1 ESTANDARIZACIÓN Y CALIBRACIÓN

ANALÍTICAS

Objetivos

Dar a conocer los fundamentos metodológicos de la calibración y de la estandarización

Ofrecer los detalles estadísticos de la regresión univariante

Comprender la utilización de la calibración analítica

Bibliografía

M. Otto, Chemometrics, Statistics and Computer Application in Analytical Chemistry, Wiley-

VCH, Weinheim (Alemania), 1999

J.C. Miller, J.N. Miller, Estadística para Química Analítica, 2a Ed., Addison-Wesley Iberoameri-
cana, USA, 1993

1.1. Introducción

Las medidas analíticas no son más que comparaciones. Si se analizan las ya conocidas deter-
minaciones volumétricas, por ejemplo las que se llevan a cabo con EDTA, la valoración de
cualquier metal con EDTA consiste en la comparación de una concentración conocida de éste
con un metal u otro. Cuando se usan medidas instrumentales la comparación es más clara y los
resultados de cualquier medida carecerían de valor si no se dispone de una referencia. La mayor
parte de las medidas realizadas por medios instrumentales se expresan por medio de la fuerza
electromotriz (V o mV) o de la intensidad (mA o µA ) eléctrica (Ver Capítulo 6). Los sistemas
instrumentales utilizan señales eléctricas (analógicas o digitales) como representación de pro-
piedades físicas de los analitos asociadas a su concentración. Para determinar la concentración

1
 1.1. INTRODUCCIÓN

de un analito en una serie de muestras, es obligatorio medir tanto las muestras de concentración
desconocida como los estándares de concentraciones conocidas en las mismas condiciones.

La variación de la señal con respecto a la concentración o contenido de analito es el fundamento

de la comparación. Esa relación es la forma de llegar a la cuantificación de los analitos. La rela-
ción entre el contenido o concentración de analito y la señal analítica se ha de definir de forma
matemática, puesto que en definitiva el proceso de calibrado lo que pretende es un modelado de
la respuesta instrumental. Además de la variación de la concentración de los analitos, el mode-
lado matemático puede tener en cuenta otros compuestos químicos que haya en la muestra así
como las condiciones físico-químicas de la misma. En consecuencia, si los factores a considerar
son muchos, los modelos matemáticos pueden ser muy engorrosos.

Figura 1.1: Relación entre la señal y la concentración.

Aunque más adelante se profundizará sobre ello, el protocolo de la calibración consiste en una
sucesión de operaciones, a pesar de que parezca que consiste solo en la preparación y medición
de disoluciones de concentración o contenido conocido. Los valores de las señales obtenidas
experimentalmente y las concentraciones de los analitos han de ser ajustados mediante funciones
matemáticas. El objetivo del ajuste es obtener los valores de los parámetros de la función de
calibrado que se utilizará posteriormente para la cuantificación de los contenidos de las muestras
desconocidas.

En el núcleo de la calibración se encuentran los estándares de contenido conocido. Entre los

estándares están los de primer nivel, segundo nivel, estándares de referencia y los estándares de
trabajo. Se puede decir que los de primer nivel son los que tienen las características metrológi-
cas más importantes y sus valores son aceptados sin compararlos con estándares de la misma

2
 1.2. CALIBRACIÓN ANALÍTICA

calidad. Los de segundo nivel vienen de la comparación con los de primer nivel. Los estánda-
res de referencia son los que tienen características metrológicas más altas y son accesibles en
sitios conocidos y organismos metrológicos de prestigio. Por último, los estándares de trabajo
son estándares utilizados para la construcción de calibrados, para demostrar la bondad de un
instrumento o para medir materiales de referencia.

En consecuencia, el mejor resultado de una medición cuantitativa es la del propio calibrado, es

decir, no se puede obtener mejor resultado cuantitativo que el del propio calibrado. Los factores
que pueden expresar la calidad de un calibrado son los siguientes:

Repetitividad de las medidas. Si la señal es muy variable, tanto con las muestras como con
los estándares, entonces, el poder de predicción del calibrado será más pobre.

Veracidad de los estándares. A pasar de que los valores asignados a un estándar se encuen-
tran dentro de un intervalo de incertidumbre, hay que utilizar los estándares en condiciones
muy extremas para que éstos pierdan su veracidad.

Validez de las comparaciones. Este suele ser la gran amenaza de los análisis químicos.
Hay que asegurar, de todas las formas posibles, que la respuesta del instrumento es veraz
con los estándares y con las muestras desconocidas. Las diferencias físicas (T, presión,
viscosidad, tamaño de partícula, etc.), por ejemplo, pueden ser muy influyentes y la res-
puesta instrumental puede llegar a ser muy diferente en función de cómo sean las muestras
y los estándares .

1.2. Calibración analítica

1.2.1. Protocolo de calibración

El esquema de la Figura 1.3 en la página siguiente solo pretende mostrar las operaciones de la
calibración. Por lo tanto, no hay que seguir en todos los casos la misma sucesión de operaciones.
De cualquier forma, a partir de este esquema se puede extraer una idea de cual es el camino más
general a seguir en el caso de llevar a cabo una calibración.

