Perfil inflamatório em pacientes com

Rinossinusite Crônica com Pólipo Nasal

em diferentes regiões do Brasil

Resumo
Introdução

A rinossinusite crônica (RSC) é uma doença de alta prevalência na população geral, com grande
impacto socioeconômico e que leva a um significativo prejuízo na qualidade de vida dos indivíduos
acometidos. Apesar dos avanços nas últimas décadas, a fisiopatogenia da RSC ainda continua muito
pouco elucidada, com provável etiologia multifatorial. O tratamento representa um grande desafio,
devido ao alto índice de recorrências e impacto na qualidade de vida. Estudos recentes têm
demonstrado que a resposta terapêutica de pacientes com RSC depende tanto de características
fenotípicas (com pólipos vs. sem pólipo nasal) como da presença de biomarcadores inflamatórios
(endotipos) na mucosa nasossinusal. Entretanto, a depender da população avaliada, há uma grande
heterogeneidade de biomarcadores na mucosa inflamada, que pode estar associado ao ambiente local
e/ou composição étnica. No Brasil, ainda não existem relatos fidedignos de como deva ser o padrão
inflamatório predominante em pacientes com RSC. O melhor entendimento dos endotipos da RSC na
população brasileira poderia auxiliar o modo como tais pacientes deveriam ser tratados clinica ou
cirurgicamente.

Objetivos

Estudar o perfil inflamatório, citocinas e quimiocinas humanas dos pacientes com RSC com pólipo
nasal (RSCcPN) em diferentes regiões do país, comparando-o com o de indivíduos controles.
Estabelecer a prevalência dos perfis inflamatórios dos pacientes com RSCcPN e avaliar a variablidade
conforme as diferentes regiões. Comparar os achados brasileiros nacionais com os achados de estudos
em outros países

Pacientes e métodos

O estudo será realizado em 10 centros de diversas regiões do país. Em cada um destes centros, serão
avaliados 16 pacientes com diagnóstico de RSCcPN com pólipos e 16 pacientes controles. Todos os
pacientes serão submetidos à biópsias dos pólipos nasais (casos) ou concha média (controles) após um
período mínimo de 30 dias sem uso de antibióticos ou corticoesteróides. Será realizada a identificação
do perfil inflamatório (Th1/Th2/Th17/Treg) pela determinação da concentração dos seguintes analitos
no tecido nasossinusal: EGF, eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNα2, IFNγ, IL-10, IL-12P40, IL-12P70,
IL-13, IL-15, IL-17A, IL-1RA, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1,
MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNFα, TNFβ, VEGF,FGF-2, TGF-α, FIT-3L, fractalcina, GRO, MCP-3,
MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB, sCD40L e IL-9.

Summary
Introduction: Chronic rhinosinusitis (CRS) is a prevalent, multifactorial
disease. It causes great burden on patient’s quality of life and has a deep
economical impact. Despite recent advances, CRS pathophysiology it is still
poorly understood. Adequate treatment still represents a great challenge,
specially due to frequent recurrences. Recent studies have shown that the
treatment choices should take in consideration phenotypical and endotypical
features. However, different populations present different inflammatory
patterns, due to environmenal and ethnical influences. There is no data
regarding the predominant inflamattory pattern in brazillian population. Better
understanding of endotypes of CRS patients in Brazil will help on treatment
choices, both clinically and surgically.

Objectives: To study the inflammatory TH profile, human citokynes and

chemokynes of patients with chronic rhinosinusitis with nasal polyps
(CRSwNP) in different regions of Brazil and compare it with controls.

Casuistic and Methods: A prospective cross-sectional study will identify the

inflammatory profile (Th1 / Th2 / Th17) by concentration of the following :
EGF, eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNα2, IFNγ, IL-10, IL-12P40, IL-12P70, IL-
13, IL-15, IL-17A, IL-1RA, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8,
IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNFα, TNFβ, VEGF,FGF-2, TGF-
α, FIT-3L, Fractalkine, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA, PDGF-AB/BB,
sCD40L and IL-9 in patients with CRSwNP and controls. The study will be
conducted in 10 rhinology centers in different parts of Brazil. Each center will
analyze 16 patients and 16 controls. All patients will undergo a minimum of 30
days without steroids or antibiotics.

