Biodegradación de colorante azul índigo mediante cepa bacteriana de

Pseudomonas pùtida.

Biodegradation of indigo blue dye by bacterial strain of Pseudomonas

pùtida.

Carolina G. Vivero1, Daniel M. Ochoa2

RESUMEN

Durante décadas el colorante azul índigo ha sido utilizado para diversos

procesos industriales por su facilidad a la hora de producción y de
manipulación, siendo el uso prolongado de este colorante un problema a largo
plazo por sus implicaciones en la contaminación de diversas fuentes hídricas
naturales existentes en el planeta, por este motivo recae la importancia de
encontrar métodos eficientes y económicos para degradar fácilmente estos
compuestos xenobióticos ya sea mediante la utilización de microorganismos o
cualquier otro método. En este trabajo de investigación se demostró
experimentalmente que la bacteria Pseudomonas pútida tiene la capacidad de
degradar fácilmente este compuesto xenobiótico con una eficiencia de
degradación de más del 80%, eficiencia demostrada mediante la técnica de la
espectofotometría, tomando muestras del biorreactor cada 24 horas para
obtener los resultados deseados, es decir, la desaparición del colorante.

Palabras clave: Pseudomonas pútida, biodegradación, colorante, espectrofotometría.

ABSTRACT

During decades the blue coloring indigo has been used for diverse industrial
processes by his facility at the moment of production and manipulation, being
the long use of this coloring a long-term problem for his implications in the
pollution of diverse water natural existing sources in the planet, for this motive
it relapses the importance of finding efficient and economic methods to
degrade easily these composed xenobiotics already is by means of the
utilization of microorganisms or any another method. In this work investigative

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there was demonstrated experimentally that the polished pseudomonas has
the skill of degrading easily this compound xenobiotic with an efficiency of
degradation of more than 80 %, in which this efficiency was demonstrated by
means of the technology of the spectrometry, aking samples of the bioreactor
every 24 hours to obtain the desired results, that is, the disappearance of the
dye.

Keywords: Pseudomonas pútida, biodegradation, dye, spectrophotometry.

INTRODUCCION

El colorante azul índigo (C12H10O2N2) es conocido comúnmente por ser un

compuesto desarrollado por el ser humano con el fin de aumentar su
productividad, estos productos creados por el hombre se denominan
compuestos xenobióticos y por este motivo al no encontrarse naturalmente en
el medio ambiente no existes organismos con enzimas capaces de degradar
este tipo de compuesto, por esta razón siempre se recurre a la degradación
por medio de microorganismos ya que estos evolutivamente han sintetizado
enzimas con la capacidad de romper enlaces atómicos muy fuertes de una
molécula específica para abastecerse ellas mismas de nutrientes. El colorante
azul índigo es clasificado como compuesto xenobiótico por que posee un
enlace tipo azo, en el cual el enlace azo se caracterizan por tener un doble
enlace nitrógeno-nitrógeno (-N=N-), en el cual dependiendo del colorante
xenobiótico a utilizar estos pueden tener de uno a dos enlaces de
nitrógeno-nitrógeno (Barragán et,2017).
En el cual uno de los mayores responsables de la contaminación de fuentes
hídricas naturales con el colorante azul índigo son las industrias
especializadas en la fabricación de productos textiles, ya que en el proceso de
teñido con este colorante se necesita una gran cantidad de agua ya sea esta
agua potable o agua subterránea. Dando como resultado después del proceso
de teñido la producción de aguas de tipo residual siendo estas depositadas
directamente a fuentes hídricas sin ningún tipo de tratamiento especializado
para la remoción de estos colorantes, es decir estas aguas residuales están
siendo depositadas con altos índices de contaminantes, mutágenos y con sub
productos capaces de causar daños irreparables en la salud de la flora y fauna
que habitan y sobreviven en estos efluentes naturales.
Siendo el mayor problema de este colorante xenobiótico es que es
excesivamente contaminante cuando se encuentra suspendido en fuentes
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hídricas, estos compuestos son tóxicos ya que estos cuentan con la presencia
de grupos cromóforos de un alto peso molecular, en los cuales al acumularse
estos en fuentes hídricas provocaran una disminución en la luminosidad de las
aguas y en consecuencia inducen a la disminución de la actividad fotosintética,
además produce la disminución de oxigeno disponible favoreciendo procesos
de eutrofización por el aumento de carga orgánica (Robinson etal.,2001).