El primer paso es la obtención de los estándares adecuados o la preparación de los mis-

mos. Para preparar los estándares del modo más adecuado hay que tener en cuenta las
condiciones físicas (estado físico, condiciones físicas, etc.) y químicas de las muestras
desconocidas.

3
 1.2. CALIBRACIÓN ANALÍTICA

Figura 1.2: La bondad de la calibración puede verse limitada porque las concentracio-
nes/contenidos de los estándares tienen un ajuste escaso o porque la señal es muy
variable.

Figura 1.3: Protocolo general de calibración analítica.

4
 1.2. CALIBRACIÓN ANALÍTICA

El siguiente paso es la medida de los estándares preparados. Para ello, hay que determinar
primero cuantos estándares se van a preparar y cuantas medidas se van a hacer con ellos.

Una vez medidos los estándares habrá que llevar a cabo el ajuste mediante modelos de
calibración. La construcción del modelo es una formulación matemática empírica que
resulta de la comparación de la señal y la concentración, en la mayoría de los casos la
ecuación de una línea recta. Este desarrollo tiene características estadísticas y en función
de ellas se hablará de la idoneidad o bondad del modelo de calibrado.

Tras medir las muestras se aplicará el modelo para estimar las concentraciones descono-
cidas. En el mismo nivel, de acuerdo con este protocolo, se realizará la validación de la
calibración. Aunque es preciso validar todo el proceso analítico, en muchos casos, para
mostrar la utilidad del modelo de calibración se puede hacer una validación de la calibra-
ción. Para ello, el mejor modo es el siguiente: medir los estándares que no se han utilizado
en la elaboración del modelo de calibración y por medio de éste calcular los valores de
las concentraciones. Las diferencias entre los valores conocidos y los valores calculados
mostrará la idoneidad de la calibración.

1.2.2. Modelos matemáticos de calibración

Como se ha indicado, la calibración depende de distintas variables. En primer lugar, hay que
seleccionar el modelo matemático que va a relacionar la señal con la concentración/contenido
de los analitos. Si se analizan de forma general las posibilidades, se pueden seleccionar las dos
siguientes:

S = f (Canalito ) (1.1)

S = fi, j (Ci , X j ) (1.2)

La primera opción es la más simple, puesto que la señal (S) solo depende de la concentración del
analito. Esa situación se elige para que el modelo sea lo más simple posible y porque la señal que
se utiliza es selectiva. La señal medida puede tener el aporte de varios componentes químicos
(Ci ) y mostrar una dependencia respecto a las condiciones físico-químicas no específicas ni
relacionadas directamente con la concentración de los analitos (X j ). Este tipo de modelos se usan
cuando se hace el análisis simultáneo de distintos tipos de analitos o cuando las interferencias
de otros componentes o condiciones son significativas.

5
 1.2. CALIBRACIÓN ANALÍTICA

Si se sigue la posibilidad mostrada por la ecuación 1.1 en la página anterior se podrían usar
muchos modelos de calibración. De todos ellos, el más simple es el siguiente:

S = β1 ·Canalito (1.3)

puesto que es un modelo con un solo parámetro (β1 ). Para aceptar dicho modelo hay que ase-
gurarse de que cuando la Canalito = 0 la señal también es nula, porque si no el modelo no sería
adecuado. El parámetro β1 mide la sensibilidad del modelo de calibración, es decir, la posibili-
dad de distinguir concentraciones muy cercanas. Al intervalo de concentración de analito donde
ese parámetro es constante se le denomina intervalo de trabajo.

Sin embargo, el modelo anterior no es muy utilizado puesto que para concentraciones nulas de
analito es difícil obtener señales nulas. En consecuencia, es más utilizado el siguiente modelo:

S = β0 + β1 ·Conc. (1.4)

donde β0 es la ordenada en el origen de coordenadas de la recta y β1 , de nuevo, la sensibilidad.

Como antes, el intervalo donde ambos parámetros son validos definirán el intervalo de trabajo
lineal. Sin ninguna duda, este modelo es de los más utilizados para el análisis de un único analito,
puesto que solo tiene dos parámetros ajustables y la función es sencilla.

Cuando se quiere ampliar el intervalo de trabajo de los modelos anteriores, o cuando se quieren
incluir las curvaturas en el modelo, hay que recurrir a polinomios de mayor grado. Por ejemplo:

S = β0 + β1 ·Conc. + β2 ·Conc.2 (1.5)

Este tipo de polinomios son totalmente empíricos, es decir, se introducen polinomios de mayor
grado para conseguir un ajuste mejor, no porque haya algún fundamento mecanístico concreto.