Introdução
A rinossinusite crônica (RSC) é uma doença de alta prevalência na
população geral. Na Europa varia entre 7% e 27% dos adultos, nos EUA é de
14% e na China varia ente 2% e 8%. Em São Paulo, sua prevalência foi
estimada em 5,51%1. É uma doença crônica, com exacerbações agudas, que
traz um impacto médico e social bastante negativo. Estudos indicam que o
paciente portador de RSC tem uma queda importante de qualidade de vida,
ainda pior que a de pacientes portadores de doenças cardíacas2.
Classicamente, dividimos a RSC em dois fenótipos principais: Com e
Sem pólipo nasal (RSCsPN e RSCcPN). Entre eles, os portadores de
RSCcPN são os que mais sofrem e apresentam, após tratamento cirúrgico, a
maior taxa de recorrência da doença3.
Porém, com o avanço das pesquisas em biologia molecular, percebeu-
se que existem diferenças imunológicas importantes entre e até mesmo
dentro destes fenótipos básicos. Estes mecanismos imunológicos distintos
sugerem a presença de distintos endótipos que se manifestam clinicamente
de forma semelhante4. Estudos recentes têm demonstrado que a melhor
resposta terapêutica de pacientes com RSC depende tanto das
características fenotípicas (com pólipos vs. sem pólipo nasal; com asma vs.
sem asma, etc) como da presença de biomarcadores inflamatórios
(endotipos) na mucosa nasossinusal. Sabemos que pacientes com
inflamação do tipo Th2 tem melhor resposta ao uso de corticoesteróides,
enquanto pacientes do tipo Th1 podem se beneficiar do uso de macrolideos a
longo prazo. Além disso, o desenvolvimento de novas drogas, como os
imunobiológicos, com alvos específicos da cascata inflamatória (IgE, IL-5, IL-
4R) torna imperativo o conhecimento detalhado dos mecanismos
inflamatórios envolvidos em cada paciente5,6,7,8.
Em 2016, Tomassen et al publicaram um estudo que tentou avançar
na categorização dos pacientes com RSC baseados em uma seria de
biomarcadores celulares. Eles foram motivados pro descobertas recentes que
mostravam que apenas as inflamações do tipo Th1 e Th2 nao eram
suficientes para explicar os mecanismos fisiopatológicos de todos os
pacientes, especialmente em populações não-européias. Inicialmente, os
pacientes foram divididos em 10 subtipos de acordo com a presença de uma
série de biomarcadores (Interferon gama, IL-5, IL-17A, IL-22, TNF alfa, IL-1B,
IL-6, IL-8, MPO, ECP, Ige total, Ige especifica para superantígenos de S.
Aureus, albumina e TGF-beta 1). Em seguida, esses subtipos foram
pareados com características clinicas, principalmente a presença de polipose
nasal e de asma. De forma resumida, os resultados mostram que a presença
de IL-5 está relacionada à maior presença de polipose e asma, de forma
diretamente proporcional à sua intensidade5.
A depender da população avaliada, há uma grande heterogeneidade
de biomarcadores na mucosa nasossinusal inflamada e nos pólipos, que
pode estar associado ao ambiente local e/ou composição étnica. Pacientes
da Europa Ocidental e da Austrália apresentam mais perfil Th2, enquanto na
China, existe uma padrão misto Th1/Th2/Th176. Alem disso, esses perfis
podem mudar com o decorrer do tempo. Um estudo mostrou que na Tailândia
a porcentagem de pacientes com perfil inflamatório eosinofilico aumentou nos
últimos 10 anos, assim como a presença de de S. Aureus na mucosa
nasossinusal, sugerindo a interferência do ambiente nos mecanismos da
inflamação sinusal crônica7. Por outro lado, descendentes de asiáticos que
nasceram nos Estados Unidos mantém a preponderância de inflamação
neutrofilica, sugerindo a importância do mecanismo genético 8.
No Brasil, ainda não existem relatos fidedignos de como é o padrão
inflamatório predominante em pacientes com RSCcPN. O melhor
entendimento dos endótipos da RSC na população brasileira irá auxiliar o
modo como tais pacientes serão tratados, tanto clinica como cirurgicamente.

