔF508.
proteina chinasi A
Porzione centrale
della molecola

brane cellulari. La struttura proposta per la proteina – Consulenza genetica


chiamata regolatore del trasporto transmembrana della
fibrosi cistica (CFTR) – è illustrata nella Figura 4.12. La Abbiamo visto che molte malattie genetiche nell’uomo
mutazione ΔF508 interferisce con il legame per l’adeno- sono causate da difetti degli enzimi e delle proteine che
sina trifosfato (ATP), nella regione di legame per i nu- dipendono da mutazioni a livello di singoli geni. Parec-
cleotidi (NBF, Nucleotide-Binding Fold) situata all’e- chie altre malattie genetiche sono originate da alterazio-
stremità N-terminale della proteina. L’analisi comparati- ni cromosomiche che possono coinvolgere più geni e/o
va della sequenza di amminoacidi della proteina della fi- le loro regioni regolative (vedi Capitolo 16). Oggi gli
brosi cistica e delle sequenze di amminoacidi di altre scienziati hanno a disposizione una serie di strumenti
proteine depositate in banca dati, ha mostrato che CFTR tecnici e la possibilità di applicare saggi molecolari per
è omologa a una vasta famiglia di proteine coinvolte nel identificare il malfunzionamento di molti enzimi e pro-
trasporto attivo di sostanze attraverso la membrana. teine o per valutare le numerose possibili modifiche del
Oggi sappiamo che questa proteina costituisce un canale DNA associate alle malattie genetiche. Possono quindi
del cloro in alcune membrane cellulari. Nelle persone determinare se un individuo ha una malattia genetica o
con fibrosi cistica, il gene mutato determina una proteina se ne è portatore.
CFTR del tutto o in parte non funzionante e ciò causa un La comprensione della trasmissione ereditaria, la
alterato trasporto di ioni attraverso le membrane. Da ciò sfida alla diagnosi e le ripercussioni di una malattia ge-
derivano i sintomi presentati, a partire dalla secrezione netica a livello medico, psicologico, sociologico ed eti-
anormale di muco e dal suo accumulo. co hanno portato alla necessità di una figura professio-
La fibrosi cistica è attualmente studiata nei topi gene- nale di aiuto a singole persone e famiglie. Il consulente
ticamente modificati in modo da avere lo stesso difetto genetista offre una consulenza genetica, cioè fornisce
nel loro gene CFTR. Si spera che, attraverso lo studio un parere basato sulle analisi: (1) della probabilità che i
della malattia in modelli murini, i ricercatori possano ot- pazienti abbiano un difetto genetico, o (2) del rischio
tenerne una migliore comprensione ed essere in grado di che i futuri genitori possano generare un bambino con
sviluppare un trattamento efficace, forse anche avvalen- un difetto genetico. In quest’ultimo caso la consulenza
dosi della terapia genica. genetica ha il compito di presentare le opportunità dis-
ponibili per evitare o rendere minimi questi rischi. Se
viene identificato un serio difetto genetico in un feto,
Nota chiave una delle possibili opzioni è l’aborto. La consulenza ge-
Dagli studi delle alterazioni nelle proteine diverse da-
netica dà alle persone l’opportunità di comprendere i
gli enzimi – come quelle dell’emoglobina, che sono
problemi genetici che sussistono nelle loro famiglie o
responsabili dell’anemia falciforme e di altre forme di
potrebbero aver luogo nelle loro future famiglie.
anemia – sono state ottenute prove convincenti che i
La consulenza genetica richiede una vasta quantità
geni controllano le strutture di tutti i polipeptidi.
di informazioni sull’ereditarietà nell’uomo. In molti ca-
si, il rischio di avere un figlio con un difetto genetico
La funzione del gene 69

può essere stabilito in termini di probabilità precise; in cazione dei portatori avviene mediante tecniche che per-
altri casi, quando il ruolo dell’ereditarietà non è comple- mettono un’analisi molecolare del DNA. (Esempi di
tamente chiaro, il rischio può essere stimato solo in ter- questo tipo di analisi e di tecniche utilizzate verranno
mini generali e probabilistici. Il consulente genetico ha discussi nel Capitolo 10.)
la responsabilità di fornire alle persone che lo richiedo-
no informazioni chiare, non emotive e senza pregiudizi,
basate sulla storia famigliare e su tutte le informazioni
Analisi fetale
scientifiche pertinenti, in merito ai possibili rischi di far Un altro importante aspetto della consulenza genetica è
nascere un bambino con un difetto genetico. la possibilità di verificare se il feto è normale. Questa
La consulenza genetica comincia generalmente con analisi può essere fatta in molti casi utilizzando una pro-
l’analisi dell’albero genealogico delle famiglie, con- cedura chiamata amniocentesi (Figura 4.13). Quando il
dotta insieme all’annotazione precisa dei fenotipi di en- feto si sviluppa nel sacco amniotico, è circondato dal li-
trambe le famiglie per un certo numero di generazioni. quido amniotico che serve ad attutire eventuali urti.
(L’analisi degli alberi genealogici è descritta in maggior
dettaglio nei Capitoli 11 e 12). L’analisi degli alberi ge-
nealogici è utilizzata per determinare la probabilità che Prelievo di liquido
un particolare allele sia presente nelle famiglie di en- amniotico
trambi i genitori.
La scoperta di una condizione genetica avviene in
due possibili modi, eventualmente in parallelo: analisi
dei genitori per identificare i portatori (cioè gli eterozi-
goti per mutazioni recessive che non manifestano la ma-
lattia) o analisi fetale. Saggi che misurano l’attività di en-
zimi o la quantità di una data proteina possono essere uti-
lizzati solo in quei casi nei quali il difetto genetico sia
espresso nei genitori e/o nel feto. Saggi che misurano
cambiamenti a carico del DNA associati alla malattia
permettono di fare un’analisi genetica diretta e indipen-
dente dall’espressione del gene nei genitori o nel feto.
Benché si possano identificare i portatori di numero-
si alleli mutanti e si possa determinare se il feto ha un Centrifugazione
danno genetico, in molti casi non esistono metodi per
cambiare il fenotipo che ne deriva. L’identificazione dei
portatori e l’analisi fetale servono soprattutto per infor-
mare i genitori dei rischi e delle probabilità di avere un
Sopranatante
figlio con un difetto.
Analisi per valutare deficit
enzimatici, alterazioni nelle
Identificazione dei portatori proteine e difetti del DNA Cellule fetali
L’identificazione dei portatori individua persone che
sono eterozigoti per una mutazione recessiva. Il portato-
re eterozigote per un gene mutante ha di solito un feno-
tipo normale. Nel caso di una mutazione recessiva che
ha conseguenze gravemente dannose per l’individuo Coltura
omozigote per tale mutazione, è di grande importanza
determinare se le persone che pensano di mettere al
mondo un figlio siano entrambe portatrici, dato che in
questa situazione un quarto dei figli manifesterebbe la
malattia. L’identificazione dei portatori può essere uti-
lizzata nei casi in cui è quantificabile un prodotto geni-
co (proteina o enzima). In questi casi, l’individuo etero- Analisi dei difetti
cromosomici
zigote dovrebbe presentare un’attività enzimatica o una
quantità di proteina più o meno pari alla metà di quella Figura 4.13
trovata in individui normali, anche se ciò non è stato os- Amniocentesi, una procedura utilizzata per la diagnosi
servato per tutte le mutazioni. Negli altri casi, l’identifi- prenatale dei difetti genetici.
70 Capitolo 4

Liquido amniotico
Utero
Sinfisi pubica

Placenta

Corion
Cannula

Figura 4.14
Analisi dei villi coriali, una procedura utilizzata
per la diagnosi prenatale precoce dei difetti
genetici.

Nell’amniocentesi viene prelevato un campione del li- sotto controllo ecografico. Una volta che si sia ottenuto
quido amniotico inserendo con attenzione l’ago di una un campione del tessuto, l’analisi viene effettuata diret-
siringa attraverso la parete uterina materna fino all’in- tamente su di esso. I vantaggi di questa tecnica sono che
terno del sacco amniotico. Il fluido contiene cellule che essa permette ai genitori di sapere se il feto ha un difet-
si sono sfaldate dalla pelle del feto; queste cellule posso- to genetico in un momento più precoce della gravidanza
no essere coltivate in laboratorio e analizzate per indivi- rispetto all’amniocentesi, e che non occorre coltivare le
duare alterazioni o deficienze di enzimi o proteine, cam- cellule per ottenere materiale sufficiente per l’analisi
biamenti nel DNA e anormalità cromosomiche. È possi- biochimica. Tuttavia, il rischio di mortalità del feto e di
bile effettuare l’amniocentesi in qualsiasi stadio della diagnosi poco accurata per la presenza di cellule mater-
gestazione, ma la piccola quantità di liquido amniotico ne, è più comune nell’analisi dei villi coriali che nel-
disponibile e i rischi per il feto la rendono impraticabile l’amniocentesi.
prima delle 12 settimane di gravidanza. Dal momento
che l’amniocentesi è complicata e costosa, il suo uso è
principalmente indicato nei casi a rischio.
Un altro metodo di valutazione fetale è l’analisi dei Nota chiave
villi coriali (Figura 4.14). L’analisi può essere effettua- La consulenza genetica è un parere basato sull’ana-
ta tra l’8a e la 12a settimana di gravidanza, cioè più pre- lisi della probabilità che i pazienti abbiano un difet-
cocemente rispetto all’amniocentesi. Il corion è una to genetico o sul calcolo del rischio che futuri geni-
membrana che circonda il feto e consiste interamente di tori possano generare un bambino con un difetto
tessuto embrionale. Un campione del tessuto dei villi genetico. L’individuazione dei portatori e l’analisi
coriali può essere prelevato dalla placenta attraverso del feto danno come risultato la diagnosi precoce di
l’addome (come nell’amniocentesi) oppure attraverso la una malattia genetica.
vagina, utilizzando un forcipe o un catetere flessibile
La funzione del gene 71

Sommario
l Esiste una relazione specifica tra geni ed enzimi, inizial- un individuo deve avere entrambi gli alleli mutati per il ge-
mente rappresentata dall’ipotesi un gene-un enzima, che ne implicato.
stabilisce che ogni gene controlla la sintesi o l’attività di un l Dallo studio delle alterazioni in proteine diverse dagli enzi-
singolo enzima. Poiché alcuni enzimi sono costituiti da più mi sono state ottenute prove convincenti che i geni control-
di un polipeptide, e i geni codificano per catene polipepti- lano la struttura di tutte le proteine, non solo di quelle che
diche individuali, questa relazione fu aggiornata nell’ipote- svolgono una funzione enzimatica.
si un gene-un polipeptide. Oggi sappiamo che non tutti i l La consulenza genetica consiste in un’analisi del rischio
geni codificano per proteine e che alcuni geni eucariotici che i futuri genitori possano generare un bambino con un
che codificano per proteine vengono espressi producendo difetto genetico e nella presentazione ai membri della fami-
più di un polipeptide. glia delle opzioni disponibili per evitare o ridurre al mini-
l Molte malattie genetiche umane sono causate da deficit in mo questi rischi. L’individuazione dei portatori e l’analisi
attività enzimatiche. La maggior parte sono ereditate come fetale permettono una precoce individuazione di una ma-
caratteri recessivi, vale a dire che per sviluppare la malattia lattia genetica.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


D4.1 Un certo numero di ceppi mutanti auxotrofi è stato iso- (nessuno dei mutanti dovrebbe crescere in presenza del primo
lato da un lievito selvatico aploide. Questi ceppi rispondono al- composto della catena). Quindi la catena metabolica dedotta fi-
l’aggiunta di certi elementi nutrizionali al terreno minimo di no a questo punto è
coltura o crescendo (+) o non crescendo (0). Nella seguente ta-
bella sono riportate le risposte di ciascun ceppo mutante per un S D [B,A,T] D R
singolo gene:
dove l’ordine di B, A e T deve ancora essere determinato.
Ora consideriamo ciascuno dei ceppi mutanti e vediamo come
Aggiunte al terreno
i fenotipi di crescita possano aiutare a definire la catena meta-
minimo di coltura
bolica.
Ceppi mutanti B A R T S Il ceppo 1 cresce solo quando gli viene fornito B o R. Quindi
l’enzima difettoso nel ceppo 1 deve agire da qualche parte pri-
1 + 0 + 0 0 ma della formazione di B e R, e dopo le sostanze A, T e S. Dato
che abbiamo stabilito che R è il prodotto finale della catena,
2 + + + + 0
possiamo proporre che B sia l’immediato precursore di R, e che
3 + 0 + + 0 il ceppo 1 non sappia produrre B. La catena deve essere quindi

4 0 0 + 0 0 1
S D [A,T] D B D R
Schematizzate una via biochimica che sia in accordo con i ri-
sultati, indicando in quale punto della catena viene bloccato Il ceppo 2 cresce in tutti casi eccetto che in presenza di S, il pri-
ciascun mutante. mo composto della via. Quindi il difetto enzimatico nel ceppo 2
deve agire nella conversione di S nel composto successivo nel-
R4.1 I risultati da analizzare sono molto simili a quelli de- la catena, che sarà A o T. Non sappiamo ancora se A o T seguo-
scritti nel testo per l’analisi di Beadle e Tatum su mutanti auxo- no S nella catena, ma i dati di crescita ci permettono almeno di
trofi di Neurospora, sulla base dei quali essi proposero l’ipote- concludere dove il ceppo 2 viene bloccato nella catena e cioè:
si un gene-un enzima. Ricordate che, più avanti nella catena
metabolica un mutante risulta bloccato, tanto minori aggiunte 2 1
nutrizionali dovranno essere utilizzate per farlo crescere. Dai S D [A,T] D B D R
dati riportati, dobbiamo assumere che le aggiunte nutrizionali
non siano necessariamente elencate nell’ordine nel quale esse Il ceppo 3 cresce in presenza di B, R e T, ma non di A o S.
compaiono nella catena metabolica. Sappiamo che R è il prodotto finale ed S è il primo composto
L’analisi dei risultati indica che tutti i quattro ceppi crescono se della catena. Questo ceppo mutante permette di determinare
viene dato R e non crescono se viene dato S. Da ciò possiamo l’ordine di A e T nella via biochimica. Infatti, dato che il ceppo
concludere che R è probabilmente il prodotto finale della cate- 3 cresce con T ma non con A, T deve essere in uno stadio suc-
na (tutti i mutanti devono crescere in presenza del prodotto fi- cessivo rispetto ad A e l’enzima difettoso in 3 deve essere inca-
nale) e che S è probabilmente il primo composto della catena pace di convertire A in T. La catena metabolica ora è
72 Capitolo 4

2 3 1 tazione in 4 deve bloccare l’ultimo passaggio della catena bio-


SDADTDBDR chimica, che converte B in R. La catena metabolica finale de-
dotta e le posizioni dei relativi blocchi nei mutanti sono:
Il ceppo 4 può crescere solo se gli viene fornito il prodotto R,
ritenuto quello terminale. Quindi il difetto enzimatico presente 2 3 1 4
in tale ceppo mutato deve agire prima della formazione di R e SDADTDBDR
dopo la formazione di A, T e B dal primo composto S. La mu-
Espressione genica:
5 la trascrizione
Che cosa è il dogma centrale? Come si svolgono l’inizio, l’allungamento
e la terminazione della trascrizione nei batteri?

Quali sono i quattro tipi principali di molecole Come avviene la trascrizione negli eucarioti?
di RNA nelle cellule?
Come viene sintetizzata una catena di RNA? Come viene prodotto un mRNA funzionale
dal trascritto iniziale di un gene che codifica
per una proteina negli eucarioti?

Attività Espressione genica. Il dogma centrale:


Molte tecniche biotecnologiche sono rese
possibili dalla comprensione dell’espressione ge-
schema generale
nica, il primo passaggio della quale è la trascri- Nel 1956, tre anni dopo che Watson e Crick avevano
zione. Durante la trascrizione, l’informazione vie- proposto il loro modello a doppia elica del DNA, Crick
ne trasferita dalla molecola di DNA a una mole- definì dogma centrale il processo in due fasi indicato
cola di RNA a singolo filamento. In questo capito-
con: DNA D RNA D proteina (cioè la trascri-
lo, imparerete come il DNA viene trascritto in
zione seguita dalla traduzione). La trascrizione è la sin-
RNA, e la struttura e le proprietà di forme diffe-
renti di RNA. Poi, nella iAttività, potrete verifica- tesi di una molecola di RNA copiata da un segmento di
re come mutazioni che alterano il processo della DNA; solo uno dei due filamenti del DNA viene trascrit-
trascrizione possano determinare una malattia to in un RNA. Questo è logico, perché la funzione
ereditaria. dell’RNA nella cellula dipende dalla sua sequenza di ba-
si, quindi un trascritto dell’altro filamento di DNA
avrebbe una sequenza di RNA complementare che non
potrebbe svolgere correttamente la propria funzione.
La struttura, la funzione, lo sviluppo e la riproduzione La produzione di un RNA attraverso la trascrizione
di un organismo dipendono dalle proprietà delle protei- di un gene è una fase dell’espressione genica. Ci sono
ne presenti in ogni cellula e tessuto. Una proteina con- quattro tipi principali di molecole di RNA, ciascuna co-
siste di una o più catene di amminoacidi. Ogni catena è dificata da geni specifici, ma solo uno di essi, l’RNA
un polipeptide, e la sequenza degli amminoacidi in un messaggero (mRNA), viene tradotto. Tutte le altre clas-
polipeptide è codificata da un gene. Quando in una cel- si comprendono RNA trascritti ma non tradotti in catene
lula è necessaria una proteina, il codice genetico per la polipeptidiche, che hanno ruoli funzionali importanti.
sequenza di amminoacidi di quella proteina deve esse-
re letto dal DNA e la proteina deve essere prodotta. La 1. mRNA (RNA messaggero), che codifica per la se-
sintesi proteica consiste di due fasi principali: la trascri- quenza di amminoacidi di un polipeptide. Gli
zione e la traduzione. La trascrizione è la sintesi di un mRNA sono i trascritti dei geni che codificano per
singolo filamento di RNA copiato da un segmento di proteine. La traduzione di un mRNA produce un po-
DNA. Nel caso della sintesi proteica, un gene che codi- lipeptide.
fica per una proteina viene trascritto in un RNA mes- 2. rRNA (RNA ribosomale), che, insieme alle protei-
saggero. La traduzione (sintesi proteica) è la conver- ne ribosomali, costituisce i ribosomi (le strutture nel-
sione dell’informazione portata nella sequenza di basi le quali viene tradotto l’mRNA).
dell’RNA messaggero nella sequenza di amminoacidi 3. tRNA (transfer RNA o RNA di trasporto), che
di un polipeptide. In questo capitolo descriveremo il porta gli amminoacidi al ribosoma durante la tradu-
processo della trascrizione. zione.
74 Capitolo 5

4. snRNA (small nuclear RNA; piccolo RNA nuclea- I precursori dell’RNA per la trascrizione sono i ribonu-
re), che, insieme a proteine, forma complessi che cleosidi trifosfati ATP, GTP, CTP, e UTP, chiamati col-
vengono usati nella maturazione degli RNA eucario- lettivamente NTP (Nucleoside TriPhosphates). La sin-
ti per produrre mRNA funzionali. tesi dell’RNA avviene mediante reazioni di polimeriz-
zazione simili a quelle che avvengono durante la sintesi
Nella cellula si trova un gran numero di altre piccole mo- del DNA (Figura 5.2; la sintesi del DNA è mostrata nel-
lecole di RNA, non codificanti (indicate come ncRNA, la Figura 3.3). L’RNA polimerasi sceglie il nucleotide
non coding RNA), che verranno descritte nei prossimi ca- successivo da aggiungere alla catena in base alla sua ca-
pitoli. Nel seguito di questo capitolo studierete il processo pacità di appaiarsi con la base complementare sul fila-
della trascrizione nei batteri e negli eucarioti, in particola- mento stampo del DNA. A differenza della DNA poli-
re per quanto riguarda i geni che codificano per proteine. merasi, l’RNA polimerasi è in grado di iniziare una nuo-
va catena di RNA; in altre parole, non c’è bisogno di un
primer o innesco. Ricordate che le catene di RNA con-
Il processo della trascrizione tengono nucleotidi con la base uracile al posto della ti-
Come viene sintetizzata una catena di RNA? A ogni ge- mina, e che l’uracile si appaia all’adenina. Quindi, dove
ne sono associate sequenze chiamate elementi regolato- c’è un nucleotide A nel filamento stampo di DNA, nel-
ri, che sono coinvolte nella regolazione della trascrizio- la catena di RNA verrà inserito un nucleotide U invece
ne. Il processo della trascrizione è catalizzato dall’enzi- di T. Per esempio, se la sequenza dello stampo di DNA
ma RNA polimerasi (Figura 5.1). (Più precisamente, è la seguente
l’enzima è noto come RNA polimerasi DNA-dipenden-
3′-ATACTGGAC-5′
te perché usa uno stampo di DNA per la sintesi di una ca-
tena di RNA.) Prima dell’ini- la catena di RNA che verrà sintetizzata in direzione da 5′
nimazione zio della trascrizione, la dop- a 3′ avrà la sequenza
La biosintesi pia elica di DNA deve svol-
5′-UAUGACCUG-3′
MyLab dell’RNA gersi per un breve tratto vici-
no al gene. Nei batteri, lo sro-
tolamento del DNA viene effettuato dalla stessa RNA po-
limerasi; negli eucarioti, ci sono altre proteine che si lega-
Nota chiave
no al DNA vicino al punto d’inizio della trascrizione. La trascrizione è il processo nel quale l’informazione
Durante la trascrizione, l’RNA viene sintetizzato in genetica contenuta nel DNA viene trasferita nella
direzione da 5′ a 3′. Il filamento di DNA che viene letto in sequenza di basi dell’RNA. Il DNA si srotola in una
direzione 3′-5′ per formare il filamento di RNA viene corta regione vicino al gene, e una RNA polimerasi
chiamato filamento stampo o codificante. Il filamento catalizza la sintesi di una molecola di RNA in dire-
di DNA 5′-3′ complementare allo stampo, e con la stessa zione da 5’ a 3’ lungo il filamento stampo 3’-5’ del
polarità del RNA prodotto, viene chiamato filamento non DNA. Solo un filamento del DNA a doppia elica vie-
stampo o non codificante. Per convenzione, nella lettera- ne trascritto in una molecola di RNA.
tura scientifica e nelle banche dati di sequenze geniche, la
sequenza riportata è quella dell’elica di DNA non codifi-
cante. A partire da quest’elica, si può ricavare direttamen- La trascrizione nei batteri
te la sequenza del trascritto di RNA e, se si tratta di un Il processo della trascrizione avviene in tre fasi: inizio,
mRNA, possono essere letti direttamente gli amminoaci- allungamento e terminazione. In questo paragrafo ci oc-
di codificati in base al codice genetico. cuperemo della trascrizione nella specie modello, E. coli.

Inizio della Figura 5.1


trascrizione Direzione della trascrizione Il processo di trascrizione. La doppia elica
RNA polimerasi Filamento non-stampo del DNA viene denaturata dall’RNA
polimerasi nei procarioti, e da altre
3¢ proteine negli eucarioti. L’RNA polimerasi
5¢ catalizza quindi la sintesi di una catena
5¢ di RNA a singolo filamento, a partire
3¢ 3¢
dal punto di “inizio della trascrizione”.

La catena di RNA viene sintetizzata
Filamento
Promotore Ibrido RNA-DNA di DNA stampo in direzione 5’-3’, utilizzando solo
un filamento del DNA come stampo
che ne stabilisce la sequenza di basi.
Espressione genica: la trascrizione 75

Catena di RNA Filamento


in allungamento di DNA stampo

5¢ 3¢ 5¢ 3¢
O O O– H O O O O– H O
–O P O P O P O –O P O P O P O

O– O– O O– O– O
CH2 CH2
H2C
O A T O H2C
O A T O
O O

O P O– O P O–
O OH H O O OH H O
–O P O –O P O
RNA
O O
Formazione CH2
polimerasi CH2
del legame H2C
O G C O H2C
O G C O

fosfodiesterico O O

O P O– O P O–
OH OH H O O OH H O
3¢ –O P O
O O O O
–O CH2 CH2
P O P O P O CH2 O U A O H2C
O U A O
O O
O– O– O–
O P O– O P O–
OH OH H O OH OH H O

Ribonucleoside trifosfato
in ingresso CH2 CH2
G O G O
O O
Direzione di allungamento
O P O– O P O–
della catena 5¢-3¢
H O H O
Allungamento della catena
+
CH2 O O CH2
T O T O
O –O P O P OH O
Figura 5.2 O P O– O– O– O P O–
La reazione chimica catalizzata dall’RNA O O
polimerasi e coinvolta nella sintesi di RNA
5¢ 5¢
sul filamento stampo di DNA.

Inizio della trascrizione: i promotori quenza del promotore serve cioè a orientare l’RNA
polimerasi in modo che la trascrizione cominci all’i-
Qual è il meccanismo dell’inizio della trascrizione in E. nizio del gene, e assicura che l’inizio della sintesi di
coli? Facendo riferimento alla trascrizione, un gene bat- ogni RNA abbia luogo nello stesso punto.
terico può essere suddiviso in tre regioni (Figura 5.3): Un gene con il proprio promotore è un’unità indipen-
dente. Ciò vuol dire che il filamento della doppia eli-
1. una sequenza, chiamata promotore, che si trova a ca utilizzato come stampo è gene-specifico. In altre
monte del punto di inizio del gene che codifica per parole, alcuni geni usano un filamento del DNA co-
l’RNA. L’RNA polimerasi interagisce con il promo- me stampo, mentre altri geni usano l’altro filamento.
tore. Il modo in cui avviene questa interazione fra L’organizzazione attuale dei geni, per quanto riguar-
l’RNA polimerasi e il promotore, dal punto di vista da questo aspetto, è il risultato dell’evoluzione dei
spaziale, definisce la direzione della trascrizione e, genomi;
quindi, indica all’enzima quale filamento del DNA è 2. la sequenza che codifica per l’RNA – cioè la sequen-
lo stampo e dove deve iniziare la trascrizione. La se- za di DNA trascritta dall’RNA polimerasi in RNA;

Gene

Promotore Sequenza codificante per l’RNA Terminatore Figura 5.3


+1
5¢ 3¢ Filamento non codificante Promotore, sequenza che codifica per
DNA 3¢
5¢ Filamento stampo l’RNA e regione del terminatore di un
Sito d’inizio Sito di terminazione gene. Il promotore si trova a monte
della trascrizione della trascrizione della sequenza codificante, il termi-
natore a valle. La sequenza codifi-
A monte del gene A valle del gene cante inizia con il nucleotide +1.
76 Capitolo 5

3. un terminatore, che indica dove finisce la trascri- del gene al nucleotide giusto. In questa fase, la RNA po-
zione. limerasi è in contatto con circa 75 coppie di basi di
DNA, dalla posizione –55 alla +20.
Il confronto delle sequenze che si trovano a monte del- Poiché le sequenze dei promotori sono diverse, l’effi-
le sequenze codificanti, e lo studio degli effetti delle cienza del legame dell’RNA polimerasi è variabile. Ciò fa
mutazioni di ciascuna coppia di basi a monte dei siti di sì che l’efficienza dell’inizio della trascrizione vari da ge-
inizio della trascrizione, hanno permesso di dimostrare ne a gene. Per esempio, se la sequenza –10 è 5′-GA-
che nella maggior parte dei promotori dei geni di E. co- TACT-3′, il tasso d’inizio della trascrizione sarà inferiore
li sono presenti due sequenze di DNA fondamentali per rispetto a una sequenza 5′-TATAAT-3′, perché la capaci-
specificare l’inizio della trascrizione. Queste sequenze tà del fattore sigma dell’RNA polimerasi di riconoscere e
si trovano generalmente in posizione –35 e –10, cioè 35 legare la prima sequenza è inferiore rispetto alla seconda.
e 10 coppie di basi a monte rispetto al punto di inizio Come abbiamo già detto, i promotori della maggior
della trascrizione, indicato con +1. La sequenza di parte dei geni di E. coli possiedono le sequenze di ricono-
consenso (o consensus, cioè le basi che si trovano con scimento –35 e –10. Questi promotori sono riconosciuti
frequenza maggiore in ciascuna posizione) per la regio- da un fattore sigma con un peso molecolare di 70 000 Da,
ne –35 (la box –35) è 5′-TTGACA-3′. La sequenza chiamato σ70. In E. coli ci sono altri fattori sigma, con un
consenso per la regione –10 (la box –10, una volta chia- ruolo importante nella regolazione dell’espressione geni-
mata anche Pribnow box dal nome del ricercatore ca. Ciascun tipo di fattore sigma si lega al nucleo enzima-
David Pribnow che l’ha individuata per primo) è 5′- tico dell’RNA polimerasi, e consente all’oloenzima di ri-
TATAAT-3′. conoscere promotori differenti. Per esempio, in condizio-
Nei batteri è presente solo un tipo di RNA polimera- ni di stress termico da alte temperature (heat-shock), e in
si, quindi tutte le classi di geni – geni che codificano per seguito ad altri tipi di stress, nella cellula aumenta la
proteine, geni per i tRNA, e geni per gli rRNA – vengo- quantità di un altro fattore sigma, σ32 (con peso moleco-
no trascritte da questo enzima. L’inizio della trascrizione lare di 32 000 Da), che indirizza alcune molecole di RNA
di un gene richiede una forma di RNA polimerasi chia- polimerasi a legarsi ai promotori dei geni che codificano
mata oloenzima (o enzima completo). L’oloenzima è for- proteine necessarie per la risposta allo stress. Questi pro-
mato dal nucleo (core) enzimatico dell’RNA polimera- motori hanno sequenze consenso di riconoscimento spe-
si, costituito da due polipeptidi α, un polipeptide β e uno cifiche per il fattore σ32 in posizione –39 e –15. Ci sono
β′, legato a un altro polipeptide chiamato fattore sigma numerosi altri tipi di fattori sigma con ruoli diversi.
(σ). Il fattore sigma assicura che l’RNA polimerasi si le- La regolazione dell’espressione dei geni batterici ver-
ghi in maniera stabile solo ai promotori. Senza il fattore rà discussa nel Capitolo 17. In sintesi, la trascrizione di
sigma, infatti, il nucleo enzimatico dell’RNA polimerasi molti geni batterici viene controllata attraverso l’intera-
si può legare a qualunque sequenza di DNA e iniziare la zione di proteine regolatrici con sequenze regolatrici che
sintesi dell’RNA, ma in questo caso l’inizio della trascri- si trovano a monte della sequenza che codifica per
zione non avviene nei punti giusti. L’associazione del l’RNA, vicino al promotore. Ci sono due classi di protei-
fattore sigma con il nucleo enzimatico riduce notevol- ne regolatrici: gli attivatori stimolano la trascrizione faci-
mente la capacità dell’enzima di legarsi al DNA in ma- litando il legame dell’RNA polimerasi o l’allungamento
niera non-specifica, e conferisce all’oloenzima la pro- del filamento di RNA, mentre i repressori inibiscono la
prietà di legarsi in modo specifico al promotore. Il fatto- trascrizione, rendendo più difficile il legame dell’RNA
re sigma non è necessario per le fasi di allungamento e polimerasi o l’allungamento del filamento di RNA.
terminazione della trascrizione.
L’oloenzima della RNA polimerasi si lega ai promo-
tori della maggior parte dei geni, come è mostrato nella
Allungamento della catena di RNA
Figura 5.4. All’inizio, l’oloenzima prende contatto con la La sintesi dell’RNA avviene in una regione di DNA che
sequenza –35, e poi si lega all’intero promotore, mentre si è separata in singoli filamenti formando una bolla di
il DNA si trova ancora nella forma standard a doppia eli- trascrizione. Una volta che la sintesi sia iniziata e si sia
ca, uno stato chiamato complesso del promotore chiuso instaurata la fase di allungamento, l’RNA polimerasi co-
(Figura 5.4a). Quindi, l’oloenzima srotola il DNA in cor- mincia a muoversi lungo il DNA e il fattore sigma viene
rispondenza della regione –10 (Figura 5.4b). La forma rilasciato (Figura 5.4c). Il nucleo enzimatico è capace di
srotolata del promotore è chiamata complesso del pro- completare la trascrizione del gene da solo. In cellule di
motore aperto. Il fattore sigma dell’oloenzima ha un ruo- E. coli che crescono a 37 °C, la trascrizione ha una velo-
lo chiave in queste fasi, interagendo direttamente con il cità di circa 40 nucleotidi/s. Durante la transizione dalla
promotore a livello delle sequenze –35 e –10. Una volta fase di inizio a quella di allungamento, l’RNA polimera-
che la RNA polimerasi è legata alla box –10, essa è si diventa più compatta, ed è in contatto con una regione
orientata nel modo corretto per iniziare la trascrizione di DNA più piccola. Quando la fase di allungamento è
Espressione genica: la trascrizione 77

a) Nella fase di inizio, l’oloenzima dell’RNA polimerasi riconosce dapprima la regione –35 del promotore e quindi lo lega interamente.