Como se ha dicho anteriormente, dadas las facilidades computacionales existentes hoy día, se
pueden usar modelos más elaborados y matemáticamente complejos, si bien las condiciones
asociadas a los mismos son cada vez más extremas. Por ejemplo, cuando el número de analitos a
determinar en la muestra es superior a uno, se puede pensar que utilizar un sistema instrumental
en el que se puedan determinar todos a la vez puede ser una buena salida. Seguramente ese
sistema dará más de una señal para cada medida, es decir, la respuesta instrumental será función
de muchas variables. Si bien este tipo de modelo de calibración no es más que una extensión del
anterior, se puede resolver mediante el siguiente sistema de ecuaciones:

6
 1.2. CALIBRACIÓN ANALÍTICA

S
y = b 0 + b 1 *C

y = b 0 + b 1 *C+ b 2 *C 2

Figura 1.4: Resultados de la calibración con estándares y representación de los modelos mate-
máticos

y11 = b11 · x11 + b12 · x12 + .... + b p1 · x1p

y21 = b11 · x21 + b12 · x21 + .... + b p1 · x2p
(1.6)
:::::
yn1 = b11 · xn1 + b12 · xn2 + .... + b p1 · xnp

En este caso se habla de un modelo de calibración multivariante, cuyo esquema general se

presenta en la Figura 1.5.

Figura 1.5: Esquema de la calibración multivariante.

Los modelos anteriores se dicen que son lineales, es decir, todos los parámetros tienen una
relación lineal con la señal (no dependen de operadores matemáticos). En esas condiciones, el
procedimiento matemático para la realización del ajuste será la regresión lineal, que se analizará
más adelante. En algunos casos, de todas formas, se utilizan también relaciones no lineales.
Entre ellas hay que destacar las funciones logarítmicas y las potencias. En esos casos, el ajuste
del modelo matemático tiene que llevarse a cabo por otras vías, concretamente, mediante la

7
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

regresión no lineal.

En cualquier caso, en el ajuste del modelo los problemas que pueden surgir son, principalmente,
los dos siguientes:

utilizar un modelo pobre, es decir, tener en cuenta pocos parámetros o pocos componentes

utilizar un modelo sobreajustado, es decir, usar demasiados parámetros o componentes.

Los dos tienen un efecto contrapuesto y ninguno es adecuado para la validación del modelo de
calibración. En el primero de los casos se pierde información, puesto que el modelo no puede
explicar la variación de la concentración como es debido. El segundo, además de mostrar las
variaciones originadas por los analitos, introduce otras variaciones referidas a otras fuentes que
no es necesario considerar. En este contexto tiene mucha importancia la realización de la vali-
dación del modelo de calibrado, puesto que si le consigue validar el modelo cabe pensar que los
dos problemas anteriores han sido superados.

Una costumbre suele ser la de utilizar el modelo más simple y confirmar si ese modelo es válido
con los datos de calibración recogidos.

1.3. Fundamento estadístico de la calibración

De los modelos anteriores, únicamente se ofrecerán aquí los detalles o características del modelo
lineal y de ellas solo las referidas a las calibraciones de una única variable (modelo de calibrado
univariante). La estimación de los valores de los parámetros de la ecuación 1.4 en la página 6 y
sus incertidumbres se lleva a cabo mediante las siguientes operaciones:

∑Ni=1 (xi − x) · (yi − y)

b1 = 2
(1.7)
∑Ni=1 (xi − x)

b0 = y − b1 · x (1.8)

donde x e y, son los valores medios de x e y. La varianza de los residuos del modelo se puede
expresar de la siguiente forma:

2
∑Ni=1 (yi − ybi )
s2y = (1.9)
N −2

8
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

donde ybi es el valor de yi calculado a través del modelo.

El fundamento de estas ecuaciones es el procedimiento de mínimos cuadrados. Para ello, dado

que el número de medidas experimentales (es decir, el número de disoluciones distintas que se
miden) es mayor que el de parámetros a calcular (N >2) la condición que hay que poner es que
la suma de los cuadrados de los residuos sea mínima. Para cualquier modelo que se considere,
los residuos son los valores experimentales menos los calculados, por lo tanto:

ri = yi − ybi = yi − f (xi ) = yi − (b0 + bi · xi ) (1.10)

N
R = ∑ (ri )2 =⇒ min (1.11)
i=1

y resolviendo las derivadas parciales con respecto a los parámetros de la suma cuadrática de los
residuos (R) se estiman los valores de los parámetros b1 y b0 como se recoge en las ecuaciones
1.7 y 1.8, respectivamente.

Es preciso señalar que hay una serie de condiciones implícitas en las ecuaciones anteriores:

1. La incertidumbre de los estándares es despreciable con respecto a las incertidumbres de

la medida de esos estándares. Esta suposición se puede dar como válida fácilmente si los
estándares se preparan a partir de los compuestos puros. De prepararlos de otra manera,
las conclusiones obtenidas no serán utilizables.

