UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS - ESPE

DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA

INGENIERÍA EN BIOTECNOLOGÍA

ENZIMOLOGÍA

NOMBRES: Alexander Maldonado, Roque Rivas

FECHA: 11 de Noviembre de 2013

NRC: 4686

1. TEMA: Actividad de la deshidrogenasa del ácido succínico.

2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo General
 Determinar la actividad de la deshidrogenasa del ácido succínico en músculo
fresco.

2.2 Objetivos Específicos

 Determinar los parámetros cinéticos de la ecuación de Michaelis-Menten para
cada concentración de inhibidor.
 Determinar tipo de inhibición de este proceso enzimático.

3. INTRODUCCIÓN
La enzima succinato deshidrogenasa o deshidrogenasa del ácido succínico es una
oxidorreductasa que cataliza la oxidación del succinato para formar fumarato siendo la
coenzima el FAD. Esta enzima se localiza en eucariontes en la membrana mitocondrial
interna (MacFaddin, 2003).
La succinato deshidrogenasa cataliza la deshidrogenación estereoespecífica de succinato a
fumarato, como se observa en la Fig. 1.

(Voet et al; 2007).

Fig. 1.- Deshidrogenación del succinato

Esta enzima es inhibida fuertemente por malonato,

(Voet et al; 2007).

Fig. 2.- Malonato y Succinato.

un análogo estructural del succinato (Fig. 2) y un ejemplo clásico de un inhibidor

competitivo. Cuando Krebs formuló su teoría del ciclo del ácido cítrico, la inhibición de la
respiración celular por malonato proporcionó una de las claves de que el succinato cumple
un papel catalítico en la oxidación de sustratos y que no es solo otro sustrato (Voet et al;
2007).
 4. RESULTADOS
4.1. Resultados primarios:

Tabla 1: Absorbancias versus tiempos a diferentes concentraciones de sustrato e inhibidor.

ABSORBANCIA
INHIBIDOR CONCENTRACIÓN 0[min] 1[min] 3[min] 5[min] 10[min] 15[min] Pendiente
DEL SUSTRATO Absorbancia
[M] vs Tiempo.
(µmol/L/min)
SIN 0.001 1,469 1,432 1,171 1,160 1,601 -0,070
INHIBIDOR 0.05 1,309 1,262 1,279 1,125 2,387 2,411 -0,032
0.1 1,345 1,305 1,321 1,325 1.211,000 -0,002
0.5 1,319 1,315 1,338 1,330 2,545 1,352 0,003
10% 0.001 1,315 1,277 1,125 1,332 1,188 1,864 -0,003
0.05 2,252 1,315 1,300 1,338 2,549 2,357 -0,139
0.1 2,425 2,286 1,360 1,270 1,264 2,471 -0,258
0.5 2,542 2,534 2,057 1,272 1,569 2,527 -0,261
15% 0.001 2,298 1,267 2,154 2,127 2,207 0,048
0.05 2,328 2,341 2,334 2,478 2,413 0,027
0.1 1,314 2,361 2,459 2,479 2,433 0,187
0.5 2,529 2,527 2,551 2,554 2,520 0,006
1% 0.001 1,862 1,985 1,652 1,279 2,139 -0,130
0.05 1,904 2,506 1,277 2,511 2,514 0,030
0.1 2,466 2,544 2,115 2,529 1,331 -0,013
0.5 2,541 2,546 2,504 2,538 -0,003
20% 0.001 1,307 0,650 0,668 0,508 2,916 0,927 -0,126
0.05 1,317 1,127 1,108 1,111 5,11 1,041 -0,033
0.1 1,321 1,158 1,335 1,281 1,314 1,1 0,007
0.5 1,333 1,327 1,986 2,481 1,324 1,325 0,248
 4.2. Cálculo de la actividad enzimática para cada concentración del sustrato:

La pendiente de los datos de absorbancia versus tiempo representa la actividad enzimática.

Así tenemos:

Tabla 2. Resumen de datos calculados previos a la realización de los métodos de

linealización.
INHIBIDOR CONCENTRACIÓN DEL Velocidad
SUSTRATO (%) Pendiente (µmol/L/min)
m
SIN INHIBIDOR 0.001 -0,006 0,006
0.05 - 0,0066 0,0066
0.1 - 0,2577 0,2577
0.5 - 0,2608 0,2608
1% 0.001 - 0,0046 0,0046
0.05 - 0,007 0,007
0.1 - 0,0342 0,0342
0.5 - 0,0636 0,0636
10% 0.001 - 0,004 0,004
0.05 - 0,0058 0,0058
0.1 - 0,1381 0,1381
0.5 - 0,2605 0,2605
15% 0.001 - 0,0033 0,0033
0.05 - 0,0061 0,0061
0.1 - 0,2106 0,2106
0.5 - 0,2215 0,2215
20% 0.001 - 0,0022 0,0022
0.05 - 0,0063 0,0063
0.1 - 0,1645 0,1645
0.5 - 0,2316 0,2316
 4.3. Determinación de parámetros cinéticos:

Tabla 3. Resumen de datos calculados previos a la realización de la de linealización de

Lineweaber-Burk.