Promotore Sequenza codificante


RNA polimerasi Complesso del promotore chiuso

5¢ 3¢


Fattore s

b) Mentre la fase di inizio procede, l’RNA polimerasi si lega più strettamente al promotore a livello della regione –10; lo srotolamento
localizzato del DNA in quella regione accompagna l’evento. A questo punto, l’RNA polimerasi è orientata nel modo corretto
per iniziare la trascrizione in posizione +1.

Regione –35 Regione –10

Nucleotide
d’inizio



5¢ PPP 5¢

Complesso
del promotore aperto +1

c) Dopo la polimerizzazione di 8-9 nucleotidi, Direzione della trascrizione


il fattore sigma si dissocia dal nucleo enzimatico.
RNA polimerasi




3¢ 3¢
5¢ Filamento
di DNA stampo
Ibrido RNA-DNA
Rilascio
del fattore s

d) Mentre l’RNA polimerasi allunga la nuova catena di RNA, l’enzima


srotola il DNA a valle, mantenendo una bolla di trascrizione a singolo
filamento che si estende per circa 25 paia di basi. Circa 9 basi del nuovo
RNA sono legate al DNA a singolo filamento nella bolla di trascrizione,
e il rimanente esce dall’enzima sotto forma di filamento singolo.



3¢ 3¢ 5¢

Allungamento
dell’RNA
Promotore Sequenza codificante

Figura 5.4
L’azione dell’RNA polimerasi di E. coli nelle fasi di inizio
e di allungamento della trascrizione.

stabilizzata, l’RNA polimerasi è in contatto con circa 40 per esporre un nuovo segmento del DNA stampo a sin-
coppie di basi di DNA, 25 delle quali fanno parte della golo filamento. Dietro la regione srotolata i due filamen-
bolla di trascrizione. ti del DNA riformano la doppia elica (Figura 5.4d). Nella
Durante la fase di allungamento il nucleo enzimatico regione srotolata circa 9 nucleotidi di RNA sono appaia-
si muove, srotolando la doppia elica di DNA davanti a sé ti al DNA, formando un ibrido temporaneo RNA-DNA;
78 Capitolo 5

il resto dell’RNA appena sintetizzato esce dall’enzima la forcina impediscono in modo parziale o completo la
come filamento singolo (Figura 5.4d). terminazione.
L’RNA polimerasi ha due attività di correzione di I terminatori Rho-dipendenti sono sequenze ricche di
bozze. Una di queste è simile a quella della DNA poli- C e povere di G, che non formano strutture a forcina co-
merasi, nella quale il nucleotide inserito erroneamente me quelle dei terminatori Rho-indipendenti. La termina-
viene rimosso dall’enzima invertendo la reazione di sin- zione in questo caso si ottiene nel modo seguente: Rho si
tesi, facendo un passo indietro, e sostituendo il nucleoti- lega alla sequenza ricca di C del terminatore, nel trascrit-
de sbagliato con quello giusto. Nell’altra attività di cor- to a monte del sito di termine della trascrizione. Quindi
rezione, l’enzima torna indietro di uno o più nucleotidi e Rho si muove lungo il trascritto fino a raggiungere l’RNA
taglia l’RNA in quella posizione, prima di riprendere la polimerasi, dove l’RNA appena sintetizzato è appaiato
sintesi dell’RNA nella direzione giusta. con il DNA stampo. Rho è un’elicasi, cioè un enzima ca-
pace di srotolare gli acidi nucleici a doppia elica. Quando
Rho raggiunge l’RNA polimerasi, l’elicasi srotola l’elica
Terminazione della catena di RNA formata fra l’RNA e il filamento stampo del DNA, usan-
La fine della trascrizione dei geni batterici viene segna- do l’idrolisi dell’ATP come fonte dell’energia necessaria.
lata da sequenze di terminazione o terminatori. Nella Si ha quindi il rilascio della nuova molecola di RNA, la
terminazione della trascrizione di alcuni geni di E. coli doppia elica del DNA si riforma, e l’RNA polimerasi e
è coinvolta una proteina, chiamata proteina Rho (ρ). I Rho si dissociano dal DNA; la trascrizione è terminata.
terminatori di questi geni sono chiamati terminatori
Rho-dipendenti (o terminatori di tipo II). Per altri geni,
è il nucleo enzimatico dell’RNA polimerasi che termi- Nota chiave
na da solo la trascrizione; i terminatori per questi geni In E. coli, l’inizio e il termine della trascrizione sono
sono chiamati terminatori Rho-indipendenti (o termi- indicati da sequenze specifiche che fiancheggiano
natori di tipo I). la regione codificante del gene. Il promotore viene
I terminatori Rho-indipendenti sono costituiti da una riconosciuto dal fattore sigma, un componente del
sequenza ripetuta invertita che si trova circa 16-20 coppie complesso RNA polimerasi-fattore sigma. Esistono
di basi a monte del punto di termine della trascrizione, se- due tipi di sequenze di terminazione, e un determi-
guita da una serie di 4-8 coppie di basi A-T. L’RNA poli- nato gene può avere l’una o l’altra. Un tipo di termi-
merasi trascrive la sequenza del terminatore, che fa parte natore viene riconosciuto dall’RNA polimerasi da so-
integrante del gene che codifica per l’RNA. A causa del- la, mentre l’altro tipo viene riconosciuto dall’enzi-
la presenza della sequenza ripetuta invertita, l’RNA appe- ma associato al fattore Rho.
na sintetizzato si ripiega a formare una struttura a forcina
(Figura 5.5). La struttura a forcina determina un rallenta-
mento, e quindi una pausa, nella sintesi dell’RNA da par- La trascrizione negli eucarioti
te dell’RNA polimerasi. La serie di nucleotidi U a valle Negli eucarioti, la trascrizione è più complessa rispetto
della forcina destabilizza l’appaiamento fra la nuova cate- ai batteri. Ciò è dovuto al fatto che gli eucarioti possie-
na di RNA e il filamento stampo del DNA, e l’RNA poli- dono tre classi differenti di RNA polimerasi, e al modo
merasi si dissocia dallo stampo; la trascrizione è così ter- in cui vengono processati i trascritti per ottenerne le for-
minata. Le mutazioni che impediscono la formazione del- me funzionali. In questo paragrafo ci occuperemo della
trascrizione dei geni che codifica-
Simmetria bipartita
no per proteine.

Stampo 5¢ C C C A G C C C G C C T A A T G A G C G G G C T T T T T T T T G A A C A A A A 3¢
(DNA) 3¢ G G G T C G G G C G G A T T A C T C G C C C G A A A A A A A A C T T G T T T T 5¢ Le RNA polimerasi eucariote
Trascritto
5¢ C C C A G C C C G C C U A A U G A G C G G G C U U U U U U U U – OH 3¢
Negli eucarioti, la trascrizione dei
(RNA)
geni per i quattro tipi principali di
A RNA è effettuata da tre RNA poli-
A U
U G merasi differenti. L’RNA polime-
Il trascritto si ripiega formando
C A rasi I, localizzata nel nucleolo, ca-
la forcina di terminazione Mutazioni C –G
A U G–C Mutazioni
A C –G A
U C –G A U C Figura 5.5
C –G A U
G–C Sequenza di un terminatore Rho-indipendente e
5¢– C C C A – U U U U U U U U – OH 3¢ struttura dell’RNA terminato. Le mutazioni nello
stelo della forcina (indicato in giallo) impediscono
Delezione parzialmente o completamente la terminazione.
G
Espressione genica: la trascrizione 79

talizza la sintesi di tre degli RNA che si trovano nei ribo-


somi: le molecole di rRNA 28S, 18S, e 5,8S. (I valori S
indicano il coefficiente di sedimentazione delle moleco-
le di rRNA durante la centrifugazione, e danno un’in-
dicazione molto approssimativa della dimensione delle
molecole.) L’RNA polimerasi II, localizzata nel nu-
cleoplasma, sintetizza gli RNA messaggeri (mRNA) e
alcuni piccoli RNA nucleari (snRNA). L’RNA polime-
rasi III, che si trova anch’essa nel nucleoplasma, sinte-
tizza: (1) gli RNA transfer (tRNA); (2) l’rRNA 5S, una
piccola molecola di rRNA presente in tutti i ribosomi; e
(3) gli snRNA non sintetizzati dall’RNA polimerasi II.
Tutte le RNA polimerasi eucariote sono costituite da
più subunità. Per esempio, l’RNA polimerasi II del lievi-
to è formata da 12 subunità e ha una struttura a forma di Figura 5.6
U; l’estremità aperta della U guida la polimerasi mentre Struttura tridimensionale dell’RNA polimerasi II del lievito.
si muove lungo il DNA (Figura 5.6). Le RNA polimera- Ciascun colore rappresenta un polipeptide differente.
si II eucariote di altre specie hanno una struttura simile.
Le RNA polimerasi batteriche sono più piccole, ma han- che alterano in maniera significativa la trascrizione per-
no una struttura abbastanza simile a quella delle RNA mettono di individuare elementi importanti dei promoto-
polimerasi eucariote. ri. Il secondo modo consiste nel confrontare le sequenze
di DNA a monte di un certo numero di geni che codifica-
no per proteine, e vedere se si individuano regioni con
Nota chiave sequenze simili. I risultati di questi esperimenti hanno
In E. coli, un’unica RNA polimerasi sintetizza gli dimostrato che i promotori dei geni che codificano per
mRNA, i tRNA e gli rRNA. Gli eucarioti hanno tre proteine coprono una regione di circa 200 coppie di basi
RNA polimerasi nucleari distinte, ciascuna delle qua- a monte del sito d’inizio della trascrizione, e contengono
li trascrive tipi di geni diversi: l’RNA polimerasi I tra- vari elementi di sequenza. Nel promotore possono esse-
scrive i geni per gli RNA ribosomali 28S, 18S e 5,8S; re distinte due regioni: (1) il nucleo del promotore; e (2)
l’RNA polimerasi II trascrive i geni per gli mRNA e al- gli elementi prossimali.
cuni snRNA; e l’RNA polimerasi III trascrive i geni per Il nucleo del promotore è costituito da una serie di
l’rRNA 5S, i tRNA, e i rimanenti snRNA. elementi che agiscono in cis necessari perché la sintesi
dell’RNA possa iniziare nel punto giusto. (Cis vuol dire
“dalla stessa parte”. Una sequenza che agisce in cis in-
La trascrizione dei geni che codificano fluenza solo l’attività di un gene che si trova sulla stessa
per proteine da parte dell’RNA polimerasi II molecola di DNA.) Questi elementi si trovano di solito
In questo paragrafo descriveremo la successione degli non più di 50 paia di basi a monte del sito d’inizio della
eventi molecolari coinvolti nella trascrizione dei geni trascrizione. Gli elementi del nucleo del promotore me-
che codificano per proteine da parte dell’RNA polimera- glio caratterizzati sono: (1) una corta sequenza chiamata
si II. I geni eucarioti trascritti dall’RNA polimerasi II Inr (Iniziatore), che comprende il sito d’inizio della tra-
hanno specifiche sequenze del promotore ma, contraria- scrizione (definito +1); e (2) la TATA box o elemento
mente ai geni batterici, non hanno specifiche sequenze di TATA (chiamata anche box Goldberg-Hogness, dai
terminazione. Il prodotto della trascrizione è una mole- nomi dei suoi scopritori), localizzata all’incirca in posi-
cola di mRNA precursore (pre-mRNA) – un trascritto zione –30. La TATA box ha una sequenza di consenso di
che deve essere modificato, processato, o entrambe le sette nucleotidi: 5′-TATAAAA-3′. Gli elementi Inr e
cose, per produrre una molecola di mRNA matura e fun- TATA specificano dove si deve assemblare l’apparato
zionale che possa essere tradotta in un polipeptide. della trascrizione, e determinano dove essa avrà inizio.
Tuttavia, in assenza di altri elementi, la trascrizione av-
Promotori ed enhancer I promotori dei geni che codi- viene solo a un livello molto basso.
ficano per proteine possono essere analizzati principal- Gli elementi prossimali del promotore si trovano a
mente in due modi. Un modo consiste nell’esaminare gli monte della TATA box, nella regione che va da –50 a
effetti di mutazioni che causano la delezione o il cambia- –200 nucleotidi dal sito d’inizio della trascrizione. Fra
mento di coppie di basi nella sequenza a monte del pun- questi elementi abbiamo, per esempio la CAAT (“cat”)
to d’inizio della trascrizione, e verificare se nei mutanti box, denominata in base alla sua sequenza consenso e lo-
si abbia un’alterazione della trascrizione. Le mutazioni calizzata in posizione –75; e la GC box, che ha la sequen-
80 Capitolo 5

Focus sul genoma


La ricerca dei promotori
I promotori sono ovviamente importanti per la fun- perché si legano meno bene all’apparato della tra-
zione genica. Precedentemente in questo capitolo scrizione, o perché altre proteine aiutano l’RNA po-
abbiamo definito le sequenze consenso per i pro- limerasi a legarsi. Uno dei primi obiettivi della ge-
motori e altre regioni regolatrici a monte, per nomica è stato l’analisi delle sequenze per ricercare
esempio le box TATA e CAAT. Le sequenze di questi possibili promotori, al fine di identificare i geni as-
elementi, così come la loro distanza relativa l’uno sociati a quelle sequenze. Anche la ricerca di cornici
rispetto all’altro e rispetto al sito d’inizio della tra- di lettura aperte (ORF, Open Reading Frames), de-
scrizione, sono importanti dal punto di vista funzio- scritte nel Capitolo 6, e di regioni contenenti i se-
nale. Non tutti i geni mostrano nei loro promotori gnali di terminazione permettono l’individuazione
una corrispondenza precisa con queste sequenze, o di sequenze geniche nel genoma.

za consenso 5′-GGGCGG-3′ e che si trova in posizione no complessi con altre proteine. Il DNA che contiene gli
–90. Sia la CAAT box sia la GC box funzionano in en- enhancer viene portato vicino al DNA del promotore, al
trambi gli orientamenti (cioè la loro sequenza può essere quale è legato il complesso della trascrizione, stimolando
orientata nello stesso senso rispetto alla trascrizione, o al massimo livello la trascrizione di quel particolare gene.
nel senso opposto). Mutazioni in ciascuno di questi ele- Nel Capitolo 18 verranno discussi in maggior detta-
menti (o in altri elementi prossimali non menzionati) de- glio gli attivatori, i promotori, gli enhancer, e come ven-
terminano una marcata diminuzione della frequenza d’i- gono regolati i geni che codificano per proteine negli eu-
nizio della trascrizione a partire dal promotore, indican- carioti. Il Focus sul genoma di questo capitolo descrive
do che essi hanno un ruolo nel determinare l’efficienza come i ricercatori identificano i promotori nelle sequen-
del promotore stesso. ze di DNA genomico.
I promotori possono contenere varie combinazioni
degli elementi del nucleo e prossimali, che nell’insieme Inizio della trascrizione Un preciso inizio della trascri-
ne determinano la funzionalità. Gli elementi prossimali zione di un gene che codifica per una proteina prevede
sono importanti nel determinare come e quando un gene l’assemblaggio sul nucleo del promotore dell’RNA poli-
è espresso. La chiave di questa regolazione è rappresen- merasi II e di un certo numero di altre proteine, chiama-
tata da proteine regolatrici chiamate attivatori, che de- te fattori generali di trascrizione (GTF). Contraria-
terminano l’efficienza dell’inizio della trascrizione. Per mente alle RNA polimerasi batteriche, nessuna delle tre
esempio, geni che sono espressi in tutti i tipi cellulari per RNA polimerasi eucariote si può legare direttamente al
le funzioni di base – detti geni housekeeping – hanno ele- DNA. Particolari GTF si legano prima, e reclutano
menti prossimali riconosciuti da attivatori presenti in tut- l’RNA polimerasi formando un complesso. Successiva-
ti i tipi cellulari. Esempi di geni housekeeping sono il ge- mente si legano altri GTF, e la trascrizione può avere ini-
ne per l’actina e il gene per l’enzima glucosio 6-fosfato zio. I GTF sono identificati da un numero, che si riferisce
deidrogenasi. Al contrario, geni che sono espressi solo in all’RNA polimerasi con la quale interagiscono, e da una
tipi cellulari particolari, o in un momento particolare, lettera che indica l’ordine con il quale sono stati scoper-
hanno gli elementi prossimali dei promotori riconosciuti ti. Per esempio, TFIID è il quarto fattore di trascrizione
da attivatori presenti in quei tipi cellulari o in quelle par- generale scoperto (come indicato dalla lettera D), che in-
ticolari condizioni. teragisce con l’RNA polimerasi II.
Altre sequenze – gli enhancer (stimolatori) – sono Nel caso dei geni che codificano per proteine, i GTF
necessarie per ottenere il livello massimo di trascrizione e l’RNA polimerasi II si legano in vitro agli elementi del
di un gene. Gli enhancer sono un altro tipo di elemento promotore secondo un ordine specifico per formare il
che agisce in cis. Per definizione, gli enhancer funziona- complesso d’inizio della trascrizione completo, chiama-
no sia a monte sia a valle rispetto al sito d’inizio della tra- to anche complesso di pre-inizio (PIC) perché è pronto a
scrizione – anche se, di solito, si trovano a monte del ge- iniziare la trascrizione (Figura 5.7). Come abbiamo detto
ne che controllano, a volte anche a migliaia di coppie di in precedenza, il legame degli attivatori agli elementi
basi di distanza. In altre parole, gli enhancer modulano la prossimali del promotore e agli enhancer determina l’ef-
trascrizione a distanza. Gli enhancer contengono una va- ficienza complessiva dell’inizio della trascrizione a li-
rietà di elementi costituiti da corte sequenze, alcuni dei vello di un particolare promotore.
quali sono uguali a quelli che si trovano nei promotori. Mentre gli esperimenti effettuati in vitro indicano
Gli attivatori si legano anche a queste sequenze, e forma- che l’assemblaggio dei GTF e dell’RNA polimerasi II
Espressione genica: la trascrizione 81

Assemblaggio del complesso di pre-inizio Figura 5.7


Assemblaggio del complesso d’inizio della tra-
TAFs scrizione. Il fattore TFIID si lega per primo
TFIID
TBP TFIID si lega alla alla TATA box per formare il complesso d’inizio
TATA box per formare preliminare. TFIID è costituito da più subunità,
il complesso
TATA box Punto d’inizio d’inizio preliminare fra le quali la proteina che lega la TATA box
della trascrizione (TBP), che riconosce la sequenza della TATA box,
e numerose altre proteine chiamate fattori
TFIIA
associati alla TBP (TAF). In vitro, il complesso
TFIIB TFIID-TATA box costituisce il sito di legame per
l’aggiunta in sequenza di altri fattori di tra-
scrizione. Inizialmente, si legano TFIIA e poi
TFIIB, seguiti dalla RNA polimerasi II e da TFIIF,
per formare il complesso minimo d’inizio della
trascrizione. (La RNA polimerasi II, come tutte
le RNA polimerasi eucariote, non può riconosce-
TATA box re direttamente gli elementi del promotore
TFIIF e legarvisi.) In seguito, si legano TFIIE e TFIIH
per formare il complesso d’inizio della trascrizio-
ne completo, chiamato anche complesso di pre-
inizio (PIC). A questo punto, l’attività di elicasi
di TFIIH srotola il DNA del promotore, e la tra-
scrizione può iniziare.

RNA polimerasi II RNA polimerasi II

La struttura e la produzione
Complesso
minimo d’inizio degli mRNA eucarioti
della trascrizione
TATA box Nelle cellule procariote e in quelle eucariote
TFIIE gli mRNA maturi, biologicamente attivi, sono
costituiti da tre parti principali (Figura 5.8):
TFIIH (1) una regione non tradotta al 5„ (5„
UnTranslated Region o 5„ UTR, chiamata
anche sequenza leader) all’estremità 5′; (2) la
sequenza che codi-
RNA polimerasi II fica per la protei- nimazione
na, che specifica la La produzione
Complesso d’inizio
della trascrizione
sequenza degli am- dell’mRNA MyLab
completo (= complesso minoacidi di una negli eucarioti
di pre-inizio)
TATA box proteina durante la
traduzione; e (3) una sequenza non tradotta
al 3„ (3„ UTR, chiamata anche sequenza trai-
sul promotore avviene secondo un ordine sequenziale, in ler). La sequenza 3′ UTR può contenere informazioni
vivo la situazione è meno chiara. Alcuni dati indicano che determinano la stabilità di quel particolare mRNA
che il complesso d’inizio prende contatto con il promo- (vedi Capitolo 18).
tore come un complesso unico. In ogni caso, l’inizio del- La produzione dell’mRNA è diversa nei batteri e ne-
la trascrizione in vivo è chiaramente più complicato a gli eucarioti. Nei batteri (Figura 5.9a), il trascritto di
causa dell’organizzazione del cromosoma in nucleosomi RNA funziona direttamente come molecola di mRNA;
(questo aspetto verrà affrontato nel Capitolo 18). la sequenza di coppie di basi di un gene batterico è cioè
colineare con quella dell’mRNA tradotto. Inoltre, dal
momento che i batteri sono privi di nucleo, un mRNA
Attività inizia a essere tradotto sui ribosomi prima che la sua tra-
Sul sito web dedicato agli studenti, scoprite scrizione sia stata completata; questo processo viene
come mutazioni in diverse regioni del gene della chiamato accoppiamento di trascrizione e traduzione.
β-globina influenzino la trascrizione dell’mRNA e
Negli eucarioti (Figura 5.9b), l’RNA trascritto (il pre-
MyLab
la produzione della β-globina nella iAttività
Investigating Transcription in Beta-Thalassemia
mRNA) viene modificato nel nucleo durante il processa-
Patients (Studiare la trascrizione nei pazienti af- mento dell’RNA per produrre un mRNA maturo. Inoltre,
fetti da beta-talassemia). prima di essere tradotto l’mRNA deve migrare dal nu-
cleo al citoplasma (dove si trovano i ribosomi). Quindi,
82 Capitolo 5

mRNA 5¢ 3¢ Figura 5.8


Struttura generale dell’mRNA presente
Regione non Sequenza che codifica Regione non sia nei batteri sia nelle cellule eucariote.
tradotta al 5¢ per la proteina tradotta al 3¢
(5¢ UTR) (3¢ UTR)
Inizio Fine
della traduzione della traduzione

un mRNA eucariote viene sempre trascritto completa- alcuni virus animali contengono sequenze interne che
mente, e poi processato, prima di essere tradotto. non sono espresse come sequenze di amminoacidi delle
Un’altra differenza fondamentale fra mRNA batterici proteine da essi codificate. In seguito, lo stesso fenomeno
ed eucarioti consiste nel fatto che gli mRNA batterici so- fu osservato negli eucarioti. Sappiamo ora che, negli eu-
no spesso policistronici, cioè contengono l’informazione carioti in generale, i geni che codificano per proteine con-
per codificare gli amminoacidi di più di un gene, mentre tengono di solito sequenze che non codificano per ammi-
gli mRNA eucarioti sono di solito monocistronici, cioè noacidi, chiamate introni, interposte fra le altre sequenze
contengono l’informazione per codificare un solo gene. Il che si trovano nell’mRNA, gli esoni. Il termine introne
sistema eucariote permette più livelli successivi di con- deriva infatti da intervening sequence (letteralmente, “se-
trollo dell’espressione genica, il che è particolarmente quenza interposta”) – cioè una sequenza che non viene
importante in organismi multicellulari, più complessi. tradotta in una sequenza di amminoacidi – e il termine
esone deriva da expressed sequence (letteralmente, “se-
Produzione dell’mRNA maturo negli eucarioti A dif- quenza espressa”). Gli esoni comprendono le sequenze
ferenza degli mRNA batterici, gli mRNA eucariotici ven- UTR in 5′ e in 3′, e le regioni che codificano per gli am-
gono modificati a entrambe le estremità, 5′ e 3′. Inoltre, minoacidi. Durante il processamento del pre-mRNA per
una scoperta particolarmente interessante nella storia del- formare la molecola di mRNA matura, gli introni vengo-
la genetica molecolare si ebbe nel 1977, quando Richard no rimossi. Roberts e Sharp hanno ricevuto nel 1993 il
Roberts, Tom Broker, e Louie Chow – e, separatamente, Premio Nobel per la Fisiologia o Medicina per le loro
Philip Sharp e Susan Berger – dimostrarono che i geni di scoperte indipendenti dei geni dotati di introni.
Figura 5.9
Processi necessari per la sintesi di un mRNA funzionale della traduzione. (b) Negli eucarioti, il trascritto primario
nei batteri e negli eucarioti. (a) Nei batteri, l’mRNA sinte- di RNA è una molecola di mRNA precursore (pre-mRNA),
tizzato dalla RNA polimerasi non deve subire una matura- che viene processato nel nucleo attraverso l’aggiunta
zione prima di essere tradotto dai ribosomi. Inoltre, dato di un cappuccio all’estremità 5’ e di una coda di poli(A)
che non c’è una membrana nucleare, la traduzione del- all’estremità 3’, e la rimozione degli introni. La traduzione
l’mRNA può avere inizio mentre la trascrizione è ancora in può avvenire solo quando l’mRNA maturo sia stato
corso, determinando l’accoppiamento della trascrizione e trasportato nel citoplasma.
a) Batterio b) Eucariote

DNA

Nucleo

RNA polimerasi
mRNA precursore
(pre-mRNA)


5¢ RNA
polimerasi
.. .
AAA.
Processamento A..
(cappuccio in 5¢, AA
coda di poli(A) in 3¢,
rimozione degli introni)

mRNA
..
A.