2. Las medidas son independientes. No deben existir tendencias con respecto al tiempo o a
posibles contaminaciones.

3. Las medidas tienen desviaciones estándar parecidas que no dependen de los valores de
dichas medidas

4. Las medidas presentan una distribución normal.

Los cálculos de mínimos cuadrados expresados por medio de las ecuaciones anteriores se pueden
realizar fácilmente usando hojas de cálculo o en las calculadoras modernas.
Ejemplo 1.1a. Supongamos que se ha llevado a cabo la determinación espectrofotométrica de formaldehí-
do a 570 nm. La calibración se ha llevado a cabo con 7 disoluciones, con los resultados recogidos en la
siguiente tabla:

9
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

C (mg.l−1 ) Aexp
0.1 0.086
0.3 0.269
0.5 0.445
0.5 0.452
0.6 0.538
0.7 0.626
0.9 0.782

Tras introducir los datos en la hoja de cálculo Excel se pueden representar éstos así como la resolución
del ajuste por medio de la ecuación 1.4 en la página 6. De quererlo, Excel puede representar fuera de la
imagen los resultados obtenidos por medio del ajuste de mínimos cuadrados con la información estadística
mas relevante del ajuste.

1 .00
0 .80
0 .60
S

0 .40
0 .20
0 .00
0 0 .2 0 .4 0 .6 0 .8 1

Por lo tanto, el modelo de calibración del formaldehído se puede expresar mediante la siguiente ecuación:

S = (0,006 ± 0,008) + (0,87 ± 0,01) ·C

1.3.1. Análisis de varianza de la regresión lineal

Para mostrar la adecuación estadística del modelo de calibrado hay que hacer un análisis varianza
de los residuos. Para ello la suma de los cuadrados de los residuos (SSR ) se dividirá en dos
componentes: en la suma de los cuadrados de los residuos de los puntos experimentales (SS pe )
y en la suma de los cuadrados de la falta de ajuste (SSlo f ):

10
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

SSR = SS pe + SSlo f (1.12)

SSR es la suma de los cuadrados de los residuos:

SSR = ∑(yi − ybi )2 (1.13)

i

SS pe es la suma de los cuadrados de las incertidumbres de las medidas experimentales. Para

poder estimar SS pe por lo menos hay que repetir una medida o conocer de antemano su valor, ya
que de otra forma no se podría hacer el análisis de varianza.

SS pe = ∑(yi − yi )2 (1.14)
i

Por último, SSlo f es la suma cuadrática de la falta de ajuste. Este factor reune la diferencia entre
la media de las muestras repetidas y los valores calculados por el modelo.

SSlo f = ∑(yi − ybi )2 (1.15)

i

SSR

SSpe SSlof

dfpe dflof

MSpe MSlof

FKalk= MSlof /MSpe

Figura 1.6: Esquema del ANOVA del calibrado.

De la misma forma que se ha separado la suma de cuadrados, los grados de libertad también
se pueden separar. Teniendo en cuenta los grados de libertad, se pueden calcular las varianzas

11
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

como el cociente entre la suma de cuadrados y los grados de libertad. Esta última operación solo
se hará para el caso de Var pe y Varlo f , puesto que esos serán los valores a comparar.
Como hay que comparar las varianzas la prueba a utilizar será el test F, es decir, se calculará
el cociente entre esas dos varianzas y después de compararlas con el valor crítico se obtendrán
conclusiones sobre esas varianzas. En consecuencia, si Varlo f ∼ Var pe no habrá desajustes muy
grandes y el modelo sería adecuado. Sin embargo, si Varlo f ≫ Var pe el modelo ensayado mos-
trará un desajuste y no se debería utilizar.
Muchas veces, para mostrar la idoneidad del ajuste, se utiliza el coeficiente de determinación
del modelo (r2 ) que no es más que la varianza debida a los parámetros del modelo (SS f act )
dividido por la varianza de la correlación (SScorr ). La suma de esos dos cuadrados se calcula de
la siguiente forma:

SScor = ∑(yi − y)2 SS f act = ∑(yi − ybi )2 (1.16)

i i

SS f act
r2 = (1.17)
SScor

Ejemplo 1.1b. Para hacer el análisis de varianza del anterior modelo de calibración (ejemplo 1.1a) se han
recogido en la siguiente tabla las sumas de cuadrados y las varianzas:

SS df Var F Fcrit ( %95)

Residuos 0.00036 5
incertidumbre experimental 0.0000245 1 2.45E-05
falta de ajuste 0.0003355 4 8.39E-05 3.42 230.5

Se ve que F <Fcrit y por lo tanto se puede confirmar que no hay diferencia entre las dos varianzas con un
nivel de confianza del 95 %.
Como se ha dicho en el anterior apartado el coeficiente de determinación (r2 ) es de 0.999, es decir, los
parámetros b0 y b1 son capaces de explicar un 99.9 % de la correlación entre x e y.
El análisis de varianza tiene más representatividad que los valores de r2 . Con los valores de r2 del ejemplo
no se puede decir que es un ajuste adecuado (o inadecuado), es decir, un valor de r2 cercano a 1 no
asegura de que el modelo sea adecuado. Como antes se ha dicho, el significado de ese r2 es de otro tipo,
concretamente, la varianza total que explican los parámetros de la regresión. Es más, que el modelo sea
adecuado no significa que todos los parámetros sean necesarios, y así, se podría discutir si b0 = 0 o no.

