METODOS DE CONTEO EN PLACA EN LA LECHE

Álvarez, Pilar; Fernández, Massiel; Martínez, Neila; Nandar, Yessica

Curso: microbiología de alimentos, Grupo: A (Microbiología), Departamento de Ciencias Básicas,
Universidad de Pamplona

RESUMEN: Las características nutricionales de la leche la convierte en un alimento completo para los seres
humanos en sus primeras etapas de vida, esto mismo lo convierte en un medio de cultivo idóneo para múltiples
microorganismos. En la antigüedad ya se aprovechaba esta microbiota para la elaboración de yogures, kumis,
quesos y demás productos lácteos. En el laboratorio se trabajó con leche cruda de cantina expedida por vehículos
repartidores en la cuidad de Pamplona, Norte de Santander. Se tomó una muestra homogénea de leche y se
realizaron 6 diluciones consecutivas de la cuales las ultima 3 diluciones se sembraron en cajas de SPC y PDA con
el fin de evaluar la cantidad de Aerobios mesofilos, mohos y levaduras presentes en la leche bovina cruda. Se
tomaron estas últimas diluciones ya que al ser un alimento crudo se esperaba que la concentración de
microorganismos estuviera muy elevada. Pasado el tiempo de incubación se revelaron los datos, se contaron las
colonias y se reportaron los resultados con Min Salud e Icontec y se compararon estos resultados con la normal.
Palabras Claves: Min Salud, Icontec, leche, hongos, bacterias, aerobios mesofilos.

1. Introducción
La calidad microbiológica se refiere a la presencia de
bacterias, hongos, microorganismos patógenos, de
residuos de antibióticos y medicamentos. Conteos
altos de bacterias y de células somáticas, producen
alteraciones en las propiedades nutritivas y
organolépticas de la leche y reducen la vida útil de los
productos lácteos. Los microorganismos patógenos
en la leche pueden afectar la salud humana y los
procesos de transformación de la leche, en la
producción de crema, mantequilla yogurt y queso.
(Calderón et al. 2006).
La leche es un alimento que constituye un hábitat
ideal para el desarrollo microbiano,
ya que consta de grasa emulsionada, una concentra
ción fisiológica de azucares, sales, proteínas,
vitaminas y minerales disueltas en agua. Los
carbohidratos están representados por la lactosa
y galactosa. Su pH es de 6.8 el límite óptimo para el
crecimiento microbiano. Una de las ramas de la
industria láctea que depende en gran manera de la
actividad de los microorganismos, es la industria de
los quesos. Una gran variedad de ellos ha sido
elaborada bajo la actividad enzimática de diversas
especies bacterianas y fúngicas. En la elaboración de
mantequillas también se utilizan cultivos bacterianos
seleccionados por su habilidad de producir ácido y
1
Sabor. Hay otros microorganismos que no se pueden
usar por su capacidad de alterar la composición y
características organolépticas de la leche y derivados
lácteos o por sus agentes causales de enfermedad en
los consumidores (Martínez-López et al. 2011).
El manejo inadecuado durante la ordeña, el
almacenamiento y el transporte de la leche puede
deteriorar la calidad de la misma aumentando la carga
bacteriana, al adulterarse la composición (grasas,
sales, agua, entre otros), y favoreciendo
características indeseables de acidez, rancidez o
agriado. Incluso organismos no patógenos pueden
alterar la calidad de la leche pasteurizada o
descremada en polvo, crema y queso (Barbano et al.
2006)
Los microorganismos alcanzan la ubre, pueden llegar
a contaminar la leche antes o después del ordeño.
Estos microorganismos pueden alcanzar la leche por
vía mamaria ascendente o descendente. Por vía
ascendente lo hacen bacterias que se adhieren a la
piel de la ubre y posterior al ordeño entran a través
del esfínter del pezón, también puede ser
contaminada por el ambiente de la granja,
los recipientes donde se deposita la
leche, pero puede ser también contaminada por
varios agentes patógenos por un animal infectado,
entre ellos Streptococcus, Brucella, Staphylococcus se reporta por los métodos de conteo microbiológico
O levaduras (Moreno-Vásquez et al. 2007; Hernández de Colombia, Min Salud e Icontec
et al. 2009).
Min Salud
Normalmente el proceso de pasteurización elimina los
Se realizó dos diluciones por duplicado en el medio
microorganismos presentes en la leche, pero en
de cultivo SPC y se hizo su respectivo conteo (tabla
muchos países, incluido México, es una práctica
1)
común el uso de leche no pasteurizada en la
elaboración de productos lácteos artesanales Tabla 1: Conteo directo de aerobios mesofilos
(principalmente queso). Algunas de las enfermedades
bacterianas que pueden ser trasmitidas por el 10-4 10-5 10-6
consumo de leche cruda son la brucelosis, A B A B A B
leptospirosis, listeriosis, salmonelosis y tuberculosis 404 225 UFC 162 23 3 0
(Álvarez-Fuentes et al. 2012; Calderón et al. 2007; UFC UFC UFC UFC UFC
Jakobsen et al. 2011; Nada et al. 2012).