Objetivo

Avaliar o perfil inflamatório, citocinas e quimiocinas humanas nos

pacientes com rinossinusite crônica com pólipo nasal (RSCcPN) em 10
centros de diferentes regiões do pais, pela determinação da concentração
dos seguintes analitos: EGF, eotaxina, G-CSF, GM-CSF, IFNα2, IFNγ, IL-10,
IL-12P40, IL-12P70, IL-13, IL-15, IL-17A, IL-1RA, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4,
IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, TNFα, TNFβ,
VEGF,FGF-2, TGF-α, FIT-3L, fractalcina, GRO, MCP-3, MDC, PDGF-AA,
PDGF-AB/BB, sCD40L e IL-9.
Estabelecer a prevalência dos perfis inflamatórios dos pacientes com
RSCcPN e avaliar a variablidade conforme as diferentes regiões.
Comparar os achados brasileiros nacionais com os achados de
estudos em outros países

Casuística e Métodos

Pacientes

Será realizado estudo transversal, em 10 centros distribuídos pelas

diferentes regiões do pais (Tabela 1). Serão selecionados 320 pacientes e
controles, na faixa etária de 18 a 70 anos, divididos em dois grupos. O
primeiro grupo, composto por 160 pacientes com diagnóstico de RSCcPN
seguindo os critérios clínicos dos guidelines EPOS 2012 e ICAR 2016, sendo
realizadas nasofibroscopia com presença de pólipos bilateralmente e
tomografia computadorizada de seios paranasais com classificação de Lund-
Mackay ≥2. O grupo controle, será composto por 160 pacientes submetidos à
rinoplastia ou cirurgia endoscópica de base de crânio, sem nenhuma
sintomatologia de RSC e doença nasal inflamatória associada. Ambos os
grupos necessitarão preencher um período mínimo de 30 dias sem uso de
corticoesteroides (sistêmicos ou tópicos) e antimicrobianos e 15 dias sem uso
de antileucotrienos para a realização das biopsias. Nenhum dos pacientes
dos dois grupos pode ter apresentado exacerbação aguda de rinossinusite ou
infecção de vias aéreas nos 30 dias precedendo a coleta de material.

USP-RP Profa Wilma Aselmo-Lima

USP-SP Prof Richard Voegels

Universidade federal de São Paulo Prof Eduardo Macoto
Unicamp Profa Eulália Sakano
Universidade Federal do Rio Grande Prof Otavio Piltcher
do Sul
Universidade Federal do Paraná Prof Marco Cesar Oliveira
Universidade Estadual do Rio de Prof Miguel Tepedino
Janeiro
Universidade Federal da Bahia Prof Marcus Lessa
Universidade Federal de Brasilia Prof Marcio Nakanishi
Uinversidade Federal de Prof Tiago Bezerra
Pernambuco

Tabela 1. Centros participantes e coordenadores locais

Critérios de exclusão:

Grupo RSCcPN
 Autoimunidade, fibrose cística, imunodeficiência, discinesia ciliar,
pólipos unilaterais (suspeita ou confirmação).

Grupo Controle
História clinica de doença respiratória crônica
 Para os dois grupos serão levantados dados sobre idade, sexo,
história de tabagismo, diagnóstico de alergias, asma, intolerância ao AAS
(ácido acetil salicílico) ou anti-inflamatórios não hormonais e número de
cirurgias endoscópicas nasais já realizadas por cada paciente, em prontuário
médico. Serão realizados testes laboratoriais de eosinofilia, dosagem de IgE
total e teste alérgico para alérgenos inalantes (ácaros, mofo, pêlos de
animais e pólen de gramíneas)
Todos os pacientes e controles serão convidados a participar do
projeto, sendo esclarecidos sobre procedimentos e objetivos do mesmo,
forma de coleta, riscos e possível acesso aos resultados, de acordo com o
TCLE.
Método

Coleta das amostras

Os pacientes com RSC, terão as amostras do pólipo nasal colhidas

ambulatorialmente, sob anestesia tópica local. Já nos do grupo controle, será
colhida amostra de mucosa da concha media durante o procedimento
cirúrgico planejado (rinoplastia ou cirurgia de base de crânio).
Os materiais coletados serão colocados em meio essencial mínimo de
Eagle (MEM), com 10% de soro fetal bovino (SFB) e 15% de antibióticos
(penicilina-estreptomicina 20.000 U/ml) e antimicóticos (anfotericina B 200
μg/mL), para envio imediato ao laboratório de Patogenese Viral da Faculdade
de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo, onde
fragmentos dos tecidos obtidos durante a cirurgia serão lavados três vezes
com solução balanceada de Hanks (BioWhittaker®, Lonza, MD, USA) para
remover sangue e debris celulares, e a seguir cortados em fragmentos de
aproximadamente 0,5 cm x 0,5 cm, usando instrumentos tratados com
dietilpirocarbonato (DEPC) (Sigma, Switzerland) para minimizar a
contaminação com ribonucleases. As seguintes alíquotas serão obtidas e
armazenadas a -80°C: i) fragmentos macerados em Trizol (Invitrogen,
Carlsbad, CA, USA) por meio de homogeneização automatizada (Tyssue
Liser®, Quiagen) com uso de esfera metálica DEPC, na freqüência de 50 Hz
por 10 minutos, em temperatura ambiente; ii) fragmentos armazenados em
solução preservativa RNAlater® (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA); iii)
fragmentos armazenados em meio de congelamento viral (MEM, 20% de
SFB e 15% de glicerol). Adicionalmente, fragmentos serão fixados em
paraformoldeido a 4% por 18-24 horas, e diafanizados em mistura 1:1 de
xilol/etanol por 20 minutos, e submetidos a três trocas de xilol (Synth,
Diadema, SP) por 30 minutos cada. A seguir, os tecidos serão parafinizados
(Merk) em dois banhos de parafina de duas horas cada, seguidos de inclusão
em blocos de parafina e enviados para o laboratório de Patologia do
HCFMRP-USP para análise histopatológica.