En consecuencia, como antes se ha dicho, para hacer una calibración adecuada hay que decidir el
número de estándares y las replicas de esos estándares. En función de lo visto hasta ahora, para

12
 1.3. FUNDAMENTO ESTADÍSTICO DE LA CALIBRACIÓN

el modelo y = b0 + b1 · c, el número de estándar distintos, es decir, el numero de concentraciones

o contenidos distintos tendría que ser más de cuatro para que la estimación de SSlo f tuviera el
número de grados de libertad suficiente. Del mismo modo, habrá que medir más de dos estándar
con concentración o contenido parecido para hacer una estimación adecuada de SS pe .

1.3.2. Calculo de predicciones

Una vez que el modelo está definido, esto es, una vez que se han realizado las estimaciones de los
parámetros y sus incertidumbres, el siguiente paso es estimar los valores de las concentraciones
desconocidas junto con sus incertidumbres. La estimación de las concentraciones desconocidas
no tiene una gran dificultad y se puede hacer una estimación de las incertidumbres de esas
concentraciones utilizando procedimientos de propagación de incertidumbres.

La estimación de concentraciones desconocidas, por lo tanto, se llevará a cabo a través de la

siguiente expresión:

yesp − b0
xbi = (1.18)
b1

y su incertidumbre se puede expresar mediante la ecuación:

s
sy 1 1 (y − y)2
sxi = + + 2 0n (1.19)
b1 p n b1 · ∑i (xi − x)2

donde y0 es la señal experimental de la muestra, p el numero de medidas realizadas y n el

número de estándares repetidos utilizados en la calibración o bien utilizando el procedimiento
de Kragten por medio de una hoja de cálculo.

1.3.3. Limites de detección

Entre los detalles estadísticos de los modelos de calibración algunos de los más útiles son los
límites de detección y de determinación.

Si no aparece concretado en el protocolo de calibración, para obtener el límite de detección lo

que se suele hacer es bien medir una disolución sin analito (c = 0) o bien medir varias veces
una disolución de la misma concentración. A una disolución así preparada (con c = 0) se le
denomina blanco puesto que tiene todos los reactivos del estándar salvo el analito. Por medio
del modelo de calibrado directamente o por medio de la medida del blanco se puede estimar cual

13
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

es la concentración más pequeña que el modelo de calibración puede expresar. Para concretar
bien esa condición hay que tener en cuenta el siguiente concepto: es preciso distinguir muy
bien que la señal medida es del analito y no del blanco. Para ello, el valor de la señal (yld ) que
corresponde al limite de detección tiene que ser mucho mayor que la que corresponde al blanco.

yld = yblanco + 3 · sblanco (1.20)

donde yblanco es la señal que corresponde al blanco y sblanco su desviación estándar. El límite de
detección es el valor de concentración que corresponde a esa señal yld y que habrá de calcularse
de acuerdo a la ecuación de calibrado.

Tres veces la desviación estándar del blanco da la suficiente confianza para que la diferencia
entre la señal y el blanco sea tomada como significativa.

En ausencia de medidas de la señal del blanco se pueden utilizar el valor de la ordenada en el

origen (b0 ) y su incertidumbre obtenidos en el calibrado como estimadores o valores tentativos
de yblanco y sblanco , respectivamente.

Expresar que la señal medida no es del blanco no garantiza estadísticamente una estimación
adecuada de la concentración del analito. En consecuencia, para dar la concentración del analito
de modo adecuado hay que definir el límite de determinación o cuantificación. Este límite ex-
presará la concentración más pequeña que se puede determinar. Para ello se propone el valor de
la señal del blanco mas diez veces es la desviación estándar del blanco. En la Figura 1.7 en la
página siguiente se presenta una representación esquemática de estos conceptos.

Estos límites se suelen discutir mucho entre los fabricantes de instrumentación puesto que no hay
un acuerdo total en la definición de esos dos límites. En consecuencia, los límites de detección
y determinación son parámetros que ayudan a la calibración para mostrar sus cualidades.

1.4. Influencia de la matriz

El procedimiento de calibración mostrado hasta ahora es el conocido como calibración exter-

na. Es decir, las muestras que se quieren analizar y los estándares utilizados para concretar el
método son totalmente independientes. Para dar esa calibración por buena (para poder hacer
comparaciones adecuadas e interpretar los resultados) las matrices de los estándares y de los
analitos han de ser muy parecidas o, dicho de otra forma, la influencia de la matriz del analito
en la señal debe de ser despreciable. Cuando no se cumplen esas condiciones, bien porque hay

14
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

3sb

(a)

(b)

Figura 1.7: Representación de los limites de detección (a) y consecuencia de los resultados (b).

15
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

interferencias de componentes químicos desconocidos o bien porque se dan fenómenos físico-

químicos desconocidos, las determinaciones mediante calibración externa pueden tener errores
sistemáticos bastantes importantes.