AA

Polipeptide
sintetizzato

Ribosoma Citoplasma
Espressione genica: la trascrizione 83

Modifica all’estremità 5„ Quando l’RNA polimerasi II O


+ CH3 Gruppo
ha sintetizzato circa 20-30 nucleotidi di pre-mRNA, l’e- N metilico
HN
stremità 5′ dell’mRNA viene modificata dall’aggiunta di
un cappuccio (cap). La formazione del cappuccio consi-
H2N N
ste nell’aggiunta, da parte di un enzima specifico, di un Nucleotide N
guanina
nucleotide guaninico – più comunemente una 7-metil 5¢ CH
2 O
guanosina (m7G) – all’estremità 5′ mediante un legame 4¢ 1¢
insolito 5′-5′, anziché un legame 5′-3′ (Figura 5.10). Il 3¢ 2¢

processo viene chiamato capping al 5„. Anche gli zuc- OH OH


cheri dei due nucleotidi successivi vengono modificati
O Inizio dell’mRNA
per metilazione. Il cappuccio al 5′ rimane durante tutto il
processamento del pre-mRNA ed è presente nell’mRNA O P O–
maturo, che viene così protetto dalla degradazione da O
parte delle esonucleasi grazie al legame insolito 5′-5′. Il
O P O–
cappuccio al 5′ è importante anche per legare il ribosoma
O
nella fase iniziale della traduzione.
O P O–
Modifica all’estremità 3„ La maggior parte dei pre- O
mRNA eucarioti viene modificata all’estremità 3′ dal- 5¢
CH2
l’aggiunta di una sequenza di circa 50-250 nucleotidi ade- O A o G
ninici, chiamata coda di poli(A). Per la coda di poli(A) 4¢ 1¢
3¢ 2¢
non c’è un DNA stampo, ed essa rimane durante il pro-
O OCH3
cessamento del pre-mRNA per formare l’mRNA maturo. 5¢
Le molecole di mRNA con la coda di poli(A) all’estremi- O P O CH2
O
Gruppi
Base metilici
tà 3′ vengono chiamate mRNA poli(A)+. La coda di po- O– 4¢ 1¢
li(A) è necessaria perché l’mRNA possa essere esportato 3¢ 2¢

in maniera efficiente dal nucleo al citoplasma. Una volta O O CH3 o H

...
nel citoplasma, la coda di poli(A) protegge l’estremità 3′
dell’mRNA ostacolando una prematura degradazione da Figura 5.10
parte delle esonucleasi. La coda di poli(A) ha anche un Struttura del cappuccio all’estremità 5’ di un mRNA eucario-
ruolo importante nell’inizio della traduzione da parte dei te. Il cappuccio è prodotto dall’aggiunta di un nucleotide
guanina e di due gruppi metilici.
ribosomi, e nella regolazione della stabilità dell’mRNA.
L’aggiunta della coda di poli(A) definisce l’estremi-
tà 3′ di un filamento di mRNA, ed è associata con la ter- fa parte dell’mRNA. I geni che codificano per proteine
minazione della trascrizione dei geni che codificano per non hanno sequenze di terminazione specifiche, come
proteine. L’aggiunta della coda di poli(A) viene segnala- avviene nei batteri. (I geni eucarioti trascritti dall’RNA
ta quando la trascrizione dell’mRNA oltrepassa un sito polimerasi I e III hanno invece terminatori specifici.)
chiamato sito poli(A) (sito di poliadenilazione), che si Come avviene allora la terminazione dopo il sito
trova circa 10-30 nucleotidi a valle della sequenza con- poli(A)? Sono stati proposti numerosi modelli. Secondo
senso di poliadenilazione 5′-AAUAAA-3′. A questo uno di essi, un’esonucleasi 5′-3′ si lega all’RNA dopo il
punto una serie di proteine, fra le quali la proteina CPSF sito poli(A), e ne inizia la degradazione. Quando rag-
(Cleavage and Polyadenylation Specificity Factor o fat- giunge l’RNA polimerasi II, la degradazione stimola in
tore di specificità per il taglio e la poliadenilazione), la qualche modo la terminazione della trascrizione, proba-
proteina CstF (Cleavage stimulation Factor o fattore di bilmente destabilizzando il complesso enzima-fattori di
stimolazione del taglio) e due fattori di taglio (cleavage trascrizione-DNA.
factor protein), CFI e CFII, si legano all’RNA e lo taglia-
no in corrispondenza del sito poli(A) (Figura 5.11a). In Gli introni I pre-mRNA contengono spesso un certo nu-
seguito, l’enzima poli(A) polimerasi (PAP), legato al mero di introni. Per produrre un mRNA maturo, che pos-
CPSF, catalizza l’aggiunta di nucleotidi A all’estremità sa essere tradotto nel polipeptide codificato dal gene, gli
3′ dell’RNA, usando come substrato l’ATP, per formare introni devono essere escissi da ciascun pre-mRNA. La
la coda di poli(A). Non appena la coda di poli(A) sia sta- molecola di mRNA maturo contiene quindi le sequenze
ta sintetizzata, viene legata da molecole della proteina degli esoni del gene, contigue le une alle altre e non più
che lega il poli(A) (PABII). separate dalle sequenze degli introni.
Nel frattempo, l’RNA polimerasi II sta ancora sinte- Quando gli introni furono scoperti, i ricercatori sape-
tizzando l’RNA, anche se, ovviamente, questo RNA non vano che il nucleo conteneva un gran numero di moleco-
84 Capitolo 5

a) Taglio del pre-mRNA Figura 5.11


Schema della formazione dell’estremità 3’ dell’mRNA e del-
Pre-mRNA
l’aggiunta della coda di poli(A) nei mammiferi. Negli euca-

rioti, la formazione dell’estremità 3’ di un mRNA viene pro-
AAUA
AA
dotta dal taglio della catena di RNA nascente. (a) Taglio della
catena di pre-mRNA. CPSF si lega al segnale AAUAAA, e CstF
CPSF
si lega a una sequenza ricca in GU o in U (GU/U) a valle del
sito poli(A). CPSF e CstF si legano anche fra di loro, formando
un’ansa nell’RNA. CFI e CFII si legano all’RNA e lo tagliano. (b)
Taglio
CstF Aggiunta della coda di poli(A). La poli(A) polimerasi aggiunge
CFI la coda di poli(A) alla quale si legano proteine specifiche.
GU/U
CFII

RNA polimerasi

DNA
Sintesi
b) Aggiunta della coda di poli(A) dell’RNA

Pre-mRNA

AAUA 3¢
AA
PAP
CPSF
AAAAAAA

Coda di
poli(A) che viene
PABII

Taglio sintetizzata
CstF
AAA

CFI PABII
AA

A
AA
A

GU/U AAAAA
CFII

RNA polimerasi

DNA
Sintesi
dell’RNA

le di RNA di varie dimensioni, note come RNA nuclea- zione del gene produceva un pre-mRNA di 1,5 kb, con-
ri eterogenei (hnRNA), e fu proposto, correttamente, tenente sia le sequenze degli esoni sia quella dell’intro-
che le molecole di pre-mRNA facessero parte degli ne. Questo RNA si trova solo nel nucleo. La sequenza
hnRNA. Nel 1978 il gruppo di Philip Leder studiava il dell’introne viene eliminata nel corso del processamen-
gene della β-globina in cellule di topo in coltura. Questo to, e le regioni degli esoni adiacenti vengono unite a for-
gene codifica per la β-globina, un polipeptide di 146 am- mare un mRNA maturo. (Ricerche successive hanno di-
minoacidi che fa parte della molecola dell’emoglobina. I mostrato che il gene della β-globina contiene in realtà
ricercatori isolarono una molecola di hnRNA da 1,5 kb, due introni; il secondo introne, più piccolo, non era stato
che era il pre-mRNA della β-globina. Come l’mRNA individuato nella ricerca precedente.)
maturo di 0,7 kb, il pre-mRNA ha un cappuccio all’estre- Al tempo di questa scoperta, gli scienziati ritenevano
mità 5′, e una coda di poli(A) all’estremità 3′. Il gruppo che la sequenza di un gene fosse completamente colinea-
di Leder dimostrò che il pre-mRNA da 1,5 kb è colinea- re con la sequenza di amminoacidi della proteina da esso
re con il gene che lo codifica, mentre non lo è l’mRNA codificata. Scoprire che i geni potevano essere frammen-
da 0,7 kb della β-globina. L’interpretazione di questi ri- tati fu quindi una grossa sorpresa. Si è trattato di una di
sultati data dagli scienziati fu che il gene della β-globina quelle scoperte estremamente significative che hanno
avesse un introne di circa 800 coppie di basi. La trascri- cambiato il nostro modo di vedere i geni. Negli anni suc-
Espressione genica: la trascrizione 85

cessivi alla scoperta degli introni, abbiamo appreso che teine. I cinque snRNA principali sono U1, U2, U4, U5 e
molti geni eucarioti contengono introni. Gli introni sono U6; ciascuno di essi è associato a un certo numero di pro-
invece rari nei procarioti, dove li si trova solo in alcuni teine per formare le snRNP. Gli snRNA U4 e U6 si tro-
geni per tRNA ed rRNA. vano insieme nella stessa snRNP (snRNP U4/U6), e gli
altri si trovano ciascuno in una snRNP propria. Ci sono
almeno 105 copie per cellula di ogni tipo di snRNP.
Nota chiave La Figura 5.13 mostra un modello semplificato dei
I trascritti dei geni che codificano per proteine sono vari passaggi dello splicing di due esoni separati da un
gli RNA messaggeri o i loro precursori. Queste mo- introne.
lecole sono lineari e mostrano un’ampia variabilità
di lughezza a seconda della dimensione del poli- 1. La snRNP U1 si lega al sito di splicing al 5′ dell’in-
peptide che specificano e della presenza o meno di trone. Questo legame è il risultato dell’appaiamento
introni. Gli mRNA procarioti non vengono modifi- fra l’snRNA U1 della snRNP e la sequenza del sito di
cati una volta trascritti, mentre molti mRNA euca- giunzione al 5′.
rioti vengono modificati dall’aggiunta di un cap- 2. La snRNP U2 si lega a una sequenza chiamata se-
puccio all’estremità 5’ e di una coda di poli(A) all’e- quenza del punto di ramificazione, situata a monte
stremità 3’. Molti pre-mRNA eucarioti contengono del sito di splicing al 3′. Questo legame avviene gra-
introni, che devono essere escissi dal trascritto di zie all’appaiamento tra le basi dell’snRNA U2 della
mRNA per formare una molecola di mRNA matura snRNP e la sequenza del punto di ramificazione.
e funzionale. I segmenti separati dagli introni sono 3. Una snRNP U4/U6 e una snRNP U5 interagiscono, e
chiamati esoni. così associate si legano alle snRNP U1 e U2, deter-
minando il ripiegamento dell’introne e posizionando
i suoi due siti di splicing vicini l’uno all’altro.
Processo di maturazione del pre-mRNA La produzione 4. La snRNP U4 si dissocia, e si ha la formazione dello
di RNA messaggeri dai geni con introni prevede la tra- spliceosoma attivo.
scrizione del gene da parte dell’RNA polimerasi II, l’ag- 5. Le snRNP nello spliceosoma tagliano l’introne dal-
giunta del cappuccio in 5′ e l’esone 1 a livello del sito di splicing in 5′, e l’estre-
nimazione della coda di poli(A) per pro- mità 5′ dell’introne, ora libera, si lega a uno specifico
Splicing durre la molecola di pre- nucleotide A nella sequenza del punto di ramificazio-
MyLab dell’RNA mRNA, e il processo di ma- ne. A causa della sua somiglianza con il lazo dei
turazione del pre-mRNA nel cowboy, la struttura risultante è chiamata struttura di
nucleo per rimuovere gli introni e unire gli esoni fra di RNA a lazo (lariat). Il punto di ramificazione nel-
loro per formare l’mRNA maturo (Figura 5.12). l’RNA che produce questa struttura comprende un
Un tipico introne inizia con la sequenza 5′-GU, e fi- insolito legame fosfodiesterico 2′-5′, fra l’ossidrile in
nisce con AG-3′, anche se per specificare la giunzione 2′ dell’adenosina nella sequenza del punto di ramifi-
fra un introne e un esone sono
necessari più nucleotidi. Nel nu- Sequenza che codifica per l’RNA
cleo, gli introni del pre-mRNA
vengono rimossi, e gli esoni DNA
uniti, mediante il processo di
splicing (taglio) dell’mRNA. Promotore Trascrizione da parte dell’RNA polimerasi II.
Il cappuccio in 5¢ viene aggiunto quando sono
Gli eventi dello splicing hanno stati sintetizzati 20-30 nucleotidi del pre-mRNA.
Aggiunta della coda di poli(A) in 3¢.
luogo in un complesso chiamato
spliceosoma, formato dal pre- Cappuccio Esone Introne Esone Introne Esone Coda di poli(A)
mRNA legato a piccole parti-
Pre-mRNA 5¢ AAAAAAA...3¢
celle nucleari ribonucleopro-
teiche (snRNP). Le snRNP so- 5¢ UTR Splicing dell’RNA: 3¢ UTR
rimozione
no costituite da piccoli RNA nu- degli introni
cleari (snRNA) associati a pro- Sequenza che codifica per la proteina

mRNA 5¢ AAAAAAA...3¢
Figura 5.12 Traduzione
Sequenza delle fasi di formazione
dell’mRNA eucariote. Non tutte le
Polipeptide
fasi sono necessarie per tutti gli
mRNA.
86 Capitolo 5

Adenina del punto di ramificazione Figura 5.13


RNA
Modello della rimozione di un introne da parte dello spli-
5¢ Esone 1 GU Introne A AG Esone 2 3¢
ceosoma. All’estremità 5’ di un introne c’è la sequenza GU
Giunzione Giunzione e all’estremità 3’ la sequenza AG. Vicino all’estremità 3’
di splicing in 5¢ U1 di splicing in 3¢ dell’introne c’è un nucleotide A localizzato nella sequenza
L’snRNP U1 si lega
del punto di ramificazione, che nei mammiferi è YNCURAY,
all’estremità 5¢ dell’introne
dove Y = pirimidina, N = qualsiasi base, R = purina e A =
5¢ GU A AG 3¢ adenina, e nel lievito è UACUAAC (la A in corsivo nelle due
U1 sequenze è la base alla quale si lega l’estremità 5’ dell’in-
U2 trone). Con l’aiuto delle snRNP, la rimozione dell’introne
L’snRNP U2 si lega inizia con un taglio a livello della prima giunzione esone-
al punto di ramificazione introne. La G all’estremità 5’ libera dell’introne si ripiega
U2
5¢ GU A AG 3¢ su se stessa e forma un legame insolito 2’-5’ con la A della se-
U1 quenza del punto di ramificazione. Questa reazione produce
un intermedio a forma di lazo. La rimozione dell’introne
U5 è completata dal taglio alla giunzione introne-esone in 3’
e dalla ligazione dei due esoni.

U6 U6 U6
U5
U4 U4 Nelle varie fasi dello splicing, le snRNP agiscono attra-
U4
verso interazioni RNA-RNA, RNA-proteina e proteina-
5¢ proteina. Esempi di interazioni RNA-RNA sono quelle
Le snRNP U4/U6 e U5 U1
si legano a U1 e U2 UG
fra l’snRNA U1 e l’RNA al sito di splicing in 5′, fra
e si forma un’ansa U4 U6 U5 Gli esoni l’snRNA U2 e l’RNA della sequenza del punto di ramifi-
vengono
L’estremità 5 ¢ U2 cazione, e fra l’snRNA U6 e l’snRNA U2. Il Box 5.1 ri-
uniti
dell’introne si lega A AG 3¢
alla A del punto di ramificazione
assume i risultati di alcuni studi di mutazioni che hanno
e forma una struttura a lazo permesso di individuare le interazioni RNA-RNA.
U4 Nel Capitolo 18 si vedrà che lo splicing è un processo
L’snRNP U4 viene rilasciata
regolato e che, in alcuni casi, dallo stesso gene vengono
prodotti mRNA differenti mediante un processo chiama-
Spliceosoma attivo 5¢
U1 to splicing alternativo. Una conseguenza dello splicing
UG
U6
alternativo è che dallo stesso gene possono essere prodot-
U5 ti polipeptidi differenti. Questi polipeptidi avranno regio-
U2
A AG 3¢ ni di similarità, ma non saranno identici; avranno cioè
Splicing funzioni diverse. Per esempio, le proteine del muscolo
prodotte attraverso lo splicing alternativo potranno avere
Esone 1 Esone 2 U2 U1 un funzionamento ottimale in tessuti diversi, come il mu-
mRNA maturo Introne U6 scolo cardiaco, il muscolo liscio, e così via.
U5
GU

A AG Accoppiamento della maturazione del pre-mRNA alla


L’introne escisso a forma trascrizione e all’esportazione dell’mRNA dal nucleo
di lazo forma ancora
un complesso con le snRNP Ricerche effettuate negli ultimi anni hanno dimostrato
che l’espressione di un gene eucariote che codifica per
una proteina – dalla trascrizione fino alla produzione di
snRNP una proteina funzionale – è un processo continuo, piut-
Introne
RNA intronico U1 tosto che una serie di eventi indipendenti. I risultati
GU

rilasciato
a forma di lazo 5¢ U5 fondamentali a sostegno di questa visione comprendo-
A AG 3¢ no il fatto che le proteine responsabili delle varie fasi
U2 U6
del processo sono collegate dal punto di vista funziona-
le e, talvolta, strutturale; e che la regolazione del pro-
cazione e il gruppo fosfato in 5′ della guanosina all’e- cesso avviene a livello di fasi diverse. Inoltre, è partico-
stremità dell’introne. La A mantiene il legame nor- larmente importante il fatto che l’apparato coinvolto
male 3′-5′ con i nucleotidi adiacenti dell’introne. nel processo sia conservato nell’evoluzione, dal lievito
6. Successivamente, lo spliceosoma elimina l’introne all’uomo. In breve, per l’espressione di un gene euca-
(ancora in forma di lazo), tagliandolo in corrispon- riote che codifica per una proteina, la trascrizione è ac-
denza del sito di giunzione in 3′, e infine unisce gli coppiata alla maturazione del pre-mRNA, che a sua
esoni 1 e 2. A questo punto le snRNP vengono rila- volta è accoppiata all’esportazione dell’mRNA dal nu-
sciate. Il processo viene ripetuto per ogni introne. cleo attraverso i pori nucleari.
Espressione genica: la trascrizione 87

Box 5.1 Identificazione attraverso l’analisi mutazionale


delle interazioni RNA-RNA nello splicing del pre-mRNA
Dal punto di vista concettuale, è stato semplice di- stabilire un legame molto più debole con le mole-
mostrare che le interazioni RNA-RNA erano impor- cole di snRNA rispetto alle sequenze normali. Una
tanti nello splicing dell’RNA attraverso l’isolamento conferma sperimentale delle interazioni fra gli
di mutazioni geniche difettive nello splicing del snRNA e le sequenze di RNA degli introni è venuta
pre-mRNA. Molti di questi mutanti avevano altera- dall’ottenimento di snRNA mutanti che ripristinava-
zioni delle sequenze introniche critiche per lo spli- no un legame forte. La sequenza di splicing mutan-
cing del pre-mRNA, cioè a livello dei siti di splicing te veniva cioè usata per disegnare snRNA con muta-
al 5’ e al 3’, e della sequenza del punto di ramifica- zioni compensative specifiche, in modo che il lega-
zione. (Questi mutanti hanno aiutato a stabilire il me dell’snRNA mutante con la sequenza di splicing
ruolo di queste sequenze nello splicing del pre- mutante fosse forte come quello dell’snRNA nor-
mRNA.) I ricercatori ipotizzarono che per il ricono- male con la sequenza di splicing normale. Nei mu-
scimento delle tre sequenze fossero importanti gli tanti compensativi l’attività di splicing del gene mu-
snRNA delle snRNP. Questa ipotesi è sostenuta da tante era ripristinata, e questo forniva l’evidenza
modelli secondo i quali i mutanti con alterazioni funzionale dell’importanza di interazioni specifiche
nelle sequenze di splicing dovrebbero, in teoria, RNA-RNA nello splicing del pre-mRNA.

sa eliminazione. Il processo, chiamato auto-splicing, è


Nota chiave stato scoperto nel 1982 da Tom Cech e dal suo gruppo di
ricerca. Per questa scoperta, Cech ha ricevuto il Premio
Gli introni vengono rimossi dal pre-mRNA in una se-
Nobel per la Chimica nel 1989.
rie ben definita di passaggi. La rimozione degli intro-
La Figura 5.14 mostra uno schema della reazione di
ni inizia con il taglio del pre-mRNA a livello del sito
auto-splicing dell’introne di gruppo I nel pre-rRNA di
di giunzione al 5’. L’estremità 5’ libera dell’introne si
Tetrahymena. Il processo si svolge nel modo seguente:
ripiega su se stessa, e si lega a un sito a monte del si-
to di splicing al 3’. Il taglio in corrispondenza di que-
1. il pre-rRNA viene tagliato a livello del sito di spli-
sto sito di giunzione rilascia l’introne, che ha assunto
cing al 5′ e viene aggiunta una guanosina all’estremi-
una forma a lazo. Una volta escisso l’introne, gli eso-
tà 5′ dell’introne;
ni che lo fiancheggiavano vengono uniti insieme. La
2. l’introne viene tagliato a livello del sito di splicing
rimozione degli introni dal pre-mRNA eucariote ha
al 3′;
luogo nel nucleo, in complessi chiamati spliceosomi,
3. i due esoni vengono uniti;
che sono costituiti da numerose snRNP legate in ma-
4. l’introne escisso circolarizza e forma una molecola a
niera specifica a ciascun introne. La maturazione del
lazo, che viene tagliata per produrre un RNA circola-
pre-mRNA negli eucarioti è accoppiata sia alla tra-
re e un corto frammento di RNA lineare.
scrizione, sia all’esportazione dell’mRNA dal nucleo,
come parte di un processo continuo di espressione di
L’attività di auto-splicing della sequenza di RNA del-
un gene che codifica per una proteina.
l’introne non rientra nella definizione di un’attività enzi-
matica. Ovvero, anche se l’RNA svolge la reazione, esso
non viene rigenerato nella sua forma originaria alla fine
Auto-splicing (self-splicing) degli introni della reazione stessa, come avviene con gli enzimi pro-
In alcune specie di protozoi ciliati del genere Te- teici. È stato possibile produrre in laboratorio forme mo-
trahymena, il gene per l’rRNA 28S, che si trova nella dificate dell’RNA dell’introne di Tetrahymena e di altri
subunità maggiore del ribosoma (vedi Capitolo 6), è in- RNA capaci di auto-splicing in grado di funzionare in
terrotto da un introne di 413 paia di basi. La trascrizione modo catalitico. Questi RNA enzimatici sono chiamati
di questo gene produce un pre-rRNA analogo a una mo- ribozimi; essi sono utili dal punto di vista sperimentale,
lecola di pre-mRNA, nel senso che l’introne deve essere per tagliare molecole di RNA in corrispondenza di se-
eliminato per produrre un rRNA funzionale. L’escis- quenze specifiche.
sione di questo introne – chiamato oggi introne di grup- L’auto-splicing dell’introne del pre-rRNA di
po I – avviene mediante una reazione indipendente da Tetrahymena è stato il primo esempio di quello che oggi
proteine nella quale l’RNA dell’introne si ripiega a for- si chiama auto-splicing degli introni di gruppo I. Gli in-
mare una struttura secondaria che promuove la sua stes- troni del gruppo I sono rari. Altri introni di gruppo I che
88 Capitolo 5

Figura 5.14 Pre-rRNA di Tetrahymena per l’rRNA 28S


La reazione di auto-splicing per gli introni 413 nucleotidi
di gruppo I nel pre-rRNA di Tetrahymena. Esone 1 Introne Esone 2
5¢ A G 3¢
Taglio alla giunzione di splicing in 5¢ e
mostrano auto-splicing sono stati trovati in aggiunta di una G all’estremità 5¢ dell’introne
geni nucleari per rRNA, in alcuni geni mito- Esone 1 Introne Esone 2
condriali che codificano per proteine, e in al- 5¢ 3¢ + 5¢ G A G 3¢
cuni geni di batteriofagi che codificano per Taglio alla giunzione di splicing in 3¢
tRNA e proteine. Un’altra classe di introni ca- Ligazione degli esoni
Rilascio dell’introne
paci di auto-splicing è quella degli introni di Esone 1 Esone 2
gruppo II. Questi introni, che usano per l’au- 5¢ 3¢ + 5¢ G A G 3¢
to-splicing un meccanismo molecolare diver- rRNA 28S
Circolarizzazione
so da quello degli introni di gruppo I, si trova- dell’introne
no in alcuni geni dei batteri e degli organelli
G A
di protisti, funghi, alghe, e piante.

G
La scoperta che l’RNA può funzionare
Il taglio dell’introne
come una proteina è stata una pietra miliare produce un frammento
della biologia, e ha rivoluzionato le teorie lineare e uno circolare
sull’origine della vita. Le teorie precedenti
proponevano infatti che per la replicazione

G
delle prime molecole di acidi nucleici fosse- G A +
ro necessarie le proteine. L’attuale ipotesi
del mondo a RNA propone invece che una
forma di vita basata sull’RNA, nella quale l’RNA avreb- risultante avrà quindi una sequenza di basi che non cor-
be svolto le reazioni catalitiche necessarie per la vita nel- risponde alla sequenza di coppie di basi del DNA che la
la cellula primitiva, fungendo nello stesso tempo da mo- codifica.
lecola custode dell’informazione gentica, abbia precedu- La correzione dell’RNA è stata scoperta a metà degli
to quella attuale, basata sul DNA. anni ottanta del secolo scorso in alcuni mRNA mitocon-
driali dei tripanosomi, i protozoi parassiti che causano la
malattia del sonno. Per esempio, nella Figura 5.15 sono
Nota chiave riportate le sequenze del gene COIII, che codifica per la
In alcuni RNA precursori, esistono sequenze introni- subunità III della citocromo ossidasi, e dei suoi trascritti
che di RNA che si ripiegano in una struttura secon- di mRNA, nei protozoi Trypanosoma brucei (Tb),
daria in grado di eliminarsi da sola, in un processo Crithridia fasciculata (Cf), e Leishmania tarentolae (Lt).
chiamato auto-splicing. La reazione di auto-splicing Sebbene le sequenze degli mRNA siano molto simili fra
non richiede l’intervento di proteine. i tre organismi, solo le sequenze geniche di Cf e Lt sono
colineari con gli mRNA corrispondenti. Sorprenden-
temente, il gene di Tb ha una sequenza che non può pro-
Correzione (editing) dell’RNA durre l’mRNA per il quale esso apparentemente codifi-
La correzione dell’RNA consiste nell’inserzione o nel- ca. Le differenze fra i due consistono nella presenza
la delezione post-trascrizionale di nucleotidi, o nella nell’mRNA di nucleotidi U che non sono codificati nel
conversione di una base in un’altra. La molecola di RNA DNA, e di nucleotidi T nel DNA che non si trovano nel

Regione del trascritto del gene COIII

DNA di Tb G G T T T T T GG A GG G GT T T TG G G A A GA GAG
RNA di Tb u u G u G U U U U U GG u u u A GG u u u u u u u G u u G UUG u u G u u u u G u A u u A u GA u u GAG u
DNA di Cf T T T T T A T T T T GA T T T CG T T T T T T T T T A T G T G T A T T A T T T G T GC T T T GA T CCGC T
DNA di Lt T T T T T A T T T T GA T T T CG T T T T T T T T T A T G T G T T T T A T T T A T G T T A T G A G T A GG A

Proteina di Tb Leu Cys Phe Trp Phe Arg Phe Phe Cys Cys Cys Cys Phe Val Leu Trp Leu Ser

Figura 5.15
Confronto delle sequenze del DNA del gene per la subunità I nucleotidi U aggiunti al trascritto dalla correzione dell’RNA
III della citocromo ossidasi (COIII) nei protozoi Trypanosoma sono indicati con le lettere minuscole (u). Le T nel DNA
brucei (Tb), Crithridia fasciculata (Cf) e Leishmania stampo di Tb che non sono presenti nel trascritto sono
tarentolae (Lt), allineate con l’mRNA conservato di Tb. indicate in marrone.
Espressione genica: la trascrizione 89

trascritto. Una volta sintetizzato, il trascritto del gene La correzione dell’RNA non è limitata ai tripanosomi.
COIII di Tb viene sottoposto a correzione per aggiunge- Nel micomicete Physarum polycephalum singoli nu-
re nucleotidi U nelle posizioni appropriate, e rimuovere i cleotidi C vengono aggiunti, dopo la trascrizione, in
nucleotidi U codificati dai nucleotidi T del DNA. Come molte posizioni in numerosi trascritti di mRNA mitocon-
indicato nella figura, le inserzioni di nucleotidi U sono driale. Nelle piante superiori, le sequenze di molti
molto numerose. L’entità dei cambiamenti è ancora più mRNA mitocondriali e cloroplastici vengono corrette at-
evidente quando si esamini l’intera sequenza: più del traverso cambiamenti da C a U. La sostituzione di C con
50% dell’mRNA maturo è costituito da nucleotidi U ag- U è coinvolta anche nella formazione di un codone d’ini-
giunti dopo la trascrizione. Questo processo di correzio- zio AUG a partire dal codone ACG in alcuni mRNA clo-
ne dell’RNA deve essere accurato, in modo da ricostrui- roplastici in numerose piante superiori. Nei mammiferi,
re la sequenza appropriata per la traduzione della protei- la correzione da C a U si verifica nell’mRNA codificato
na. In questo processo è coinvolta una molecola speciale dal gene nucleare per l’apolipoproteina B, e determina la
di RNA, chiamata RNA guida (gRNA). Il gRNA si ap- formazione tessuto-specifica di un codone di stop.
paia con il trascritto di mRNA e lo taglia, fungendo quin- Sempre nei mammiferi, una correzione da A a G ha luo-
di da stampo per i nucleotidi U mancanti, e riunendo go nell’mRNA del recettore del glutammato, e in nume-
nuovamente insieme il trascritto mediante ligazione. rosi tRNA si ha correzione delle pirimidine.