2. Parte experimental Se promedia los valores de cada dilución, se

multiplica por el número de veces de dilución.
2.1 Materiales 10-4= 3.145.000 10-5=9.250.000 10-6=1.500.000

 Seis pipetas Se escogen los resultados que se acerquen a la

 Agar SPC verdad, siendo dilución 10-4 y 10-5
 Agar PDA
Se divide el valor de la más diluida entre el valor de la
 Asa de Hockey
más concentrada
 Mechero
 Leche 9.250.000
: 2,94 UFC
 Agua destilada estéril 3.145.000

2.3 Procedimiento
Si el resultado es x >2: se reporta promedio de la
Se realizó la práctica de laboratorio donde primero se menos diluida y si el resultado es x < 2: se reporta
tomó 11 mL de la muestra (leche cruda) y se promedio de ambas diluciones. (Tabla 2)
homogenizo con 99ml de agua destilada estéril, se
tomó un 1 mL de la dilución numero 1 diluyendo seis Tabla 2: reportes
veces la muestra (10−2 , 10−3 , 10−4 ,10−5,10−6), se
Bacterias
eligieron respectivamente las diluciones
Min salud Icontec
( 10−4 ,10−5,10−6) para los productos fermentados, 30x105 UFC/ml 3,4x10 5UFC/ml
crudos o madurados. Posteriormente en cada una de
las tres diluciones se tomó 0.1 mL para sembrar por
superficie en PDA (hongos y levaduras) por Icontec
duplicado, y 1 mL para sembrar por profundidad las
Se realizó dos diluciones por duplicado en el medio
tres diluciones en SPC (bacterias) por duplicado, se
de cultivo SPC y se hizo su respectivo conteo (tabla
incubo el medio de cultivo PDA en 25°C y el SPC en
1)
37°C por 48 horas, después se hizo el posterior
recuento directo o indirecto de las cajas de PDA y Se determinó el número de cajas incluyentes dentro
SPC, se calculó y se anotó. Luego con el apoyo de la del rango de normas
norma invima e Icontec se realizó los cálculos
presentados en la misma para informar el resultado 15 – 300 UFC Aerobios Mesofilos, Coliformes,
obtenido. Alterantes, ECSR, S. aureus, B. cereus.
Σ col
3. Análisis de resultados Y se aplicó la formula N = V (n1+(0.1 x n2) 𝑑