En primer lugar hay que diferenciar entre las interferencias referidas a la matriz y las referidas a
componentes químicos. Para ello se pueden analizar los dos tipos de interferencias que aparecen
en la Figura 1.8. En la parte (a) de dicha figura queda bastante clara la influencia de un segundo
componente químico en la señal. En la parte (b) de la figura la influencia no queda bastante
clara puesto que no se puede adscribir esa interferencia a un compuesto químico concreto. Si
algún compuesto químico tiene una influencia importante sobre la señal considerada, existe la
posibilidad de corregir esa interferencia o de introducirla en un modelo de calibración, según
se estime oportuno. Cuando se habla de la influencia de la matriz hay que entender que es algo
más inespecífico, puesto que existen menos posibilidades de corregirla o de introducirla en un
modelo de calibración. Cuando se habla de la matriz se habla de todo lo que no sea analito. Por
lo tanto, hay que entender en toda su extensión la influencia que la matriz o un no-componente
pueda tener. Debido a ello, la influencia de la matriz hay que tratarla de un modo especial.

a b

Figura 1.8: Interferencias de distinto origen sobre la señal.

1.4.1. Calibración por medio de adicciones estándar

Para salvar ese problema se ha propuesto y desarrollado el método de adicciones estándar. Si

bien es distinto en función de la técnica analítica utilizada, el método de adiciones estándar
presenta los siguientes pasos comunes:

Preparación de la muestra que se quiere estudiar (con todos los reactivos adicionales) y
medida de ésta.

Adicción de alícuotas de disoluciones (normalmente diluídas) de estándar a la anterior

muestra/disolución y medida de la nueva disolución.

16
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

Este procedimiento se ha representado en la Figura 1.9.

(a)

(b)

Figura 1.9: (a) Preparación y (b) Calibración mediante adiciones estándar.

Este método solo se puede utilizar en el caso de que se cumplan las siguientes condiciones :

* Que exista una relación lineal entre la señal y la concentración

* Las muestras que contienen el analito no puede contener enmascarantes del analito.

Puesto que los volúmenes de estándares que se añaden sobre la muestra son pequeños, la matriz
del analito no varía a pesar de que las concentraciones del analito varíen en el intervalo que se
quiera. En la mayoría de los casos además de la muestra se suelen hacer tres o cuatro adicciones
más y la concentración de analito que tiene la muestra se obtiene por extrapolación.

Ejemplo 1.2. Supongamos que se quiere hacer la determinación de cobre en una aleación de hierro
mediante adiciones estándar. Para ello se han preparado estándares de 10 ml, tal y como se indica en la
siguiente tabla:

Se toman 9 ml de la muestra de hierro y sobre ella se añaden distintas adicciones de 0 - 0.25 ml de

estándares procedentes de una disolución de Cu de 500 mg.l−1 y se llevan a 10 ml con agua destilada.

17
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

Vmuestra (ml) Vest (ml) Vagua (ml) Cest (mg.l−1 ) Señal

9 0 1 0 44.22
9 0.1 0.9 5 86.90
9 0.2 0.8 10 121.54
9 0.15 0.85 7.5 106.06
9 0.25 0.75 12.5 150.13
9 0.05 0.95 2.5 66.92

1 6 0 ,0 0 y = 8 ,1 4 3 5 x + 4 5 ,0 6 4

S
1 2 0 ,0 0

8 0 ,0 0

4 0 ,0 0

C (m g /l)
0 ,0 0
-1 0 -5 0 5 10 15

-4 0 ,0 0

CCu = 45.064 / 8.14 = 5.53 mg·l−1

SCu = 0.35 mg·l−1

La concentración obtenida es de la disolución total, es decir, es la concentración que corresponde a 10

ml y no la que corresponde a la muestra original. Puesto que ésta está sobre 9 ml habrá que hacer una
corrección por el efecto de esa dilución:

CCu corregida = 5,53 10

9 = 6.15 ± 0.38 mg·l
−1

1.4.2. Utilización de estándares internos

En los procesos de calibrado se ha tenido que hacer dos suposiciones:

La cantidad de muestra tomada bien para la determinación o para la calibración es cono-

cida de forma concreta.

18
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

Los apartados del procedimiento son los mismos en el caso de la muestra y de los están-
dares, siendo constantes los parámetros físicos influyentes.

Sin embargo, en ciertos métodos analíticos no se pueden aceptar esas dos suposiciones en su to-
talidad, por ejemplo en las cromatografías líquida y de gases cuando la inyección de la muestra
se realiza a mano o en la fluorescencia de rayos X. Mientras que el problema de la cromatogra-
fía es la variabilidad del volumen, los problemas de la técnicas espectroscópicas son fenómenos
físico-químicos propios. Para resolver esos problemas se suelen llevar a cabo correcciones me-
diante estándares internos. Es decir, aparte del analito hay que añadir otro componente conocido
a las muestras y a los estándares, en una concentración fija. Si la señal tiene una variación ines-
pecífica pero es parecida tanto en la de los analitos como en la de los estándares, entonces la
relación entre ellos es un indicador más adecuado que la señal.

La Tabla 1.1 y la Figura 1.10 en la página siguiente representan este procedimiento de calibra-
ción y los resultados obtenidos con él.