INHIBIDOR
0% 1% 10% 15% 20%

[So] 1/[So] Vo 1/Vo Vo 1/Vo Vo 1/Vo Vo 1/Vo Vo 1/Vo

0,00 1,00E+0 0,006 166,6 0,004 217,3 0,004 250 0,003 303,0 0,002 454,5
1 3 6 6 9 3 3 2 4
0,05 2,00E+0 0,006 151,5 0,007 142,8 0,005 172,4 0,006 163,9 0,006 158,7
1 6 1 6 8 1 1 3 3 3
0,1 1,00E+0 0,257 3,88 0,034 29,24 0,138 7,24 0,210 4,75 0,164 6,08
1 7 2 1 6 5
0,5 2,00E+0 0,260 3,83 0,063 15,72 0,260 3,84 0,221 4,51 0,231 4,32
0 8 6 5 5 6

Imagen 1. Linealización de Lineweaber-Burk para las distintas concentraciones de Inhibidor.

A partir de las linealizaciones realizadas se calcularon los parámetros cinéticos para cada reacción.

[ ]
 Tabla 4. Parámetros cinéticos para cada una de las concentraciones de inhibición.

Ecuación y Parámetros Cinéticos

Ecuación Vmáx km
0% y = 0,1167x + 51,374 0,0195 0,00227
1% y = 0,158x + 60,533 0,01652 0,00261
10% y = 0,193x + 58,587 0,01707 0,00329
15% y = 0,2499x + 54,579 0,01832 0,00458
20% y = 0,4043x + 51,6 0,01937 0,00784

4.4. Representación de Michaelis-Menten

4.4.1. Ecuaciones de Michaelis-Menten

Ecuaciones de Michaelis-Menten para los parámetros calculados:

Inhibidor al 0%

[ ]
[ ]

Inhibidor al 1%

[ ]
[ ]
Inhibidor al 10%

[ ]
[ ]

Inhibidor al 15%

[ ]
[ ]

Inhibidor al 20%

[ ]
[ ]
 4.4.2. Gráficas de Michaelis-Menten

Imagen 2. Gráfica de Michaelis-Menten para cada concentración de Inhibidor realizadas en el

programa Wolfram Alpha

5. DISCUSIÓN

Según los datos obtenidos al calcular los parámetros cinéticos de la reacción, la constante de
Michaellis aumenta a medida que se incrementa la concentración del inhibidor mientras que
su velocidad máxima se mantiene relativamente constante.

Según (Berg; 2008), el efecto del inhibidor competitivo consiste en aumentar el valor aparente
de Km y mantener constante Vmax.

Se observó que el tejido de hígado precipitó cuando se realizaban algunas de las mediciones
de absorbancias a tiempos mayores a 10 minutos y los valores de las absorbancias obtenidas
no seguían la tendencia de los datos generados a tiempos menores (1, 3, 5 y 10 minutos). El
tejido no era fresco, se manipuló con las manos y se mantuvo a temperatura ambiente por
varias horas, lo que es idóneo para la proliferación de muchos microorganismos.
Existen bacterias como la E. coli, Acinetobacter sup. y Candida albicans de la flora normal de la
piel, que producen proteasas que pueden degradar las enzimas (NCBI, 2013).

6. CONCLUSIONES
 El azul de metileno actúa como inhibidor de la succinato deshidrogenasa
presente en el tejido del hígado de res.
 Como la constante de Michaellis aumenta a medida que se incrementa la
concentración del inhibidor y su velocidad máxima se mantiene constante, es una
inhibición competitiva.
 El azul de metileno va a competir por el centro activo, dando como resultado una
inhibición competitiva.

7. RECOMENDACIONES
 El tejido a analizar debe ser fresco para evitar errores en los datos.

8. BIBLIOGRAFÍA

 Berg, J. et al. (2008). Bioquímica. Editorial Reverté. Recuperado el: 29/10/2013. Disponible
en:
http://books.google.com.ec/books?id=HRr4MNH2YssC&printsec=frontcover&hl=es#v=one
page&q&f=false

 MacFaddin. (2003). Pruebas Bioquímicas para la identificación de bacterias. Argentina:

Editorial Médica Panamericana. Recuperado el: 29/10/2013. Disponible en:
http://books.google.com.ec/books?id=FXDiqLK6GmAC&printsec=frontcover&hl=es#v=one
page&q&f=true

 Melo. V y Cuamatzi. O, Bioquímica de los procesos metabólicos, Estructura de los

disacáridos, Ediciones Reverte, España, 2007, 376 pp. Recuperado el: 29/10/2013.

 National Center for Biotechnology Information. Recuperado el: 29/10/2013. Disponible

en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

 Voet, V. et al. (2007). Fundamentos de Bioquímica. Editorial Médica Panamericana.

Segunda edición. Recuperado el: 29/10/2013. Disponible en:
http://books.google.com.ec/books?id=FXDiqLK6GmAC&printsec=frontcover&hl=es#v=one
page&q&f=true