2
 225+162+23 Tabla 4: reporte en Min Salud y Icontec
N = 1ml (1+(0.1 x 2) 0.0001 : 3.4𝑥105 𝑈𝐹𝐶 AM/ ml de leche
Mohos y levaduras
Mohos y levaduras
Min salud Icontec
Se realizó dos diluciones por duplicado en el medio 17x105 UFC/ml 1.1x107 UFC/ml
de cultivo PDA y se hizo su respectivo conteo (tabla
3) Hay diversas formas de Contaminación de la Leche
Tabla 3: Conteo directo de mohos y levaduras como la vía mamaria y el medio externo.
Mamaria: los microorganismos que pueden alcanzar
la ubre, pueden llegar a contaminar la leche antes o
10-4 10-5 10-6 después del ordeño. Las bacterias se adhieren a la
A B A B A B piel de la ubre como por ejemplo Staphylococcus
413 250 UFC 113 105 2 1 aureus, Streptococcus, Coliformes. También llegando
UFC UFC UFC UFC UFC a infectar la ubre como Salmonellas, Brucellas,
Mycobacterium tuberculosos.
Se promedia los valores de cada dilución, se Medio externo: la contaminación de la leche puede
multiplica por el número de veces de dilución. ocurrir una vez que esta ha sido extraída de la
10-4= 3.315.000 UFC MyL/ml de leche glándula mamaria. Los utensilios, tanques de
almacenamientos, transportes e incluso el personal
10-5=1.900.000 UFC MyL/ml de leche que manipula la leche, son fuentes de contaminación
de microorganismos que utilizan esta vía, que en
10-6=1.500.000 UFC MyL/ml de leche
algunos casos son las más abundantes, causantes de
Se escogen los resultados que se acerquen a la grandes pérdidas en la calidad del producto. Una baja
verdad, siendo dilución 10-5 y 10-6 carga microbiana que puede no llegar a multiplicarse
si la leche es manipulada adecuadamente. Leche
Se divide el valor de la más diluida entre el valor de la
puede también contaminarse al salir por medio de
más concentrada
pelos o sucio que se desprenden de los animales. La
1.500.000
: 0,8 UFC ubre está en contacto con el suelo, heno, y cualquier
1.900.000 superficie donde las vacas se echen.
Si el resultado es x >2: se reporta promedio de la Aire: el aire representa uno de los medios más
menos diluida y si el resultado es x < 2: se reporta hostiles para la supervivencia de los microorganismos
promedio de ambas diluciones. (Tabla 4) debido a la constante exposición al oxígeno, cambios
de temperatura y humedad relativa, radiación solar,
etc. Es por ello que solo aquellos microorganismos
Icontec resistentes podrán ser capaz de permanecer en el
Se realizó dos diluciones por duplicado en el medio aire y llegar a contaminar los alimentos. En el aire se
de cultivo PDA y se hizo su respectivo conteo (tabla pueden encontrar Micrococcus, Streptomyce y
1) esporas de mohos como Penicillium y Aspergillus.
Las levaduras raramente se encuentran en
Se determinó el número de cajas incluyentes dentro suspensiones aéreas.
del rango de normas
Agua: el agua utilizada para la limpieza de los
15 – 150 UFC Mohos y Levaduras, Levaduras equipos y utensilios de ordeño, la higiene del animal
Osmofílicas y del personal, debe ser lo más limpia posible. El agua
Σ col
puede ser una fuente importante de microorganismos
Y se aplicó la formula N = sipcrofilos (Pseudomonas) y por contaminación de
V (n1+(0.1 x n2) 𝑑
esta, de bacterias coliformes.
250+118+105
N = O,1ml(2+(0.1 x 0) 0.0001 : 37333333 = 3,7𝑥107 𝑈𝐹𝐶 M
Suelo: el suelo es la principal fuente de
y L /ml de leche microorganismos termodúricos y termófilos. La leche
3
nunca entra en contacto con el suelo pero si los
animales, utensilios y personal, de manera que es a
través de ellos que los microorganismos telúricos
llegando a contaminar la contaminar la leche.
El ordeñador: el ordeñador puede llegar a jugar un
papel importante en la contaminación de la leche,
sobre todo cuando el ordeño es manual.
En nuestro medio es frecuente observar como el
personal encargado del ordeño no se lava las manos
y peor aún se las humedece en la misma leche para
lograr lubricación que facilite el ordeño.
Estiércol: el estiércol es la fuente principal de