Cuadro 1.1: Calibración mediante estándares internos.

no Canalito (mg.l −1 ) Cei (mg.l −1 ) Sanalito Sei Sanalito /Sei
1 0 2 -0,524 25,182 -0,021
2 8 2 22,860 10,075 2,269
3 3 2 16,223 21,575 0,752
4 6 2 8,139 5,529 1,472
5 1 2 2,581 11,864 0,218
6 2 2 2,130 4,642 0,459
Muestra 1 ¿? 2 14,929 28,142 0,530
Muestra 2 ¿? 2 18,492 12,589 1,469

Los estándares internos han de cumplir condiciones muy estrictas para ser utilizables. En gene-
ral, las señales de los estándares internos han de ser parecidas a la de los analitos, tienen que ser
compuestos químicamente parecidos y la muestra no ha de contener esos compuestos.

1.4.3. Dilución isotópica

Una variación del método del estándar interno es la dilución isotópica/espectrometría de masas
(IDMS). Cuando el espectrómetro de masas es el detector de un sistema cromatográfico o cuan-
do se hace un análisis inorgánico elemental por medio de ICP1 , se pueden medir isótopos de
abundancias distintas y añadiendo un isótopo o varios de cada elemento por medio de estándares
1 Latécnica de ’Inductively Coupled Plasma’ (ICP) o plasma de acoplamiento inducido es una técnica de emisión
atómica.

19
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

25,000
S
20,000

15,000

10,000

5,000
C
0,000
0 2 4 6 8 10
-5,000
(a)

2,500
S/Sbe

2,000

1,500

1,000
y = 0,273x - 0,062
2
R = 0,9939
0,500

0,000
0 2 4 6 8 10
-0,500 C
(b)

Figura 1.10: (a) Calibración directa y (b) calibración por medio de estándares internos.

20
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

se pueden medir las relaciones de isótopos. Aunque el fundamento es muy parecido, hay dife-
rencias fundamentales entre la dilución isotópica/espectrometría de masas usada en el análisis
orgánico y en el análisis elemental.

En el análisis orgánico la adición de los derivados isotópicos de los analitos a la muestra se hace
en concentraciones muy bajas. Es decir, se utilizan derivados de 13C o 2 H para conseguir que
la masa del analito aumente a M + +3 respecto de la natural. Puesto que los derivados isotópicos
y los analitos tienen las mismas características cromatográficas llegaran al mismo tiempo al
detector y los derivados isotópicos harán la labor del estándar interno.

El procedimiento que se sigue en el análisis elemental es distinto. En principio, la concentración

de derivados isotópicos que se añade es bastante mayor, muchas veces mayor que la del analito.
Por ejemplo, la relación de isótopos de la plata es la siguiente: 107 Ag 51.84 % y 109 Ag 28.16 %.
Los contenidos de disolución de isótopos que se pueden añadir para determinar la plata son los
siguientes: 107 Ag 80 % y 109 Ag 20 %.

Una vez que se ha realizado la adicción de los isótopos y se ha dejado estabilizar la muestra los
análisis obtenidos por medio de IDMS no muestran influencia en los procedimientos químicos
usados para la determinación del analito. Es decir, tras dopar la muestra si hay que hacer ex-
tracciones o realizar cualquier otro tipo de procedimiento de adecuación de la muestra y a pesar
de que en ellos se produzcan perdidas de analito, el análisis dará resultados adecuados. Esta
característica proporciona una ventaja del IDMS sobre cualquier otro procedimiento analítico e,
incluso, se ha llegado a proponer que el IDMS se trata de un método de análisis absoluto.

Sin entrar en profundidades técnicas, el procedimiento de IDMS se puede resumir en los si-
guientes pasos:

Sobre una alícuota conocida de analito se añade una cantidad de derivados isotópicos
también conocida.

Se estabiliza la muestra junto con la adición de isótopos

Se realizan los trabajos de separación de los analitos o preparación de la muestra pertinen-

tes.

Se realiza la determinación de la alícuota extraída por medio de espectrometría de masas

(por medio de ICP-MS o por cromatografía ).

Se determina de modo exacto la relación de las señales entre el derivado isotópico y el

analito y se comparan con las obtenidas en la calibración. Así se puede obtener la concen-
tración del analito.

21
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

Figura 1.11: El fundamento del IDMS a partir del espectro de masas del Pb

El fundamento del análisis mediante IDMS se puede mostrar a partir de la Figura 1.11 en donde
se hace uso del espectro de masas del Pb. Para ello, se realiza el dopaje de la muestra con una
cantidad conocida del isótopo adecuado, normalmente aquel isótopo estable de menor abundan-
cia. Si ello no fuera posible, se podría dopar con isótopos radiactivos de vida media larga. En
la Figura 1.11 se utiliza el 206 Pb
para dopar la muestra mientras que el isótopo de referencia
presente en la muestra es el 208 Pb. Una vez añadido el isótopo presente en la disolución de
dopaje se debe asegurar una buena mezcla y homogeneización de la muestra antes de proseguir
con el tratamiento de la muestra. Si la muestra fuera sólida sería necesaria alguna de las técnicas
de descomposición que se mencionarán en los siguientes Capítulos. Si la homogeneización de
la muestra ha sido adecuada, la relación isotópica entre el isótopo de referencia y el dopado no
se vería alterada, incluso si hubiera pérdida de muestra o la digestión no fuera cuantitativa.