Extração do RNA
 O DNA, RNA e proteínas serão extraídos pelo método de TRIzol® (Life
Technologies). A concentração total de ácidos nucleicos e proteínas será
quantificada por espectrofotômetro NanoDrop® 2000 (Thermo Scientific).

Quantificação absoluta de citocinas/quimiocinas humanas

A quantificação de 41 de citocinas e quimiocinas de interesse nas

amostras de PN e mucosa da concha média será determinada utilizando o kit
MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Magnetic Bead Panel -
Premixed 41 Plex (Merck/Millipore). A quantificação absoluta das proteínas
será determinada utilizando padrões de concentração pré-definida
(background, 3.2, 16, 80, 400, 2,000 e 10,000 pg/mL). O kit Human
Cytokine/Chemokine Premixed 41 Plex utiliza beads de captura (microesferas
de poliestireno revestidas com anticorpos monoclonais), que se ligam às
proteínas de interesse. Uma vez que a proteína é capturada pela bead, um
anticorpo de detecção biotinilado é adicionado à reação para ao final ser
revelado por meio de incubação com reagente conjugado estreptavidina-
ficoeritrina. Cada microesfera é identificada individualmente e o resultado é
quantificado com base na fluorescência do emissor conjugado. A leitura em
formato multiplex será realizada em sistema Luminex® MAGPIX® e a
aquisição de dados será realizada com software Luminex® xPONENT® a
cada leitura.

Contagem de eosinófilos e neutrófilos

Para determinar a predominância de granulócitos na inflamação da

mucosa, serão contados o número de células e os marcadores de ativação
ECP (Proteina catiônica de eosinófilos) para eosinófilos e MPO para
neutrófilos. Apenas quando a relação entre ECP e MPO for maior que 1, o
pólipo será caracterizado com eosinofílico.

Análise estatística
 Para comparar o seio etmoidal com o seio maxilar, os valores serão
ajustados por meio do PROC MIXED do SAS 9.4 e modelos de regressão
linear de efeitos mistos. Esses modelos são utilizados nos casos de análise
de variância em que há mais de uma observação medida, por indivíduo.
Serão estimados contrastes ortogonais para comparações múltiplas, entre os
grupos.
Para a comparação entre os três grupos, serão ajustados modelos de
regressão linear e, quando necessário, as comparações múltiplas serão
realizadas por meio de estimação de contrastes ortogonais.
Na análise dos eosinófilos e neutrófilos, com os valores de citocinas,
será aplicado o método de coeficiente de correlação de Spearman (Rho). Já
nas análises dos dados clínicos foi utilizado o modelo de regressão linear, e
no caso dos eosinófilos e neutrófilos, o teste não paramétrico de Wilcoxon.
Os softwares utilizados serão o SAS 9.4 e o R 3.4.2.

Resultados previstos

Sabemos hoje da importância fundamental da correta classificação

fenotípica e endotípica dos pacientes com rinossinusite crônica para garantir
o tratamento mais adequado. Os biomarcadores existentes hoje não estão
disponíveis para uso em larga escala. Não existem dados nacionais sobre os
tipos inflamatórios mais freqüentes nos pacientes com RSCcPN
Esperamos com este estudo determinar a prevalência dos diferentes
perfis inflamatórios dos pacientes com RSCcPN nas diferentes regiões do
país. Estes resultados terão uma aplicabilidade clínica imediata, pois
poderemos predizer de forma mais acurada o prognóstico de cada paciente,
assim como proporcionar o melhor direcionamento terapêutico, tanto em
termos clínicos como cirúrgicos. Nos aproximando ao máximo do conceito
moderno da Medicina de Precisão.

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