MATERIALES Y MÉTODOS

Para el proceso de biodegradación del colorante azul índigo, se utilizó una

cepa bacteriana de Pseudomonas pútida, suministrada por el laboratorio de
Microbiología de la Universidad Distrital Francisco José de Caldas, facultad de
Medio ambiente y recursos naturales. Se incubó en agar Cetrimide
(composición: agar, K2SO4, digerido de gelatina, MgCl2,glicerol, cetrimida) a
30ºC durante 24 horas. Luego se toman colonias para sembrar en un caldo
inicial compuesto por peptona al 0.1%, sales mínimas (composición: KH2PO4,
Na2HPO4, NaNO3, MgSO4,CaCl2, H2O) y 5.0mg/mL de colorante azul índigo,
con un volumen de 50mL.
Para evaluar la capacidad de biodegradación del colorante azul índigo se
aplicaron las siguientes técnicas:

Variación de concentración de colorante azul índigo. Se utilizan tres

caldos con las siguientes composiciones: (I) caldo enriquecido con peptona al
0.1%, sales mínimas (composición: KH2PO4, Na2HPO4, NaNO3, MgSO4,CaCl2,
H2O), 2.5mg/mL de colorante, (II) caldo enriquecido con peptona al 0.1%,
sales mínimas (composición: KH2PO4, Na2HPO4, NaNO3,
MgSO4,CaCl2,H2O), 5.0mg/mL de colorante y (III) caldo enriquecido con
peptona al 0.1%, sales mínimas (composición: KH2PO4, Na2HPO4, NaNO3,
MgSO4,CaCl2,H2O), 7.5mg/mL de colorante. Se toman 2mL del caldo inicial
para sembrar. Incubación a 30ºC durante 48horas.

Evaluación del crecimiento del microorganismo. El crecimiento en caldo (I)

fue abundante, contrario al caldo (II) y (III), por tal motivo se toman muestras
de caldo (I) para realizar siembra en otros caldos con diferentes parámetros.

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Variación de pH. Se utilizan tres caldos con la misma composición antes
descrita del caldo (I) con pH6, pH7, pH8 respectivamente. Se toman 2mL de
caldo (I) principal. Se incuban a 30ºC durante 24 horas.

Variación de temperaturas. Se utilizan tres caldos con la misma composición

antes descrita del caldo (I). Se toman 2mL de caldo principal. Se incuban a
25ºC, 30ºC y 37ºC durante 24 horas.

Precultivo. Después de evaluados los parámetros físico-químicos para el

crecimiento bacteriano, se procedió a inocular en dichos parámetros, es decir,
2.5mg/mL de colorante, sales mínimas, pH7, 30ºC, peptona al 0.1%.

Cultivo. Se sembró 10mL de precultivo en caldo enriquecido con peptona al

0.1%, pH7, sales mínimas (composición antes descrita) y 1500mg/mL de
colorante azul indigo, se mantuvo en agitación mecánica a 140rpm durante
ocho días.

Muestreo y Cuantificación. Para la determinación de la degradación del

colorante se tomaron muestras de 10mL durante ocho días, a éstas se les
realizo centrifugación de 4000rpm durante 20 minutos, para obtener la
biomasa y sobrenadante. Al sobrenadante se le realizó análisis de
espectofotometría UV/vis a una longitud de onda de 611nm y 190nm para
conocer el porcentaje de degradación y la biomasa a través del peso fresco
medido en gramos.

RESULTADOS

Tabla1. Variación de concentración de colorante azul indigo

Prueba Temperatura (ºC) Resultado

Caldo (I) 30 +++

Caldo (II) 30 ++
Caldo (III) 30 +
Los resultados obtenidos en los tres caldos con diferentes concentraciones se
puedo determinar que el caldo (I) tuvo mayor crecimiento microbiano.
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 Tabla2. Variación de pH

Prueba pH Temperatura (ºC) Resultado

Caldo (I) 6 30 +

Caldo (I) 7 30 +++

Caldo (I) 8 30 +

El resultado mas relevante es del caldo (I) con pH 7, aunque también hubo un
crecimiento notorio en el caldo (I) con pH6.