Sommario
l La trascrizione è il processo nel quale l’informazione gene- zio, quindi, i fattori generali di trascrizione si legano per pri-
tica del DNA viene copiata nella sequenza di basi del- mi e poi reclutano l’RNA polimerasi per formare un com-
l’RNA. Il DNA si srotola in una corta regione vicino a un plesso. Altri fattori di trascrizione si legano in seguito e la
gene, e una RNA polimerasi catalizza la sintesi di una mo- trascrizione può cominciare.
lecola di RNA in direzione 5′-3′. Solo un filamento della l Gli mRNA hanno tre parti principali: una regione non-tra-
molecola di DNA a doppia elica viene trascritto in una mo- dotta al 5′ (UTR), la sequenza che codifica per gli ammi-
lecola di RNA. noacidi, e la regione non tradotta al 3′.
l La trascrizione delle quattro classi principali di geni produ- l Nei procarioti, il trascritto genico funziona direttamente
ce gli RNA messaggeri (mRNA), gli RNA transfer (tRNA), come molecola di mRNA, mentre negli eucarioti l’RNA
gli RNA ribosomali (rRNA) e i piccoli RNA nucleari trascritto deve essere modificato nel nucleo per produrre
(snRNA). Gli snRNA si trovano unicamente negli eucario- l’mRNA maturo. Le modifiche comprendono l’aggiunta
ti, mentre le altre tre classi si trovano sia nei procarioti sia di un cappuccio all’estremità 5′ e di una coda di poli(A) al-
negli eucarioti. Solo l’mRNA viene tradotto per produrre l’estremità 3′, e la rimozione degli introni. La rimozione
una proteina. degli introni e l’unione degli esoni vengono effettuate da-
l In E. coli, per l’inizio della trascrizione dei geni che codifi- gli spliceosomi, grazie a interazioni specifiche di snRNP
cano per proteine è necessario che un complesso costituito con il pre-mRNA. L’mRNA potrà funzionare solo quando
dall’RNA polimerasi e dal fattore sigma si leghi al promo- tutte le fasi della maturazione siano state completate; a
tore. Una volta iniziata la trascrizione, il fattore sigma si dis- quel punto, una volta esportato dal nucleo, potrà essere
socia e la sintesi dell’RNA viene completata dal nucleo en- tradotto.
zimatico dell’RNA polimerasi. Il termine della trascrizione l In alcuni organismi dotati di introni, le sequenze del pre-
è segnalato da sequenze di DNA specifiche. mRNA si ripiegano a formare una struttura secondaria
l Nei batteri, un’unica RNA polimerasi sintetizza mRNA, che si elimina da sola, un processo chiamato auto-spli-
tRNA, ed rRNA. Gli eucarioti hanno tre RNA polimerasi cing. Questo processo non prevede l’intervento di enzimi
distinte, localizzate nel nucleo, ciascuna delle quali trascri- proteici.
ve differenti tipi di geni; l’RNA polimerasi I trascrive i ge- l In alcuni organismi, la correzione dell’RNA inserisce o eli-
ni per gli RNA ribosomali 18S, 5,8S, e 28S; l’RNA polime- mina nucleotidi, o converte una base in un’altra dopo la tra-
rasi II trascrive i geni per gli mRNA e alcuni geni per gli scrizione di un RNA. La molecola di RNA funzionale risul-
snRNA; e l’RNA polimerasi III trascrive i geni per gli tante ha una sequenza di basi che non corrisponde alla se-
rRNA 5S, i tRNA, e gli altri snRNA. quenza codificante del DNA. Molti degli RNA che subisco-
l Le RNA polimerasi eucariote sono incapaci di legarsi diret- no la correzione sono codificati dal genoma dei mitocondri
tamente ai promotori. Perché la trascrizione possa avere ini- e dei cloroplasti.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


D5.1 Due molecole di RNA che abbiano sequenze di basi pia elica, proprio come il DNA. Supponete che, in una partico-
complementari possono ibridare formando una struttura a dop- lare regione del genoma di un dato batterio, un filamento di
90 Capitolo 5

DNA venga trascritto per produrre l’mRNA per la proteina A, viene inserito nel DNA un nucleotide sbagliato, che non viene
e l’altro venga trascritto nell’mRNA per la proteina B. corretto dalla correzione di bozze o dai sistemi di riparazione
a. Pensate che ci sarebbero problemi nell’espressione di que- prima della replicazione successiva. Nell’evento 2, il nucleotide
sti geni? sbagliato viene inserito in un mRNA durante la trascrizione.
b. Che cosa succederebbe alla proteina B se una mutazione
avesse modificato la struttura della proteina A? R5.2 Assumendo che si verifichi in un gene, il risultato dell’e-
vento 1 sarebbe una mutazione. L’errore sarebbe ereditato dalle
R5.1 generazioni successive, e avrebbe effetto sulla struttura di tutte
a. L’mRNA A e l’mRNA B avrebbero sequenze comple- le molecole di mRNA trascritte da quella regione; quindi, tutte
mentari, quindi potrebbero ibridare l’uno con l’altro e non le molecole della proteina corrispondente potrebbero esserne in-
essere più disponibili per la traduzione. fluenzate.
b. Ogni mutazione nel gene A sarebbe anche una mutazione Il risultato dell’evento 2 sarebbe un solo mRNA aberrante, che
nel gene B, quindi anche la proteina B potrebbe essere potrebbe quindi produrre poche molecole proteiche aberranti.
anormale. Nella cellula ci sarebbero comunque altre molecole normali di
proteina, perché sarebbero stati trascritti altri mRNA normali.
D5.2 Confrontate i due eventi seguenti, prendendone in esame L’mRNA anormale verrebbe degradato rapidamente. L’errore a
le possibili conseguenze. Nell’evento 1, durante la replicazione livello dell’mRNA non sarebbe ereditario.
Espressione genica:
6 la traduzione
Qual è la composizione chimica Come inizia la sintesi polipeptidica
di una proteina? sul ribosoma?

Qual è la struttura di una proteina? Come viene allungata la catena polipeptidica


sul ribosoma?

Qual è la natura del codice genetico? Come termina la traduzione di un polipeptide


a partire da un RNA messaggero (mRNA)?

Quali sono la struttura e la funzione Come vengono smistate le proteine


dell’RNA transfer (tRNA)? nella cellula?

Quali sono la struttura e la funzione


dell’RNA ribosomale (rRNA)?

Attività peptide viene definita codice genetico. In questo capito-


Cambiare soltanto una lettera di una parola lo si acquisiranno informazioni circa la struttura delle
può cambiarne completamente il significato. Tale
proteine e le modalità con cui la sequenza nucleotidica di
azione può, a sua volta, modificare il senso della
un mRNA viene tradotta nella sequenza amminoacidica
frase che contiene la parola stessa. Negli organi-
smi viventi, una sequenza di tre nucleotidi (le di un polipeptide.
“lettere”) codifica per un amminoacido (la “paro-
la”). Gli amminoacidi sono uniti tra di loro a for- Le proteine
mare dei polipeptidi (le “frasi”); in questo capito-
lo verrà spiegato il processo mediante il quale le La struttura chimica delle proteine
“lettere” nucleotidiche vengono tradotte nelle Le proteine sono composti organici azotati ad alto peso
“frasi” polipeptidiche. molecolare dalla composizione e dalla forma complesse.
Una delle applicazioni più importanti della ricerca Una proteina è formata da una o più subunità macromo-
sul genoma umano è l’uso dell’informazione di lecolari dette polipeptidi, a loro volta formate da subuni-
sequenza per rintracciare le cause delle malattie
tà più piccole, gli amminoacidi. Ciascun tipo di cellula
genetiche. Nella iAttività di questo capitolo verrà
possiede un insieme di proteine caratteristico che si ren-
studiata parte del gene responsabile della fibrosi
cistica, la malattia genetica letale più comune ne- de responsabile delle proprietà funzionali di quella parti-
gli Stati Uniti, cercando di identificarne le possibili colare categoria cellulare.
cause. A eccezione della prolina, tutti gli amminoacidi pre-
sentano una struttura comune, mostrata nella Figura 6.1.
Tale struttura consiste di un atomo di carbonio centrale
I geni contenuti nel genoma di una cellula codificano le (carbonio α), al quale sono legati un gruppo amminico
informazioni per le proteine presenti nella cellula stessa. (NH2), un gruppo carbossile (COOH) e un atomo di idro-
L’espressione di un gene che codifica per una proteina geno. Al valore di pH che si trova comunemente nella
avviene mediante la trascrizione del gene in un mRNA cellula, i gruppi %NH2 e %COOH degli amminoacidi
(vedi Capitolo 5), seguita dalla traduzione dell’mRNA; liberi sono carichi, a dare rispettivamente JNH3+ e
quest’ultima comporta la conversione della sequenza di JCOO– (come illustrato nella Figura 6.1). Al carbonio
basi dell’mRNA nella sequenza amminoacidica di un α è legato anche il gruppo R, che è specifico per ogni
polipeptide. L’informazione contenuta nella sequenza di amminoacido e conferisce a esso le sue proprietà caratte-
basi che codifica la sequenza amminoacidica di un poli- ristiche. I polipeptidi differiscono per la sequenza e le
92 Capitolo 6

Atomo Gruppo R che si osserva in un polipeptide, o in una porzione di


di carbonio a (varia a seconda
R dell’amminoacido) un polipeptide, dipende principalmente dalla sequen-
za amminoacidica del polipeptide o della regione del
polipeptide.
H O Un tipo di struttura secondaria che si trova in regioni
Ca
H
N
ricche di polipeptidi è l’α-elica (vedi Figura 6.4b),
C – una struttura scoperta da Linus Pauling e Robert
H
+ H O Corey nel 1951. La possibile formazione di un’α-eli-
ca dipende dai gruppi R presenti in una regione del
Gruppo amminico Gruppo carbossile polipeptide. Si notino il legame idrogeno tra il grup-
Le strutture comuni a tutti gli amminoacidi po %NH di un amminoacido (coinvolto in un lega-
Figura 6.1 me peptidico) e il gruppo %CO (anch’esso coinvol-
La formula di struttura generale di un amminoacido. to in un legame peptidico) di un amminoacido che si
trova a quattro amminoacidi di distanza lungo la ca-
tena. La formazione ripetuta di questo legame risulta
proporzioni degli amminoacidi; la sequenza amminoaci- nell’avvolgimento a elica della catena. Analogamen-
dica, e quindi la sequenza dei gruppi R, determina le pro- te a quanto si verifica in tutti gli altri tipi di struttura
prietà chimiche di ciascun polipeptide. secondaria, il contenuto in regioni ad α-elica di una
Nelle cellule viventi vengono utilizzati 20 amminoa- proteina è variabile.
cidi per formare le proteine: i loro nomi, le abbreviazio- Un altro tipo di struttura secondaria è il foglietto β;
ni a una e a tre lettere e le strutture chimiche vengono ri- quest’ultimo è formato da una o più catene polipepti-
portati nella Figura 6.2. In base alle proprietà del loro diche ripiegate a zigzag in cui regioni o catene paral-
gruppo R, i 20 amminoacidi vengono suddivisi in ammi- lele sono unite tramite legami idrogeno. Molte pro-
noacidi acidi, basici, neutri polari e neutri non polari. teine contengono un misto di regioni ad α-elica e a
Gli amminoacidi all’interno di un polipeptide sono foglietto β.
uniti dal legame peptidico, un legame covalente che si 3. La struttura terziaria di una proteina (Figura 6.4c) è
forma tra il gruppo carbossilico di un amminoacido e il la struttura tridimensionale di una singola catena
gruppo amminico dell’amminoacido adiacente (Figura polipeptidica. La forma tridimensionale di un poli-
6.3). Tutti i polipeptidi presentano un gruppo amminico peptide viene spesso definita conformazione. La
libero a un’estremità (definita N-terminale o ammino- struttura terziaria è determinata dalla distribuzione
terminale) e un gruppo carbossilico libero all’altra estre- dei gruppi R lungo la catena polipeptidica. In altri
mità (denominata C-terminale o carbossi-terminale). termini, questo tipo di conformazione rappresenta il
L’estremità N-terminale è considerata l’inizio della cate- risultato delle interazioni tra i gruppi R. Tali intera-
na polipeptidica, poiché rappresenta l’estremità che vie- zioni comprendono legami idrogeno, interazioni io-
ne sintetizzata per prima durante la traduzione di una niche, ponti disolfuro e forze di van der Waals. La
molecola di mRNA. struttura terziaria che si forma tipicamente in am-
biente acquoso presenta i gruppi carichi e polari sul-
la superficie esterna e i gruppi non polari su quella
La struttura molecolare delle proteine interna. Nella Figura 6.4c viene illustrata la struttu-
Le proteine possiedono quattro livelli di organizzazione ra terziaria della catena polipeptidica β dell’emo-
strutturale (Figura 6.4). globina. (Il Premio Nobel per la Chimica del 1962
fu conferito a Max Perutz e Sir John Kendrew per i
1. La struttura primaria di una catena polipeptidica è la loro studi sulla struttura delle proteine, mentre quel-
sequenza degli amminoacidi che la compongono lo del 1972 venne assegnato a Christian Anfinsen
(Figura 6.4a). La sequenza amminoacidica è diretta- per i suoi studi sulla ribonucleasi, l’enzima in grado
mente determinata dalla sequenza nucleotidica del di degradare l’RNA, in particolar modo per quelli
gene che codifica per il polipeptide. volti a comprendere il nesso tra la sequenza ammi-
2. La struttura secondaria di una proteina è rappresen- noacidica e la conformazione biologicamente attiva
tata dall’avvolgimento e dal ripiegamento in molte- di tale molecola.)
plici forme di una porzione della catena polipeptidica 4. La struttura quaternaria è il complesso di catene po-
(Figura 6.4b). La struttura secondaria è il risultato lipeptidiche in una proteina costituita da più subuni-
della formazione di legami deboli, come i legami tà; pertanto, essa è una caratteristica esclusiva delle
idrogeno o elettrostatici, che si formano tra i gruppi proteine formate da più di una catena polipeptidica
%NH e %CO di amminoacidi che si trovano vicini (Figura 6.4d). Il ripiegamento di una proteina in una
nella catena. Il particolare tipo di struttura secondaria struttura quaternaria consegue alle interazioni tra i
Espressione genica: la traduzione 93
Acidi Basici

H3N H + O –
H3N+ H
Acido aspartico +NH
Lisina
C CH2 C C (CH2)3 CH2 3 (Lys) (K)
(Asp) (D)
– O –
OOC OOC

H3N H +
O –
NH
H3N+ H H
Arginina
CH2 CH2 Acido glutammico
C C (Arg) (R)
(Glu) (E) C (CH2)2 CH2 N C +
NH3
– O
OOC

OOC

Neutri non polari H3N+ H

H3N+ H C CH2 C N

OOC CH Istidina
C CH2 C (His) (H)
HC N

OOC Triptofano
HC (Trp) (W) H
N

H
H3N+ H Neutri polari
Fenilalanina
C CH2 (Phe) (F) H3N+ H
–OOC Tirosina
C CH2 OH (Tyr) (Y)
H3N + H –
OOC
C H Glicina
(Gly) (G) H3N+ H

OOC
Serina
C CH2 OH
H3N+ H (Ser) (S)

Alanina OOC
C CH3
(Ala) (A)

OOC H3N+ H H
OH
Treonina
H3N+ H CH3 C C (Thr) (T)
Valina – CH3
C CH OOC
(Val) (V)

OOC CH3 H
H3N+
CH2 Asparagina
H3N+ H CH2 CH3 C C NH2
(Asn) (N)
Isoleucina –
OOC
C CH (Ile) (I) O

OOC CH3 H3N+ H
Glutammina
H3N+ H CH3 C (CH2)2 C NH2 (Gln) (Q)
Leucina –OOC
C CH2 CH O
(Leu) (L)

OOC CH3 H3N+ H

C CH2 SH Cisteina
H3N+ H CH3
Metionina – (Cys) (C)
OOC
CH2 (Met) (M)
C CH2 S
–OOC H
H
C COO–
H N+ Figura 6.2
CH2 Le strutture dei 20 amminoacidi normalmente presenti
H2C Prolina
(Pro) (P) in natura, ordinati secondo le loro proprietà chimiche.
C
Accanto al nome di ciascun amminoacido sono riportate
H H le abbreviazioni a una lettera e a tre lettere.

gruppi R e i gruppi %NH e %CO dei legami pepti- (due polipeptidi α di 141 amminoacidi e due polipep-
dici presenti su diversi polipeptidi. Nella Figura 6.4d tidi β di 146 amminoacidi), ciascuna delle quali è as-
viene mostrata la struttura quaternaria di una protei- sociata a un gruppo funzionale eme, responsabile del
na eteromultimerica (etero, “diverse”; multimerica, legame con l’ossigeno. Nella struttura quaternaria
“molte subunità”), l’emoglobina, che rappresenta la dell’emoglobina ciascuna catena α è in contatto con
molecola deputata al trasporto dell’ossigeno nel san- una catena β, mentre le interazioni tra le due catene α
gue. Essa è costituita da quattro catene polipeptidiche e le due catene β sono molto scarse.
94 Capitolo 6

Amminoacido Amminoacido Polipeptide

R1 H2O R1
O H O O H O
H3N+ C C + H3N+ C C H3N+ C C N C C

H O– O– H O–
Gruppo R H R2
2
Gruppo amminico Estremità Legame Estremità
carbossile ammino- peptidico carbossi-
terminale terminale
Figura 6.3 (N-terminale) (C-terminale)
La formazione del legame peptidico.

Per molti anni si è pensato che la sola sequenza ammi- della proteina –, ma non diventano parte della proteina
noacidica fosse sufficiente a spiegare in che modo una funzionale prodotta. Una descrizione dettagliata delle
proteina si ripiegasse nel proprio stato funzionale. È no- chaperonine esula dagli scopi di questo volume.
to come il ripiegamento dei polipeptidi avvenga cotradu-
zionalmente; nello specifico, questi ultimi si ripiegano
durante il processo di traduzione anziché dopo il loro Nota chiave
distacco dal ribosoma. Chiaramente, la formazione delle Una proteina è formata di una o più subunità mo-
diverse strutture proteiche viene determinata dalle carat- lecolari definite polipeptidi, a loro volta costituite
teristiche della sequenza amminoacidica. Tuttavia, il ri- da subunità più piccole, gli amminoacidi, legate tra
piegamento di molte proteine nel loro stato funzional- loro da legami peptidici a formare lunghe catene.
mente attivo dipende dalla presenza di una o più protei- La sequenza amminoacidica primaria di una protei-
ne della famiglia delle chaperonine (definite anche cha- na determina la sua struttura secondaria, terziaria
peron molecolari). Le chaperonine agiscono in modo e quaternaria e, quindi, il suo stato funzionale.
analogo agli enzimi, nel senso che interagiscono con le
proteine di cui devono facilitare il ripiegamento – l’inte-
razione è determinata dalla sequenza amminoacidica
La natura del codice genetico
In che modo i nucleotidi di una molecola di mRNA spe-
H N cificano la sequenza amminoacidica di una proteina?
R Avendo a disposizione quattro nucleotidi diversi (A, C,
R N C
C
G, U), qualora si trattasse di un codice a una sola lettera,
H
C potrebbero essere codificati soltanto quattro amminoaci-
H
O di. Diversamente, se fosse un codice a due lettere,
Legame
potrebbero essere codificati 16 (4 × 4) ammi-
a) Struttura primaria.
La sequenza idrogeno noacidi. Un codice a tre lettere, invece, ge-
degli amminoacidi nera 64 (4 × 4 × 4) codici possibili,
in una catena polipeptidica. più di quanto sia necessario per
codificare i 20 amminoacidi

Eme Polipeptide a
Polipeptide b

b) Struttura secondaria. c) Struttura terziaria.


Il ripiegamento Lo specifico
e l’avvolgimento ripiegamento
di una singola catena tridimensionale della catena
polipeptidica in una grande polipeptidica. (Qui è mostrata
varietà di forme. la catena del polipeptide d) Struttura quaternaria.
(Qui è mostrata la struttura b dell’emoglobina.) L’aggregazione di più
ad a-elica.)
catene polipeptidiche che
costituiscono una proteina
multimerica. (Qui è
mostrata l’emoglobina,
formata da due catene a,
Figura 6.4 due catene b e quattro
I quattro livelli di struttura delle proteine. gruppi eme.)
Espressione genica: la traduzione 95

presenti nelle cellule viventi. Dal momento che esistono contro al ciclo litico dando origine a placche. Questo ap-
solo 20 diversi amminoacidi, il presupposto dell’esisten- proccio rese agevole la selezione e l’isolamento dei po-
za di un codice a tre lettere suggerisce, come in effetti av- chi revertanti r + prodotti dal trattamento con proflavina.
viene, che alcuni amminoacidi possano essere codificati Alcuni revertanti derivarono da una correzione esat-
da più di un codone. ta della mutazione originale, cioè una delezione per
un’inserzione o un’inserzione per una delezione. Un se-
condo gruppo di revertanti risultò molto più utile per
Il codice genetico è un codice a triplette stabilire la natura del codice genetico; esso si originava
La prova che il codice genetico è un codice a triplette, da una seconda mutazione all’interno del gene rII, mol-
ovvero che un gruppo di tre nucleotidi (un codone) di un to vicina, ma distinta, rispetto al sito di mutazione origi-
mRNA codifica per un amminoacido di una catena poli- nario. Per esempio, se la prima mutazione era rappre-
peptidica, venne da esperimenti genetici effettuati sul sentata dalla delezione di una singola coppia di basi, la
batteriofago T4 da Francis Crick, Leslie Barnett, Sidney reversione comportava l’inserzione di una coppia di ba-
Brenner e R. Watts-Tobin nei primi anni sessanta del XX si nelle immediate vicinanze. La Figura 6.5a mostra un
secolo. T4 è un fago virulento, il che significa che quan- ipotetico frammento di DNA: si consideri, ai fini della
do infetta E. coli va incontro al ciclo litico, generando discussione, che il codice sia a triplette. In tal caso,
una progenie di 100-200 fagi che vengono rilasciati al l’mRNA trascritto dal DNA sarebbe ACG ACG ACG, e
momento della lisi cellulare. Alcuni mutanti di T4 pre- così via, dando origine a un polipeptide formato da una
sentano alterazioni del ciclo litico; in particolare, i mu- sequenza di amminoacidi identici – treonina – ciascuno
tanti rII producono placche chiare nel ceppo di E. coli B, codificato da ACG. Questa è la fase di lettura di parten-
mentre il ceppo selvatico r + forma placche torbide. za, ovvero quei codoni, le “parole”, che vengono letti in
Inoltre, sempre in contrasto con il ceppo r +, i mutanti rII sequenza per codificare gli amminoacidi. Qualora il
non sono in grado di andare incontro al ciclo litico nel
ceppo di E. coli K12(λ).
Crick e i suoi colleghi partirono da un ceppo mutan- a) Selvatico

te rII prodotto mediante il trattamento del ceppo r + con il 5¢ AC G AC G AC G AC G AC G 3¢


DNA
3¢ TGC TGC TGC TGC TGC 5¢
mutageno proflavina, un composto chimico che induce
mutazioni (questo argomento verrà discusso in maggior mRNA 5¢ AC G AC G AC G AC G AC G 3¢
dettaglio nel Capitolo 7). La proflavina determina l’in- Polipeptide ... T h r T h r T h r T h r T h r ...
serzione o la delezione di una coppia di basi nel DNA.
Quando tali mutazioni si verificano a carico della porzio- b) Mutazione frameshift per delezione
ne di un gene che codifica per un amminoacido, costitui- A delezione
T
scono mutazioni frameshift (mutazioni per scivola-
mento della fase di lettura). Al fine di chiarire gli effetti 5¢ AC G C G A C G AC G A C G A 3¢
DNA
3¢ TGC GCT GCT GCT GCT 5¢
di queste ultime, si consideri una serie di “parole” di tre
nucleotidi che viene letta dal macchinario traduzionale mRNA 5¢ A C G C G A C G A C G A C G A 3¢
per assemblare la catena polipeptidica corretta. L’ag- Polipeptide ... T h r A r g A r g A r g A r g ...
giunta o la perdita di una singola coppia di basi in questa
regione determina un’alterazione della lettura delle paro- c) Reversione di una mutazione per delezione
mediante inserzione
le che seguono il punto in cui è avvenuta l’inserzione o la
G inserzione
delezione; di conseguenza, la sequenza alterata codifi- C
cherà per un gruppo di amminoacidi diversi.
5¢ A C G C G A C G G A G C A C G 3¢
Crick e i suoi colleghi dedussero che, se il fenotipo DNA
3¢ T G C G C T G C C T G C T G C 5¢
mutante rII era dovuto a una inserzione o a una delezio-
mRNA 5¢ A C G C G A C G G A C G A C G 3¢
ne, il trattamento con proflavina del mutante rII avrebbe
potuto far revertire la mutazione allo stato selvatico r +. Il Polipeptide ... T h r A r g A r g T h r T h r ...
processo per cui un mutante ritorna allo stato selvatico
Figura 6.5
viene definito reversione e il ceppo selvatico ottenuto in Reversione di una mutazione frameshift per delezione
questo modo è detto revertante. Se la mutazione origina- dovuta a una mutazione per inserzione che si verifica nelle
le era un’inserzione, avrebbe potuto essere corretta da vicinanze. (a) Sequenze ipotetiche del DNA normale,
una delezione, così come, se era una delezione, avrebbe del trascritto di mRNA e del polipeptide nel selvatico.
potuto essere corretta da un’inserzione. I ricercatori iso- (b) Effetto di una delezione sulla sequenza amminoacidica
del polipeptide. La fase di lettura viene alterata.
larono un certo numero di ceppi r + revertanti piastrando (c) Reversione della delezione a opera di una mutazione
una popolazione di fagi mutanti rII trattati con proflavi- per inserzione. La fase di lettura viene ripristinata, lasciando
na su E. coli K12(λ), su cui solo gli r + possono andare in- solo un breve tratto di amminoacidi errati.
96 Capitolo 6

trattamento con proflavina deter- mRNA normale AU G AC A C AU A AC G G CU U C G UA U G GU G U G A A


minasse la delezione della seconda
coppia di basi A-T, l’mRNA sa- Amminoacidi M e t T h r H i s A s n G l y P h e V a l Tr p C y s G l u
rebbe letto come ACG CGA CGA
e così via, dando un polipeptide 3 mutazioni di segno +

che comincia con l’amminoacido +U +C +A


codificato da ACG (treonina) se-
guito da una sequenza di ammi- mRNA AU G AU C AC A UAC AC G G C A U U C G UA U G G U G U G A A
noacidi codificati dalla tripletta ri-
petuta CGA (arginina) (Figura Amminoacidi M e t I l e T h r Ty r T h r A l a P h e V a l Tr p C y s G l u

6.5b); in altri termini, si verifiche- Amminoacidi errati


rebbe una mutazione frameshift nel polipeptide
perché i codoni che seguono il Figura 6.6
punto in cui si è verificata la dele- Esempio ipotetico di come tre mutazioni per inserzione (+) vicine ripristinino
la fase di lettura corretta, garantendo una funzione normale, o quasi, della pro-
zione sono cambiati. Nello specifi-
teina. Le mutazioni sono qui indicate a livello dell’mRNA.
co, in conseguenza di tale mutazio-
ne, dopo il codone ACG la fase di
lettura del messaggio è ora costituita da una sequenza di dificante per questo filamento di mRNA, si otterrà un
codoni CGA, in cui è ancora riconoscibile la sequenza frammento di 33 nucleotidi codificante per 11 ammi-
ripetuta ACG, con la A come ultima lettera e con CG noacidi, uno in più rispetto al frammento originario.
come prime due lettere del codone CGA. Questa muta- Tuttavia, gli amminoacidi tra la prima e la terza inser-
zione può revertire aggiungendo una coppia di basi nel- zione non sono gli stessi codificati dall’mRNA selvati-
le vicinanze: per esempio, l’inserzione di una coppia G- co. In pratica, la fase di lettura è corretta prima della pri-
C dopo il GC della terza tripletta genera un mRNA che ma e dopo la terza inserzione; gli amminoacidi non cor-
viene letto come ACG CGA CGG ACG ACG e così via retti posti tra esse potrebbero dare un fenotipo revertan-
(Figura 6.5c). Ciò dà origine a un polipeptide costituito te non del tutto selvatico.
in modo preponderante dall’amminoacido codificato da Crick e colleghi scoprirono che la combinazione di
ACG (treonina), ma con due amminoacidi errati, quelli tre mutazioni + o di tre mutazioni – vicine dava revertan-
codificati da CGA e CGG (in entrambi i casi arginina). ti r +. Nessun’altra combinazione, all’infuori di quelle
La seconda mutazione ha pertanto ricostituito la fase di che erano basate su multipli di tre, diede lo stesso risulta-
lettura corretta producendo un polipeptide quasi di tipo to. La conclusione più semplice a cui giunsero per spie-
selvatico. Fino a quando gli amminoacidi non corretti gare questo fenomeno fu che il codice genetico è un co-
incorporati nella piccola regione compresa tra le due dice a triplette.
mutazioni non hanno effetto significativo sulla funzio-
nalità del polipeptide, il doppio mutante avrà un fenoti-
po normale o vicino alla normalità.
La decifrazione del codice genetico
In simboli, le inserzioni verranno indicate come mu- La relazione esatta che lega i 64 codoni ai 20 amminoa-
tazioni + e le delezioni come mutazioni –. Il passo se- cidi fu determinata dagli esperimenti svolti prevalente-
guente di Crick e colleghi consistette nel combinare in mente nei laboratori di Marshall Nirenberg e H.
vario numero mutazioni rII geneticamente distinte dello Ghobind Khorana, che condivisero con Robert Holley
stesso segno (cioè o tutte mutazioni + o tutte –)* per ve- il Premio Nobel per la Fisiologia o Medicina del 1968.
rificare se vi fossero combinazioni in grado di far rever- Per questi esperimenti risultò essenziale l’uso di sistemi
tire i fenotipi rII. La Figura 6.6 fornisce una presenta- di sintesi proteica cell-free, contenenti ribosomi, tRNA
zione ipotetica del tipo di risultati ottenuti e mostra gli legati ai rispettivi amminoacidi e tutti i fattori proteici
effetti delle mutazioni solo a livello dell’mRNA. La fi- necessari per la sintesi dei polipeptidi, assemblati a par-
gura mostra un frammento di mRNA di 30 nucleotidi tire da componenti isolati e purificati da E. coli. Per mi-
che codifica per 10 amminoacidi del polipeptide. Se si surare l’incorporazione di amminoacidi nelle proteine
aggiungono tre coppie di basi in prossimità del DNA co- di nuova sintesi si fece ricorso ad amminoacidi marcati
radioattivamente.
Uno degli approcci volti a stabilire quali codoni codi-
* Crick e i suoi colleghi non sapevano se un mutante rII risultasse ficassero quali amminoacidi consistette nel sintetizzare
da una mutazione + o –. Sapevano però quali dei loro ceppi mu-
tanti rII con una singola mutazione fossero di un segno e quali di
mRNA contenenti uno, due o tre tipi diversi di basi e nel-
segno opposto. I mutanti di un segno (per esempio, +) potevano l’aggiungerli a sistemi di sintesi proteica cell-free, ana-
essere revertiti dalla ricombinazione con mutanti co-infettanti di lizzando poi i polipeptidi prodotti. Quando l’mRNA sin-
segno opposto (ovvero –), e viceversa. tetico conteneva un unico tipo di base, i risultati erano
Espressione genica: la traduzione 97