Una vez finalizadas todas las operaciones analíticas de tratamiento, la muestra estaría preparada
para la medida de la relación isotópica R. Como se ha mencionado, la relación viene dada por
el isótopo dopado y el de referencia. En cualquier caso, es necesaria la ausencia de cualquier
interferencia isobárica2 sobre estos isótopos con el fin de garantizar una medida efectiva de la
relación R. En el ejemplo de la Figura 1.11 se mediría la relación R =208 Pb/206 Pb para deter-
minar el contenido de plomo en la muestra. Como se muestra en la Figura 1.11, las intensidades
del isótopo ligero y del pesado son aditivas, por tanto, se cumple la siguiente relación:

Nl ·2 hl + Nd ·2 hd
R= (1.21)
Nl ·1 hl + Nd ·1 hd

donde N es el número de átomos presente y h la abundancia relativa ( %) de cada isótopo. Los

subíndices l y d identifican a la muestra y a la disolución de dopaje utilizadas. A partir de la
2 Debida a la presencia en la muestra de isótopos de otros elementos con el mismo peso atómico.

22
 1.4. INFLUENCIA DE LA MATRIZ

ecuación 1.21 se puede obtener Nl de la forma siguiente:

2 h + R ·1 h


Nd d d
Nl = (1.22)
R ·1 hl −2 hl

y de la ecuación obtenida se puede deducir el contenido del analito presente (Gl ) en la muestra
original:

2 
M hd + R ·1 hd
Gl = 1,66 · 10-18 · · Nd · (µg · g-1 ) (1.23)
Wl R ·1 hl −2 hl

donde M es la masa atómica del elemento a determinar y Wl la masa (en g) de muestra analizada.

23
 1.5. EJERCICIOS

1.5. Ejercicios

1. Se ha llevado a cabo una calibración de Pb nivel de trazas por medio de espectrometría de

absorción atómica en cámara de grafito, obteniéndose los siguientes resultados:

Pb (ng/ml) 0 0.25 0.50 0.75 1.0 2.0 3.0

Señal 0.0017 0.0031 0.0053 0.0072 0.0091 0.0156 0.0221

a) Utilizando métodos gráficos, ¿cual es el modelo más adecuado para la calibración?

b) ¿Cual es el limite de detección de esa calibración?
c) Tras medir la muestra dos veces, las señales obtenidas fueron 0.0063 y 0.0061. ¿Cual
es la concentración de Pb y su incertidumbre para un nivel de confianza del 95 %?

2. Supongamos que se quiere determinar Cd y Zn por medio de ICP. Para ello, se realizan
las siguientes calibraciones en el laboratorio:

Zn (mg/l) S Cd (mg/l) S
0 2.50 0 1.16
1 7.62 0.5 10.35
2 12.31 1 19.03
2 13.23 1 18.32
4 25.15 2 36.89
4 28.37 2 38.06
8 44.80 4 78.69
16 70.63 8 165.46

a) Discutir por medio de ANOVA si el modelo S = b0 + b1Cm es adecuado para cada

caso.
b) ¿Que le ocurriría a la calibración del Zn si se quitara la última medida?

3. Supongamos que en una aleación de Fe-V se quiere determinar los contenidos de Mo, Cr
y Ti si se sabe que se encuentran en un intervalo entre 0.5 - 7.5 %. Además, se sabe que
en el tratamiento de la muestra se ha tomado 1.00 g y que tras disolverlo se ha llevado
hasta 50 ml. Por otra parte, sabiendo que los estándares primarios de ese metal son de
1000 mg/l y el intervalo de calibración puede llegar como máximo hasta 50 mg/l, explica
como llevarías a cabo la calibración de esos metales y como adecuarías la muestra de la
aleación al intervalo de calibración.

24
 1.5. EJERCICIOS

4. La determinación de As en agua de mar se ha llevado a cabo de las siguientes dos formas:

mediante calibración directa y con adiciones estándar. En el primer procedimiento se han
obtenido los siguientes resultados:

As (ng/ml) 0 5 10 20 20 30 50
S 5.07 47.50 85.31 167.27 169.60 250.56 421.49

Los resultados de la muestra son los siguientes:

M1 = 457.29

M2 = 449.54

Por medio de adicciones estándar, en cambio, se ha preparado un estándar de 2000 ng/ml y

sobre una muestra de 4.5 ml se han añadido distintos volúmenes, como recoge la siguiente
tabla, siendo el resto -hasta 5 ml- agua:

Vest (ml) S
0.03 625.60
0.05 747.45
0 458.67
0.065 839.50
0.1 1020.27
0.065 825.07
0.075 895.73

a) Analiza si las medidas de calibración y adiciones estándar tienen un ajuste adecuado.

b) Calcula la concentración de As para cada procedimiento e indica si los resultados se
pueden considerar parecidos.
c) Si la concentración real es de CAs = 30.3 ± 0.9 ng/ml, ¿a que atribuirías esa diferen-
cia?

25