microorganismos coliformes. Estos pueden alcanzar
la leche a través del animal o del ordeñador así como
también por medio de los utensilios mal higienizados.
Utensilios y Transporte: el contacto de la leche con
el material de ordeño y su permanencia en los
tanques y transporte puede multiplicar por un factor
de 2 a 50 la flora microbiana presente. De allí que la
higiene adecuada de estos, por medio de agentes
desinfectantes, afecta significativamente la calidad
sanitaria de la leche.
Control de la Contaminación El empleo de sistemas
de ordeño mecánico ayuda reducir la contaminación
a partir del animal, ordeñadores, aire y suelo.
De manera que la contaminación en este caso estará
mayormente en los tanques de almacenamiento y en
el sistema de ordeño en si mismo.
En fin, tomando en cuenta las principales fuentes de
contaminación, pueden tomarse diversas medidas
encaminadas a evitar el contacto de estas con la
leche y mejorar su calidad sanitaria final.
Factores que Afectan el Crecimiento de
Microorganismos Una vez que los microorganismos
han alcanzado la leche comienza un periodo de
adaptación de estos al medio circundante, la duración
de este periodo así como la capacidad para
multiplicarse está condicionada al efecto de varios
factores intrínsecos, extrínsecos e implícitos, los
cuales serán discutidos brevemente en los apartes
siguientes.
Tabla 5:
Alimento Riesgo clase n c m M
Leche 3 3 5 1 5x105 106
cruda
4
Teniendo en cuenta los datos teóricos de la norma
como los prácticos se tiene que el número de “n” y “c”
son aceptables debido a que se ajustan a lo requerido
y no sobrepasan el rango respectivo en cambio en “m”
el lote de muestreo se debe rechazar porque se salen
del límite microbiológico a lo indicado, en “M” el
recuento microbiano sobrepaso lo máximo estimado
para aceptar el alimento por lo cual este representa
un riesgo para la salud en los dos casos hongos y
levaduras y aerobios mesofilos. También se debe
tener en cuenta que se pudo tener errores al momento
de realizar las diluciones y muestreo en placa.
4. Conclusiones.
Con la realización de esta práctica se pudo determinar
la calidad de la leche cruda, que en este caso se
obtuvo como resultado crecimiento de bacterias,
mohos y levaduras.
Se logró llevar acabo el conteo microbiológico para
aerobios mesofilos, mohos y levaduras, con las
normas de min salud e Icontec. Podemos decir que la
carga microbiana se incrementa al momento del
ordeño o cuando la leche cruda es depositada en los
tanques de almacenamiento. Es necesario que el
personal que labora en la unidad de lácteos conozca
las buenas prácticas de higiene y de manufactura
para disminuir las cargas microbianas y cumplir con
las normas establecidas, para asegurar la salud del
consumidor.
5. Referencias de bibliográficas
 Barbano, D., M. Y. Ma, M. V. Santos. .
³Influence of raw milk quality on fluid milk shelf
life´. Journal of Dairy Science, Vol. 89(E
Suppl.), 2006
 Calderón, A., F. García, G. Martínez. ³Calidad
de la leche cruda en unidades de producción
familiar del sur de Ciudad de México´. Revista
MVZ Córdoba, Vol. 11, No. 1, 2006.
 Jakobsen, R. A., R. Heggebø, E. B. Sunde, M.
Skjervheim. ³Staphylococcus aureus and
Listeria monocytogenes in Norwegian raw milk
cheese production´. Food Microbiology, Vol.
28, 2011.
 Martínez-López, R., J. A. Tepal-Chalé, L.
Hernández-Andrade, M. C. Escobar-Ramírez,
R. Amaro-Gutiérrez, M. A. Blanco-Ochoa.
³Mejora continúa de la calidad higiénico-
sanitaria de la leche de vaca, Manual de
capacitación´. INIFAP-SAGARPA. Folleto
Técnico, No. 3, 2011.

 Moreno-Vásquez, F. C., G. Rodríguez-

 Martínez, V. M. Méndez-Mancera, L. E.
Osuna-Ávila, M. R. Vargas. ³Análisis
microbiológico y su relación con la calidad
higiénica y sanitaria de la leche producida en
la región del Alto de Chicamocha
(departamento de Boyacá)´. Revista de
Medicina Veterinaria, Vol. 14, 2007.