privi di incertezze. Un poli(U)mRNA sintetico, per possibile la determinazione della relazione specifica tra
esempio, dirigeva la sintesi di un polipeptide costituito molti codoni e gli amminoacidi per i quali essi codifica-
da una catena di fenilalanine. Dal momento che il codice no. Si noti che, in questo particolare approccio, risulta de-
genetico è a triplette, questo risultato indicava che UUU terminata la sequenza nucleotidica specifica del codone.
è un codone per la fenilalanina. Allo stesso modo, un po- Mediante il saggio di legame ai ribosomi, Niremberg e
li(A)mRNA sintetico dirigeva la sintesi di una polilisina, Leder chiarirono molti dubbi sorti utilizzando gli altri ap-
e un poli(C) quella della poliprolina, indicando che AAA procci. Per esempio, si scoprì che UCU codificava per la
è un codone per la lisina e che CCC è un codone per la serina e CUC per la leucina. Complessivamente, median-
prolina. I risultati ottenuti con un poli(G) non furono te questo metodo vennero individuati circa 50 codoni.
conclusivi, dal momento che quest’ultimo si ripiega su In definitiva, nessuno dei singoli approcci permise
sé stesso e non può pertanto venire tradotto in vitro. l’identificazione certa di tutti i codoni, ma l’informazio-
Furono anche analizzati mRNA sintetici prodotti dal- ne ottenuta mediante i diversi metodi sperimentali con-
l’incorporazione casuale di due basi diverse (definiti co- sentì di assegnare 61 codoni ai 20 amminoacidi presenti
polimeri casuali). Per esempio, le molecole di poli(AC) in tutte le cellule viventi; gli altri 3 codoni non codifica-
contengono gli otto diversi codoni CCC, CCA, CAC, no amminoacidi (Figura 6.7).* Ciascun codone viene
ACC, CAA, ACA, AAC e AAA. Nel sistema di sintesi scritto così come appare nell’mRNA e viene letto in di-
proteica cell-free, i poli(AC)mRNA sintetici diedero ori- rezione 5′-3′.
gine a polipeptidi contenenti asparagina, glutammina,
istidina e treonina, oltre alla lisina attesa per la presenza
dei codoni AAA e alla prolina attesa per la presenza dei
Le caratteristiche del codice genetico
codoni CCC. Le proporzioni di asparagina, glutammina, Le caratteristiche del codice genetico sono le seguenti.
istidina e treonina incorporate nei polipeptidi prodotti di-
pendevano dal rapporto A/C usato per produrre l’mRNA 1. Il codice è a triplette. Ogni codone dell’mRNA che
e vennero sfruttate per dedurre informazioni circa i codo- codifica per un amminoacido in una catena polipep-
ni specifici per questi amminoacidi. Per esempio, dato tidica è formato da tre nucleotidi.
che un copolimero casuale AC contenente A in misura 2. Il codice non ha segni di interpunzione, ovvero viene
molto maggiore di C dava come risultato un’incorpora- letto in modo continuo. L’mRNA viene letto in ma-
zione di asparagina molto maggiore che non di istidina, i niera continua, tre nucleotidi per volta, senza saltare
ricercatori conclusero che l’asparagina viene codificata alcun nucleotide del messaggio.
da due A e da una C e l’istidina da due C e da una A. Con 3. Il codice non ha sovrapposizioni. L’mRNA viene let-
esperimenti di questo tipo fu determinata la composizio- to in gruppi successivi di tre nucleotidi.
ne in basi (ma non la sequenza) dei codoni specifici per 4. Il codice è quasi universale. Quasi tutti gli organismi
un certo numero di amminoacidi. condividono lo stesso linguaggio genetico. Tale lin-
Diversamente, un altro approccio sperimentale uti- guaggio è arbitrario, nel senso che sono possibili
lizzò copolimeri sintetici di sequenza nota. Per esempio, molti altri codici, ma la grande maggioranza degli or-
quando un copolimero di sequenza 5′-UCUCUCUCUC- ganismi condivide questo (ciò costituisce una prova
3′ venne utilizzato in un sistema di sintesi proteica cell- rilevante del fatto che tutti gli organismi viventi con-
free, fu possibile osservare che il polipeptide risultante dividono un antenato comune). Pertanto, è possibile
possedeva uno schema amminoacidico ripetuto di leuci- isolare l’mRNA da un organismo, tradurlo mediante
na-serina-leucina-serina. Da questo risultato i ricercatori il macchinario isolato da un altro organismo e pro-
conclusero che UCU e CUC codificavano per leucina e durre la proteina così come se fosse stata tradotta nel-
serina, sebbene da tale dato non fosse possibile determi- l’organismo di partenza. Il codice non è, tuttavia,
nare l’amminoacido specifico codificato da ciascuno dei completamente universale. Per esempio, i mitocondri
due codoni. di alcuni organismi, come i mammiferi, possiedono
Un ulteriore tipo di approccio utilizzò un saggio di le-
game ai ribosomi, sviluppato nel 1964 da Nirenberg e * Altri due amminoacidi raramente presenti nelle proteine sono
Philip Leder. Questo saggio si basa sul fatto che, in assen- codificati da triplette del codice genetico. La selenocisteina è
za di sintesi proteica, molecole di tRNA specifiche si le- presente in tutti e tre i domini della vita ed è codificata dalla tri-
gano a complessi formati da ribosomi e mRNA. Per pletta UGA, che normalmente rappresenta un codone di stop.
esempio, quando un codone sintetico di mRNA, UUU, Tuttavia, la codifica di questo amminoacido non è diretta, ma
necessita della presenza di una sequenza specifica nell’mRNA
viene miscelato con dei ribosomi, forma un complesso
che guidi la tripletta UGA a codificare per la selenocisteina.
UUU-ribosoma e solamente il tRNA.Fen (ovvero quel L’amminoacido pirrolisina si trova negli enzimi coinvolti nella
tRNA che trasporta la fenilalanina all’mRNA e che porta produzione del metano di alcuni archeobatteri. In questi mi-
l’anticodone AAA) si lega al codone UUU. La scoperta crorganismi, la pirrolisina viene codificata dalla tripletta UAG,
di tale capacità dei trinucleotidi di legare i codoni rese che normalmente rappresenta un codone di stop.
98 Capitolo 6

Seconda lettera carioti AUG (metionina) è quasi sempre il codone di


U C A G
inizio della sintesi proteica.
UUU Phe UCU UAU Tyr UGU Cys U Soltanto 61 dei 64 codoni codificano per amminoaci-
UUC (F) UCC UAC (Y) UGC (C) C di: tali codoni vengono definiti codoni senso (vedi
U Ser
UUA Leu UCA (S) UAA Stop UGA Stop A Figura 6.7). Gli altri tre codoni – UAG (chiamato an-
UUG (L) UCG UAG Stop UGG Trp G
(W)
che codone “ambra”), UAA (“ocra”) e UGA (“opa-
le”) – non codificano per nessun amminoacido e in
CUU CCU CAU His CGU U cellule normali non esiste alcun tRNA che rechi l’an-
CUC Leu CCC Pro CAC (H) CGC C
Arg ticodone appropriato (durante la sintesi proteica,
C
CUA (L) CCA (P) CAA Gln CGA (R) A
l’anticodone si appaia con il codone dell’mRNA gra-
Prima lettera

Terza lettera
CUG CCG CAG (Q) CGG G
zie alla complementarità delle basi). Questi tre codo-
AUU ACU AAU Asn AGU Ser U ni sono i codoni di stop, chiamati anche codoni non-
Ile (N) (S)
AUC
(I)
ACC Thr AAC AGC C senso o codoni di terminazione, e vengono utilizza-
A
AUA ACA (T) AAA AGA A ti per segnalare la fine della traduzione di una catena
Lys Arg
AUG Met ACG AAG (K) AGG (R) G polipeptidica. Pertanto, quando si legge una partico-
(M)
lare sequenza di mRNA, si cerca un codone di stop
GUU GCU GAU Asp GGU U posto a distanza di un multiplo di tre nucleotidi – os-
(D)
G
GUC Val GCC Ala GAC GGC Gly C sia nella stessa fase di lettura – dal codone di inizio
GUA (V) GCA (A) GAA Glu GGA (G) A AUG per stabilire dove termini la sequenza codifi-
GUG GCG GAG (E) GGG G cante per gli amminoacidi del polipeptide. Una se-
= codone di terminazione (stop) quenza di questo tipo viene anche denominata Open
= codone di inizio Reading Frame (ORF).
7. Nell’anticodone avviene il fenomeno del vacillamen-
Figura 6.7
Il codice genetico. Dei 64 codoni, 61 codificano per uno
to. Dal momento che 61 codoni senso codificano per
dei 20 amminoacidi. Gli altri 3 codoni sono codoni di termi- amminoacidi nell’mRNA, esiste un totale di 61 mo-
nazione e non codificano per alcun amminoacido. La tri- lecole di tRNA che potrebbero portare gli anticodoni
pletta AUG, uno dei 61 codoni codificanti per un ammino- appropriati. Secondo l’ipotesi del vacillamento,
acido, viene usata per l’inizio della sintesi proteica. proposta da Francis Crick, l’insieme dei 61 codoni
senso può essere letto da meno di 61 tRNA diversi, a
minime variazioni del codice, così come il genoma causa delle proprietà di appaiamento delle basi nel-
nucleare del protozoo Tetrahymena. l’anticodone (Tabella 6.1). Nello specifico, la base
5. Il codice è degenerato. Tranne due eccezioni (AUG, all’estremità 5′ dell’anticodone (complementare alla
unico codone specifico per la metionina, e UGG, uni- base all’estremità 3′, ovvero alla terza lettera) non è
co codone specifico per il triptofano), per ogni ammi- sottoposta a restrizioni dal punto di vista tridimensio-
noacido è presente più di un codone. Questa capacità nale come le altre due basi. Questa caratteristica per-
di codifica multipla viene definita degenerazione o mette un appaiamento delle basi meno preciso, cosic-
ridondanza del codice, e nel suo ambito è possibile ché la base all’estremità 5′ dell’anticodone può ap-
individuare alcuni comportamenti precisi (vedi paiarsi con più di una base all’estremità 3′ del codo-
Figura 6.7). Nello specifico, se i primi due nucleotidi ne: in altre parole, può vacillare. Come illustra la
di un codone sono uguali e la terza lettera è U o C, es- Tabella 6.1, una singola molecola di tRNA può rico-
so codifica sempre per lo stesso amminoacido. Per
esempio, UUU e UUC codificano per la fenilalanina Tabella 6.1 Vacillamento del codice genetico
e CAU e CAC codificano per l’istidina. Inoltre,
quando i primi due nucleotidi sono identici e la terza Nucleotide Nucleotide
lettera è A o G, spesso l’amminoacido codificato è lo all’estremità 5„ all’estremità 3„
stesso. Per esempio, UUA e UUG codificano per la dell’anticodone del codone
leucina e AAA e AAG codificano per la lisina. In po-
G può appaiarsi con UoC
chi casi, quando i primi due amminoacidi di un codo-
ne sono identici e la base in terza posizione è U, C, A C può appaiarsi con G
o G, spesso l’amminoacido codificato è lo stesso. Per
esempio, CUU, CUC, CUA e CUG codificano tutti A può appaiarsi con U
per la leucina.
U può appaiarsi con AoG
6. Il codice ha dei segnali di inizio e di fine. Nel codice
sono contenuti segnali specifici per l’inizio e la fine I (inosina) può appaiarsi con A, U o C
della sintesi proteica. Sia negli eucarioti sia nei pro-
Espressione genica: la traduzione 99

Focus sul genoma


Altri codici genetici
Il codice genetico è quasi universale. Quanto diffe- pletta UGA codifica per il triptofano, invece che
riscono, e dove sono presenti, altri codici genetici? per uno stop, e la “N” della tripletta CTN rappre-
La divergenza maggiore si riscontra nei genomi senta una qualsiasi delle quattro basi che codifica-
degli organelli cellulari. In particolare, consideran- no per la treonina, invece che per la leucina. I ge-
do i codici genetici (12, all’inizio del 2008) degli or- nomi nucleari presentano un numero notevolmen-
ganelli noti (mitocondri e cloroplasti), 53 dei 64 co- te inferiore di variazioni. Sono note solo sei diffe-
doni sono identici in tutti i 12 codici. Le differenze renze, che colpiscono unicamente tre codoni; que-
si riscontrano esclusivamente a livello di 11 codoni, ste ultime sono tutte presenti a livello dei codoni
per un totale di sole 28 differenze. Quattordici del- che fungono da segnali di stop nel codice principa-
le 28 variazioni note riguardano i codoni di stop; le e tutte sono variazioni che corrispondono a mu-
nello specifico, tali differenze possono riguardare tazioni a carico di un gene del tRNA, in seguito a
o un codone il quale, nel codice genetico maggior- cui viene alterata la posizione di una base nell’an-
mente diffuso, codifica per un amminoacido e che, ticodone del tRNA.
in virtù delle suddette variazioni, si comporta co- Esiste una sorprendente quantità di differenze nei
me un codone di stop, o uno dei tre codoni di stop codoni di inizio. È vero che la maggior parte dei ge-
(del codice genetico principale) che modifica la ni inizia la traduzione su un codone AUG, ma sia
propria funzione, codificando per un amminoaci- nel genoma mitocondriale sia in quello nucleare è
do. Le altre variazioni riguardano la corrisponden- stato osservato che almeno sette altri codoni fun-
za di uno o più codoni a un amminoacido invece gono da codoni di inizio per alcune proteine. Tali
che a un altro. La maggiore differenza nota riguar- sequenze sono tutte simili, tranne una, al codone
da il genoma dei mitocondri di lievito, in cui la tri- AUG a livello di due delle tre basi della tripletta.

noscere al massimo tre codoni diversi. La Figura 6.8 questo aspetto e descrive le variazioni del codice che so-
fornisce un esempio di come un singolo tRNA per la no state identificate nei genomi.
leucina possa leggere due diversi codoni per la leuci-
na grazie al vacillamento dell’appaiamento tra basi. La traduzione: il processo
Una caratteristica del codice genetico, qui solo accenna-
di sintesi proteica
ta, è rappresentata dalla parziale universalità di quest’ul- La sintesi proteica ha luogo sui ribosomi, dove viene tra-
timo. Il Focus sul genoma del presente capitolo sviluppa dotto il messaggio genetico codificato dall’mRNA.
L’mRNA viene tradotto in direzione 5′→3′ e il polipep-
tide viene sintetizzato dall’estremità N-terminale a quel-
Attività la C-terminale. Gli amminoacidi giungono al ribosoma
Attraverso la iAttività Determining Causes legati a molecole di tRNA.
of Cystic Fibrosis (Stabilire le cause della fibrosi ci-
stica), presente nel sito web degli studenti, impa-
MyLab rerete a usare l’informazione di sequenza per rin- Leu Leu
tracciare parte del gene responsabile della fibrosi
3¢ 5¢ 3¢ 5¢
cistica. tRNA
per la leucina
identici

Nota chiave
G A G G A G
Il codice genetico è un codice a triplette in cui ogni Appaiamento Appaiamento
codone (l’insieme di tre basi adiacenti) di un mRNA C U C normale C U U vacillante
mRNA
codifica per un amminoacido. Il codice è degenera- 5¢ ... ... 3¢ 5¢ ... ... 3¢
to: alcuni amminoacidi sono codificati da più di un
Figura 6.8
codone. Il codice genetico non è sovrapposto ed è Esempio di vacillamento nell’appaiamento tra basi. Due
quasi universale. Codoni specifici segnalano l’inizio diversi codoni per la leucina (CUC, CUU) possono essere letti
e la fine della sintesi proteica. dalla stessa molecola di tRNA per la leucina, in contrasto
con le normali regole di appaiamento tra le basi.
100 Capitolo 6

a) Struttura a trifoglio del tRNA b) Schema della struttura tridimensionale a forma di L


di un tRNA; qui è rappresentato il tRNA per la fenilalanina
3¢ di lievito
A Alanina
Ansa IV Estremità 5¢
C
C
A
A C
5¢ C
G C
G C Estremità 3¢
(per l’attacco
G U dell’amminoacido)
C G
G C Ansa III
U U Py U
G C A Ansa I
GMe A GGC C
G A UG U
G
D CC C C IV
I UC C GG
C C C
G GG G G T y
G DA A D
GMe2 C G G III
U A
C G
C G
C G
U ψ
U II
IMe
I G C
Ansa dell’anticodone
Anticodone (ansa II)
c) Modello molecolare spaziale del tRNA
per la fenilalanina di lievito

Estremità 3¢ si. La corretta sequenza amminoacidica di un polipepti-


(per l’aggiunta de si ottiene mediante: (1) il legame di ogni amminoaci-
dell’amminoacido)
do a un tRNA specifico; (2) il legame tra il codone
dell’mRNA e l’anticodone complementare del tRNA.

La struttura dell’RNA transfer I tRNA sono lunghi


dai 75 ai 90 nucleotidi e ciascuno possiede una sequen-
za diversa. Le differenze nella sequenza nucleotidica
giustificano la capacità di una particolare molecola di
tRNA di legare un amminoacido specifico. La sequen-
za nucleotidica di tutti i tRNA può ripiegarsi formando
la cosiddetta struttura a trifoglio (Figura 6.9a). Tale
struttura deriva dall’appaiamento tra le basi comple-
mentari di diverse porzioni della molecola che genera
quattro “steli” a doppio filamento separati da quattro
anse: I, II, III e IV.
L’ansa II contiene la sequenza trinucleotidica del-
l’anticodone la quale, durante la traduzione, si appaia
con la sequenza trinucleotidica del codone dell’mRNA
Ansa dell’anticodone
grazie alla complementarità delle basi. Tale appaia-
mento codone-anticodone è fondamentale per l’inseri-
Figura 6.9
RNA transfer. Py = pirimidina. Basi modificate: I = inosina, mento dell’amminoacido codificato dall’mRNA nella
T = ribotimidina, Ψ = pseudouridina, D = diidrouridina, catena polipeptidica in via di sintesi. Le Figure 6.9b e
GMe = metilguanosina, GMe2 = dimetilguanosina, 6.9c illustrano la struttura terziaria del tRNA per la fe-
IMe = metilinosina. nilalanina di lievito; il modello molecolare spaziale
rappresenta la struttura tridimensionale attiva nelle cel-
lule. Tutti gli altri tRNA esaminati mostrano strutture
L’RNA transfer (o RNA di trasporto)
simili, a forma di L capovolta, in cui l’estremità 3′
Durante la traduzione dell’mRNA, ciascun RNA tran- dell’RNA, quella a cui si attacca l’amminoacido, si tro-
sfer (tRNA) porta al ribosoma un amminoacido specifi- va all’estremità opposta della L rispetto all’ansa che re-
co da aggiungere alla catena polipeptidica in via di sinte- ca l’anticodone.
Espressione genica: la traduzione 101

Tutte le molecole di tRNA possiedono la sequenza 5′- detto amminoacil-tRNA sintetasi. Questo processo
CCA-3′ all’estremità 3′ e presentano anche numerose viene definito amminoacilazione, o caricamento, e pro-
basi modificate chimicamente da reazioni enzimatiche: duce un amminoacil-tRNA (o tRNA carico). L’am-
esistono quadri di modificazioni differenti per ogni tipo minoacilazione ricava energia dall’idrolisi dell’ATP.
di tRNA (esempi di basi modificate vengono riportati Esistono 20 differenti amminoacil-tRNA sintetasi, una
nella Figura 6.9a). per ciascuno dei 20 diversi amminoacidi. Ogni enzima
riconosce particolari caratteristiche strutturali del
I geni degli RNA transfer I geni dei tRNA batterici tRNA, o dei tRNA, che amminoacila.
sono presenti nel genoma in singola copia o al massimo La Figura 6.10 mostra il caricamento di una moleco-
in poche copie, mentre i geni dei tRNA eucarioti sono la di tRNA a produrre un valina-tRNA (Val-tRNA). In
presenti in copie multiple. Per esempio, il rospo arti- primo luogo, l’amminoacido e l’ATP si legano all’am-
gliato del Sud Africa Xenopus laevis possiede circa 200 minoacil-tRNA sintetasi specifica. L’enzima quindi ca-
copie di ciascun gene per i tRNA. I geni per i tRNA talizza una reazione in cui l’ATP viene idrolizzato ad
batterici vengono trascritti dall’unica RNA polimerasi AMP, che si lega all’amminoacido dando origine a un
presente nei batteri, mentre i geni per i tRNA eucarioti amminoacil-AMP. In seguito, la molecola di tRNA si le-
vengono trascritti dall’RNA polimerasi III. La trascri- ga all’enzima, che trasferisce l’amminoacido dall’ammi-
zione dei geni per i tRNA sia nei batteri sia negli euca- noacil-AMP al tRNA rilasciando l’AMP. Successiva-
rioti produce molecole di precursori dei tRNA (pre- mente, l’enzima rilascia la molecola di amminoacil-
tRNA), ciascuna delle quali presenta alle due estremità tRNA. Dal punto di vista chimico, l’amminoacido si at-
sequenze aggiuntive che vengono rimosse dopo la tra- tacca all’estremità 3′ del tRNA mediante un legame co-
scrizione. In seguito, si verificano l’aggiunta della se- valente tra il gruppo carbossilico dell’amminoacido e il
quenza 5′-CCA-3′ all’estremità 3′ e la modificazione gruppo 3′-OH o 2′-OH del ribosio dell’adenina che si
delle basi lungo tutta la molecola. trova all’estremità 3′ di tutti i tRNA (Figura 6.11).
In certi eucarioti alcuni geni per i tRNA contengono
introni. L’introne si trova quasi sempre tra il primo e il
secondo nucleotide in posizione 3′ rispetto all’anticodo- Nota chiave
ne. La rimozione degli introni avviene con un meccani- Tutte le molecole di tRNA convogliano al ribosoma
smo diverso da quello dello splicing del pre-mRNA. un amminoacido specifico da aggiungere alla cate-
na polipeptidica in via di sintesi. L’amminoacido
Il riconoscimento dell’anticodone del tRNA da parte viene legato al tRNA da un’amminoacil-tRNA sin-
del codone dell’mRNA Il fatto che il codone del- tetasi amminoacido-specifica. Tutti i tRNA hanno
l’mRNA riconosca l’anticodone del tRNA e non l’am- lunghezza simile (75-90 nucleotidi), una sequenza
minoacido da esso trasportato venne dimostrato da G. 5’-CCA-3’ all’estremità 3’, presentano un certo nu-
von Ehrenstein, B. Weisblum e S. Benzer, che legarono mero di modificazioni delle basi tRNA-specifiche e
in vitro la cisteina al tRNA.Cys (questa terminologia in- una struttura terziaria affine. L’anticodone di un
dica l’amminoacido codificato dall’anticodone del tRNA è specifico per l’amminoacido da esso traspor-
tRNA, in questo caso la cisteina) e, successivamente, tato e si appaia con il codone complementare di
convertirono chimicamente la cisteina in alanina. L’a- una molecola di mRNA. Le molecole di tRNA attive
lanil-tRNA.Cys risultante (costituito dall’alanina legata dal punto di vista funzionale sono prodotte dal pro-
al tRNA recante l’anticodone complementare al codone cessamento dei trascritti di pre-tRNA dei geni per i
codificante per la cisteina) fu usato nella sintesi in vitro tRNA (evento che rimuove le sequenze aggiuntive
dell’emoglobina. In vivo, le catene α e β dell’emoglobi- presenti a entrambe le estremità), dall’aggiunta
na contengono una cisteina ciascuna. Tuttavia, quando della sequenza CCA all’estremità 3’ e dalla modifi-
venne analizzata l’emoglobina prodotta in vitro, su en- cazione di alcune basi tramite catalisi enzimatica. In
trambe le catene, nella posizione normalmente occupata alcuni geni per i tRNA di determinati eucarioti sono
dalla cisteina, fu rinvenuto l’amminoacido alanina. Tale presenti introni, che vengono rimossi nel corso del
risultato poteva soltanto indicare che l’alanil-tRNA.Cys processamento della molecola di tRNA.
aveva letto il codone per la cisteina e aveva inserito l’am-
minoacido che trasportava, in questo caso l’alanina.
Pertanto, i ricercatori conclusero che la specificità di ri-
conoscimento del codone risiede nella molecola di tRNA I ribosomi
e non nell’amminoacido da essa trasportato. La sintesi proteica avviene sui ribosomi, presenti a mi-
gliaia in tutte le cellule. I ribosomi si legano all’mRNA e
Il caricamento del tRNA con l’amminoacido L’am- facilitano il legame tra tRNA ed mRNA, consentendo la
minoacido corretto viene legato al tRNA da un enzima sintesi proteica.
102 Capitolo 6

Figura 6.10
Val
Il caricamento (amminoacilazione)
di una molecola di tRNA Amminoacido

Va
da parte dell’amminoacil-tRNA

l
sintetasi a produrre L’amminoacido P A
P
un amminoacil-tRNA e l’ATP si legano P L’enzima cata-
(tRNA carico). all’enzima lizza il legame
dell’amminoacido
P A all’AMP, a formare
P
P ATP un amminoacil-AMP.
Nella reazione
si perdono due
Amminoacil-tRNA sintetasi gruppi fosfato
P
L’enzima P
ritorna
al suo stato
originale

Va
l
P A
PA Val
AMP

L’aa-tRNA e
tRNA scarico
l’AMP vengono C A A
rilasciati aa-AMP-enzima
Val aa-tRNA-enzima

CAA

CAA Il tRNA
scarico si
Va

Amminoacil-tRNA
lega
l

(aa-tRNA)
P A all’enzima
L’enzima trasferisce l’amminoacido
dall’amminoacil-AMP al tRNA,
formando un amminoacil-tRNA
(aa-tRNA) CAA

L’RNA ribosomale e i ribosomi Sia nei procarioti sia


R Gruppo R Amminoacido
Gruppo legato mediante
negli eucarioti, i ribosomi sono costituiti da due subunità
H3 N+ CH
amminico il gruppo carbossilico di dimensioni diverse – la subunità maggiore e la subu-
C O Gruppo al ribosio dell’ultimo
ribonucleotide nità minore – ciascuna delle quali è formata da un com-
carbossilico
O della catena del tRNA plesso di molecole di RNA e proteine. Ciascuna subunità
OH contiene una o più molecole di rRNA e un gran numero
di proteine ribosomali.
Adenina CH2 Il ribosoma batterico ha una dimensione di 70S ed è
O
O
formato da una subunità 50S (subunità maggiore) e da
una subunità 30S (subunità minore)* (Figura 6.12). I ri-
O P O–
bosomi eucarioti sono più grandi e più complessi di quel-
O
li dei procarioti e variano in dimensione e composizione
Nucleotidi C Gli ultimi 3 nucleotidi
di tutti i tRNA
nei diversi organismi. I ribosomi di mammifero, per
citosina
C sono -CCA-3¢
5¢ * Il valore S è la misura della velocità di sedimentazione in centri-
fuga. La velocità di sedimentazione di un oggetto non dipende
solo dalla sua massa, ma anche dalla sua conformazione tridi-
mensionale. In particolare, considerati due oggetti con uguale
Anticodone
massa ma diversa conformazione, il più compatto sedimenterà
più velocemente e avrà perciò un valore di S maggiore rispetto a
Figura 6.11 quello meno compatto. Per quanto riguarda i ribosomi, ne deri-
Attacco di un amminoacido a una molecola di tRNA. va che 50S + 30S ≠ 70S, dato che, quando le due subunità si uni-
In una molecola di amminoacil-tRNA (tRNA carico), il gruppo scono a formare un ribosoma completo, la conformazione di-
carbossilico dell’amminoacido è legato al gruppo 3’-OH venta meno compatta e la sedimentazione risulta più lenta ri-
o 2’-OH dell’adenina 3’ terminale del tRNA. spetto a quanto atteso dalla somma delle due subunità.
Espressione genica: la traduzione 103

rRNA 16S tRNA minore. I ribosomi eucarioti contengono quattro moleco-


rRNA 5S le di rRNA – l’rRNA 28S, l’rRNA 5,8S e l’rRNA 5S nel-
la subunità maggiore, e l’rRNA 18S nella subunità mi-
nore. Le molecole di rRNA svolgono un ruolo struttura-
rRNA 23S le nel ribosoma e un ruolo funzionale nelle diverse fasi
della traduzione.
Durante la traduzione, l’mRNA passa attraverso la
subunità ribosomale minore (Figura 6.14). Siti specifici
del ribosoma legano i tRNA in fasi diverse della sintesi
proteica: il sito A (amminoacilico), dove si lega un am-
minoacil-tRNA entrante, il sito P (peptidilico), dove si
trova il tRNA recante la catena polipeptidica in via di
sintesi, e il sito E (di uscita), a livello del quale un tRNA
Proteine Proteine
ribosomali ribosomali
è incanalato nel percorso che dal sito P lo porta a lascia-
della subunità della subunità re il ribosoma. I siti P e A sono costituiti da regioni ap-
minore maggiore
partenenti sia alla subunità maggiore sia a quella minore,
Subunità 30S Subunità 50S mentre il sito E è una porzione della subunità maggiore.
Ribosoma 70S
Verranno fornite ulteriori informazioni circa questi siti
Figura 6.12 nei prossimi tre paragrafi, che descrivono le fasi della
Modello molecolare di un ribosoma batterico completo traduzione.
(70S). Il ribosoma mostrato è quello di Thermus
thermophilus. Si possono vedere gli RNA e le proteine I geni per gli RNA ribosomali Nei procarioti e negli
delle due subunità, oltre al tRNA nel suo sito di legame.
eucarioti le regioni del DNA contenenti i geni per gli
rRNA vengono definite DNA ribosomale (rDNA) o
esempio, hanno una dimensione di 80S e sono formati da unità di trascrizione dell’rRNA. E. coli possiede sette
una subunità maggiore di 60S e da una subunità minore unità di trascrizione dell’rRNA sparse nel suo cromoso-
di 40S. ma. Ogni unità di trascrizione dell’rRNA contiene una
Ogni subunità ribosomale contiene una o più mole- copia delle sequenze codificanti degli rRNA 16S, 23S e
cole di rRNA specifiche e diverse proteine ribosomali 5S, posizionate nell’ordine 16S-23S-5S. Vi è un unico
(Figura 6.13; rappresentate anche nel modello molecola- promotore per ogni unità di trascrizione dell’rRNA e la
re riportato nella Figura 6.12). I ribosomi batterici con- trascrizione da parte dell’RNA polimerasi produce una
tengono tre molecole di rRNA – l’rRNA 23S e l’rRNA molecola di rRNA precursore (pre-rRNA) con orga-
5S nella subunità maggiore e l’rRNA 16S nella subunità nizzazione 5′-16S-23S-5S-3′ e provvisto di sequenze non
costituite da rRNA, definite sequenze spazia-
a) trici, poste dopo ogni sequenza di rRNA e alle
Ribosoma batterico (70S) estremità 5′ e 3′. Il processamento da parte di
(2,5 µ 106 dalton) rRNA 23S (2904 nt) ribonucleasi specifiche rimuove gli spaziatori,
+
rRNA 5S (120 nt) consentendo il rilascio dei tre rRNA. Le protei-
+ ne ribosomali si associano alla molecola di
31 proteine
Subunità 50S
pre-rRNA non appena essa viene trascritta,
formando un grosso complesso ribonucleopro-
rRNA 16S (1542 nt) teico. Il processamento del trascritto avviene a
+
21 proteine livello di tale complesso e le associazioni spe-
Subunità 30S cifiche degli rRNA con le proteine ribosomali
generano le subunità ribosomali funzionali.
b) La maggior parte degli eucarioti possiede
Ribosoma di mammifero rRNA 28S (4718 nt) molte copie dei geni che codificano per i quat-
(80S) (4,2 µ 106 dalton) +
rRNA 5,8S (160 nt) tro tipi di rRNA 18S, 5,8S, 28S e 5S. I geni de-
+ gli rRNA 18S, 5,8S e 28S si trovano adiacenti
rRNA 5S (120 nt)
+ uno all’altro nell’ordine 18S-5,8S-28S e cia-
Subunità 60S 49 proteine

rRNA 18S (1874 nt) Figura 6.13


+ Composizione del ribosoma completo
33 proteine e delle subunità ribosomali delle cellule
nt = nucleotidi
Subunità 40S batteriche (a) e di mammifero (b).
104 Capitolo 6

Catena polipeptidica ne delle sequenze spaziatrici. Gli eventi di processamen-


nascente
to del pre-rRNA avvengono in complessi formati dal
Amminoacido
pre-rRNA, dall’rRNA 5S e dalle proteine ribosomali.
Subunità L’rRNA 5S viene prodotto mediante la trascrizione dei
maggiore geni degli rRNA 5S (comunemente localizzati in una se-
de diversa del genoma) da parte dell’RNA polimerasi III.
Sito di Durante il processamento del pre-rRNA i complessi van-
uscita (E) tRNA no incontro a cambiamenti conformazionali, con la con-
Sito seguente formazione delle subunità ribosomali funziona-
peptidilico (P) li 60S e 40S, che vengono successivamente trasportate
Sito nel citosol.
amminoacilico Subunità È importante sottolineare la differenza tra introni e
(A) minore
spaziatori. La rimozione degli spaziatori rilascia gli RNA
mRNA fiancheggianti, che rimangono separati. Al contrario, la
...
3¢ rimozione di un introne determina l’unione (splicing) del-
...