Tabla3. Variación de la temperatura

Prueba pH Temperatura (ºC) Resultado

Caldo (I) 7 25 ++

Caldo (I) 7 30 +++

Caldo (I) 7 37 +

De los tres medios el mejor resultado fue obtenido por el caldo (I) a una
temperatura de 30ºC, aunque cabe resaltar que la temperatura optima de
crecimiento de la Pseudomonas pútida esta entre 25-30ºC.

Crecimiento del microorganismo en el bioreactor.

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 Tabla 4.

Tiempo (h) Biomasa (g)

0 0.1682

24 0.1885

48 0.2035

72 0.2248

96 0.2431

120 0.2516

144 0.2805

168 0.2810

Análisis de espectofotometría.

Tabla5.

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 Tiempo (h) Longitud de Absorbanci
onda (nm) a

0 611 0.1

24 611 0.14

48 611 1.20

72 611 1.38

96 611 1.3

120 190 1.05

144 190 1.03

168 190 1.0

ANÁLISIS DE RESULTADOS

Variación de concentración de colorante azul indigo. Se evaluó el

crecimiento de la Pseudomonas pútida en tres concentraciones de colorante,
2,5mg/mL, 5.0mg/mL y 7.5mg/mL, de lo cual se pudo determinar que la
bacteria tiene una mayor asimilación del colorante a una concentración de
2.5mg/mL, debido a una evidente desaparición del nivel de color. En el caldo
(II) con concentración de 5.0mg/mL hubo crecimiento bacteriano pero bajo,
debido a que la concentración era mayor. De igual manera sucedió con el
caldo (III) aunque su crecimiento fue mas bajo.

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Variación de pH. En cuanto a la variación del pH se observó que hubo mayor
crecimiento en el caldo (I) con pH7 (neutro), aunque cabe resaltar que la
Pseudomonas pútida tiene un crecimiento óptimo en un rango de pH de 6-8.

Variación de la temperatura. Este parámetro se evalúo en temperaturas de

25, 30 y 37ºC, en la cual se obtuvo el mejor resultando de crecimiento
bacteriano a 30ºC, aunque se evidenció que a una temperatura de 25º C hay
crecimiento pero inferior a los 30ºC y mayor a 37ºC.

Crecimiento del microorganismo en el bioreactor. Se determino a través

del peso fresco o biomasa en gramos. Como se puede observar en la Tabla4.
la bacteria tuvo un crecimiento acelerado las primeras 48 horas. Después de
esas horas fue muy poca la variación de crecimiento microbiano.

Análisis de espectofotometría. para la evaluación de este parámetro se

utilizaron dos longitudes de onda, una de 611nm y otra de 190nm, debido a la
variación del color en el bioreactor. En cuanto a los resultados como se puede
observar en la Tabla.5 hubo mayor degradación del colorante a las 72 horas
con una longitud de onda de 611nm.

CONCLUSIONES

Se determinó que los parámetros físico-químicos óptimos para el crecimiento

de la Pseudomonas pútida son: 2.5mg/mL de colorante, pH7, temperatura
30ºC.
La Pseudomonas pútida demostró la capacidad de degradar el colorante azul
indigo en un 80% en 72 horas, gracias a las condiciones a las que fue
sometida antes descrita. Esta capacidad de degradación fue a través de
enzimas especializadas de oxido-reductasas, lo cual concuerda con lo
reportado por Barragan et. Al. 2007, sin embargo hay poca profundidad en el
estudio de las rutas metabólicas que intervienen en la biotransformaciòn del
colorante.
BIBLIOGRAFIA

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Barragan, B. Costa, C., Marquez, C. M.(2007). Biodegradation of azo dyes by
bacteria inoculated on solid media. Dyes and Pigments 75: 73-81.

Ghasemi, F., Tabande, F., Bambai, B., Sambasiva, R.(2010). Decolorization of

different azo dyes by Phanerochaete chrysosporium RP78 under optimal
condition. Int. J. Environ. Sci. Tech.

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