5¢ le due sequenze di RNA che fiancheggiano l’introne.


Figura 6.14
Struttura del ribosoma in cui sono visibili il percorso
dell’mRNA attraverso la subunità minore, i tre siti di legame L’inizio della traduzione
del tRNA nelle diverse fasi della sintesi proteica e il punto
di uscita della catena polipeptidica di nuova sintesi. Le tre fasi fondamentali della sin-
tesi proteica – inizio, allungamento nimazione
e terminazione – sono simili nei Inizio della
scuna unità costituita dai tre geni è generalmente ripetu- batteri e negli eucarioti. In questo traduzione MyLab
ta in tandem dalle 100 alle 1000 volte (a seconda dell’or- paragrafo e nei due successivi tali
ganismo), formando uno o più gruppi (cluster) di unità fasi verranno trattate in modo se-
ripetute di rDNA. In conseguenza dell’attività di tra- quenziale e, in particolare, l’attenzione verrà incentrata
scrizione delle unità ripetute, si forma un nucleolo intor- sui processi che avvengono in E. coli. Nella discussione
no a ogni cluster. Di solito, i diversi nucleoli si fondono verranno sottolineate le differenze significative nella tra-
costituendo un unico nucleolo. duzione tra batteri ed eucarioti.
Ogni unità ripetuta di rDNA eucariote viene tra- L’inizio comprende tutte le fasi che precedono la
scritta dall’RNA polimerasi I producendo una moleco- formazione del legame peptidico tra i primi due ammi-
la di pre-rRNA caratterizzata da un’organizzazione 5′- noacidi della catena polipeptidica e coinvolge una mo-
18S-5,8S-28S-3′ e da sequenze spaziatrici tra gli rRNA e lecola di mRNA, un ribosoma, uno specifico tRNA ini-
alle estremità 5′ e 3′. Il processamento da parte di ribonu- ziatore, i fattori di inizio proteici (IF) e il GTP (guano-
cleasi specifiche genera i tre rRNA mediante la rimozio- sinatrifosfato).

L’inizio nei batteri Nei batteri, il primo stadio dell’ini-


zio della traduzione è l’interazione della subunità riboso-
Nota chiave male 30S (minore), a cui sono legati IF-1 e IF-3, con la
I ribosomi sono formati da due subunità di dimen- regione dell’mRNA che contiene il codone d’inizio
sioni diverse, ciascuna delle quali contiene una o AUG (Figura 6.15). IF-3 facilita il legame della subunità
più molecole di RNA e proteine ribosomali. I tre all’mRNA e impedisce il legame tra la subunità riboso-
rRNA procarioti e tre dei quattro rRNA eucarioti male 50S e la subunità 30S.
vengono codificati a livello delle unità di trascrizio- Il codone di inizio AUG da solo non è sufficiente per
ne dell’rRNA. Il quarto rRNA eucariote viene invece indicare il punto in cui la subunità 30S dovrebbe legarsi
codificato da geni distinti. La trascrizione delle uni- all’mRNA, ma è richiesta anche la presenza di una se-
tà trascrizionali dell’rRNA da parte dell’RNA poli- quenza a monte (sul versante 5′ del leader dell’mRNA)
merasi produce molecole di pre-rRNA, che vengono del codone AUG, definita sito di legame al ribosoma
processate a dare rRNA maturi attraverso la rimo- (RBS). Negli anni settanta del XX secolo John Shine e
zione delle sequenze spaziatrici. Il processamento Lynn Dalgarno ipotizzarono che la sequenza RBS, ricca
avviene in complessi costituiti dal pre-rRNA, da pro- in purine (5′-AGGAGG-3′ o una sequenza simile), e tal-
teine ribosomali e da altre proteine, e rappresenta volta altri nucleotidi presenti nella stessa regione potesse-
una parte della serie di eventi che conducono alla ro appaiarsi a una regione complementare ricca in pirimi-
formazione delle subunità ribosomali mature. dine (contenente sempre la sequenza 5′-UCCUCC-3′) a
livello dell’estremità 3′ terminale dell’rRNA 16S (Figura
Espressione genica: la traduzione 105

Figura 6.15
Inizio della sintesi proteica nei
batteri. Il complesso di inizio
IF-3 IF-1 30S è formato da una subunità
Subunità ribosomale 30S Sequenza ribosomale 30S, dall’mRNA,
di Shine-Dalgarno dall’fMet-tRNA iniziatore
La subunità ribosomale e dai fattori di inizio. Successi-
mRNA 5¢ AU G 3¢
30S si lega all’mRNA vamente si lega la subunità
ribosomale 50S, formando
il complesso di inizio 70S. Du-
rante questo evento vengono
rilasciati i fattori di inizio
mRNA 5¢ AU G 3¢ e si verifica l’idrolisi del GTP.
IF-3 IF-1

fMet Shine-Dalgarno di un mRNA presenta una mutazio-


Il tRNA iniziatore si lega 3¢ 5¢ fMet-tRNA ne che riduce in modo significativo, o impedisce del
al complesso subunità iniziatore
ribosomale 30S-mRNA tutto, il possibile appaiamento con la sequenza
GTP IF-2 dell’rRNA 16S, l’mRNA mutato non può essere tra-
UAC
dotto. Analogamente, la traduzione dell’mRNA non
può avvenire nel caso in cui si verifichi una mutazio-
fMet
3¢ 5¢ fMet-tRNA
ne a carico della sequenza dell’rRNA complementa-
iniziatore re alla sequenza di Shine-Dalgarno. Dal momento
GTP che era possibile contestare tali osservazioni conside-
IF-2
UAC rando che la perdita di traducibilità in seguito a muta-
mRNA 5¢ AU G 3¢ zione in uno dei due RNA può essere determinata da
IF-3 IF-1 effetti non correlati alla perdita di complementarità
Complesso di inizio 30S tra le due regioni di RNA, venne eseguito un esperi-
mento più elegante. In particolare, vennero indotte
Legame della subunità nella sequenza di Shine-Dalgarno alcune mutazioni
ribosomale 50S in grado di impedire l’appaiamento con la sequenza
Subunità selvatica di rRNA e nella sequenza di rRNA furono
ribosomale
IF-2 50S introdotte delle mutazioni “compensanti”, in modo
IF-1 che le due sequenze mutate potessero appaiarsi. In
IF-3 questo caso, la traduzione dell’mRNA avveniva nor-
GDP + P
malmente, dimostrando l’importanza dell’appaia-
mento tra le due regioni di RNA. (Questo tipo di
Sito P esperimento, in cui vengono introdotte delle muta-
fMet zioni compensanti in due sequenze che si suppone in-
3¢ 5¢ teragiscano tra loro, è stato utilizzato in numerosi al-
Sito E Sito A tri sistemi per indagare i ruoli delle interazioni speci-
fiche nelle funzioni biologiche.)
UAC
mRNA 5¢ AU G 3¢

Complesso di inizio 70S a) Sequenza all’estremità 3¢ dell’rRNA 16S

3¢ AU U C C U C C AUAG 5¢

6.16). Joan Steitz fu la prima a dimostrare sperimental- b) Esempio di appaiamento tra l’estremità 3¢ dell’rRNA 16S
e la sequenza nucleotidica a monte del codone AUG
mente tale appaiamento. La regione RBS dell’mRNA di un mRNA
oggi è comunemente nota come la sequenza di Shine- Sequenza di Codone
Dalgarno. Shine-Dalgarno di inizio

La maggior parte delle sequenze RBS si trova tra gli 8 5¢ U G UAC UA AGGAG G U U G U AU G G A AC A AC G C 3¢
e i 12 nucleotidi a monte del codone di inizio. Il modello
A UU C C U C C A
prevede che la formazione di coppie di basi complemen-
UA

Estremità 3¢ G
tari tra l’mRNA e l’rRNA 16S consenta alla subunità ri- 3¢ dell’rRNA 16S
bosomale minore di localizzare sull’mRNA la sequenza Figura 6.16
corretta per l’inizio della sintesi proteica. Evidenze di ti- Sequenze coinvolte nel legame dei ribosomi all’mRNA
po genetico supportano questo modello. Se la sequenza di nel processo di inizio della sintesi proteica nei procarioti.
106 Capitolo 6

Lo stadio seguente nell’inizio della traduzione è il lega- lizza un altro meccanismo per riconoscere il codone di
me di un tRNA iniziatore particolare al codone di inizio inizio AUG. Inizialmente, un fattore di inizio eucariote
AUG a cui è legata la subunità 30S. Sia nei procarioti sia eIF-4F – un multimero di numerose proteine, tra cui eIF-
negli eucarioti, AUG codifica per la metionina: in en- 4E, la Cap Binding Protein (CBP) – si lega al cap all’e-
trambe le classi di organismi, pertanto, le proteine di stremità 5′ dell’mRNA (vedi Capitolo 5). Successiva-
nuova sintesi iniziano con la metionina. In molti casi la mente, si crea un complesso formato dalla subunità ribo-
metionina viene successivamente rimossa. somale 40S, dal Met-tRNA iniziatore, da diverse protei-
Nei batteri, il tRNA iniziatore è il tRNA.fMet che ne eIF e dal GTP che, insieme ad altri eIF, si sposta lun-
possiede l’anticodone 5′-CAU-3′ per legarsi al codone di go l’mRNA alla ricerca del codone di inizio AUG; que-
inizio AUG. Questo tRNA trasporta una forma di metio- st’ultimo si trova inserito all’interno di una corta sequen-
nina modificata, la formilmetionina (fMet), nella quale za – nota come sequenza di Kozak (da Marilyn Kozak) –
al gruppo amminico della metionina è stato aggiunto un che lo identifica come codone di inizio. Questo processo
gruppo formilico. Nello specifico, in primo luogo la me- viene definito modello a scansione per l’inizio della tra-
tionil-tRNA sintetasi catalizza l’aggiunta della metioni- duzione. Il codone AUG corretto è quasi sempre il primo
na al tRNA e, successivamente, l’enzima transformilasi codone AUG a partire dall’estremità 5′ dell’mRNA ma,
aggiunge alla metionina il gruppo formilico. La moleco- per agire da codone di inizio, deve trovarsi all’interno di
la risultante è denominata fMet-tRNA.fMet (questa no- una sequenza appropriata. Una volta trovato questo
menclatura indica che il tRNA è specifico per il legame AUG, la subunità 40S si lega a esso, seguita dalla subuni-
della fMet e che reca attaccata la fMet). tà 60S che spiazza gli eIF (tranne eIF-4F, necessario per
Si noti che, quando sulla molecola di mRNA si incon- il successivo inizio della traduzione), formando il com-
tra un codone AUG che non sia nella posizione iniziale plesso di inizio 80S, con il Met-tRNA iniziatore legato
della sequenza codificante, viene utilizzato un tRNA di- all’mRNA nel sito P del ribosoma.
verso, denominato tRNA.Met, per inserire una metionina Anche la coda di poli(A) dei messaggeri eucarioti
in quel punto della catena polipeptidica. Questo tRNA svolge un ruolo nella traduzione. La proteina di legame
viene caricato dalla stessa amminoacil-tRNA sintetasi che al poli(A) II (PABPII; vedi Figura 5.11b), legata alla co-
agisce sul tRNA.fMet, producendo il Met-tRNA.Met. da di poli(A), si lega anche a eIF-4G, una delle proteine
Tuttavia, il tRNA.Met e il tRNA.fMet vengono codifica- di eIF-4F del cap, portando così l’estremità 3′
ti da geni diversi e possiedono sequenze nucleotidiche di- dell’mRNA in prossimità dell’estremità 5′. In questo
stinte. Più oltre nel presente capitolo verrà illustrato come modo la coda di poli(A) stimola l’inizio della traduzione.
i due tRNA siano usati in modo diverso.
Il tRNA iniziatore, fMet-tRNA.fMet, viene portato al
complesso subunità 30S-mRNA da IF-2, che trasporta an-
L’allungamento della catena polipeptidica
che una molecola di GTP. Il tRNA iniziatore si lega alla La fase successiva all’inizio del-
subunità a livello del sito P. In seguito verrà spiegato che, la traduzione è l’allungamento. nimazione
successivamente, tutti gli amminoacil-tRNA che giungo- La Figura 6.17 mostra gli eventi Allungamento
no al ribosoma si legano al sito A. Tuttavia, il legame di che si verificano durante l’allun- della catena MyLab
IF-1 alla subunità 30S blocca il sito A in modo che solo il gamento – l’aggiunta di un am- polipeptidica
sito P risulti disponibile per il legame con il tRNA inizia- minoacido alla volta alla catena
tore. A questo punto si è formato il complesso di inizio polipeptidica in crescita – così come avvengono nei bat-
30S, costituito dall’mRNA, dalla subunità 30S, dal tRNA teri. Questa fase è costituita da tre passaggi:
iniziatore e dai fattori di inizio (vedi Figura 6.15). In una
fase successiva, si verifica il legame della subunità riboso- 1. legame dell’amminoacil-tRNA (tRNA carico) al ri-
male 50S, evento che determina l’idrolisi del GTP e il ri- bosoma a livello del sito A;
lascio dei tre fattori di inizio. Il complesso finale viene de- 2. formazione di un legame peptidico;
finito complesso di inizio 70S (vedi Figura 6.15). 3. migrazione (traslocazione) del ribosoma lungo
l’mRNA, un codone alla volta.
L’inizio negli eucarioti Negli eucarioti l’inizio della
traduzione è simile a quanto avviene nei batteri, anche se Come l’inizio della traduzione, anche l’allungamento
è più complesso e coinvolge molti più fattori di inizio, necessita di fattori proteici accessori, denominati fattori
noti come fattori di inizio eucarioti (eIF). Le differenze di allungamento (EF), e del GTP. Negli eucarioti il pro-
principali sono le seguenti: (1) la metionina iniziatrice cesso si svolge in modo simile.
non è modificata, nonostante esista anche in questo caso
un tRNA iniziatore specifico che la porta al ribosoma, e Il legame dell’amminoacil-tRNA All’inizio della fase
(2) le sequenze di Shine-Dalgarno non sono presenti su- di allungamento, l’anticodone dell’fMet-tRNA è unito
gli mRNA eucarioti, in quanto il ribosoma eucariote uti- mediante legami idrogeno al codone di inizio AUG in
Espressione genica: la traduzione 107

Figura 6.17 Rigenerazione da parte di Ts


Fase di allungamento della tradu- del complesso EF-Tu-GTP
zione nei batteri. Per quanto Ts
riguarda le proteine EF-Tu ed EF-Ts, GTP GDP
la “u” sta per “instabile” (unstable), Complesso
mentre la “s” sta per “stabile” Ser EF-Tu-Ts
(stable). Ts Ts
GTP EF-Tu
Ciclo di scambio
GDP
EF-Tu-Ts
Peptidil-tRNA AG G
legato al sito P
Ser
fMet
Sequenza P
di Shine-Dalgarno
Sito E Sito A AG G
vuoto
UAC 2 La molecola successiva di fMet Ser
amminoacil-tRNA
AU G U C C A AG (Ser-tRNA.Ser), complessata
5¢ 3¢
mRNA con il fattore di allungamento
Codone: 1 2 3 Tu (EF-Tu) e il GTP, si lega
1 Non appena si è formato al codone esposto (UCC) UAC AG G
il complesso di inizio 70S, nel sito A (amminoacilico)
del ribosoma. AU G U C C A AG
l’fMet-tRNA.fMet si lega al 5¢ 3¢
codone AUG nel sito P mRNA
(peptidilico) del ribosoma. Codone: 1 2 3

3 Si forma il legame peptidico tra


i due amminoacidi adiacenti, ca-
talizzato dalla peptidil-transferasi.
6 Il ciclo di allungamento si ripete fino Gli amminoacidi uniti risultano
a incontrare un codone di stop. attaccati al tRNA sul sito A,
formando un peptidil-tRNA.
fMet Legame peptidico fMet

Ser Centro Ser


della peptidil-
transferasi
Sito E
vuoto
AG G UAC AG G
AU G U C C A AG AU G U C C A AG
5¢ 3¢ 5¢ 3¢
Codone: 1 2 3 Codone: 1 2 3
5 Quando la traslocazione è completata 4La traslocazione richiede EF-G e GTP
e il peptidil-tRNA si trova nel sito P, e si verifica con lo spostamento del riboso-
il tRNA scarico viene rilasciato ma di un codone verso destra e con il mo-
dal sito E e il ribosoma è pronto per vimento del peptidil-tRNA dal sito A
un altro ciclo di allungamento. al sito P. Il tRNA scarico si muove
fMet dal sito P al sito E.
Ser

Ciclo
Sito A Complesso
UAC EF-G
EF-G-GTP
vuoto
UAC AG G EF-G
AU G U C C A AG
5¢ 3¢
GTP
Codone: 1 2 3 GDP + P

corrispondenza del sito P del ribosoma (Figura 6.17, minoacil-tRNA si lega al codone nel sito A, l’idrolisi del
punto 1). Il codone successivo dell’mRNA si trova sul GTP determina il rilascio di EF-Tu-GDP. EF-Tu viene
sito A; nella Figura 6.17 questo codone (UCC) codifica riciclato, come mostra la Figura 6.17, punto 2. Inizial-
per la serina (Ser). mente, un secondo fattore di allungamento, EF-Ts, si le-
Successivamente, l’amminoacil-tRNA appropriato ga a EF-Tu e determina lo spostamento del GDP. In se-
(in questo caso, Ser-tRNA.Ser) si lega al codone esposto guito, il GTP si lega al complesso EF-Tu-EF-Ts gene-
nel sito A (Figura 6.17, punto 2). Questo amminoacil- rando il complesso EF-Tu-GTP con il rilascio simulta-
tRNA viene trasportato al ribosoma legato a EF-Tu- neo di EF-Ts. Un amminoacil-tRNA si lega a EF-Tu-
GTP, complesso formato dal fattore proteico di allunga- GTP e tale complesso può legarsi al sito A del ribosoma
mento EF-Tu e da una molecola di GTP. Quando l’am- quando risulta esposto il codone complementare. Negli
108 Capitolo 6

eucarioti il processo è molto simile: eEF-1A svolge il Capitolo 5). Dall’analisi della struttura ad alta risoluzio-
ruolo di EF-Tu, mentre eEF-1B svolge il ruolo di EF-Ts. ne della subunità ribosomale maggiore si è dedotto che la
peptidil-transferasi consiste esclusivamente di RNA.
La formazione del legame peptidico Il ribosoma man- L’RNA ribosomale interagisce anche con i tRNA quan-
tiene i due amminoacil-tRNA dei siti P e A nella posizio- do essi si legano e vengono rilasciati dal ribosoma.
ne corretta affinché si possa formare il legame peptidico Pertanto, al contrario di quanto ipotizzato in passato, le
tra i due amminoacidi (Figura 6.17, punto 3). I due pas- proteine ribosomali costituiscono le unità strutturali che
saggi coinvolti nella formazione di un legame peptidico facilitano l’organizzazione dell’rRNA negli elementi
sono mostrati nella Figura 6.18. In primo luogo viene funzionali chiave dei ribosomi.
rotto il legame tra l’amminoacido e il tRNA nel sito P; in Una volta formato il legame peptidico (vedi Figura
questo caso, la rottura avviene tra la fMet e il suo tRNA. 6.17, punto 3), nel sito P rimane un tRNA privo di ammi-
La seconda fase consiste nella formazione del legame noacido (un tRNA scarico), mentre il tRNA nel sito A, ora
peptidico tra la fMet, ormai libera, e la Ser attaccata al detto peptidil-tRNA, è attaccato ai primi due amminoaci-
tRNA nel sito A; tale reazione è catalizzata dalla pepti- di della catena polipeptidica, in questo caso fMet-Ser.
dil-transferasi.
Per molti anni si è pensato che questa attività enzima- La traslocazione Nell’ultima fase del ciclo di allunga-
tica fosse il risultato dell’interazione tra alcune proteine mento, la traslocazione (Figura 6.17, punto 4), il riboso-
ribosomali della subunità 50S, finché nel 1992 Harry ma si sposta di un codone lungo l’mRNA verso l’estre-
Noller e i suoi collaboratori scoprirono che, rimuovendo mità 3′. Nei batteri, la traslocazione richiede l’attività di
gran parte delle proteine dalla subunità ribosomale 50S, un altro fattore proteico di allungamento, EF-G. Un
e lasciando soltanto l’RNA ribosomale, si poteva ancora complesso EF-G-GTP si associa al ribosoma, il GTP
misurare un’attività peptidil-transferasica. Questa attivi- viene idrolizzato e il ribosoma si sposta, mentre il tRNA
tà veniva inoltre inibita dagli antibiotici cloramfenicolo e scarico viene rimosso dal sito P. È possibile che l’idroli-
carbomicina, entrambi noti per la loro specifica attività si del GTP modifichi la struttura di EF-G, facilitando l’e-
inibitoria nei confronti della peptidil-transferasi. Infine, vento di traslocazione. La traslocazione negli eucarioti è
l’attività peptidil-transferasica veniva persa quando simile; il fattore di allungamento è in questo caso eEF-2,
l’rRNA era trattato con ribonucleasi T1, che degrada che agisce in modo analogo a EF-G.
l’RNA, ma non le proteine. Tali risultati suggerirono che Il tRNA scarico si sposta dal sito P e si lega in modo
la molecola di rRNA 23S della subunità ribosomale transiente al sito E della subunità ribosomale 50S, bloc-
maggiore fosse intimamente coinvolta nell’attività pepti- cando il legame del successivo amminoacil-tRNA al sito
dil-transferasica, e che la molecola stessa potesse in ef- A finché la traslocazione non è completata e il peptidil-
fetti costituire l’enzima. In questo caso, dunque, l’rRNA tRNA non è legato in modo corretto al sito P. Successi-
agirebbe come un ribozima (un RNA catalitico; vedi vamente alla realizzazione di tali eventi, il tRNA scarico

a) Amminoacil-tRNA adiacenti legati b) Dopo la formazione del legame peptidico, nel sito P
all’mRNA sul ribosoma si trova un tRNA scarico e nel sito A un tRNA con due
amminoacidi legati tra loro (dipeptidil-tRNA)
Subunità CH3
50S S Legame peptidico
CH3 CH2
Peptidil-
S CH2
transferasi O H O
CH2 C N C C
H H NH
CH2 CH2OH CH2OH
O H
C
C N C C O H2N C C O H
H H H Formazione del legame C O
O O OH
peptidico catalizzata O
dalla peptidil-transferasi 5¢
5¢ 5¢
Sito P Sito A 5¢

Sito E H2O

UAC AG G UAC AG G

5¢ AU G UCC A AG 3¢ 5¢ AU G UCC A AG 3¢
mRNA
Subunità
30S Sito A con un dipeptidil-
Codone Codone nel sito P
Codone nel sito P Codone nel sito A tRNA; in questo caso,
successivo con il tRNA scarico
con fMet-tRNA.fMet con Ser-tRNA.Ser fMet-Ser-tRNA.Ser
(lisina)
Figura 6.18
La formazione del legame peptidico tra i primi due amminoacidi (fMet e Ser)
di una catena polipeptidica è catalizzata sul ribosoma dalla peptidil-transferasi.
Espressione genica: la traduzione 109

viene rilasciato dal ribosoma. Dopo la 5 ribosomi che stanno Catene Polipeptide
traslocazione, EF-G viene rilasciato e poi leggendo lo stesso RNA polipeptidiche completo
in maniera sequenziale nascenti
riciclato, come mostrato nella Figura 6.17,
punto 5. Durante la fase di traslocazione il Codone
di inizio 50S
peptidil-tRNA resta associato al suo codo-
ne sull’mRNA e, poiché il ribosoma si è AUG UAG
5¢ 3¢ mRNA
spostato, viene ora a trovarsi nel sito P (da tRNA
Codone di stop
qui il nome di sito peptidilico).
30S
Dopo il termine della traslocazione, il Movimento del ribosoma

sito A è libero. Un amminoacil-tRNA re- Figura 6.19


cante l’anticodone corretto si lega al nuo- Diagramma di un polisoma: diversi ribosomi che traducono
lo stesso mRNA in maniera sequenziale.
vo codone esposto a livello del sito A, rei-
terando il processo già descritto. L’intero
processo si ripete finché la traduzione termina a livello di ne di stop grazie all’aiuto di proteine denominate fattori
un codone di stop (Figura 6.17, punto 6). di rilascio (RF), che possiedono una forma che simula
Sia nei batteri sia negli eucarioti, una volta che il ri- quella del tRNA, comprese le regioni che riconoscono i
bosoma si è mosso dal sito di inizio sull’mRNA, si veri- codoni (Figura 6.20, punto 2), e che avviano una serie di
fica un altro evento di inizio. L’intero processo si ripete eventi specifici della terminazione. E. coli possiede tre
finché, tipicamente, non si arriva alla traduzione simulta- RF, due dei quali riconoscono i codoni di stop: RF1 rico-
nea dello stesso mRNA da parte di diversi ribosomi. Il nosce UAA e UAG, mentre RF2 riconosce UAA e UGA
complesso che si forma tra una molecola di mRNA e tut- (nella figura viene illustrato il legame tra RF1 e UAG). Il
ti i ribosomi che la stanno traducendo simultaneamente legame di RF1 o di RF2 a un codone di stop induce la
viene definito poliribosoma, o polisoma (Figura 6.19). peptidil-transferasi a tagliare il polipeptide dall’mRNA a
Ogni ribosoma di un polisoma traduce l’intero mRNA e livello del sito P (Figura 6.20, punto 3). Il polipeptide la-
produce un polipeptide completo. I poliribosomi consen- scia quindi il ribosoma.
tono la produzione rapida ed efficiente di un gran nume- Successivamente, RF3-GDP si lega al ribosoma, sti-
ro di polipeptidi da un singolo mRNA. molando il rilascio dell’RF dal codone di stop e dal ribo-
soma (Figura 6.20, punto 4). Il GTP sostituisce quindi il
GDP su RF3 e quest’ultimo idrolizza il GTP, evento che
Nota chiave permette il rilascio di RF3 dal ribosoma.
La traduzione è un processo complesso che richiede Una fase aggiuntiva importante è rappresentata dallo
molti RNA, fattori proteici ed energia. Il codone di smantellamento del complesso rimanente formato dalle
inizio AUG (metionina) segnala l’inizio della tradu- subunità ribosomali, dall’mRNA e dal tRNA scarico, af-
zione sia nei procarioti sia negli eucarioti. L’al- finché il ribosoma e il tRNA possano essere riciclati. In
lungamento è dovuto alla formazione di un legame E. coli il fattore di riciclaggio del ribosoma (RRF) – la
peptidico tra l’amminoacido attaccato al tRNA nel cui forma mima quella di un tRNA – si lega al sito A
sito A del ribosoma e il polipeptide in via di sintesi (Figura 6.20, punto 5). In seguito, si verifica il legame di
attaccato al tRNA nel sito P. La traslocazione avvie- EF-G, che causa la traslocazione del ribosoma e, di con-
ne quando il tRNA nel sito P, ormai scarico, viene ri- seguenza, lo spostamento di RRF nel sito P e del tRNA
lasciato dal ribosoma e quest’ultimo si sposta di un scarico nel sito E (Figura 6.20, punto 6). L’RRF rilascia
codone lungo l’mRNA. La terminazione è il risultato il tRNA scarico ed EF-G rilascia l’RRF, provocando la
dell’interazione tra un fattore di rilascio proteico e dissociazione delle due subunità ribosomali dall’mRNA
un codone di stop. (Figura 6.20, punto 7).
Negli eucarioti, il termine della traduzione è simile a
quanto avviene nei batteri. In questo caso, un solo fattore
di rilascio – il fattore di rilascio 1 eucariote (eRF1) – rico-
La fine della traduzione nosce tutti e tre i codoni di stop ed eRF3 induce gli even-
La fine della traduzione vie- ti di terminazione. Negli eucarioti si verifica il riciclaggio
nimazione ne segnalata da uno dei tre del ribosoma, ma non esiste un equivalente dell’RRF.
Terminazione codoni di stop (UAG, UAA e Come spiegato precedentemente, il polipeptide si ri-
MyLab
della traduzione UGA), uguali nei procarioti e piega durante il processo di traduzione. Nel Box 6.1 ven-
negli eucarioti (Figura 6.20, gono descritte ricerche recenti che dimostrano come due
punto 1). I codoni di stop non codificano per alcun am- polipeptidi con sequenza amminoacidica identica possa-
minoacido e, pertanto, nella cellula non esistono tRNA no ripiegarsi in modo da produrre polipeptidi con struttu-
con i relativi anticodoni. Il ribosoma riconosce un codo- re e funzioni diverse.
110 Capitolo 6

Ser
fMet

Sito P Molti 5 Il fattore di


Lys amminoacidi riciclaggio del
1 Incontro con ribosoma
un codone (RRF) si lega
di stop al sito A
Sito E RRF
Sito E Sito A
UUC UUC
... A AG UAG A AG UAG
5¢ 3¢ 5¢ ... 3¢

mRNA Codone
di stop
RF1 Fattore
di rilascio
(RF1)
Ser
fMet 6 EF-G-GTP si lega al ribo-
soma. L’idrolisi del GTP
Peptidil- a GDP provoca
2 Il fattore transferasi la traslocazione
Lys
di rilascio (RF1) del ribosoma,
si lega portando l’RRF
al codone nel sito P
di stop e il tRNA GDP
RRF EF-G
RF1 nel sito E
UUC UUC
A AG UA G A AG UA G
5¢ ... 3¢ 5¢ ... 3¢

Ser RRF
fMet tRNA scarico
Rilascio
7 L’RRF induce EF-G
della catena
Lys polipeptidica il rilascio del tRNA
C
OC scarico; successi- UU
HO vamente, EF-G GDP
induce il rilascio 50S
3 La catena
polipeptidica è dell’RRF e le due
stata rilasciata subunità riboso-
mali si dis-
sociano
dall’mRNA Sito Sito Sito
E P A
RF1
UUC
A AG UA G AG 3¢
5¢ ... 3¢ mRNA A AG U

5¢ ...
RF1
4 Legame di RF3-GDP, che
causa il rilascio di RF1. 30S
Il GDP viene sostituito
dal GTP, la cui idrolisi
determina il rilascio
di RF3. RF3–GDP
Figura 6.20
Terminazione della traduzione. Il ribosoma riconosce
un codone di stop (UAG) con l’aiuto dei fattori di rilascio.
UUC Un fattore di rilascio legge il codone di stop, scatenando
A AG UA G una serie di eventi di terminazione specifici che portano
5¢ ... 3¢
al rilascio del polipeptide completato. In seguito, le subunità
ribosomali, l’mRNA e il tRNA scarico si separano. Nei batteri
questo evento è stimolato dal fattore di riciclaggio
RF3
del ribosoma (RRF) e da EF-G.

Lo smistamento delle proteine nucleo, i mitocondri, i cloroplasti e i lisosomi. Lo smi-


stamento delle proteine nei compartimenti appropriati è
nella cellula sotto il controllo genetico, mediato da sequenze segna-
Nei batteri e negli eucarioti alcune proteine possono es- le specifiche (o “leader” delle proteine) che le dirigono
sere secrete, mentre negli eucarioti altre devono essere negli organelli corretti. Allo stesso modo, nei batteri al-
posizionate in diversi compartimenti cellulari come il cune proteine si localizzano nella membrana, mentre
Espressione genica: la traduzione 111

Box 6.1 Stessa sequenza amminoacidica, differenti strutture


e funzioni
In questo capitolo è stato spiegato che la sequen- ripiegamento del polipeptide non rappresenta
za amminoacidica di un polipeptide viene deter- unicamente una proprietà del polipeptide stesso;
minata dalla sequenza dei codoni nell’mRNA la al contrario, spesso tale processo di ripiegamento
quale, a sua volta, è legata alla sequenza delle coinvolge proteine accessorie, come le chaperoni-
coppie di basi della regione codificante di un ge- ne, e si verifica durante la traduzione, piuttosto
ne. È stato inoltre riportato che la sequenza am- che dopo la fine della sintesi del polipeptide. Circa
minoacidica di un polipeptide determina la moda- 20 anni fa, alcuni ricercatori ipotizzarono che le
lità di ripiegamento dello stesso e, quindi, la sua velocità di traduzione delle regioni di alcuni poli-
struttura tridimensionale e funzionale. Per decen- peptidi nella cellula influenzassero le modalità di
ni gli scienziati hanno creduto che ciò fosse vero. ripiegamento degli stessi. È noto che la velocità di
Tuttavia, nuove ricerche hanno dimostrato come spostamento del ribosoma lungo un particolare
sia possibile che due polipeptidi con sequenze am- mRNA non è costante. Alcune ricerche recenti
minoacidiche identiche assumano conformazioni hanno prodotto risultati che supportano tale ipo-
diverse e, di conseguenza, svolgano funzioni dif- tesi. I ricercatori hanno studiato due diverse muta-
ferenti. In che modo può realizzarsi tale condizio- zioni silenti nel gene umano MDR1 (gene della re-
ne? Una delle caratteristiche del codice genetico sistenza multipla ai farmaci); questo gene codifica
di cui si è discusso è la degenerazione, in virtù del- per un trasportatore di membrana, definito glico-
la quale per molti amminoacidi esiste più di un co- proteina-P, il quale agisce come una pompa per
done codificante (Figura 6.7). Pertanto, una varia- trasportare fuori della cellula diversi tipi di farma-
zione in una coppia di basi nella regione codifi- ci. L’entità della sua azione può quindi alterare
cante di un gene potrebbe sostituire un codone l’efficacia di particolari terapie farmacologiche,
dell’mRNA con un altro che codifica per lo stesso compresi alcuni trattamenti chemioterapici.
amminoacido. Tale mutazione puntiforme viene Tutte le mutazioni silenti sostituiscono un codone
definita mutazione silente e in questo caso il nuo- che viene letto rapidamente durante la traduzio-
vo codone viene denominato sinonimo rispetto al ne con uno che viene letto lentamente. Le glico-
codone selvatico. proteine-P prodotte nelle cellule mutate possede-
Due codoni codificanti per lo stesso amminoacido vano strutture diverse rispetto alla proteina selva-
possono però avere effetti diversi sulla traduzio- tica, mostrando, in particolare, alterazioni nei siti
ne. Vale a dire che le molecole di amminoacil- di legame di farmaci e di inibitori degli stessi.
tRNA non sono presenti tutte in ugual quantità. Pertanto, polipeptidi con la stessa sequenza am-
Se il codone sinonimo viene letto da un amminoa- minoacidica possono realmente ripiegarsi in mo-
cil-tRNA relativamente raro, mentre il codone sel- do differente nel corso della loro traduzione, ge-
vatico viene letto da un amminoacil-tRNA comu- nerando polipeptidi con strutture e funzioni di-
ne, la velocità di traduzione lungo il codone sarà verse. Ciò significa che le mutazioni silenti posso-
più lenta nel caso dell’mRNA mutato rispetto no influenzare la progressione di una malattia,
all’mRNA selvatico. Qual è l’importanza di tale nonché le modalità con cui i pazienti rispondono
evento? In questo capitolo è stato spiegato che il ai trattamenti farmacologici.

altre vengono secrete. Di seguito verranno descritte ne e la degradazione di questa estensione (Figura 6.21).
brevemente le modalità con cui si realizza la secrezione Per questo lavoro Blobel vinse il Premio Nobel per la
delle proteine da parte di una cellula eucariote. Tali Fisiologia o Medicina nel 1999.
proteine transitano attraverso il reticolo endoplasmati- La sequenza segnale di una proteina destinata al RE
co (RE) e l’apparato del Golgi. Nel 1975, Gunther consta di circa 15-30 amminoacidi all’estremità N-ter-
Blobel, Bernhard Dobberstein e i loro collaboratori minale. Quando la sequenza segnale viene tradotta ed
scoprirono che le proteine secrete e altre proteine smi- esposta sulla superficie del ribosoma, una particella di
state dal Golgi contengono inizialmente degli ammi- riconoscimento del segnale (SRP, un complesso di
noacidi aggiuntivi a livello di estremità ammino-termi- RNA e proteine) citoplasmatica si lega a essa e blocca
nale. Gli studi di Blobel portarono alla formulazione l’ulteriore traduzione dell’mRNA finché il complesso
dell’ipotesi del segnale, secondo la quale le proteine polipeptide nascente-SRP-ribosoma-mRNA non rag-
smistate dal Golgi si legano mediante un’estensione giunge il RE legandosi a esso (vedi Figura 6.21). La SRP
idrofobica ammino-terminale (la sequenza segnale) al- si lega a un recettore SRP nella membrana del RE, pro-
la membrana del RE. In seguito, avvengono la rimozio- muovendo un forte legame del ribosoma al RE, il rilascio
112 Capitolo 6


c ap
Il peptide segnale La SRP si lega al suo Il peptide segnale viene La traduzione è
mRNA emerge dal ribosoma recettore; la traduzione rimosso dal polipeptide, completata; le subunità
e viene legato dalla riprende indirizzando la cui sintesi continua ribosomali stanno
SRP; la traduzione il polipeptide nel lume per dissociarsi
Ribosoma si blocca del RE
all’inizio
della traduzione Peptide AAA 3¢
segnale
Particella Peptide
di riconoscimento segnale
del segnale (SRP)

a de l RE
bran Peptidasi
Mem del segnale Peptide segnale
legato alla peptidasi
Recettore SRP del segnale

Spazio delle cisterne del RE Polipeptide completo


rilasciato nel RE

Figura 6.21
Modello per il trasporto delle proteine all’interno del reticolo endoplasmatico negli eucarioti.

della SRP e la ripresa della traduzione. Il polipeptide na-


scente si estende attraverso la membrana del reticolo nel-
lo spazio delle cisterne. Nota chiave
Non appena la sequenza segnale viene a trovarsi in- Le proteine eucariote che entrano nel reticolo en-
teramente all’interno delle cisterne del RE, viene rimos- doplasmatico possiedono sequenze segnale alla lo-
sa dal polipeptide dall’enzima peptidasi del segnale. ro estremità N-terminale che le indirizzano in que-
Quando il polipeptide intero si trova completamente al- sto organello. La sequenza segnale si lega dappri-
l’interno delle cisterne del RE, viene di solito modificato ma a una particella di riconoscimento del segnale
mediante l’aggiunta di specifici gruppi glucidici dando (SRP), bloccando la traduzione. Successivamente, il
origine a una glicoproteina. Le glicoproteine vengono complesso si lega a un recettore SRP presente sulla
poi trasferite all’interno di vescicole all’apparato del membrana esterna del RE, la traduzione riprende e
Golgi, dove avviene la maggior parte del loro smista- il polipeptide viene traslocato nello spazio delle ci-
mento. Le proteine destinate a essere secrete, per esem- sterne del RE. Una volta nel RE, la sequenza segna-
pio, vengono immagazzinate in vescicole secretorie, le le viene rimossa dalla peptidasi del segnale. Le pro-
quali migrano verso la superficie della cellula, dove si teine vengono infine smistate dal complesso di
fondono con la membrana plasmatica rilasciando il loro Golgi verso le loro destinazioni finali.
contenuto proteico all’esterno della cellula.

Sommario
l Una proteina è formata da una o più subunità definite poli- noacido o segnala la terminazione della traduzione. Alcuni
peptidi, ciascuna a sua volta composta da subunità più pic- amminoacidi sono codificati da più di un codone. Tre codo-
cole, gli amminoacidi. Gli amminoacidi di un polipeptide ni vengono utilizzati per la terminazione della sintesi del
sono uniti insieme mediante legami peptidici. polipeptide nel corso della traduzione. Il codice è pressoché
l La sequenza amminoacidica di una proteina (la sua strut- universale e viene letto senza interruzioni lungo codoni suc-
tura primaria) ne determina la struttura secondaria, terzia- cessivi non sovrapposti.
ria e quaternaria e, nella maggior parte dei casi, lo stato l L’mRNA viene tradotto in una catena polipeptidica sui ri-
funzionale. bosomi. Gli amminoacidi necessari per la sintesi del poli-
l Il codice genetico è un codice a triplette, in cui ciascun co- peptide giungono al ribosoma su molecole di tRNA. La tra-
done di tre nucleotidi di un mRNA codifica per un ammi- duzione della sequenza amminoacidica corretta è garantita
Espressione genica: la traduzione 113
dal legame specifico di ogni amminoacido al suo particola- nel sito A del ribosoma e il polipeptide nascente sul tRNA
re tRNA e dal legame specifico tra il codone dell’mRNA e nel sito P adiacente. Una volta formato il legame peptidico,
l’anticodone complementare del tRNA. il ribosoma trasloca di un codone lungo l’mRNA preparan-
l Nei batteri e negli eucarioti AUG (metionina) rappresenta il dosi all’arrivo del tRNA successivo. Il tRNA entrante con il
codone di inizio per l’avvio della traduzione. Nei batteri l’i- suo amminoacido si lega al codone successivo occupando il
nizio della sintesi proteica richiede una sequenza a monte sito A. Fattori proteici, denominati fattori di allungamento
del codone AUG, a cui si lega la subunità minore del ribo- (EF), svolgono ruoli importanti in questa fase della tradu-
soma. Questo tratto a monte di AUG è la sequenza di Shine- zione.
Dalgarno, che si lega in maniera specifica all’estremità 3′ l La traduzione prosegue finché non viene raggiunto un co-
dell’rRNA 16S della subunità ribosomale minore, determi- done di stop (UAG, UAA o UGA) sull’mRNA. Tali codoni
nandone l’associazione con l’mRNA. Negli mRNA euca- vengono letti da fattori proteici di rilascio e il polipeptide
rioti non esiste alcuna sequenza equivalente dal punto di vi- viene rilasciato dal ribosoma. Successivamente, gli altri
sta funzionale; i ribosomi vengono invece caricati sul- componenti del macchinario di sintesi proteica si dissocia-
l’mRNA a livello dell’estremità 5′ e lo percorrono verso l’e- no e vengono riciclati in altri eventi di traduzione.
stremità 3′, iniziando la traduzione a livello del primo codo- l Negli eucarioti le proteine si trovano libere nel citoplasma
ne AUG. oppure sono posizionate in diversi compartimenti cellulari,
l Sia nei batteri sia negli eucarioti l’inizio della sintesi protei- come il nucleo, i mitocondri, i cloroplasti e le vescicole se-
ca richiede dei fattori proteici, definiti fattori di inizio (IF). cretorie. Esistono dei meccanismi che smistano le proteine
Questi ultimi si legano al complesso mRNA-ribosoma du- nel compartimento cellulare appropriato. Per esempio, le
rante la fase di inizio e si dissociano non appena è iniziata la proteine che devono essere secrete possiedono sequenze se-
sintesi della catena polipeptidica. gnale N-terminali che facilitano il loro ingresso nel reticolo
l L’allungamento della catena proteica comporta la forma- endoplasmatico al fine del loro smistamento successivo nel-
zione di un legame peptidico tra l’amminoacido sul tRNA l’apparato del Golgi e oltre.

Approccio analitico alla soluzione di problemi di genetica


D6.1 R6.2
a. Quanti dei 64 codoni si possono ottenere a partire dai tre a. La probabilità di trovare una U in ogni posizione del co-
nucleotidi A, U e G? done è 2/3, e la probabilità di trovare una C è 1/3. Perciò,
b. Quanti dei 64 codoni si possono ottenere a partire dai i codoni, le loro frequenze relative e gli amminoacidi per
quattro nucleotidi A, U, G e C, con una o più C in ciascun cui codificano sono:
codone?
UUU = (2/3)(2/3)(2/3) = 8/27 = 0,296 = 29,6% Phe
UUC = (2/3)(2/3)(1/3) = 4/27 = 0,148 = 14,8% Phe
R6.1
UCC = (2/3)(1/3)(1/3) = 2/27 = 0,0741 = 7,41% Ser
a. Questa domanda si riferisce al calcolo delle probabilità.
UCU = (2/3)(1/3)(2/3) = 4/27 = 0,148 = 14,8% Ser
Ci sono quattro basi, pertanto la probabilità di trovare una
CUU = (1/3)(2/3)(2/3) = 4/27 = 0,148 = 14,8% Leu
citosina nella prima posizione di un codone è 1/4.
CUC = (1/3)(2/3)(1/3) = 2/27 = 0,0741 = 7,41% Leu
All’inverso, la probabilità di trovare una base diversa dal-
CCU = (1/3)(1/3)(2/3) = 2/27 = 0,0741 = 7,41% Pro
la citosina in prima posizione è 1 – 1/4 = 3/4. Le stesse
CCC = (1/3)(1/3)(1/3) = 1/27 = 0,037 = 3,7% Pro
probabilità si applicano per le altre due posizioni nel co-
done. Pertanto, la probabilità di avere un codone privo di In totale, 44,4% Phe, 22,21% Ser, 22,21% Leu, 11,11%
citosina è (3/4)3 = 27/64. Pro. (Il totale non è esattamente 100 a causa degli errori di
b. Questa domanda si riferisce alla frequenza relativa di codo- arrotondamento.)
ni che possiedono una o più citosine. Abbiamo già calcola- b. La probabilità di trovare una U in ogni posizione del codo-
to la probabilità che un codone non possieda citosina, per- ne è 1/4, la probabilità di trovare una C è 1/4 e la probabi-
tanto tutti i codoni rimanenti possiedono una o più citosine. lità di trovare una G è 1/2. Pertanto, i codoni, le loro fre-
La risposta a questa domanda è quindi (1 – 27/64) = 37/64. quenze relative e gli amminoacidi per cui codificano sono:

D6.2 In alcuni degli esperimenti volti a decifrare il codice UUU = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Phe
genetico si utilizzarono dei copolimeri casuali. Per ognuna UUC = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Phe
delle seguenti miscele di ribonucleotidi, indicate i codoni at- UCU = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Ser
tesi e le relative frequenze e fornite le proporzioni attese di UCC = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Ser
amminoacidi che si troverebbero in un polipeptide la cui sin- CUU = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Leu
tesi fosse diretta dal copolimero in un sistema di sintesi pro- CUC = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Leu
teica cell-free. CCU = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Pro
a. 2 U : 1 C CCC = (1/4)(1/4)(1/4) = 1/64 = 1,56% Pro
b. 1 U : 1 C : 2 G UUG = (1/4)(1/4)(1/2) = 2/64 = 3,13% Leu
114 Capitolo 6

UGU = (1/4)(1/2)(1/4) = 2/64 = 3,13% Cys GGC = (1/2)(1/2)(1/4) = 4/64 = 6,25% Gly
UGG = (1/4)(1/2)(1/2) = 4/64 = 6,25% Trp UCG = (1/4)(1/4)(1/2) = 2/64 = 3,13% Ser
GUU = (1/2)(1/4)(1/4) = 2/64 = 3,13% Val UGC = (1/4)(1/2)(1/4) = 2/64 = 3,13% Cys
GUG = (1/2)(1/4)(1/2) = 4/64 = 6,25% Val CUG = (1/4)(1/4)(1/2) = 2/64 = 3,13% Leu
GGU = (1/2)(1/2)(1/4) = 4/64 = 6,25% Gly CGU = (1/4)(1/2)(1/4) = 2/64 = 3,13% Arg
GGG = (1/2)(1/2)(1/2) = 8/64 = 12,5% Gly GUC = (1/2)(1/4)(1/4) = 2/64 = 3,13% Val
CCG = (1/4)(1/4)(1/2) = 2/64 = 3,13% Pro GCU = (1/2)(1/4)(1/4) = 2/64 = 3,13% Ala
CGC = (1/4)(1/2)(1/4) = 2/64 = 3,13% Arg
CGG = (1/4)(1/2)(1/2) = 4/64 = 6,25% Arg In totale, 3,12% Phe, 6,25% Ser, 9,38% Leu, 6,25% Pro,
GCC = (1/2)(1/4)(1/4) = 2/64 = 3,13% Ala 6,26% Cys, 6,25% Trp, 12,51% Val, 25% Gly, 12,51%
GCG = (1/2)(1/4)(1/2) = 4/64 = 6,25% Ala Arg, 12,51% Ala.
Mutazione, riparazione del DNA
7 ed elementi trasponibili
La variazione genetica è il risultato Come avviene la riparazione del DNA?
di adattamento o di mutazione casuale?

Qual è l’effetto delle mutazioni sulla struttura Che cosa sono gli elementi trasponibili?
e sulla funzione dei polipeptidi?
Come possono revertire le mutazioni? In che modo gli elementi trasponibili
si muovono nel genoma?

Come si possono indurre mutazioni nel DNA? Quali elementi trasponibili si trovano
nei batteri?

Come possono essere individuati potenziali Quali elementi trasponibili si trovano negli
mutageni? eucarioti?

Come possono essere riconosciuti i mutanti?

Attività mosomico, si parla di mutazioni genomiche. In questo


Una mutazione in un gene può provocare capitolo tratteremo le mutazioni puntiformi, mentre le
un cambiamento in un fenotipo. Quali tipi di mu- altre mutazioni saranno descritte nel Capitolo 16. Una
tazioni si possono verificare nel nostro DNA? E mutazione puntiforme può cambiare il fenotipo dell’or-
quali effetti possono avere sulla salute? Nella pri-
ganismo colpito se si verifica nella regione codificante
ma iAttività di questo capitolo analizzerete i pos-
di un gene o nelle sequenze che lo regolano. Quindi, le
sibili rischi per la salute di mutazioni indotte dalla
contaminazione delle acque. In una seconda mutazioni puntiformi che hanno rivestito una particola-
iAttività osserverete un altro modo in cui il DNA re importanza per i genetisti sono le mutazioni geniche,
può modificarsi. Negli anni quaranta del secolo che hanno effetti sulla funzione dei geni. Una mutazio-
scorso, Barbara McClintock scoprì che i “geni sal- ne genica può alterare il fenotipo cambiando la funzione
tatori”, o elementi trasponibili, possono dare ori- di una proteina, come illustrato nella Figura 7.1. In que-
gine a mutazioni geniche, alterare l’espressione sto capitolo esamineremo alcuni meccanismi che causa-
genica e produrre diversi tipi di mutazioni cromo- no mutazioni puntiformi, alcuni sistemi di riparazione
somiche. In questa iAttività, avrete l’opportunità del danno genetico e alcuni metodi utilizzati per rileva-
di esplorare ulteriormente come un elemento tra- re mutanti genetici. Nello studio delle specifiche muta-
sponibile di E. coli si muova da un sito a un altro.
zioni puntiformi occorre tener presente che le mutazioni
sono la principale fonte di variabilità genetica in una
specie, e quindi sono elementi importanti nel processo
Il DNA può essere modificato in diversi modi, per cam- evolutivo.
biamenti spontanei, errori nella replicazione, o azione Cambiamenti genetici possono anche avvenire quan-
delle radiazioni o di particolari sostanze chimiche. A se- do particolari elementi genetici presenti nei cromosomi
conda della lunghezza del tratto di DNA oggetto di mu- dei procarioti e degli eucarioti si muovono da una posi-
tazione si parla di mutazioni puntiformi o cromosomi- zione a un’altra nel genoma. Questi elementi genetici
che. Le mutazioni puntiformi sono cambiamenti che mobili sono noti come elementi trasponibili, poiché il
riguardano solo una o poche coppie di basi; le mutazio- termine riflette gli eventi di trasposizione (cambiamento
ni cromosomiche coinvolgono interi cromosomi o loro di posizione) associati a questi elementi. La loro scoper-
porzioni. Quando le mutazioni coinvolgono interi geno- ta fu una grande sorpresa che modificava la visione clas-
mi, quindi implicano variazioni nell’intero assetto cro- sica dei geni e dei genomi e introduceva un nuovo feno-
116 Capitolo 7

Gene Figura 7.1


normale Concetto di mutazione nella
Prodotto genico Fenotipo
DNA normale regione di un gene che codifica
normale
per una proteina. (Si noti che non
Trascrizione tutte le mutazioni causano
Evento mutazionale e traduzione un’alterazione delle proteine
Prodotto genico e non tutte le mutazioni
anormale (parzialmente Fenotipo avvengono nella regione
funzionante o non alterato
Gene funzionante) o assente codificante.)
mutato

meno da prendere in considerazione nella formulazione molto più alto). Se la teoria dell’adattamento fosse cor-
di teorie sull’evoluzione dei genomi. In questo capitolo retta, una certa frazione delle cellule della quarta genera-
analizzeremo la natura degli elementi trasponibili e co- zione sarebbe indotta in quel momento a diventare resi-
me essi si spostano nel genoma. stente a T1 (Figura 7.2a). Di particolare importanza è il
fatto che quella frazione sarebbe identica per tutte le
Mutazione del DNA colture dello stesso tipo, perché l’adattamento non ha
inizio prima dell’aggiunta del fago T1. Al contrario, se
Adattamento versus selezione fosse corretta la teoria della mutazione spontanea, il nu-
Nella prima parte del XX secolo esistevano due scuole di mero di cellule della quarta generazione resistenti al fago
pensiero opposte a proposito della variazione dei caratte- T1 dipenderebbe da quando è comparsa nella coltura una
ri ereditari. Alcuni genetisti credevano che la variabilità mutazione casuale che conferisce resistenza a T1. Nel
tra gli organismi fosse dovuta a mutazioni spontanee e nostro esempio, se l’evento mutazionale è avvenuto nel-
casuali che alcune volte avevano carattere adattativo. la terza generazione, 2 cellule su 16 della quarta genera-
Altri credevano invece che la variabilità fosse conse- zione saranno resistenti (Figura 7.2b); se invece la muta-
guente ad adattamento, cioè che l’ambiente inducesse un zione è avvenuta nella prima generazione, saranno resi-
cambiamento ereditabile. La teoria dell’adattamento si stenti 8 cellule su 16 della quarta generazione (Figura
ricollega alla teoria lamarckiana, che prevede l’ereditabi- 7.2b). Il concetto base è che, se la teoria della mutazione
lità dei caratteri acquisiti. Alcune osservazioni ottenute spontanea è corretta, dovrebbe esserci una fluttuazione
in esperimenti con i batteri diedero vigore al dibattito. nel numero di cellule resistenti a T1 in quarta generazio-
Per esempio, se una coltura derivata da una singola cel- ne, perché la mutazione verso la resistenza a T1 è avve-
lula di E. coli viene piastrata in presenza di una grande nuta casualmente nella popolazione e non necessita del
quantità di batteriofago T1 virulento, la maggior parte contatto con il fago.
delle cellule verrà lisata. Tuttavia, poche cellule soprav- Luria e Delbrück dimostrarono una larga variabilità
viveranno e daranno origine a colonie resistenti al fago nel numero di colonie resistenti al fago ottenute in iden-
T1. Il carattere della resistenza è ereditabile. I sostenitori tiche colture. Questi risultati sostenevano l’ipotesi se-
della teoria dell’adattamento ritenevano che il carattere condo cui il meccanismo di mutazione era di tipo casua-
della resistenza fosse comparso come conseguenza della le e non adattativo.
presenza del fago T1 nell’ambiente. Quelli della teoria
della mutazione spontanea sostenevano che le mutazioni
avvengono casualmente, cosicché, in una popolazione di
cellule sufficientemente ampia, in ogni momento alcune
Nota chiave
cellule andrebbero incontro a mutazione diventando, per Le mutazioni possono dare origine a variazioni dei
esempio, resistenti al fago T1, pur non essendone mai caratteri ereditabili. La variabilità genetica non è
state in contatto. Quindi, se in un momento successivo un effetto dell’adattamento indotto dall’ambien-
venisse aggiunto il fago, verrebbe operata una selezione te, ma origina da mutazioni casuali e spontanee
delle cellule resistenti a T1. che l’ambiente seleziona.
L’acquisizione della resistenza a T1 venne utilizzata
da Salvador Luria e Max Delbrück nel 1943 per determi-
nare quale, fra il meccanismo della mutazione spontanea Definizione delle mutazioni
e quello dell’adattamento, fosse corretto. Il test da essi Una mutazione è un’alterazione della sequenza di basi
ideato è noto come test di fluttuazione. Consideriamo nel DNA.
una popolazione di E. coli originatasi per divisione da Una cellula con una mutazione è una cellula mutan-
un’unica cellula (Figura 7.2). Assumiamo che il fago T1 te. Se una mutazione avviene in una cellula somatica
venga aggiunto dopo 4 generazioni, quando vi sono 16 (negli organismi pluricellulari), si tratta di una mutazio-
cellule (nell’esperimento reale il numero delle cellule era ne somatica – quindi, le caratteristiche mutanti si mani-
Mutazione, riparazione del DNA ed elementi trasponibili 117

a) Generazione Generazione
0 0

1 1

Tempo 2 2

3 3

Aggiunta
4 4
del fago T1

b) Generazione Generazione
0 0

1 1

Tempo 2 2

3 3

Aggiunta
4 4
del fago T1

Figura 7.2
Rappresentazione di una popolazione in divisione di E. coli dalla presenza del fago T1 e quindi la frazione di cellule re-
selvatico, sensibile al fago T1. Alla quarta generazione viene sistenti sarebbe diversa nelle colture duplicate. A sinistra: se
aggiunto il fago T1. (a) Se la teoria dell’adattamento fosse una cellula muta diventando resistente al fago T1 nella terza
corretta, le cellule muterebbero solo con l’aggiunta del fago generazione, 2 cellule su 16 della quarta generazione
T1, quindi la frazione di cellule resistenti nelle colture dupli- saranno resistenti al fago. A destra: se una cellula diventa
cate sarebbe la stessa. (b) Se fosse corretta la teoria della mu- resistente al fago T1 nella prima generazione, 8 cellule su 16
tazione casuale, le cellule muterebbero indipendentemente della quarta generazione saranno resistenti a T1.

festano solo nell’individuo in cui è avvenuta la mutazio- purina-pirimidina, per esempio A-T con G-C. In parti-
ne, ma non vengono trasmesse alla generazione succes- colare, ciò significa che la purina in un filamento di
siva. Al contrario, una mutazione nella linea germinale DNA (A nell’esempio) è sostituita da un’altra purina,
di organismi che si riproducono sessualmente – una mu- mentre la pirimidina sul filamento complementare (T, la
tazione della linea germinale – può essere trasmessa at- base appaiata ad A) è scambiata con un’altra pirimidina.
traverso i gameti alla generazione successiva, dando ori- Una mutazione per transversione (Figura 7.3b) è una
gine a un individuo mutato sia nelle cellule somatiche sia mutazione che sostituisce una coppia purina-pirimidina
nelle germinali. con una coppia pirimidina-purina, come G-C con C-G o
Due diversi termini vengono utilizzati per dare una A-T con C-G. Nello specifico, questo significa che la
misura quantitativa dell’occorrenza di mutazioni. Il tas- purina su un filamento di DNA (A nel secondo esem-
so di mutazione è la probabilità che si verifichi un parti- pio) è sostituita da una pirimidina (C), mentre la pirimi-
colare tipo di mutazione in funzione del tempo, come il dina sul filamento complementare (T, la base appaiata
numero di mutazioni per coppia di nucleotidi per genera- ad A) è cambiata in una purina (G) in grado di appaiarsi
zione, o il numero per gene per generazione. La fre- con la pirimidina alterata.
quenza di mutazione è il numero di casi di un particola- Le mutazioni per sostituzione di una coppia di basi in
re tipo di mutazione, espresso come proporzione di cel- geni codificanti per una proteina possono essere definite
lule o di individui nella popolazione, come il numero di a seconda dell’effetto che hanno sulla sequenza di ammi-
mutazioni per 100 000 organismi o il numero per 1 mi- noacidi. A seconda di come la base sostituita viene tra-
lione di gameti. dotta secondo il codice genetico, la mutazione potrà ave-
re effetti che vanno da nessun cambiamento nella protei-
Tipi di mutazioni puntiformi Le mutazioni puntifor- na, a un cambiamento poco rilevante, a uno con conse-
mi possono essere divise in due grandi categorie: le so- guenze gravi.
stituzioni di coppie di basi e le inserzioni o delezioni di Una mutazione missenso (Figura 7.3c) è una muta-
coppie di basi. Una mutazione per sostituzione di una zione genica nella quale una sostituzione di una coppia di
coppia di basi è un cambiamento nel DNA tale che una basi nel DNA causa un cambiamento nel codone del-
coppia di basi viene rimpiazzata da un’altra. Vi sono l’mRNA, con il risultato che nel polipeptide viene inseri-
due tipi di tali sostituzioni. Una mutazione per tran- to un amminoacido differente. Il fenotipo potrà cambiare
sizione (Figura 7.3a) è una mutazione che sostituisce o meno a seconda del tipo di amminoacido inserito. Nella
una coppia di basi purina-pirimidina con un’altra coppia Figura 7.3c, una transizione da A-T a G-C cambia
118 Capitolo 7

Sequenza di parte Sequenza Figura 7.3


di un gene normale di un gene mutato Tipi di mutazioni per sostitu-
zione di una coppia di basi.
a) Mutazione per transizione (da A-T a G-C in questo esempio) La trascrizione del segmento
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A AGA A T T T A CG 3¢ mostrato produce un mRNA
DNA
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGAG T T C T T A A A T GC 5¢ con sequenza
5’…UCUCAAAAAUUUACG…3’,
b) Mutazione per transversione (da C-G a G-C in questo esempio)
che codifica per …-Ser-Gln-Lys-
Phe-Thr-…
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T GA A A A A T T T A CG 3¢
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGA C T T T T T A A A T GC 5¢

o UGA). Per esempio, nella Fi-


c) Mutazione missenso (sostituzione di un amminoacido con un altro; qui una tran-
sizione da A-T a G-C cambia il codone per la lisina in quello per l’acido glutammico)
gura 7.3d, una transversione da
A-T a T-A cambia il DNA da
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A AGA A T T T A CG 3¢
DNA
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGAG T T C T T A A A T GC 5¢
5′-AAA-3′ 5′-TAA-3′
mRNA 5′ UCUCAAAAAUUUACG 3′ 5′ UCUCAAGAAUUUACG 3′ a , e
3′-TTT-5′ 3′-ATT-5′
Proteina ... Ser Gln Lys Phe Thr ... ... Ser Gln Glu Phe Thr ...
ciò modifica il codone del-
d) Mutazione nonsenso (sostituzione di un amminoacido con un codone di stop; l’mRNA da 5′-AAA-3′ (lisina) a
qui una mutazione per transversione da A-T a T-A cambia il codone per la lisina 5′-UAA-3′, che è un codone di
nel codone di stop UAA)
stop. Una mutazione nonsenso dà
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A A T A A T T T A CG 3¢
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGAG T T A T T A A A T GC 5¢
origine alla terminazione prema-
5′ UCUCAAAAAUUUACG 3′ 5′ UCUCAAUAAUUUACG 3′
tura della catena polipeptidica,
... Ser Gln Lys Phe Thr ... ... Ser Gln Stop quindi, invece del prodotto com-
pleto, verrà rilasciato dai ribosomi
e) Mutazione neutra (sostituzione di un amminoacido con un altro con proprietà un frammento troncato del poli-
chimiche simili; qui una mutazione per transizione da A-T a G-C cambia il codone peptide, spesso non funzionale,
per la lisina in uno per l’arginina)
(Figura 7.4).
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A A AGA T T T A CG 3¢ Una mutazione neutra (Figu-
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGAG T T T C T A A A T GC 5¢
ra 7.3e) è una sostituzione di una
5′ UCUCAAAAAUUUACG 3′ 5′ UCUCAAAGAUUUACG 3′
... Ser Gln Lys Phe Thr ... ... Ser Gln Arg Phe Thr ... coppia di basi in un gene che cam-
bia un co-
f) Mutazione silente (cambiamento nel codone che non comporta un cambiamento
done nel- nimazione
dell’amminoacido; qui una mutazione da A-T a G-C in terza posizione del codone l’mRNA,
forma un codone che codifica ancora per la lisina)
ma l’ammi-
Mutazioni
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A A A AG T T T A CG 3¢ noacido ri-
nonsenso
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ AGAG T T T T C A A A T GC 5¢
sultante non
e mutazioni
5′ UCUCAAAAAUUUACG 3′ 5′ UCUCAAAAGUUUACG 3′ nonsenso MyLab
determina
... Ser Gln Lys Phe Thr ... ... Ser Gln Lys Phe Thr ... di tipo
alcuna alte-
razione nel-
soppressore
g) Mutazione frameshift (inserzione o delezione di una o più coppie di basi che
alterano la fase di lettura; qui l’inserzione di una coppia di basi G-C scombina la funzione
il messaggio a valle della glutammina) della proteina prodotta. Una muta-
5¢ T C T C A A A A A T T T A CG 3¢ 5¢ T C T C A A G A A A T T T A C G 3¢ zione neutra è un tipo di mutazio-
3¢ AGAG T T T T T A A A T GC 5¢ 3¢ A G A G T T C T T T A A A T G C 5¢
ne missenso, nella quale il codone
5′ UCUCAAAAAUUUACG 3′ 5′ U C U C A A G A A A U U U A C G 3′
mutato codifica per un amminoa-
... Ser Gln Lys Phe Thr ... ... Ser Gln Glu Ile Tyr ...
cido diverso, ma chimicamente
equivalente a quello originario.
Nella Figura 7.3e, una transizione da A-T a G-C
5′-AAA-3′ 5′-GAA-3′
il DNA da a , cambiando una cambia un codone da 5′-AAA-3′ (lisina) a 5′-AGA-3′
3′-TTT-5′ 3′-CTT-5′
(arginina). Dato che arginina e lisina hanno proprietà
base del codone dell’mRNA da una purina all’altra. In simili – entrambi sono amminoacidi basici – la funzio-
questo caso il codone dell’mRNA varia da 5′-AAA-3′ ne della proteina può non essere alterata in modo signi-
(lisina) a 5′-GAA-3′ (acido glutammico). ficativo.
Una mutazione nonsenso (Figura 7.3d) è una mu- Una mutazione silente (Figura 7.3f) – nota anche
tazione genica nella quale un cambiamento in una cop- come mutazione sinonima – è una mutazione che cambia
pia di basi altera un codone di mRNA per un ammi- una coppia di basi in un gene, ma il codone alterato
noacido in un codone di stop (nonsenso: UAG, UAA nell’mRNA codifica per lo stesso amminoacido nella
Mutazione, riparazione del DNA ed elementi trasponibili 119
Gene normale che codifica per una proteina Gene mutato
Evento mutazionale
Filamento 3′ GGA TTC 5′ 3′ GGA ATC 5′
stampo
di DNA Trascrizione Trascrizione
e traduzione e traduzione

5' 5' 5'

Fattore di
rilascio
GGA UUC GGA
mRNA 5′ CCU AAG 3′ mRNA 5′ CCU UAG 3′
Codone Codone alterato
senso nonsenso

La traduzione La traduzione si interrompe


prosegue prematuramente

Si forma un polipeptide incompleto


Si forma un polipeptide completo

Figura 7.4
Mutazione nonsenso e sue conseguenze sulla traduzione.

proteina. La proteina in questo caso è ovviamente identi- DNA, non ci sarà frameshift ma la delezione o l’inser-
ca a quella selvatica. Per esempio, nella Figura 7.3f, una zione del numero corrispondente di amminoacidi. Le
mutazione silente è causata dalla transizione da A-T a G- mutazioni frameshift sono state uno degli elementi che
C che cambia il codone 5′-AAA-3′ in 5′-AAG-3′, en- hanno permesso di determinare che il codice genetico è
trambi codificanti per la lisina. Le mutazioni silenti av- basato su triplette (Capitolo 6).
vengono spesso attraverso cambiamenti a carico della In conclusione, le mutazioni sono classificate sulla
terza posizione – oscillante – di un codone. Ciò è com- base dell’effetto sul DNA (puntiformi o cromosomiche,
prensibile alla luce del fenomeno noto come degenera- sostituzione o inserzione/delezione, transizione o tran-
zione del codice genetico (vedi Figura 6.7 e Capitolo 6). sversione) o sulla proteina codificata (nonsenso, missen-
Se una o più coppie di basi vengono aggiunte o dele- so, neutra, silente e frameshift). Le mutazioni possono
te da un gene che codifica per una proteina, la fase di let- essere classificate anche sulla base della causa di insor-
tura dell’mRNA risulterà cambiata dal punto della muta- genza (spontanee o indotte), come vedremo più avanti.
zione in poi. Per esempio, l’aggiunta o la delezione di
una coppia di basi fanno slittare la fase di lettura della re-
gione a valle dell’mRNA di una base, cosicché vengono Nota chiave
incorporati nel polipeptide amminoacidi sbagliati dal La mutazione è il processo che altera la sequenza
punto della mutazione in poi. Questo tipo di mutazione, di coppie di basi in una molecola di DNA. Le muta-
detto mutazione frameshift o scivolamento della corni- zioni che alterano una singola coppia di basi del
ce di lettura (Figura 7.3g), di solito rende non funziona- DNA vengono chiamate mutazioni per sostituzione
le la proteina. Spesso, le mutazioni frameshift generano di basi. Mutazioni per sostituzione di basi e inser-
nuovi codoni di stop, che daranno origine a una proteina zioni/delezioni di una singola coppia di basi vengo-
troncata; in alternativa possono far continuare la sintesi no definite mutazioni puntiformi. Le mutazioni
oltre il normale codone di stop, dando origine a un poli- che interessano la sequenza dei geni sono dette
peptide più lungo del normale; oppure possono determi- mutazioni geniche.
nare un’alterazione significativa della sequenza di am-
minoacidi di un polipeptide. Nella Figura 7.3g, l’inser-
zione di una coppia di basi G-C altera il messaggio a val- Reversioni e mutazioni di tipo soppressore Le muta-
le del codone che specifica la glutammina. Dato che ogni zioni puntiformi possono essere divise in due classi in
codone consiste di tre basi, lo scivolamento della cornice base ai loro effetti sul fenotipo: (1) le mutazioni in
di lettura origina dall’inserzione o dalla delezione di un avanti causano un cambiamento dal gene selvatico al
numero di basi nel DNA non divisibile per tre. Se la de- mutante; (2) le mutazioni per reversione (note anche
lezione o l’inserzione riguardano una o più triplette nel come reversioni o mutazioni di ritorno) determinano
120 Capitolo 7

una modifica di un gene mutato agendo nello stesso sito esempio, un gene per un tRNA per la tirosina (che ha
della prima mutazione cosicché la sua funzione ritorna l’anticodone 3′-AUG-5′) muta cosicché il tRNA abbia
quella del gene selvatico. La reversione di una mutazio- l’anticodone 3′-AUC-5′, il tRNA mutato (che continua a
ne nonsenso, per esempio, avviene quando un cambia- portare tirosina) leggerà il codone nonsenso 5′-UAG-3′.
mento di una coppia di basi in corrispondenza di un co- Così, anziché terminare la traduzione, verrà inserita una
done nonsenso nell’mRNA ne ripristina uno che può tirosina in quel punto della proteina (Figura 7.5).
nuovamente codificare per un amminoacido. Se la rever- Tuttavia si pone un problema: se la mutazione del
sione riporta alla codifica dell’amminoacido originale gene codificante per lo specifico tRNA per la tirosina fa
presente nel selvatico, la mutazione è una vera reversio- sì che il suo anticodone sia complementare a un codone
ne. Se la reversione porta alla codifica di un amminoaci- nonsenso, esso non potrà leggere il codone originale,
do diverso, la mutazione è una reversione parziale, che specifico per l’amminoacido che trasporta. La soluzio-
può però restaurare parzialmente o completamente la ne di questo problema viene dalla scoperta che i tRNA
funzionalità della proteina. La reversione di mutazioni soppressori di nonsenso vengono prodotti di solito per
missenso può avvenire nello stesso modo. mutazione in geni di tRNA che sono ridondanti nel ge-
Gli effetti di una mutazione possono essere ridotti o noma. In altre parole, due o più geni diversi codificano
aboliti da una mutazione di tipo soppressore, che è una tutti per la stessa specie di tRNA per la tirosina. Se av-
mutazione in un sito diverso da quello della mutazione viene una mutazione in uno di questi geni ridondanti,
originaria. La mutazione di tipo soppressore maschera gli altri geni che specificano lo stesso tRNA continua-
o compensa gli effetti della prima mutazione, ma non la no a produrre molecole che interpretano il normale co-
fa revertire. done per la tirosina.
Le mutazioni di tipo soppressore possono avvenire
all’interno dello stesso gene nel quale si trova la prima
mutazione ma in un sito diverso (soppressori intrageni- Nota chiave
ci), oppure in un gene diverso (soppressori intergenici).
Le reversioni sono mutazioni che avvengono nel
Sia i soppressori intragenici sia quelli intergenici agisco-
medesimo sito di una mutazione originale e deter-
no riducendo o eliminando l’effetto deleterio della muta-
minano il cambiamento del genotipo da mutante a
zione originale. Tuttavia, il meccanismo di azione dei
selvatico. Una mutazione di tipo soppressore è una
due tipi di soppressori è completamente diverso.
mutazione in un secondo sito che ristabilisce com-
I soppressori intragenici agiscono alterando un diver-
pletamente o parzialmente la funzione che era sta-
so nucleotide all’interno dello stesso codone nel quale è
ta alterata dalla prima mutazione. I soppressori in-
avvenuta la mutazione originale, oppure alterando un
tragenici sono mutazioni di tipo soppressore che
nucleotide in un differente codone. Un esempio del se-
avvengono all’interno dello stesso gene nel quale
condo caso è la soppressione di una mutazione frame-
era avvenuta la prima mutazione, ma in un sito dif-
shift per inserzione di una coppia di basi mediante una
ferente. I soppressori intergenici sono mutazioni di
delezione di una coppia di basi nelle vicinanze (vedi
tipo soppressore che avvengono in un gene sop-
Capitolo 6; Figura 6.5).
pressore – cioè un gene diverso da quello nel qua-
La soppressione intergenica avviene come risultato
le era avvenuta la mutazione originaria.
di una seconda mutazione in un gene diverso. I geni che
causano la soppressione di mutazioni in altri geni ven-
gono chiamati geni soppressori. Per esempio, nel caso
dei soppressori di mutazioni nonsenso, specifici geni
codificanti per tRNA mutano in modo che i loro antico-
Mutazioni spontanee o indotte
doni riconoscano come codificante per un amminoacido La mutagenesi, il processo responsabile della creazione
anche un codone di stop nell’mRNA. Di conseguenza, di mutazioni, può avvenire spontaneamente o essere in-
invece di terminare precocemente la sintesi della catena dotta. Le mutazioni spontanee avvengono naturalmen-
polipeptidica in corrispondenza del codone nonsenso, il te. Le mutazioni indotte avvengono quando un organi-
tRNA alterato (soppressore) inserisce un amminoacido smo è esposto deliberatamente o casualmente ad agenti
in quella posizione e questo amminoacido può riportare fisici o chimici, noti come mutageni, che interagiscono
alla funzionalità totale o parziale del polipeptide. con il DNA causando mutazioni. Le mutazioni indotte
Questo processo di soppressione non è molto efficiente, avvengono di solito con frequenza molto maggiore delle
ma lo è a sufficienza per produrre una quantità di poli- mutazioni spontanee e perciò si sono dimostrate molto
peptide funzionale e far revertire, almeno parzialmente, utili negli studi di genetica.
il fenotipo.
Vi sono tre classi di soppressori nonsenso, una per Mutazioni spontanee Tutti i tipi di mutazioni puntifor-
ogni tipo di codone di stop UAG, UAA e UGA. Se, per mi possono avvenire spontaneamente. Le mutazioni
Mutazione, riparazione del DNA ed elementi trasponibili 121

Gene normale che codifica per una proteina Gene mutato


Evento mutazionale
Filamento 3′ GGA TTC 5′ 3′ GGA ATC 5′
stampo
di DNA Trascrizione Trascrizione e
e traduzione traduzione dell’mRNA
con il codone nonsenso
Lys Tyr

5′ 5′ 5′ 5′
Anticodone
alterato
dalla mutazione
GGA UUC G G A AU C nel gene per il tRNA
mRNA 5′ CCU AAG 3′ mRNA 5′ CCU UAG 3′
Codone Codone alterato in
senso codone nonsenso

La traduzione Non vi è terminazione


prosegue precoce della traduzione

Si forma un polipeptide Viene sintetizzato


completo un polipeptide completo
con un amminoacido non corretto

Figura 7.5
Meccanismo di azione di un soppressore intergenico di muta- che l’anticodone del tRNA vari da 3’-AUG-5’ a 3’-AUC-5’, può
zione nonsenso, dovuto a mutazione in un gene per un tRNA. leggere un codone nonsenso UAG, inserendo tirosina nella
In questo esempio, un gene per un tRNA.Tyr, mutato in modo posizione corrispondente del polipeptide.

spontanee possono avvenire durante la replicazione del normale appaiamento, secondo Watson e Crick, di T con
DNA o nelle altre fasi della crescita e della divisione cel- A e C con G (Figura 7.6a). Tuttavia, un appaiamento er-
lulare. Le mutazioni spontanee possono anche essere rato può avvenire se la base si trova in una forma tauto-
causate da movimenti di elementi genetici trasponibili, merica rara, detta enolica. Le Figure 7.6b e 7.6c mostra-
argomento che verrà trattato più oltre in questo capitolo. no gli appaiamenti errati causati da purine o da pirimidi-
Nell’uomo, il tasso di mutazione spontanea di geni ne nello stato tautomerico raro.
singoli varia tra 10–4 e 4 × 10–6 per gene per generazione. La Figura 7.7 illustra come una mutazione può esse-
Per gli eucarioti in generale, il tasso di mutazione spon- re conseguenza di un appaiamento errato derivante dalla
tanea è compreso tra 10–4 e 10–6 per gene per generazio- transizione di una base a un suo raro stato tautomerico.
ne, e per i batteri e i fagi il tasso è compreso tra 10–5 e In questo esempio, la forma tautomerica rara della T for-
10–7 per gene per generazione. (Le frequenze di mutazio- ma un appaiamento errato con la G del filamento com-
ni spontanee in loci specifici per diversi organismi sono plementare del DNA. Se l’appaiamento errato non viene
riportate in Tabella 21.6). Questi valori di tassi e fre- riparato, una mutazione per transizione da G-C ad A-T
quenza di mutazione si riferiscono alle mutazioni che si avrà luogo nel successivo ciclo di replicazione.
fissano nel DNA, cioè divengono ereditabili. La maggior Durante la replicazione possono avvenire sponta-
parte degli errori che avvengono spontaneamente è cor- neamente piccole inserzioni e delezioni (Figura 7.8).
retta dai sistemi di riparazione del DNA, che verranno Queste possono aver luogo a causa di un anomalo av-
trattati più oltre in questo capitolo. Solo pochi rimango- volgimento che interessa o lo stampo di DNA o il fila-
no non corretti, come cambiamenti permanenti. mento in crescita, generalmente in regioni dove vi sono
sequenze formate da una base ripetuta. Se l’ostacolo si
Errori nella replicazione del DNA Le mutazioni per trova sullo stampo, la DNA polimerasi salta la o le basi
sostituzione di coppie di basi – cioè le mutazioni punti- interessate, e ciò causerà una mutazione per delezione.
formi che implicano cambiamenti da una coppia di basi Se la DNA polimerasi sintetizza una o più basi che non
a un’altra – possono avvenire se si verifica un appaia- sono presenti sullo stampo, questo nuovo DNA ridon-
mento errato durante la replicazione del DNA. Chimica- dante rappresenterà un’inserzione. Se avvengono nella
mente, ogni base può esistere in stati alternativi, detti regione codificante di un gene strutturale, queste inser-
tautomeri. Quando una base cambia stato si dice che ha zioni o delezioni nel DNA daranno luogo a mutazioni
cambiato forma tautomerica. Nel DNA, la forma usuale frameshift, a meno che le basi inserite o delete siano 3 o
di ogni base è quella chetonica, che è responsabile del un suo multiplo.
122 Capitolo 7

a) Normale appaiamento secondo Watson e Crick tra le forme normali delle pirimidine e delle purine Figura 7.6
Appaiamenti delle basi
H H
nel DNA che seguono
CH3 O H N N H N H O N o non seguono la regola
di Watson e Crick.
N N
H T N H N A H C N H N G
dR dR
N N N N
dR O H dR O H N
H

b) Appaiamento che non segue la regola di Watson e Crick tra pirimidine normali e forme rare delle purine

H H
CH3 O H O N H N H N N

N N
H T N H N G H C N H N A
dR dR
N N N N
dR O H N dR O H
H
Timina Rara forma enolica Citosina Rara forma imminica
normale della guanina normale dell’adenina

c) Appaiamento che non segue la regola di Watson e Crick tra forme rare delle pirimidine e purine normali

H H
H N H N N CH3 O H O N

N N
H C N H N A H T N H N G
dR dR
N N N N
dR O H dR O H N
H
Rara forma imminica Adenina Rara forma enolica Guanina
della citosina normale della timina normale

a) b) c) d) Figura 7.7
La guanina Appaiamento Transizione da G-C ad Produzione di una mutazio-
si appaia errato G-T dopo A-T dopo un’ulteriore ne causata da appaiamento
con la T la replicazione replicazione errato conseguente a un’ec-
cezione alla regola di
ACGT C Watson e Crick. I dettagli
T G C A G Selvatico sono spiegati nel testo.
ACGT C
TGT AG
T AT C
G

ACA TC
5¢ 3¢ Replicazione Mutante
G

TGT AG
ACGT C del DNA AC
TGCAG TG Replicazione
G AG

3¢ 5¢ del DNA
C
TC

DNA ACGT C
parentale Selvatico
A CGT C TGCAG
T GCAG

Prima generazione ACGT C


della progenie T G C A G Selvatico

Seconda generazione
della progenie

Gli errori della replicazione possono essere riparati dai DNA, attraverso la rottura del legame che la lega al de-
sistemi di correzione degli appaiamenti errati (che pren- sossiribosio, generando pertanto un sito apurinico. La
deremo in esame più oltre in questo capitolo). depurinazione avviene perché il legame covalente tra lo
zucchero e la base purinica è molto meno stabile di quel-
Cambiamenti chimici spontanei La depurinazione e la lo tra una pirimidina e lo zucchero e tende a rompersi.
deamminazione di particolari basi sono due dei più co- Normalmente una cellula di mammifero perde migliaia
muni eventi chimici che producono mutazioni sponta- di purine per depurinazione in un ciclo cellulare. Se que-
nee. Nella depurinazione una purina viene rimossa dal ste lesioni non sono riparate, viene a mancare una base
Mutazione, riparazione del DNA ed elementi trasponibili 123

Filamento 5¢ ... 3¢
neosintetizzato AG T C G C A T AG T T
T C A G C G T A T C A AA AACGTCGA TC
Filamento stampo 3¢ ... ... 5¢
Protrusione
del filamento
neosintetizzato
5¢ ... 3¢ 5¢ ... 3¢
T
AG T C G C A T AG T T AG T C G C A T AG T T T T
T C A G C G T A T C A A A ACGTCGATC T C A G C G T A T C A A A AACGTCGATC
3¢ ... A ... 5¢ 3¢ ... ... 5¢
Protrusione
del filamento stampo
Inserzione di una base
Delezione di una base nel nuovo filamento
nel nuovo filamento
5¢ ... ... 3¢ 5¢ ... ... 3¢
T
AG T C G C A T AG T T T T G C AG C T AG AG T C G C A T AG T T T T T G C AG C T AG
T C AG C G T A T C AA AA C G T C GA T C T C AG C G T A T C AA AAA C G T C GA T C
3¢ ... A ... 5¢ 3¢ ... ... 5¢

Figura 7.8
Origine spontanea di mutazioni per inserzione o delezione in seguito a un errato
posizionamento del DNA durante la replicazione.

che serva da stampo per la base complementare durante Mutazioni per depurinazione e deamminazione possono
la replicazione del DNA e ciò farà sì che la DNA polime- essere riparate dal sistema di escissione di basi (vedi più
rasi si arresti o si dissoci dal DNA. avanti nel presente capitolo).
La deamminazione è la rimozione di un gruppo am-
minico da una base. Per esempio la deamminazione del- Mutazioni indotte Si possono indurre mutazioni espo-
la citosina produce uracile (Figura 7.9a), che non è una nendo gli organismi a mutageni fisici, come le radiazio-
normale base del DNA, anche se è una normale base ni, o a mutageni chimici. Le mutazioni indotte delibera-
dell’RNA. Un sistema di riparazione rimuove la mag- tamente hanno avuto, e continuano ad avere, un ruolo
gior parte dell’uracile nel DNA, minimizzando quindi le importante nello studio della genetica. Dato che il tasso
conseguenze mutazionali della deamminazione della ci- di mutazione spontanea è basso, i genetisti generalmente
tosina. Tuttavia, se l’uracile non viene rimosso, un’ade- utilizzano mutageni per elevare la frequenza di mutazio-
nina verrà incorporata durante la replicazione nella po- ne, così da ottenere un numero significativo di organismi
sizione complementare del filamento neosintetizzato, mutati nel gene che stanno studiando.
determinando una mutazione di C-G in T-A per tran-
sizione.
Il DNA dei procarioti e degli eucarioti contiene una a) Deamminazione della citosina a uracile
piccola quantità della base modificata 5-metilcitosina NH2 O
(5mC) (Figura 7.9b) in sostituzione della citosina stan- H H H
4 4
N3 N3
dard. La deamminazione della 5mC produce timina 5
Deamminazione 5
2
1 6 2 1 6
(Figura 7.9b), determinando il cambiamento dalla cop- O N H O N H
pia G-5mC in G-T. Se tale appaiamento scorretto non è
riparato, al successivo ciclo di replicazione G sarà uno Citosina Uracile
stampo per C, mentre T deteminerà l’incorporazione di
A nel filamento di nuova sintesi. La conseguenza è che
una delle molecole sintetizzate avrà il normale appaia-
b) Deamminazione della 5-metilcitosina (5mC) a timina
mento G-C, mentre l’altra, mutante, porterà A-T. Di con-
NH2 Gruppo O
seguenza, la deamminazione della 5mC determina muta- metilico
zioni per transizione da G-C ad A-T. Dato che una gran- CH3 H CH3
N3 4
5 N3 4
Deamminazione 5
de quantità di altri tipi di mutazioni è corretta da mecca- 2 6 2 6
1
nismi di riparazione, ma le mutazioni per deamminazio- O N H O
1
N H
ne di 5mC lo sono molto meno, i punti del genoma dove
si trovano 5mC sono spesso punti caldi mutazionali (hot 5-metilcitosina (5mC) Timina (T)

spots), cioè nucleotidi in corrispondenza dei quali la mu- Figura 7.9


tazione avviene con una frequenza superiore alla media. Cambiamenti nelle basi del DNA in seguito a deamminazione.
124 Capitolo 7

O O UV O O